Apostila Micro Polpa de Frutas Ad

ANLISE MICROBIOLGICA DE

POLPA DE FRUTAS

Profa. Dr

a. Hassa R. Cardarelli

2014

NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

As normas de segurana nos laboratrios de Microbiologia foram elaboradas com o objetivo de proteger a sade do pessoal do laboratrio e do pblico, assim como o meio ambiente, dos riscos associados exposio acidental a microrganismos e materiais biolgicos experimentais.

Os acidentes em laboratrio de Microbiologia, normalmente, ocorrem pela formao de aerossis, por respingos, pipetagens incorretas, injees, trabalhos com grandes quantidades e/ou concentraes elevadas de microrganismos, laboratrios superlotados de pessoal e material, infestao por roedores e insetos, entrada de pessoas no autorizadas. Para evitar a maior parte destes riscos, devem ser tomados cuidados especiais, desde a concepo geral e instalao do laboratrio.

As infeces por microrganismos em laboratrio de Microbiologia podem ocorrer atravs da pele, da via digestiva, da via respiratria e dos olhos e ouvidos.

As regras enumeradas a seguir constituem a base das prticas seguras de laboratrio e devem ser consideradas regulamento de trabalho. Sero apresentadas aqui as regras mais importantes, s quais podem ser acrescentadas outras, muitas delas especficas para cada laboratrio onde se trabalhe com agentes patolgicos especficos.

1. No se alimente, no beba ou fume, no guarde alimentos e no aplique cosmticos no recinto de trabalho;

2. No pipete com a boca qualquer tipo de material; proteja a ponta superior das pipetas com algodo antes da esterilizao;

3. O laboratrio deve ser mantido limpo e em ordem, devendo ser dele retirados quaisquer materiais que no tenham relao com o trabalho;

4. As superfcies de trabalho devem ser descontaminadas, pelo menos, uma vez por dia e sempre que ocorrer caso de derramamento de substncias potencialmente perigosas;

5. O pessoal de laboratrio deve lavar as mos antes de iniciar os experimentos, depois de haver manipulado materiais e animais infectados, e tambm ao deixar o laboratrio;

6. Conservar as mos longe da boca, nariz, olhos e rosto;

7. Deve ser evitado o uso de barba e os cabelos compridos devem estar sempre presos;

8. Todos os procedimentos devem ser efetuados de maneira a se evitar, ao mximo, a formao de aerossis;

9. As superfcies das bancadas devem ser recobertas com papel absorvente, sempre que exista a possibilidade de respingamentos de material perigoso;

10. As subculturas de microrganismos infecciosos devem ser feitas em capelas;

11. Todos os lquidos e slidos contaminados devem ser descontaminados antes de eliminados ou reutilizados. Os materiais esterilizados em autoclaves ou incinerados fora do laboratrio devero ser acondicionados em recipientes fechados, impermeveis e devidamente indentificados;

12. Use sempre avental ou uniforme enquanto estiver no laboratrio; estas roupas no devem sair do recinto de trabalho e devem ser desinfetadas por procedimentos adequados;

13. Sempre que for necessrio, proteja os olhos e o rosto de respingos ou impactos usando culos de segurana, escudos faciais, mscaras ou qualquer outro dispositivo de segurana;

14. As bancadas do laboratrio devem ter a superfcie muito lisa, de maneira a serem facilmente limpas e desinfetadas;

15. Somente devero ser autorizadas a entrar no laboratrio pessoas que tenham sido informadas sobre os possveis riscos e satisfaam os requisitos que se exigem para o acesso; durante o trabalho, as portas devem ser mantidas fechadas; somente tero acesso ao local, animais e pessoas autorizadas; no se deve permitir a entrada de crianas no laboratrio;

16. No se deve permitir a entrada no laboratrio, de animais que no tenham relao com os trabalhos que esto sendo efetuados;

17. Deve ser estabelecido um programa de luta contra os insetos e roedores;

18. As pipetas usadas devem ser imediatamente imersas em desinfetantes;

19. Em caso de respingos, cubra imediatamente a rea com desinfetantes;

20. Nunca umedea rtulos com a lngua; use gua ou rtulos auto-adesivos;

21. Use seringas e agulhas hipodrmicas somente para injeo parenteral, aspirao de lquidos dos animais de laboratrio e de vacinas contidas em frascos com tampas perfurveis. No as use para manipular lquidos infecciosos; nestes casos, devem ser empregadas pipetas automticas;

