[ ] Bioquímica I

Índice

1. Objectivo......................................................................................................................................... 3

2. Introdução...................................................................................................................................... 3

3. Material e Reagentes....................................................................................................................... 5

3.1. Reagentes..............................................................................................................................................5

3.2. Material................................................................................................................................................6

4. Procedimento Experimental........................................................................................................... 6

4.1 Recta de calibração de DNS para o açúcar invertido............................................................................6

4.2 Estudo da variação da actividade da enzima com a concentração do substrato....................................7

5. Apresentação e tratamento de resultados.......................................................................................8

5.1. Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido...........................................................................8

5.2. Traçar o gráfico da actividade da enzima (μmol de “açúcar invertido” formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reacção), em função da concentração de substrato (mol.dm-3) e calcular KM e vmax (Curva de Michaelis-Menten)........................................................................................10

5.3. Traçar o gráfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax...................................15

6. Discussão /Conclusão.................................................................................................................... 17

7. Bibliografia................................................................................................................................... 19

8. Anexos........................................................................................................................................... 21

8.1. Anexo 1- Segurança e riscos...............................................................................................................21

8.2. Anexo 2- Dedução da equação de Lineweaver-Burk...........................................................................22

8.3. Anexo 3- Preparação de soluções.......................................................................................................23

2

[ ] Bioquímica I

1. Objectivo

O objectivo da actividade experimental é estudar a cinética enzimática invertase num

substrato de sacarose, ou seja, determinar o valor da velocidade máxima e a respectiva

afinidade enzimática para o substrato.

2. Introdução

Com o desenvolvimento da bioquímica fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres vivos,

existiam substâncias capazes de catalisar de modo muito específico determinadas reacções

químicas.3 Uma enzima é um catalisador biológico, que mesmo em baixas concentrações

aumenta a velocidade da reacção.4 As enzimas diminuírem a energia de activação, mas não

afectam o equilíbrio da reacção.4

A invertase (β-fructofuranosidade) é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose em

“açúcar convertido”, isto é, nos seus dois monómeros constituintes: glicose e frutose

(figura 1). 2,5 O seu substrato preferencial é a sacarose porém, também, pode hidrolisar

ramonose e estaquiose.7

A

invertase encontra-se presente nos animais, mas também em plantas superiores, fungos e

bactérias.5 É possível obter o extracto não purificado da enzima, destruindo as células de

fermento por autólise e removendo os detritos celulares por centrifugação, após a qual a

invertase ficará no líquido sobrenadante.5 Existem actualmente várias aplicações desta

enzima, principalmente na indústria alimentar, onde a enzima usada tem origem na

levedura.2

A cinética enzimática estuda a acção das enzimas, a sua actividade catalítica e seu estudo

é feito in vitro.3 Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima, preparações

que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto, quanto mais purificada

estiver a preparação enzimática mais fácil será o seu estudo cinético.3

O mecanismo mais simples para explicar a acção enzimática é o modelo de Michaelis-Menten:

Neste modelo a enzima (E) liga-se ao substrato (S) para formar um complexo enzima-

substrato (E-S). A quantidade de produto (P) formada, assim como a velocidade da reacção

vão depender directamente da concentração em complexo E-S, isto é, da concentração de

enzima que se liga ao substrato.4,8

3

Figura 1 - Hidrolise da sacarose catalisada pela invertase. A glicose e a frutose são açúcares redutores.

Gráfico 1. Variação da velocidade de reacção em função da concentração de substrato

Gráfico 2. Gráfico de Lineweaver-Burk.

