Apresentação -curso_biossegurança_og_ms_ch ristiane_microrganismos2

Análise de risco sobre a biota do solo

Christiane Abreu de Oliveira Paiva

Embrapa Milho e Sorgo

Porque devemos zelar pela saúde do solo ?

POPULAÇÃO MICROBIANA SOLO

• FUNGOS, BACTÉRIAS, ALGAS

• MACRO E MESO FAUNA

SOLO

• Fração física, Química

• FRAÇÃO BIOLÓGICA

CULTURAS

• INTERAÇÃO PLANTA-SOLO-MICRORGANISMOS

• NUTRIÇÃO

Porque nos devemos zelar pela saúde do solo ?

1. Nos solos ocorrem processos chave para equilíbrio da vida no planeta, em sua maioria mediados por comunidades microbianas

• Purificação e armazenamento de água

• Decomposição/Mineralização

• Fixação biológica de Nitrogênio

• Ciclagem de Nutrientes

2. Tipicamente, existem 40 milhões de células bacterianas/g de solo (Whitman et al. 1998), totalizando uma massa que excede a biomassa de plantas e animais no planeta (Hogan

2010) 3. Fonte de

biodiversidade

www.agencia.cnptia.embrapa.br Foto: Dr Itamar Soares de Melo

http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/

Principais funções dos microrganismos do solo

• Fixação Biológica de Nitrogênio

• Micorrizas

• Microrganismos Promotores do Crescimento de Plantas : fitohormonios

• Controle Biológico

• Solubilizadores de Rochas

• Atividade Enzimática

• Banco de Germoplasma

Porque devemos monitorar as comunidades microbianas no solo ?

1. Microrganismos são praticamente onipresentes e reagem rápido à alterações químicas e físicas no ambiente

2. Alterações em comunidades microbianas são muitas vezes precursoras de mudanças na saúde e na vitalidade do ambiente como um todo.

3. Comunidades microbianas exercem funções essenciais para a funcionamento do sistema solo-planta

4. Existem metodologias bem estabelecidas para o estudo de comunidades microbianas

• Acesso a diversidade microbiana

–Domínio de metodologia clássicas, baseadas em técnicas dependentes de cultivo;

–Domínio de técnicas moleculares – independentes de cultivo

•Avaliação da atividade microbiana no solo – bioindicação da saúde do solo

(Medição do impacto ambiental no solo)

• Biomassa - coeficiente metabólico

• Biolog

• DGGE, técnicas moleculares

• Enzimas

Análise de Risco OGMs

Solo

Biota

Resolução Normativa 09 CTNBIO

Não trata especificamente de bioindicadores do solo relacionados a microrganismos

Artigo 11: Monitoramento em geral: questionários, relatórios de artigos publicados, outras ferramentas

Não existem normas específicas de técnicas e metodologias

Avaliação do Impacto de

plantas GMs no solo

Natureza da

substância

Tipo de evento

Tipo de solo e cultura

Analise de risco Pré liberação

Indicadores de processos

Indicadores de abundância

Indicadores de persistência da proteína

METODOLOGIAS SUGERIDAS PARA ANÁLISE DE RISCO:

–Pré-liberação:

• Indicadores de processos:

–Métodos enzimáticos,

–métodos específicos (depende do evento, ex.: fixação de N),

–PCR em tempo real,

– Atividade metabólica,

–Coeficiente metabólico ??

•

•

•

•

METODOLOGIAS SUGERIDAS PARA ANÁLISE DE RISCO:

– Pré-liberação:

• Indicadores abundância – Quantificação da população de microrganismos do solo

(biota do solo, invertebrados também), biomassa

– Indicadores de biodiversidade – Caracterização de grupos específico: métodos

moleculares de fingerprint de comunidade (ex.: DGGE, T-RFLP, ...)

– Uso de metagenômica para caracterização

• Indicadores de persistência da proteína (se for o caso) ou outra substância, como enzimas. – Quantificação por ELISA, quantificação da taxa de

decomposição e liberação de nutrientes.

•

•

•

•

– Pós-liberação:

• Menor número de indicadores – seria feito uma correlação múltipla e tentar sugerir os melhores indicadores para pós monitoramento.

Resultados de pesquisa Embrapa Milho e Sorgo

Embrapa Agrobiologia

Projetos

• Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros-praga, predadores e organismos não-alvo

– Líder: Simone Martins Mendes

• 2010-2012

• Impacto ambiental de milho transgênico expressando toxinas de Bacillus thuringiensis sobre a entomofauna, microbiota do solo e produção de grãos

– Líder: Fernando Hercos Valicente

• 2/1/2011 a 30/12/2014

Projeto 1: Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros praga, predadores e organismos não-

alvo

• Objetivos/Hipóteses

• Hipótese 1: A utilização de plantas de milho Bt não afeta a incidência e atividade de organismos não-alvo

• Impactos de toxinas Bt sobre a estrutura e função de comunidades bacterianas na rizosfera

• Diversidade funcional da comunidade bacteriana do solo

• Diversidade genética da microbiota através de eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)