22. No empregue chumaos de algodo ao esvasiar uma seringa contendo ar ou excesso de lquido. Use um pequeno frasco cheio de algodo embebido em desinfetante;

23. Antes e depois de injetar materiais infecciosos em animais, esfregue o local da infeco com desinfetante;

24. Utilize seringas com acessrio especial para evitar que a agulha se separe da seringa;

25. Em todos os trabalhos nos quais existem possibilidades de contato direto acidental com sangue, material infeccioso ou animais infectados, devem ser usadas luvas. Estas luvas, antes de descartadas, devem ser esterilizadas em autoclaves;

26. Todos os derramamentos, acidentes e exposies reais ou potenciais por material infectado devem ser imediatamente notificados ao diretor do laboratrio. Devem existir protocolos escritos destes episdios, onde so previstas avaliaes, vigilncia e tratamento mdico apropriados;

27. Amostras de soro sanguneo de todo o pessoal do laboratrio e demais pessoas expostas aos riscos a ele inerentes, devem ser conservadas como referncia;

28. As centrfugas usadas para material contaminado ou infeccioso devem ser protegidas por anteparos;

29. Use para centrifugao somente tubos no danificados e tampados. Tenha a certeza de que o lquido contido no tubo no transbordar durante a centrifugao;

30. Culturas lquidas de organismos altamente infecciosos requerem cuidados especiais, pois, qualquer movimento que agite a superfcie do lquido, produzir aerossol; os liquidificadores do origem a pesados aerossis.

1 - Vidraria - Uso do Forno de Pasteur

Todo material de vidro, metal ou plstico que entrar em contato com o alimento deve ser esterilizado. Normalmente emprega-se o forno de Pasteur para esterilizar vidraria e material de metal e o xido de etileno ou irradiao para esterilizao de material plstico (normalmente comercializados j esterilizados, podendo ser usados uma s vez).

O forno de Pasteur trata-se de uma cabine de metal, com paredes isoladas termicamente, aquecido a eletricidade. Todo material de vidro ou metal a ser esterilizado deve ser mantido a 170-180 C, durante uma hora. Os frascos de vidro (erlenmeyers, tubos de ensaio, bales, provetas, etc.) devem ter sua boca protegida por um chumao de algodo hidrfobo recoberto por papel. Placas de Petri devem ser embrulhadas em papel antes de colocadas no forno, o mesmo acontecendo com pipetas (que devem ter um chumao de algodo hidrfobo na extremidade a ser colocada na boca), e demais utenslios (pinas, esptulas, etc.). Decorrido o tempo de esterilizao, deixar o forno esfriar por si s uma vez que sua abertura quando ainda quente poder danificar o material devido brusca variao de temperatura. Aconselha-se esterilizar o material necessrio na vspera do seu emprego.

2 - Meios de cultura

Com raras excees (determinada nas frmulas de preparo), todos os meios de cultura empregados numa anlise microbiolgica devem ser esterilizados.

Preparar os meios de cultura conforme instrues . Colocar um chumao de algodo hidrfobo na boca de cada frasco e cobrir com papel. Alguns meios de cultura especiais no podem ser autoclavados, devendo ser esterilizados por simples fervura ou em vapor fluente (autoclave aberta), ou ainda filtrados. Nunca se deve utilizar os meios de cultura na temperatura que saem da autoclave. Se necessrio abaixar a temperatura em gua corrente e manter os meios num banho-maria a 45-50 C at o instante do uso.

Uso da autoclave

Princpio de funcionamento: obteno de altas temperaturas por aquecimento de gua em recipiente fechado, sob presso.