[ ] Bioquímica I

O modelo de Michaelis-Menten parte da hipótese que o passo limitante da velocidade é a

quebra do complexo E-S para formar o produto e a enzima livre.9

(1)

A representação gráfica da velocidade da reacção em função da concentração de substrato

(gráfico 1) é uma hipérbole. A assímptota horizontal corresponde à Vmáx. O valor de Km

também pode ser obtido através do gráfico, uma vez que quando a [S]= Km , a equação de

Michaelis-Menten prevê que velocidade de reacção é

metade de Vmáx.4,8

Km é uma medida de afinidade da enzima para o substrato

e essa afinidade é igual a 1/ Km.4,8 Para um Km elevado,

existe uma baixa afinidade (é necessária uma elevada [S]

para se atingir a V igual na 1/2Vmáx, para um Km baixo

existe uma elevada afinidade.4,8

O gráfico de velocidade vs [S] mostrado anteriormente não é linear, pelo que se torna

difícil estimar os valores de Km e Vmáx , sendo assim necessário desenvolver métodos de

linearização da equação de Michaelis-Menten. . Podemos transformar a equação de

Michaelis-Menten, invertendo-a:

O gráfico de Lineweaver-Burk (gráfico 2) é a forma mais comum, e simples, de mostrar

os dados cinéticos, apesar de não ser o mais fiável.

Como se pode observar pelo gráfico 2, não se podem tomar valores negativos para 1/[S], sendo o mínimo valor possível é 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentração infinita de substrato, e daí 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intersecção entre a recta e o eixo x é uma extrapolação de dados experimentais. Assim sendo, os gráficos de Lineweaver-Burke distorcem as medidas realizadas a baixas concentrações de substrato e isto pode dar lugar a estimativas não muito exactas de Vmax e de Km.10

3. Material e Reagentes

3.1. Reagentes

4

(2)

[ ] Bioquímica I

Tabela 1- Características gerais dos reagentes utilizados

ReagentesFórmulaQuímica

MassaMolar(g/mol)

Grau de Pureza (%)

Densidade(g/cm3)

Riscos e Segurança1

Solução aquosa de invertase

diluída 1:400

Hidrogeno-carbonato de

sódioNaHCO3 84,01 99,5 2,159 -

Ácido 3,5-dinitrosalicílic

o (DNS)

Hidróxido de Sódio

NaOH 39,997 98,6 2,13 CorrosivoR: 35

S: 2-26-37/39

Ácido 3,5- dinitrosalicílico

(DNS)

C7H4N2O7

228,12 99 - NocivoR: 22

S: 22-24/25

Tartarato de sódio e potássio

tetrahidratado

C4H4KNaO6.4H2O

282,23 99-102 - -

Tampão acetato

Acetato de sódioCH3COO

Na82,03 99 1,52

IrritanteCorrosivo

R: 36/37/38S: 16-29/56

Ácido Clorídrico(37%)

HCl 36,46 37 1,19 CorrosivoR: 34-37S: 26-45

Solução de sacarose

SacaroseC12H22O

11342, 30 - 1,587 -

Solução equimolar de

glucose/frutose

Frutose C6H12O6 180,16 - 1,54 -

Glucose C6H12O6. 180,16 99,5 -

Água Destilada - H20 18,02 - 1 -

3.2. Material

Tubos de ensaio Suporte para tubos de ensaio Micropipetas Pipetas graduadas

Pipetador Vórtex Banho com água 100°C Banho com água fria

1 Anexo 1

5

[ ] Bioquímica I

Espectrofotómetro Cronómetro

Placa de aquecimento Pompete

4. Procedimento Experimental

4.1 Recta de calibração de DNS para o açúcar invertido

Para a construção da recta de calibração preparar 5 tubos de ensaio de acordo com a tabela

1.

Tabela 2- Preparação de soluções

Vsol (mL)Tubo1

(branco)Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

Gluc/frut

0,0025M0,00 0,10 0,40 0,70

1,00

H2O dest. 2,00 1,90 1,60 1,30 1,00

Tampão

acetato1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Sacarose

0,25M1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

DNS 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00

Agitar no vórtex.

Aquecer os tubos num banho com água a 100°C durante 5 minutos exactos.

Arrefecer num banho com água fria.

Adicionar 4mL de água destilada a cada tubo e agitar no vórtex.

Vsol (mL) Tubo1

(branco)

Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

H2O dest. 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

Ler absorvância a 540 nm (Calibrar com tubo 1).