• Hipótese 2: Restos vegetais de plantas Bt podem afetar a comunidade microbiana do solo e apresentar distintas taxas de decomposição, alterando a ciclagem de nutrientes

• Decomposição e ciclagem de nutrientes a partir de resíduos de plantas Bt

Projeto 1: Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros praga, predadores e organismos não-

alvo

• Qualidade biológica do solo rizosférico de plantas

transgênicas de milho, expressando proteínas CryAb e Cry1F

• Atividade Enzimática

• Perfil Metabólico de Comunidades

Figura 1: Ilustração da determinação da atividade da urease e arginase

0,15 g Agitação

Reagente A e C + Incubação 37ºC + Reagente D e E Centrifugação Leitura

400 nm

SOLO

0,5 g

1,0 g SOLO

Agitação

Reagente A + Incubação 37ºC + Reagente B

Centrifugação Reagente C e D

Leitura

Incubação

660 nm

100μl

SOLO

Extração/

Diluição

Centrifugação (4000g, 15’)

Inoculação em placas ECOPLATES - BIOLOG

Figura 2: Ilustração da determinação da atividade das fosfatases

Figura 3: Ilustração da determinação da diversidade funcional da comunidade microbiana

Figura 1: Ilustração da determinação da atividade da urease e arginase

0,15 g Agitação

Reagente A e C + Incubação 37ºC + Reagente D e E Centrifugação Leitura

400 nm

SOLO

0,5 g

1,0 g SOLO

Agitação

Reagente A + Incubação 37ºC + Reagente B

Centrifugação Reagente C e D

Leitura

Incubação

660 nm

100μl

SOLO

Extração/

Diluição

Centrifugação (4000g, 15’)

Inoculação em placas ECOPLATES - BIOLOG

Figura 2: Ilustração da determinação da atividade das fosfatases

Figura 3: Ilustração da determinação da diversidade funcional da comunidade microbiana

Qualidade biológica do solo rizosférico de plantas transgênicas de milho, expressando proteínas CryAb e Cry1F

Efeito local predominante, não ocorrendo diferença significativa

entre as variedades de Milho Bt avaliadas e sua isolínea

Tabela 1. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates),

Número de substratos utilizados (S), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) em 72 horas de incubação para amostras de solo não rizosférico e rizosférico de 3 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, em solo de várzea e cerrado

• Projeto 2: Impacto ambiental de milho transgênico expressando toxinas de Bacillus thuringiensis sobre a entomofauna, microbiota do solo e produção de grãos

• Objetivos

• A utilização de plantas de milho Bt não afeta a a estrutura e a função de comunidades microbianas do solo incidência e atividade de organismos não-alvo

• Impactos de toxinas Bt sobre a estrutura e função de comunidades bacterianas na rizosfera

• Diversidade funcional da comunidade bacteriana do solo

• Diversidade genética da microbiota através de eletroforese em gel de gradiente (DGGE), T-RFLP e clonagem/sequenciamento

• Projeto 2: Delineamento Experimental

Blocos casualizados com 4 repetições

• Ano 1 Safra 2010/2011 – 12 tratamentos

• Ano 2 Safra 2011/2012 – 18 tratamentos

• (Janeiro de 2012)

• O experimento plantado na mesma posição ano após ano

• Duas Localidades – Sete Lagoas e Janaúba

• Duas épocas de amostragem – 30 e 45 dias após plantio

• Tratamentos

• Milho Bt

• Isolinha

• Isolinha + tratamento químico

Experimento Janúba ano 2 – Safra 2011/2012

• Projeto 2: Parâmetros Avaliados

Micorrizas

• Taxa de colonização radicular

• Diversidade molecular da comunidade colonizando raízes (T-RFLP)

Fixadores de Nitrogênio

• Diversidade molecular genes Nif (DGGE)

Comunidade Bacteriana Total

• Diversidade molecular da comunidade por 16S rRNA (DGGE)

Perfil Metabólico da Comunidade Bacteriana

• BIOLOG – Ecoplates

Decomposição palhada Milho Bt

• Ensaios in vitro

Tabela 2. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) e Equitabilidade – E de amostras de solo rizosférico de 6 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, no Município de Sete Lagoas Ano 2 – Safra 2011/2012