Tcnica: colocar gua no fundo da autoclave, introduzir a cesta contendo o material a ser autoclavado, adaptar a tampa e fechar os parafusos, deixando a vlvula de escape de vapor aberta. Ligar a autoclave no mximo de intensidade. A princpio, haver expulso do ar contido na caldeira. Quando a gua comear a ferver haver sada de um jato intermitente de ar misturado com vapor de gua. Quando todo o ar for expulso, comear a sair, apenas, um jato contnuo de vapor de gua. Neste momento, fechar a vlvula de escape de vapor e observar o aumento de presso acusado pelo manmetro. Ao atingir a temperatura desejada, regular o aquecimento de modo que o ponteiro do manmetro fique estvel, mantendo-se neste nvel pelo tempo desejado. Decorrido este tempo, desligar a autoclave e esperar que a presso desa a zero e, ento, abrir a vlvula de escape de vapor. Quando no h mais sada de vapor, abrir a tampa e retirar o material.

I. PREPARO DO MATERIAL PARA UMA ANLISE MICROBIOLGICA

3 - Outros reagentes

Outros reagentes como solues tampes de diluio, gua, soluo de cidos ou lcalis, etc., precisam estar estreis se forem entrar em contacto com o alimento, podendo ser esterilizados na autoclave junto com os demais meios de cultura, ou ento filtrados em filtros de esterilizao.

Uso de filtros de esterilizao

Ex: Filtros tipo Millipore ou Nuclepore (de celulose).

Colocar a membrana de esterilizao no local adequado, e esterilizar todo o conjunto (Kitassato, funil, membrana, copo) na autoclave a 121 C, durante 30 minutos.

Colocar o lquido a ser esterilizado no copo do filtro, ligar a extremidade do Kitassato trompa d'gua (ou bomba de vcuo) e proceder a filtrao, que no deve demorar muito. Filtrado todo o lquido, transfer-lo assepticamente para um frasco previamente esterilizado.

1 - Alimentos slidos

Pesar, assepticamente, 25 g do alimento e homogeneizar com 225 mL de tampo diluente ou gua peptonada. *A homogeneizao pode ser feita em homogeneizador prprio para alimentos ou em liquidificador com o copo "higienizado" pela lavagem, por 3 vezes, com lcool 70% e posteriormente com gua destilada estril. Usar velocidade baixa para no aquecer a

mistura. Transferir a diluio 10-1 assim obtida para um frasco estril e proceder diluio

seriada decimal (1 mL da diluio 10-1 adicionado 9 mL de diluente, e assim por diante).

2 - Alimentos lquidos

Pipetar, assepticamente, 25 mL de alimento e transferir para um frasco contendo 225 mL de diluente e homogeneizar. Proceder diluio seriada como descrito acima.

*Preferencialmente, a homogeneizao deve ser feita em aparelho do tipo stomacher.

II. PREPARO DO ALIMENTO PARA ANLISE

III. METODOLOGIAS

1. ENUMERAO DE BACTRIAS AERBIAS MESFILAS

Meio de cultura: gar Padro para Contagem PCA

Vidraria esterilizada:

Placas de Petri Pipetas Alas de Drigalski

Estufas a 35-37 C Banho-maria a 45-50 C Contador de colnias

1.2.1. Preparar a quantidade necessria do gar para contagem padro (PCA), conforme instrues no frasco, calculando 15 a 20 mL para cada placa de Petri.

1.2.2. Efetuar a pesagem, homogeneizao e diluio seriada do alimento em diluente gua peptonada.

1.2.3. Procedimento

1.2.3.1. Bactrias aerbias mesfilas e termfilas

a) De cada diluio do alimento transferir 1 mL para placas de Petri esterilizadas.

b) Adicionar cerca de 20 mL de PCA, esfriado a 45 C, em cada placa semeada e homogeneizar girando suavemente as placas em movimentos na forma de oito.

c) Uma vez solidificado o gar, inverter as placas e incub-las a 35-37 C durante 48 horas, para as bactrias aerbias mesfilas e a 55 C durante 48 horas, para as bactrias aerbias termfilas.

1.2.3.2. Bactrias aerbias mesfilass

a) De cada diluio do alimento semear 0,1 mL na superfcie de placas contendo PCA. Espalhar com a ala de Drigalski. Incubar a 35-37 C durante 48 horas.

1.2.4. Enumerao

1.1. Material necessrio

1.2. Metodologia

a) Decorrido o tempo de incubao, selecionar as placas contendo 25 a 250 colnias e cont-las com o auxlio de contador.

b) Calcular o nmero de unidades formadoras de colnias de bactrias aerbias mesfilas por grama de amostra (UFC/g ou mL), multiplicando o nmero de colnias encontradas pelo inverso do fator de diluio.