4.2 Estudo da variação da actividade da enzima com a concentração do substrato

6

Perfazer com água destilada o volume total

de 2 ml

[ ] Bioquímica I

Para o estudo da actividade enzimática preparar 7 tubos de ensaio de acordo com a tabela 2.

Tabela 3- Preparação de soluções

Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

Sacarose

0,25M0,00 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80

1,60

H2O dest. 2,00 1,95 1,90 1,80 1,60 1,20 0,40

Tampão

acetato1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Incubar a 25°C durante 5 minutos.

Em intervalos de 60s adicionar.

Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

Enzima

1:4001,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Agitar no vórtex.

Incubar a 25°C durante 10 minutos exactos.

Em intervalos de 60s adicionar.

7

Perfazer com água destilada o volume total

de 2 ml

[ ] Bioquímica I

Vsol (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

DNS 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00

Agitar no vórtex.

Aquecer em banho com água a 100°C durante 5 minutos exactos.

Arrefecer em banho de água fria.

Adicionar 4mL de água destilada e agitar no vórtex.

Vsol (mL)Tubo1

(branco)Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

H2O dest. 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

Ler absorvância a 540 nm (usar tubo 1 como branco).

5. Apresentação e tratamento de resultados

5.1. Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido

[solução equimolar de glicose/frutose] (M)

[solução]conc. = 0,0025M

Vfinal = 10mL

Tubo 2

Vinicial 2 = 0,10mL

[solução]tubo 2 = ?

ninicial=nfinal ⇔

[ solu çã o ]conc . ×V inicial 2=[ solu çã o ]tubo2 ×V final⇔

8

[ ] Bioquímica I

[ solu çã o ]tubo2=0,0025 M ×0,1 mL

10 mL⇔

[ solu çã o ]tubo2=2,5× 10−5 M ⇔ [ solu çã o ]tubo2=0,025× 10−3 M

Tubo 3

Vinicial 3 = 0,40mL

[solução]tubo 3 = ?

ninicial=nfinal ⇔

[ solu çã o ]conc . ×V inicial 3=[ soluçã o ]tubo 3×V final⇔

[ solu çã o ]tubo3=0,0025 M ×0,40 mL

10 mL⇔

[ solu çã o ]tubo3=2,5 ×10−5 M ⇔ [ solu çã o ]tubo3=1,0× 10−4 M

Tubo 4

Vinicial 4 = 0,70mL

[solução]tubo 4 = ?

ninicial=nfinal ⇔

[ solu çã o ]conc . ×V inicial 4=[ so lu çã o ]tubo4 ×V final ⇔

[ solu çã o ]tubo 4=0,0025 M × 0,70 mL

10 mL⇔

[ solu çã o ]tubo 4=2,5 ×10−5 M ⇔ [ solu ção ] tubo4=1,75 × 10−4 M

Tubo 5

Vinicial 5 = 1,0mL

[solução]tubo5 = ?

ninicial=nfinal ⇔

[ solu çã o ]conc . ×V inicial 5=[ soluçã o ]tubo 5×V final⇔

[ solu çã o ]tubo5=0,0025 M ×1,0 mL

10 mL⇔

[ solu çã o ]tubo5=2,5 ×10−5 M ⇔ [ solu çã o ]tubo5=2,5× 10−4 M

9

[ ] Bioquímica I

Tabela 4 – Registo de resultados com os dados necessários á construção da recta de calibração do DNS

para o açúcar invertido

Tubo Vsolução equimolar de glicose/frutose[solução equimolar de

glicose/frutose]Absorvância

1 - Branco 0 0 0

2 0,1 0,000025 0,005

3 0,4 0,0001 0,134

4 0,7 0,000175 0,293

5 1 0,00025 0,433

0.0000 0.0001 0.0002 0.00030.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

f(x) = 1801.15606936415 x − 0.0251271676300578R² = 0.990372671086214

Recta de calibração do DNS para o açucar invertido

concentração equimolar de glicose /frutose (M)

Abso

rvân

cia (n

m)

Gráfico 3 – Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido

5.2. Traçar o gráfico da actividade da enzima (μmol de “açúcar invertido” formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reacção), em função da concentração de substrato (mol.dm-3) e calcular KM e vmax (Curva de Michaelis-Menten).