Atividade H E

Genótipo Coleta 1

Coleta 2

Coleta 1

Coleta 2

Coleta 1

Coleta 2 MON 810 16.59 Aa 21.71 Bb 3.30 ns 3.38 ns 0.97 ns 0.98 ns

Isolinha 1 + Q 18.89 Aa 18.04 Aa 3.38 ns 3.40 ns 0.98 ns 0.99 ns

Isolinha 1 16.55 Aa 20.43 Ab 3.33 ns 3.39 ns 0.97 ns 0.99 ns

Bt11 16.92 Aa 21.50 Ab 3.29 ns 3.41 ns 0.96 ns 0.99 ns

Isolinha 2 + Q 16.94 Aa 21.26 Ab 3.28 ns 3.39 ns 0.96 ns 0.99 ns

Isolinha 2 21.59 Aa 18.27 Aa 3.38 ns 3.37 ns 0.99 ns 0.99 ns

HERCULEX 16.72 Aa 21.20 Ab 3.32 ns 3.38 ns 0.97 ns 0.99 ns



MON8034 15.22 Aa 21.52 Bb 3.32 ns 3.41 ns 0.97 ns 0.99 ns


Isolinha 4 21.09 Aa 23.12 Ab 3.37 ns 3.40 ns 0.98 ns 0.99 ns

DKB390 CINCO 14.89 Aa 16.25 Aa 3.19 A 3.39 B 0.94 ns 0.99 ns



IMPACTO VIPTERA 17.27 Aa 18.53 Aa 3.32 ns 3.39 ns 0.97 ns 0.99 ns

Isolinha 6 10.87 Aa 17.65 Ba 3.14 ns 3.38 ns 0.92 A 0.98 B


Letras maiúsculas comparam médias entre coletas – Scott-Knott a 5% Letras minúsculas comparam médias entre colunas (genótipos) – Scott-Knott a 5%

Tabela 3. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) e Equitabilidade – E de amostras de solo rizosférico de 6 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, no Município de Janaúna, MG Ano 2 – Safra 2011/2012

Atividade H E

Genótipo Coleta 1

Coleta 2

Coleta 1

Coleta 2

Coleta 1

Coleta 2 MON 810 16.66 A 21.01 B 3.42 ns 3.39 ns 1.00 ns 0.99 ns

Isolinha 1 + Q 17.17 A 19.76 A 3.41 B 3.37 A 0.99 ns 0.98 ns

Isolinha 1 13.19 A 20.58 B 3.38 A 3.41 B 0.99 ns 0.99 ns

Bt11 14.12 A 18.09 B 3.41 B 3.37 A 0.99 ns 0.98 ns

Isolinha 2 + Q 14.38 A 20.93 B 3.42 ns 3.41 ns 1.00 ns 0.99 ns

Isolinha 2 15.39 A 18.83 A 3.40 ns 3.38 ns 0.99 ns 0.98 ns

HERCULEX 16.92 A 20.45 A 3.42 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns


Isolinha 3 15.55 A 19.21 A 3.40 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns

MON8034 13.89 A 20.57 B 3.40 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns


Isolinha 4 15.06 A 22.15 B 3.40 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns

DKB390 CINCO 16.14 A 18.70 A 3.41 ns 3.39 ns 0.99 ns 0.99 ns


Isolinha 5 + Q 17.46 A 20.02 A 3.41 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns

IMPACTO VIPTERA 18.03 A 20.46 A 3.41 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns



Letras maiúsculas comparam médias entre coletas – Scott-Knott a 5%

Conclusões • Projeto 1: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas,

não tem causado mudanças significativas na atividade das enzimas Arginase, Fosfatase ácida e alcalina e Urease;

• Projeto 1: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas, não causou mudanças significativas no perfil metabólico de comunidades microbianas amostradas da rizosfera das plantas;

• Projeto 2: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas, causou mudanças significativas no perfil metabólico de comunidades microbianas amostradas da rizosfera das plantas no município de Sete Lagoas, mas não em Janaúba.

• Em sua maioria causando aumento na atividade metabólica da comunidade microbiana

Equipe

• Dra. Christiane Abreu de Oliveira Paiva

• Dra. Eliane Aparecida Gomes

• Dr. Francisco Adriano de Souza

• Dr. Ivanildo Evódio Marriel

• M.Sc. Ubiraci Gomes de Paula Lana

Avaliação comparativa da Biota do Solo em Feijoeiro Olathe Pinto e Olathe 5.1 modificado geneticamente

para resistência ao mosaico dourado

Maria Elizabeth Fernandes Correia

Embrapa Agrobiologia

Simbiose Feijoeiro/Rhizobium tropici

Micorrizas arbusculares

Solo sob influência do feijoeiro

Macro e mesofauna Biomassa microbiana Alfa-proteobactérias Atividade respiratória Atividade enzimática

Componentes investigados

Impacto do feijoeiro 5.1 sobre a biota do solo

Exsudados radiculares e tecidos vegetais senescidos podem alterar quantitativamente e qualitativamente os organismos do solo, e os processos em que estão envolvidos

Análise da rizosfera do feijoeiro

www.agencia.cnptia.embrapa.br Foto: Dr Itamar Soares de Melo

http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/

Locais de estudo áreas de cultivo de feijão

(2 ensaios em cada localidade – 2008/2009)

0-42 43-108 109-245 246-679 > 680 outros

Área em ha

Santo Antônio de Goiás

Sete Lagoas

Londrina

Conclusão

O feijoeiro 5.1, modificado geneticamente para resistência ao mosaico dourado, não afeta as simbioses com fungos micorrízicos e bactérias

fixadoras de N2, assim como a quantidade, qualidade e atividade da biota do solo rizosférico,

comparativamente ao feijoeiro convencional Olathe

Obrigada!!!

Apresentação -curso_biossegurança_og_ms_ch ristiane_microrganismos2

Documents

Transcript of Apresentação -curso_biossegurança_og_ms_ch ristiane_microrganismos2