Considerar o volume semeado para o clculo de UFC/g ou mL. Multiplicar pelo inverso da diluio e ainda por 10 (uso de 0,1 mL de amostra diluda).

1.3. Resultados

Expressar os resultados em Unidades Formadoras de Colnias por grama ou mL de alimento (UFC/g ou UFC/mL).

Em caso de se obter apenas placas com nmero inferior a 25 ou superior a 250 colnias, expressar os resultados como: Contagem estimada: UFC/g ou UFC/mL.

10-2 10-3

9 mL de diluente

1 mL 1 mL

PCA (Superfcie)

0,1 mL

Mesfilos 35-37C/48h

9 mL de diluente

PCA (Superfcie)

0,1 mL

Mesfilos 35-37C/48h

25g amostra

10-1 225 mL de diluente

Homogeneizao

PCA (Superfcie)

0,1 mL

Mesfilos 35-37C/48h

1.4. Esquema 25 g/25 mL da amostra

2. ENUMERAO DE FUNGOS

Meio de cultura: gar Batata Dextrose com Cloranfenicol


Placas de Petri Pipetas de 1 mL Basto de vidro Alas de Drigalski Banho-maria a 45 C Contador de colnias

2.2.1. Preparar a quantidade necessria de gar batata dextrose com cloranfenicol (adicionar ao meio de cultura pronto, aps resfriamento antes do plaqueamento), conforme instrues do frasco, e esterilizar em autoclave a 121 C durante 15 min. Distribuir o meio de cultura em placas de Petri esterilizadas.

2.2.2. Efetuar a pesagem, homogeneizao e a diluio seriada adequada da amostra.

2.2.3. Procedimento

a) De cada diluio do alimento, transferir 0,1 mL para a superfcie das placas de gar batata dextrose.

b) Espalhar com a ala de Drigalski.

c) Incub-las a 25 C, sem inverter, durante 3-5 dias.

d) Decorrido o perodo de incubao, selecionar as placas contendo entre 15 e 150 colnias e contar as colnias.

e) Determinar o nmero de colnias de fungos por grama ou mL de alimento, conforme o item 1.2.4.

2.3. Resultados

Expressar os resultados em Unidades Formadoras de Colnias por grama ou mL de alimento (UFC/g ou UFC/mL).


2.2. Metodologia

gar BD (superfcie) gar BD (superfcie)

Contagem total Contagem total

10-2 10-3

9mL de diluente 9mL de diluente

1 mL 1 mL

gar BD (superfcie)

0,1 mL 0,1 mL

25C/3-5dias

Contagem total

0,1 mL

25C/3-5dias 25C/3-5dias

25 g/ 25 mL amostra


Homogeneizao

2.4. Esquema

3. ENUMERAO DE COLIFORMES TOTAIS, COLIFORMES A 45 C (TERMOTOLERANTES) E DE Escherichia coli

Meios de cultura: Caldo Lauril Sulfato Triptose LST Caldo Bile Verde Brilhante 2% VB Caldo EC gar Eosina Azul de Metileno Levine

Banho-maria a 45 0,2 C (alimento) Banho-maria a 44,5 0,2 C (gua) Estufa a 35 C

3.1.2.1. Preparo do alimento para anlise

Efetuar a pesagem, homogeneizao e a diluio seriada do alimento. Preparar, no mnimo, 3 diluies decimais subsequentes.

3.1.2.2. Procedimento

Teste presuntivo para coliformes totais, coliformes termotolerantes e E. coli

a) De cada diluio do alimento, transferir alquotas de 1 mL para 3 tubos contendo o caldo Lauril Sulfato Triptose (LST). Homogeneizar atravs de agitao cuidadosa.

b) Incubar a 35 C durante 48 horas.

c) Decorrido o tempo de incubao, separar os tubos positivos, ou seja, os que apresentarem turvao do meio e gs no interior do tubo de Durham; dispensar os demais.

Teste confirmatrio para coliformes totais

a) Transferir, com o auxlio de ala, um inculo de cada tubo positivo de LST para outro tubo contendo caldo Bile Verde Brilhante (VB).


c) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gs no interior dos tubos de Durham) e anotar os resultados.

d) Utilizar a Tabela NMP adequada para calcular o "Nmero Mais Provvel" (NMP) de coliformes totais por grama ou mL de alimento.