5.2.1. Cálculos necessários à construção da curva Michaelis-Menten

Cálculo da concentração de açúcar invertido após os 10 minutos de incubação

com a enzima

Pela lei Lambert-Beer, a absorvância em função da concentração deve ser uma linha recta,

logo existe uma relação entre a lei e a equação da recta.

y = m . x + b

A = Ɛ . l . c

10

[ ] Bioquímica I

Este cálculo é feito com base na recta de calibração do gráfico 3 e com as absorvâncias

medidas experimentalmente substituindo-as na equação obtida:

y=1801,2 x−0,0251

Tubo 2

[gluc / frut ]=0,003+0,02511801,2

=1,560 ×10−5 M

Tubo 3

[gluc / frut ]=0,022+0,02511801,2

=2,615 ×10−5 M

Tubo 4

[gluc / frut ]=0,213+0,02511801,2

=1,322 ×10−4 M

Tubo 5

[gluc / frut ]=0,381+0,02511801,2

=2,255 ×10−4 M

Tubo 6

[gluc / frut ]=0,528+0,02511801,2

=3,071 ×10−4 M

Tubo 7

[ glucfrut ]=0,616+0,0251

1801,2=3,559× 10−4 M

Cálculo do número de moles de açúcar invertido presentes em solução após os 10

minutos de encubação com a enzima.

Tubo 2

na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔

na ç. inv .=1,560× 10−5 M × 0,010 dm3 ⇔

na ç. inv .=1,560× 10−7 mol

Tubo 3

na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔

na ç. inv .=2,615× 10−5 M × 0,010 dm3⇔

11

[ ] Bioquímica I

na ç. inv .=2,615× 10−7 mol

Tubo 4

na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔

na ç. inv .=1,322× 10−4 M × 0,010 dm3⇔

na ç. inv .=1,322× 10−6 mol

Tubo 5

na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔

na ç. inv .=3,071× 10−4 M × 0,010 dm3⇔

na ç. inv .=3,071× 10−6 mol

Tubo 6

na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔

na ç. inv .=2,931× 10−4 M ×0,010 dm3⇔

na ç. inv .=2,931× 10−6 mol

Tubo 7

na ç. inv .=ca ç. inv . ×V sol.⇔

na ç. inv .=3,559× 10−4 M ×0,010 dm3⇔

na ç. inv .=3,559× 10−4 × 10−6 mol

Cálculo da actividade enzimática durante o tempo de encubação (10 minutos)

v=na ç uc. inv .(μ mol)

∆ t(min .)×V enzima(mL)

A enzima encontrava-se diluída 1:400, pelo que para a realização do cálculo da actividade

enzimática tem de entrar em linha de conta esse factor de diluição. Assim:

v=naçuc .inv .

∆ t ×V enzima

400

Tubo 2

v=1,560 × 10−7 ×106 μmol

10 min ×1mL400

⇔ v=6,240 μmol . min−1 .mL−1

12

[ ] Bioquímica I

Tubo 3

v=2,615× 10−7 ×106 μmol

10 min ×1mL400

⇔ v=10,460 μmol .min−1. mL−1

Tubo 4

v=1,322 ×10−6× 106 μmol

10 min ×1mL400

⇔ v=52,876 μmol .min−1. mL−1

Tubo 5

v=2,255× 10−6 ×106 μmol

10 min ×1mL400

⇔ v=90,184 μmol .min−1 . mL−1

Tubo 6

v=3,071 ×10−6 ×106 μmol

10 min ×1mL400

⇔ v=122,829 μmol . min−1 . mL−1

Tubo 7

v=3,559 × 10−6 ×106 μmol

10 min ×1mL400

⇔ v=142,372 μmol . min−1 . mL−1

Tabela 5 – Dados utilizados para construção da curva de Michaelis-Menten

Tubo V Sac (mL) [Sac] (M) Absorvância[Açúcar

Invertido]n açúcar invertido

Activ. Enz (μmol.min-1mL-1)

