Aula 2 - Enzima de Restrição

7/26/2019 Aula 2 - Enzima de Restrio

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Enzimas de Restrio


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Enzimas de restrio

1970 Purifica-se a primeira enzima de

restrio tipo II: o Hind II (Smith & Wilcox).

1972 Primeiras experincias com DNA

recombinante.

1978 Isolamento e caracterizao de mais de200 enzimas de restrio.


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As enzimas restrio ou endonucleases de restrio, so enzimasque cortam a molcula de DNA atravs do reconhecimento desequncias nucleotdicas especficas.

So enzimas bacterianas que funcionam como tesoura molecularreconhecendo sequncias especficas do DNA.

So altamente especficas.

Estas enzimas funcionam nas clulas bacterianas como parte deum mecanismo de proteo ao ataque de bacterifagos.

Enzimas de restrio


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O uso das enzimas de restrio permite aobteno dos fragmentos de DNA in vitro.

A explorao de sua atividade ecomercializao permitiu um avano naEngenharia Gentica.

Stio normalmente uma palndrome (mesma

sequncia de nucleotdeos com polaridadeinvertida). Ex: osso, anilina.

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Hidrlise Enzimtica

As enzimas de

restrio atuam sobresequncias especficas

do DNA, catalisando a

destruio da ligao

fosfodister entre

nucleotdeos.

Produtos da hidrliseresultam em

extremidades 3-OH e

5-P

5

3

5

3


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Enzimas de restrio Podem ser de 3 tipos: I, II e III.

Reconhecem seqncias de 4 a 8 pares de bases.

Cortes com extremidades abruptas ou coesivas.

Pode-se recombinar DNA humano com qualquer outraespcie.

Fragmentos separados por eletroforese.


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Nomenclatura das enzimas

Primeira letra maiscula gneroe as duas outrasminsculas so espcies.Por exemplo a enzima EcoRI.

E Escherichia (gnero)

co coli (espcie)

R RY13 (estirpe)

IPrimeira

identificada

(ordem de identificao da

bactria)

5N-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-N 33N-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-N 5


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Extremidades abruptas X coesivas


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Extremidades Coesivas

Extremidades Cegas


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ENZIMAS DE RESTRIO E O DNA RECOMBINANTE

Endonucleases que conferem proteo sbactrias contra vrus invasores.

Stios de restrio: seqncias

palndrmicas


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Quando se separa o DNA cortado pela

EcoRI obtemos extremidades coesivas ou

adesivas (corte assimtrico) porque se

podem sobrepor novamente.


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Nem todas as enzimas de restrio produzemextremidades coesivas. Algumas fazem cortessimtricos resultando extremidadesdenominadas abruptas ou retas.

A sequncia a seguir apresentada asequncia de reconhecimento da SmaI,endonuclease de restrio isolada a partirda Serratia marcescens.


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Resultado:

Em concluso, da especificidade dasequncia de determinada molcula deDNA, cada enzima de restrio gera umconjunto nico de fragmentos.


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Quais as enzimas que produzem:a) Extremidades abruptas?

b) Extremidades coesivas?


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IzoesquizmerosDiferentes enzimas de restrio que possuem a

mesma sequncia de reconhecimento

Diferem nas condies timas de reao, naestabilidade

Enzimas derestrio Sequncia dereconhecimento

SacIGAGCTC

CTCGAG

SstI

GAGCTC

CTCGAG

Exemplo:


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Fatores que influenciam a atividade das enzimas de

restrio:Composio do tampo

! Diferem na fora inica (concentrao de sal)

! Diferem no ction principal (Na+ou K+)

! Soluo: Manter o pH da reao (geralmente em 8.0)

Temperatura de incubao!

A maioria das enzimas cliva melhor a 37C

!Excees: Bactrias termoflicas clivam melhor entre 50 a 60C.

Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37C, recomenda-se a

incubao a 20C.


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Restrio enzimtica


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