3.1. Mtodo dos tubos mltiplos

3.1.1. Material necessrio:

3.1.2. Metodologia

Teste confirmatrio para coliformes termotolerantes e E. coli

Obs.: A legislao em vigor (Resoluo RDC 12 de janeiro de 2001) estabelece limites para coliformes a 45 C, sinnimo de coliformes fecais ou termotolerantes.

a) Transferir um inculo com o auxlio de ala de cada tubo positivo de caldo LST para outro tubo contendo caldo EC.

b) Incubar a 45 C 0,2 (alimento) ou 44,5 C 0,2 (gua) durante 24 horas.

c) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gs no interior dos tubos de Durham) e anotar os resultados.

d) Utilizar a tabela NMP adequada para calcular o "Nmero Mais Provvel" de coliformes a 45 C por grama de alimento.

Teste confirmatrio para E. coli

a) Semear, por estrias, os tubos positivos de caldo EC em gar Levine, de modo a obter colnias isoladas.


c) Observar o surgimento de colnias tpicas de E. coli, isto , de colorao negra, com brilho metlico esverdeado (este brilho pode estar ausente ou pouco visvel). Deve-se posteriormente fazer a confirmao bioqumica das colnias suspeitas atravs da srie IMViC (prova do indol, do vermelho de metila, de Voges-Proskauer e do citrato).

d) Expressar os resultados em NMP de E. coli/g ou mL do alimento consultando a tabela do NMP.

3.1.3. Tabelas

Tabela 1: Nmero Mais Provvel (NMP) e intervalo de confiana a nvel de 95% de probalidade, para diversas combinaes de tubos positivos e negativos na inoculao de 10 pores de 10 mL da amostra por tubo (APHA, 1985)

Intervalo de confiana (95%) (valores aproximados)

N de tubos positivos

NMP/100 mL

Mnimo Mximo

0

6 9,2 3,1 21,1 7 12,0 4,3 27,1 8 16,1 5,9 36,8 9 23,0 8,1 59,5 10 >23,0 13,5 Infinito

Tabela 2: NMP por grama e intervalo de confiana (95%), para sries de 3 tubos com 0,1, 0,01 e

0,001 g/mL de inculo.

Pos. tubes NMP/g

Conf. lim. Pos. tubes MPN/g

Conf. lim.

0.10 0.01 0.001 Low High 0.10 0.01 0.001 Low High

0 0 0 1100 420 --

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#tables

Multiplicao e produo de gs NMP coliformes a

45C

gar EMBA (Teste confirmativo

para E. coli)

9 mL de diluente

1 mL

10-2 10-3

9 mL de diluente

1 mL

35-37C/48h

Caldo LST (Teste

Presuntivo)

Multiplicao e produo de gs (tubos positivos)

1 alada

Caldo EC (Teste confirmativo para Coliformes a

45C)

Caldo VB (Teste confirmativo

para Coliformes Totais)

E. coli E. aerogenes

45/24h

35-37C/48h

1 ala

35-37C/24h

Multiplicao e produo de gs NMP coliformes

totais Citrato de Simmons

Caldo MR-VP

Caldo Triptona

VP (-) e VM (+)

35-37C/24h

35-37C/96h

35-37C/48h (VP)

35-37C/96h (VM)

Citrato (-)

Indol (-) ou (+)

25g amostra


1 ala

1 mL 1 mL 1 mL

Homogeneizao

3.1.4. Esquema

4. Pesquisa de Salmonella

Meios de cultura: Caldo Lactosado Caldo Rappaport-Vassiliadis RV Caldo Tetrationato TT gar Bismuto Sulfito BS gar Xilose lisina deoxicolato - XLD gar Lisina Ferro LIA (10) gar Trplice Acar Ferro TSI (21)


Placas de Petri Pipetas de 1 mL

Estufa a 35 C Contador de colnias

4.2.1. Pr-enriquecimento

Homogeneizar 25 g ou 25 mL do alimento com 225 mL de caldo Lactosado. Incubar a 35-37 C, por 18-24 horas.