Branco 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2 0,05 1,25E-03 0,003 1,560E-05 1,560E-07 6,240

3 0,10 2,50E-03 0,022 2,615E-05 2,615E-07 10,460

4 0,20 5,00E-03 0,213 1,322E-04 1,322E-06 52,876

5 0,40 1,00E-02 0,381 2,255E-04 2,255E-06 90,184

6 0,80 2,00E-02 0,528 3,071E-04 3,071E-06 122,829

7 1,60 4,00E-02 0,616 3,559E-04 3,559E-06 142,372

13

[ ] Bioquímica I

5.2.2. Construção do gráfico da curva de Michaelis-Menten

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.0450.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

160.0

Activ. Enz (μmol.min-1mL-1)

Concentração de sacarose (M)

Vel

ocid

ade

da r

eaçã

o (μ

mol

.min

-1m

L-1)

Gráfico 4 – Curva de Michaelis-Menten

5.2.3. Determinação dos valores de KM e Vmax (pela representação Michaelis-Menten)

A equação de Michaelis-Menten permite uma visualização rápida e directa, mas não muito

precisa dos valores de Vmáx e de Km, uma vez que esta depende do observador.

A velocidade atingirá o ponto máximo quando a enzima estiver saturada, ou seja, quando

todos os locais de ligação do centro activo estiverem ocupados com os ligandos e quando a

concentração de substrato não influenciar a velocidade. Como a curva relativa ao gráfico

de Michaelis-Menten tende para o infinito, não existe um valor preciso para Vmáx mas sim

uma estimativa deste. Neste caso, o valor foi de aproximadamente 145 μmol.min-1mL-1

O Km corresponde ao valor da concentração de substrato (eixo xx) lido a partir de V0 (eixo

dos yy) que equivale à metade de Vmáx. Assim:

k m=V máx

2=145

2=72,5μmol .min−1 . mL−1

Observando o gráfico, extrapolou-se que o Km será de aproximadamente 0,0075 M

14

[ ] Bioquímica I

5.3. Traçar o gráfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax.

Cálculos necessários à construção do gráfico de Lineweaver-Burk

A dedução da equação de Lineweaver-Burk a partir da equação de Michaelis-Menten é

dada por:

Y = m x + b

Assim, esta é a equação de uma recta onde 1/v representa a ordenada, 1/[S] a abcissa, o

declive é dado por KM/vmax e a ordenada na origem 1/ vmax.

Tabela 6 - Dados usados para a construção da recta de Lineweaver-Burk

1/[sacarose] 800 400 200 100 50 25

1/V 1,602E-01 9,561E-02 1,891E-02 1,109E-02 8,141E-03 7,024E-03

0 100 200 300 400 500 600 700 800 9000.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.160

0.180

f(x) = 0.000211280752766364 x − 0.00529118432755426R² = 0.966195181877005

Recta de Lineweaver- Burk

1/[sacarose] (M-1)

1/V

(m

ol-1

min

.mL)

Gráfico 5 - Representação gráfica da equação Lineweaver-Burk

Visto que o valor de b obtido é negativo, não é possível calcular o valor de Vmáx e consequentemente o valor de Km, uma vez que o valor da velocidade calculado daria negativo, o que é impossível.

15

[ ] Bioquímica I

Tabela 7 - Dados usados para a construção da recta de Lineweaver-Burk desprezando 2 pontos

1/[sacarose] 800 400 50 25

1/V 1,602E-01 9,561E-02 8,141E-03 7,024E-03

0 100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0000.0200.0400.0600.0800.1000.1200.1400.1600.180

f(x) = 0.000203258708455223 x + 0.00296615068356586R² = 0.988972140606615

Recta de Lineweaver-Burk

1/[sacarose] (M-1)

1/V

(m

ol-1

min

.mL)

Gráfico 6 - Representação gráfica da equação Leneweaver-Burk desprezando 2 pontos

De forma a obter um valor de velocidade máxima aceitável, foi desprezado o ponto 3 e 4,

obtendo a recta: Y=0,0002 x+0,003

b= 1Vmáx

⇔Vm= 10,003

≈ 333,33 μmolmin−1ml−1

m= KmVm

⇔ Km=m× Vm⇔ Km=333,33 ×0,0002=0,0667 M

Tabela 8 – Resultados obtidos pela curva de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk

Michaelis-Menten Lineweaver-BurkVmáx 145 333,33KM 0,0075 0,0667

16

[ ] Bioquímica I

6. Discussão /Conclusão

Com o intuito de realizar esta experiência laboratorial e para efectuar o cálculo dos

parâmetros cinéticos relativos à enzima invertase, onde se relaciona a velocidade

reaccional com a concentração do substrato presente, procedeu-se à realização de uma

recta de calibração. Esta recta relaciona a concentração de glucose/frutose com as

absorvâncias lidas para cada uma das concentrações padrão. Na segunda parte do trabalho

e com recurso a esta recta, foi possível calcular efectivamente a concentração do produto

da reacção (concentração de glucose/frutose derivado da degradação da sacarose pela

invertase) e efectuar de novo a leitura das absorvâncias para as amostras com diferentes

concentrações de substrato. Dependendo da concentração de substrato presente na amostra,

a concentração dos produtos foi variando no decurso da reacção enzimática, o que nos

permitiu estudar a actividade da enzima invertase para com o substrato, ou seja, a sua

afinidade para com este.

O estudo desta mesma actividade enzimática foi feito com recurso a duas representações

gráficas: a curva de Michaelis-Menten e a recta de Lineweaver-Burk.

O gráfico 4 mostra a variação da [Sacarose] quando a [Invertase] é constante. Como se

pode observar, para concentrações relativamente baixas de sacarose, V0 aumenta quase

linearmente com o aumento da [Sacarose], fruto da grande quantidade de enzima livre que

se pode ligar ao substrato. Para concentrações elevadas deste mesmo substrato, V0 aumenta

cada vez menos em resposta ao aumento da concentração de sacarose, atingindo um

patamar que representa o valor de Vmáx. Esta tendência para o infinito representa o

momento em que os centros activos da invertase se encontram todos ligados à sacarose

(saturação da enzima), em que a velocidade reaccional não aumenta mais

independentemente dos aumentos da concentração da sacarose.

Este gráfico permitiu então uma determinação empírica das constantes cinéticas

enzimática: Km e Vmáx. No nosso caso, os valores foram ≈0,0075 M e ≈145 µmol.min-

1.mL-1, respectivamente. Contudo, estes parâmetros não são muito precisos dado que Vmáx

não é um valor preciso mas sim assimptótico (tende para o infinito) e por consequência, Km

também não é rigoroso porque depende de Vmáx.

De forma a colmatar as falhas relativas a esta observação empírica, recorreu-se a uma das

formas linearizadas da equação de Michaelis-Menten – Equação de Lineweaver-Burk

17

[ ] Bioquímica I

(inverso de Michaelis-Menten). Esta equação permite uma leitura mais correcta dos

parâmetros cinéticos Km e Vmáx (cálculos matemáticos).

Não obstante, no nosso trabalho prático, os valores acima referidos não puderam ser

calculados uma vez que a equação que representa a recta de Lineweaver-Burk tinha o

parâmetro b negativo (-0,0053) (gráfico 5). Se assim fosse, Vmáx daria negativo (Vmáx

=1/b) bem como Km (Km = m xVmáx). Uma possível explicação para este facto ocorrido é

de que este método provoca uma distorção do erro experimental – para baixos valores de

V0, um pequeno erro em V0 corresponde a um enorme erro em 1/V0; pelo contrário, para

valores elevados de V0, o mesmo pequeno erro em V0 corresponderá a erros desprezáveis

em 1/V0.