Transferir 1 mL do homogeneizado para um tubo contendo 10 mL de caldo tetrationato e 0,1 mL para um tubo contendo 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis. Incubar o primeiro a 35 C e o segundo a 43 C em banho-maria por 24 horas.

Semear superficialmente por esgotamento os caldos de enriquecimento em placas de gar Bismuto Sulfito (BS) e Agar xilose lisina deoxicolato (XLD), de modo a obter colnias isoladas. Incubar a 35-37 C por 24 horas.

gar BS: as colnias podem ser de cor marrom, cinza ou preta; algumas vezes apresentam-se com brilho metlico.

gar XLD: as colnias so vermelhas e algumas com centros negros. O Agar se torna vermelho pela presena de Salmonella.


4.2. Metodologia

4.2.2. Enriquecimento

4.2.3. Semeadura em gar seletivo

4.2.4. Identificao de colnias suspeitas

4.2.5. Identificao bioqumica

Semear uma colnia em tubo contendo gar Trplice Acar Ferro (TSI), inclinado, e gar Lisina Ferro (LIA). Incubar a 35-37 C/24h.

TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo cido (amarelo), com ou sem produo de H2S (escurecimento do gar). Reao atpica em TSI que no deve ser descartada se as demais reaes em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cidos (amarelos), com ou sem produo de H2S.

LIA: fundo e rampa alcalinos (prpura, sem alterao da cor do meio), com ou sem produo de H2S (escurecimento do meio). Reao atpica em LIA que no deve ser descartada se as demais reaes em TSI se apresentarem tpicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produo de H2S.

4.3. Resultados

Expressar os resultados como ausncia ou presena de Salmonella spp. em 25 g ou 25 mL de alimento.

Homogeneizao

25g amostra

225 mL de caldo de pr-enriquecimento

Enriquecimento seletivo

Incubao 35-37C/18-24h 1 mL 0,1 mL

Caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) 10 mL Caldo Tetrationato (TT) 10 mL

35C/24h 43C/24h

gar BS gar XLD gar BS gar XLD 35-37C/24h

Identificao

gar TSI gar LIA

35-37C/24h

4.4. Esquema

1 - gar Bismuto Sulfito (BS)

Preparar conforme instrues no frasco.

Neste meio de cultura, sulfito de bismuto e verde brilhante inibem o crescimento de gram positivos e coliformes, permitindo o vigoroso crescimento de Salmonella. A produo de H2S ocorre devido presena de compostos de sulfurados no meio e o H2S gerado reage com o ferro contido no meio, formando um precipitado, gerando colnias caractersticas marrons ou negras, com brilho metlico. A reduo dos ons bismuto a bismuto metlico que confere brilho metlico s colnias. As colnias de Salmonella podem ser de cor marrom, cinza ou preta; algumas apresentam brilho metlico.

2 - gar Eosina Azul de Metileno (EMBA) - Levine


Esse meio possui uma combinao de eosina e azul de metileno como indicadores, permitindo uma ntida diferenciao de colnias fermentadoras e no fermentadoras de lactose. Os microrganismos lactose positivos podem produzir aldedos que, combinados aos corantes, originam cor caracterstica. E. coli aparece com centro escuro e caracterstico brilho verde metlico e outros coliformes produzem colnias rseas.

3 - gar Lisina Ferro (LIA)

Preparar conforme instrues do fabricante.

O meio de cultura contm, entre outros ingredientes, a seguinte composio:

Glicose fonte primria de energia L-lisina aminocido a ser descarboxilado Citrato frrico amoniacal e tiossulfato de sdio reveladores de H2S Prpura de bromocresol indicador de pH ( cido = amarelo, bsico = prpura)

A glicose, ao ser metabolizada, acidifica o meio tornando-o amarelo. Quando depletada a glicose, se a bactria produzir a enzima lisina-descarboxilase, a lisina ser degradada, dando origem a metablitos alcalinos e a cor do meio voltar a ser prpura. Ainda nesse meio, pode-se observar a produo de H2S, que reage com o ferro presente no meio, produzindo colorao negra. Tambm pode haver produo de gs a partir da glicose.