Se pelo contrário desprezássemos dois pontos da recta de Lineweaver-Burk

(nomeadamente o 3º e 4º pontos), obteríamos um b positivo (0,003) (gráfico 6), o que nos

permitiria obter valores de Vmáx ≈ 333,33 µmol.min-1.mL-1 e Km = 0,0667 M. Este valor

calculado esta dentro do limite teórico previsto (10−8 a 10−2 M). No entanto, como não

existem valores de referência para actividade enzimática da invertase não se pode inferir

quanto aos erros analíticos cometidos, nem à exactidão dos resultados experimentais.

Tendo em conta o valor obtido para Km (6 ,67 ×10−2, tem-se uma má actividade

enzimática visto que este se aproxima do limite superior teórico previsto (

10−8<6,67 ×10−2 M <10−2). Todavia, este resultado não pode ser considerado

estatisticamente significativo, uma vez que foram desprezados 2 pontos e o r2 é inferior a

0,999 (correlação fiável).

Outro motivo para os resultados não serem considerados fiáveis é que segundo o descrito

na literatura, a enzima invertase não tem uma actividade significativa (24%), mesmo na

capacidade máxima de actuação (actividade óptima). De referir ainda que apesar da baixa

actividade, o pH óptimo (4,5) foi proporcionado pelo tampão acetato de sódio.

Outra ilação que podemos retirar da realização deste trabalho prático foi que a sacarose não

foi precisa para a preparação da recta de calibração (gráfico 3), uma vez que só os açúcares

glucose e frutose têm a capacidade de reduzir o DNS devido à presença de carbonos

anoméricos (carbonos capazes de participar na formação de ligações glicosídicas). Pelo

contrário, como a sacarose já apresenta uma ligação glicosídica, não apresenta o carbono

livre necessário à redução do DNS. No entanto, utilizou-se a sacarose nesta primeira parte

18

[ ] Bioquímica I

da experiência para que na medição das absorvâncias houvesse os mesmos constituintes

em ambas as partes do trabalho, pois na segunda parte a enzima invertase não é capaz de

degradar a sacarose na sua totalidade.

De referir ainda que os valores não foram de encontro ao esperado, possivelmente por

terem ocorrido erros sistemáticos e experimentais, tais como: má preparação das soluções-

padrão, desfasamento temporal entre a primeira parte e a segunda da experiência, más

leituras no espectrofotómetro devido a células danificadas e mau funcionamento do

aparelho.

Em suma, podemos então afirmar que os parâmetros cinéticos podem ser calculados tanto

pela curva de Michaelis-Menten como pela recta de Lineweaver-Burk. Pela curva de

Michaelis-Menten o calculo de Km não é rigoroso, pois depende da determinação do Vmáx

que é calculada por aproximação, sendo que também exige um numero elevado de

determinações. Contudo, o segundo método é mais expedito, rigoroso e rápido e são

necessárias menos leituras experimentais, pois o traçado da recta exige um menor número

de pontos da curva. Para além disto, a recta de Lineweaver-Burk não implica

aproximações, mas sim cálculos matemáticos.

7. Bibliografia

1. Adão, M. H. et al. (1997). Bioquímica. LIDEL- Edições Técnicas. ISBN: 972-757-

042-9;

2. http://legion.geleia.net/Guia_Laboratorios.pdf;

3. http://users.med.up.pt/ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados_anos_anteriores/2006-

2007/enzimas_e_cinetica_enzimica.pdf;

4. Nelson, D.L., Cox, M.M. (2001). “Lehninger, Principles of Biochemistry”, 3a

edição, Worth Publishers,;

5. Protocolo da actividade prática fornecido pelos docentes da cadeira;

6. Fiedurek, J.; Pielecki, J.; Skowronek, M. (2000). Direct methods for selecting

mutants with increased production of invertase from mutagenised cultures of

Aspergillus fumigatus. Journal of Basic Microbiology, v. 40, p. 111-118;