+ 4 gar Padro para Contagem (PCA)


um meio rico (contm triptona, extrato de levedura e dextrose) que permite o desenvolvimento de praticamente todas as bactrias presentes na amostra,

IV. MEIOS DE CULTURA

permitindo que se tenha uma medida quantitativa do nmero de bactrias. Este nmero importante porque d idia das condies de higiene e conservao do produto. Se variarmos a temperatura de incubao podemos avaliar a populao de bactrias psicrotrficas (7 C / 10d), mesfila (37 C / 48h) ou termfilas (45 C / 48h).

5 gar Trplice Acar Ferro (TSI)

Preparar de acordo com as instrues do fabricante.

O meio de cultura contm, entre outros ingredientes, a seguinte composio:

Glicose 1 g Lactose e Sacarose 10 g cada Citrato frrico amoniacal e tiossulfato de sdio reveladores de H2S Vermelho de fenol indicador de pH ( cido = amarelo, bsico = vermelho)

Este meio permite avaliar a capacidade de utilizao de lactose e sacarose com produo de gs (constatada pela presena de bolhas no meio de cultura), e ainda a produo de gs sulfeto (visualizada pela presena de um precipitado negro). Esse meio contm uma pequena quantidade de glicose e dez vezes mais de lactose. As Enterobacteriaceae e outros fermentadores de glicose metabolizam primeiramente a glicose, aerbia e anaerobiamente (tanto na superfcie do gar como na base), causando a acidificao do meio e consequente mudana de vermelho para amarelo (devido presena de indicador de pH vermelho de fenol), dentro de 6 h. Depois da utilizao da glicose, organismos fermentadores de sacarose ou lactose comearo a utilizar esses acares. Como a lactose est presente em alta concentrao, o organismo continuar produzindo cidos e o meio permanecer amarelo, aps 24 h de incubao (reao cido/cido, A/A). Se o organismo que est sendo testado no capaz de utilizar a lactose e/ou sacarose do meio, ele deve produzir energia, metabolizando as protenas e aminocidos presentes no meio. O metabolismo protico ocorre principalmente na superfcie do meio, onde o oxignio abundante. Os subprodutos da quebra da peptona (como por exemplo, amnia) so alcalinos e fazem com que a superfcie do meio se torne vermelha. A base permanece cida devido prvia fermentao da glicose. Essa reao chamada Alcalina/cida (K/A) Os organismos no fermentadores da glicose podem tambm produzir compostos alcalinos a partir de peptona, verificado na superfcie do meio.

6 gar xilose lisina deoxicolato (XLD)

O Agar XLD (Xilose Lisina Desoxicolato) um meio seletivo utilizado para o isolamento de Salmonella e Shigella a partir de amostras clnicas e alimentos, como recomendado pela ISO 6579: 2002. A recuperao de Salmonella e Shigella no ocultada pelo crescimento abundante de outras espcies, portanto o Agar XLD ideal para a anlise de amostras que contenham flora mista e com suspeita de abrigar patgenos entricos, por exemplo, espcimes clnicos ou em produtos alimentcios. Colnias vermelhas falso-positivo podem ocorrer com algumas espcies de Proteus e Pseudomonas. A incubao por mais de 48 horas podem levar a resultados falsos positivos.

O gar de XLD tambm um meio de diferenciao. Contm extracto de leveduras como fonte de nutrientes e vitaminas. Utiliza o desoxicolato de sdio como agente selectivo e, por isso, possui uma aco inibitria em relao aos microrganismos gram positivos. A xilose incorporada no meio uma vez que fermentada por praticamente todos os microrganismos entricos, exceto pelas Shigellae, e esta caracterstica permite a diferenciao das espcies de Shigella. A lisina includa de modo a permitir que o grupo de Salmonella seja diferenciado dos microrganismos no patognicos uma vez que, sem a lisina, as salmonelas rapidamente fermentariam a xilose, tornando-se impossvel distingui-las das espcies no patognicas. Depois das salmonelas terem acabado com a fonte de xilose, a lisina atacada atravs da enzima lisina decarboxilase, revertendo a um pH alcalino que imita a reaco da Shigella. De modo a evitar que se d uma inverso deste tipo por coliformes positivos lisina, adiciona-se lactose e sacarose para produzir cido em excesso. Para aumentar a capacidade de diferenciao da formulao, inclui-se um sistema de indicador de H2S, composto por tiossulfato de sdio e citrato de amnia frrico, para a visualizao do sulfeto de hidrognio produzido, resultando na formao de colnias com centros pretos. Os produtores de H2S no patognicos no decarboxilam a lisina; assim, a reaco cida que produzem impede que as colnias se tornem negras, o que acontece apenas com um pH neutro ou alcalino. Preparar de acordo com as instrues do fabricante.