7. http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/Enzimas.htm;

8. Campos L. (1999). “Entender a Bioquímica”Escolar Ed, 2ª edição,. Capítulo 2,

Cinética das Reacções Bioquímicas;

19

[ ] Bioquímica I

9. http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/

Apostila_cinetica_enzimatica_ju.pdf;

10. Tseng SJ, Hsu JP. (1990). A comparison of the parameter estimating procedures

for the Michaelis–Menten model. J Theor Biol. Aug 23;145(4):457–64. PMID

2246896;

11. http://www.scielo.br/scielo.php?

pid=S010466322000000400051&script=sci_arttext

20

[ ] Bioquímica I

8. Anexos

8.1. Anexo 1- Segurança e riscos

NaOH:

R 35: Provoca queimaduras graves.

S 2: Manter fora do alcance das crianças.

S 26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em água e

chamar um especialista.

S 37/39: Usar luvas adequadas e protecção para os olhos/cara

Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS):

R 22: Nocivo por ingestão.

S 22: Não respirar o pó

S24/25: Evitar o contacto com os olhos e com a pele

Ácido Cloridrico:

R34: Provoca queimaduras

R37: Irritante para as vias respiratórias.

S26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em água e

chamar um especialista

S45: Em caso de acidente ou indisposição consultar imediatamente um médico (se possível

mostrar-lhe o rótulo do produto)

Acetato de sódio:

R 36/37/38: Irritante para os olhos, vias respiratórias e pele.S 16: Conservar longe de fontes de ignição - Não fumar.S 29: Não deitar os resíduos no esgotoS56: Não despejar na rede de esgotos nem no meio aquático. Utilizar para o efeito um local apropriado para o tratamento dos resíduos

21

[ ] Bioquímica I

8.2. Anexo 2- Dedução da equação de Lineweaver-Burk

Dedução da equação de Lineweaver-Burk por linearização da equação de Michaelis-

Menten.

vvmax

=[ S ]

K M+[ S ]⇔

vmax

v=

K M+[ S ][ S ]

⇔

1v=

KM+ [ S ]vmax . [ S ]

⇔

1v=

K M

vmax . [ S ]+

[ S ]vmax . [ S ]

⇔

1v=

K M

vmax . [ S ]+ 1

vmax

⇔

1v=

KM

vmax

×1

[S ]+ 1

vmax

22

[ ] Bioquímica I

8.3. Anexo 3- Preparação de soluções

Extracto não purificado de enzima

Homogeneizar muito bem 50 g de fermento de padeiro em 100 ml de solução NaHCO3 0,1

M, durante 1 ou 2 minutos. Transferir a mistura para um erlenmeyer de 250 ml, vedar com

um pouco de algodão e incubar num banho termostatizado a 40ºC, durante 24 h.

Após a autólise da células de fermento, centrifugar a mistura durante 15 min. Transferir o

líquido sobrenadante, límpido, para uma proveta e registar o volume, guardando este

extracto de enzima no frigorífico.

Reagente de DNS

Dissolver 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico em 200 ml de NaOH 2 N, aquecendo e agitando

vigorosamente (solução A). Dissolver 300 g de tartarato de sódio e potássio em 500 ml de

água destilada (solução B). Misturar 30 ml da solução A com 75 ml da solução B e

perfazer o volume para 150 ml com água destilada.

Tampão acetato 20 mM, pH 4.5

Pesar a quantidade de acetato de sódio necessária para preparar 500 ml de solução 20 mM,

colocar num copo de 500 ml, adicionar cerca de 400 ml de água e homogeneizar. Verificar

o pH da solução resultante com o medidor de pH. Se necessário, acertar o pH no valor

pretendido (4.5), adicionando pouco a pouco, com um conta gotas, ácido clorídrico

concentrado, agitando continuamente a solução através de um agitador magnético.

Transferir a solução para um balão de 500 ml e aferir com água destilada. Homogeneizar.

23