7 - gua Peptonada a 0,1%

peptona 1 g gua destilada 1 litro

Dissolver a peptona na gua destilada. Ajustar o pH a 7,0 0,2. Autoclavar a 121 oC durante 15 minutos.

Diluente para homogeneizao e diluio de amostras para a anlise.

8 Caldo Bile Verde Brilhante 2% (VB)

Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo, introduzindo um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.

Serve como agente inibitrio de microrganismos gram positivos e dos no fermentativos. Contm sais biliares e o corante verde brilhante, sendo mais seletivo que o LST e, permitindo a confirmao da presena de coliformes totais. Novamente neste caldo observada a produo de gs a partir de lactose, dentro de 48 h a 35 C.

9 - Caldo EC


Consiste de um caldo lactosado tamponado, contendo 0,15% de sais biliares. Nesse meio inibido o crescimento de organimos formadores de esporos e de

estreptococos fecais, enquanto que o crescimento de Escherichia coli favorecido. A temperatura de incubao (44,5 C/24h) tambm favorece o desenvolvimento de E. coli. A turvao do meio com produo de gs (devido fermentao da lactose), indica prova positiva para a presena de coliformes fecais.

10 Caldo Lactosado

Extrato de carne 3,0 g Peptona 5,0 g Lactose 5,0 g gua Destilada 1000 mL

Misturar os ingredientes, ajustar o pH para 6,9 0,2. Autoclavar a 121 C por 15min.

11 Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)


O LST possui alguma seletividade para organismos coliformes devido presena do surfactante lauril sulfato, mas ainda permite a recuperao de bactrias que possam estar injuriadas (expostas a condies adversas como a presena de cloro, por exemplo). Para anlise de gua utiliza-se 10 tubos com 10 mL de LST dupla concentrao, contendo um tubo invertido (tubo de Durham), que aprisionar o gs que poder ser produzido a partir da fermentao da lactose presente no meio de cultura. Os tubos inoculados so incubados a 35 C/48 h e so observados para a produo de gs.

12 Caldo Rappaport-Vassiliadis (RV)

Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo

Contm verde malaquita, cloreto de magnsio e um baixo pH (5,1) como agentes inibidores, permitindo a seleo de membros do gnero Salmonella. Esse meio explora a capacidade de Salmonella sobreviver a presses osmticas relativamente altas e apresentar capacidade de multiplicao em baixos pHs, maior resistncia ao verde malaquita, e menores requerimentos nutricionais. importante que o tamanho do inculo seja pequeno o suficiente para no interferir na seletividade (1:100).

13 Caldo Tetrationato (TT)

Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo de ensaio. No autoclavar. No instante do uso, adicionar 0,1 mL de uma soluo de verde brilhante 1:1000 e 0,2 mL da seguinte soluo de lugol:

iodo 6 g iodeto de potssio 5 g gua destilada 20 mL

O meio de cultura contm a seguinte composio: proteose peptona, sais biliares, tiossulfato de sdio, carbonato de clcio, verde malaquita e iodo-iodeto de potssio.

A efetividade do meio na inibio de coliformes decorrente da presena de ons tetrationato (S4O6

--) originrios do tiossulfato presente na formulao deste meio. Organismos que possuem a enzima tetrationato redutase crescem nesse meio, por exemplo, Salmonella e Proteus. Os sais biliares inibem os organismos que no vivem no intestino e o carbonato de clcio netraliza os produtos cidos da decomposio do tetrationato. Atuam ainda, como agentes seletivos o verde malaquita e o iodo-iodeto de potssio.

Dos caldos de enriquecimento secundrio (TT e RV), com auxlio de uma ala de nquel cromo, so estriadas placas de gar Rambach (RAM), gar Hektoen Enteric (HE) e gar sulfito de bismuto (BSA) ou tambm Agar xilose lisina deoxicolato (XLD).

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