AÇÕES INTEGRADAS DE CONTROLE DIMINUEM A … · Anopheles Darlingi e a incidência de malaria em...

AÇÕES INTEGRADAS DE CONTROLE DIMINUEM A POPULAÇÃO DE ANOPHELES DARLINGI E A INCIDÊNCIA DE MALÁRIA EM UMA

ÁREA DE TRANSMISSÃO INSTÁVEL NA AMAZÔNIA RURAL BRASILEIRA

KEILLEN MONICK MARTINS CAMPOS

Manaus – AM 2013

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS

FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

i


AÇÕES INTEGRADAS DE CONTROLE DIMINUEM A POPULAÇÃO

DE ANOPHELES DARLINGI E A INCIDÊNCIA DE MALÁRIA EM UMA

ÁREA DE TRANSMISSÃO INSTÁVEL NA AMAZÔNIA RURAL

BRASILEIRA

Orientador: Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro

Co-Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda

Manaus – AM

2013

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Medicina Tropical da

Universidade do Estado do Amazonas

em convênio com a Fundação de

Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira

Dourado, para obtenção do titulo de

Mestre em Doenças Tropicais e

Infecciosas.

Ficha catalográfica elaborada por

Maria Eliana N. Silva – CRB- 11/248

C198a Campos, Keillen Monick Martins Campos.

Ações integradas de controle diminuem a população de

Anopheles Darlingi e a incidência de malaria em uma área de

transmissão instável na Amazônia rural / Keillen Monick

Martins Campos. -- Manaus: Universidade do Estado do

Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2013.

X, 92 f. : il.

Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em

Doenças Tropicais e Infecciosas – UEA/FMT, 2013.

Orientador: Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro .

1. Malária 2.Anopheles Darlingi I. Título.

CDU: 616.92

ii

FOLHA DE JULGAMENTO

AÇÕES INTEGRADAS DE CONTROLE DIMINUEM A POPULAÇÃO DE

ANOPHELES DARLINGI E A INCIDÊNCIA DE MALÁRIA EM UMA ÁREA DE

TRANSMISSÃO INSTÁVEL NA AMAZÔNIA RURAL BRASILEIRA


“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”. Banca Julgadora:

_______________________________ Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro

Presidente

__________________________________ Prof. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa

Membro

_______________________________ Prof. Dr. Felipe Arley Costa Pessoa

Membro

iii

DEDICATÓRIA

À minha mãe Miracelma Queiroz,

Pelo seu companheirismo, honestidade, sinceridade, por seu amor

incondicional. Por sempre acreditar em mim estando comigo nos momentos em que

preciso de um abraço ou até mesmo de uma palavra de conforto. Por ser meu maior

exemplo de mulher moderna que sabe ter seu foco sem ter medo dos problemas

que possam vir com o dia a dia. Por ser minha inspiração e por me fazer sempre

sorrir e com isso deixando com ela meu melhor sorriso, meu melhor abraço, a

melhor parte de mim.

E não poderia deixar de citar uma música que ressalta o meu amor por ela

“Como é grande o meu amor por você (Roberto Carlos)”.

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por seu amor infinito e por me dar força para enfrentar os problemas

com os quais me deparei.

À minha mãe, Miracelma Queiroz, por ser meu porto seguro, meu aconchego,

por dividir comigo os momentos de tristezas e felicidades.

À minha mãezinha Creuza Queiroz, por ser parte fundamental da minha vida,

por ser alicerce e ser compreensiva nos momentos mais chatos dessa fase.

A meu orientador, Prof. Dr. Wuelton Monteiro, por sua paciência, por seus

ensinamentos, por sempre ter tempo para tirar as dúvidas, pela atenção no trabalho

comigo.

A meu co - orientador, Prof. Dr. Marcus Lacerda, por sua confiança e acreditar

no meu trabalho, pela presença constante e compreensão.

Ao Prof. Dr. Tadei, por ter aberto às portas do seu Laboratório de Malária e

Dengue (INPA) e me proporcionar muitos momentos de conhecimento.

Ao seu Nelson Fé e a técnica do laboratório da Entomologia Íria Cabral que

fizeram as coletas e identificação dos anofelinos estudados no trabalho.

A equipe de trabalho André Siqueira, Sheila Vítor, Roberto que trabalharam

juntos e deram informações importantes sobre a incidência de Malária a partir do

estudo com os pacientes.

Aos microscopistas, Juscelino Torres dos Santos, Eliana Lima e Irailton dos

Santos pelo trabalho importante na leitura das lâminas.

A Gerência de Malária, as amigas Teresa Sanchez, Daniele de Araújo,

Larissa Brasil, Anne Almeida, Siuhelem Rocha pela amizade e por vezes me

v

ajudarem na contagem dos anofelinos e a Giselly Melo por ter me ensinado a parte

molecular de PCR em tempo real e pela paciência e presteza.

Ao Laboratório de Malária e Dengue do INPA, as amigas Erika Gomes,

Rochelly Mesquita, Rejane Simões, Lorena Coelho, Rafaela Bordalo e aos demais

que me ajudaram no insetário e a Waléria Dasso por ter me ensinar a trabalhar a

parte molecular, a extração de DNA dos mosquitos e em especial pela amizade

conquistada.

Aos amigos do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, pelas

ótimas tardes que passamos juntos ganhando conhecimento.

Aos funcionários da secretaria do Programa de Pós-Graduação em Medicina

Tropical, por sempre estarem disponíveis em nos ajudar.

A todos que indiretamente me ajudaram na realização do trabalho.

vi

RESUMO

Estudos sobre o comportamento de vetores e da avaliação da eficácia das medidas de controle na proteção contra a malária em áreas endêmicas, como na América Latina, onde predomina o Plasmodium vivax devem ser realizados devido à presença do Anopheles darlingi e da grande incidência de malária nesses locais. Este trabalho tem como objetivo investigar a fauna de anofelinos e verificar o impacto do manejo integrado de vetores em dois projetos de colonização agrícola no município do Careiro, na Amazônia Ocidental Brasileira. Foram realizadas quatro capturas de mosquitos de agosto entre 2008 a março de 2010, com um intervalo de seis meses entre cada uma. Desde setembro de 2009, um grande programa para reduzir a malária começou nas comunidades do Panelão e Céu Azul, com a distribuição de mosquiteiros impregnados com inseticida (MII) e intensificação da pulverização residual interna (PRI). Foram utilizados como desfecho para estimar as medidas de controle da malária, a taxa de picadas homem/hora (TPHH), taxas de inoculação entomológica (TIE), taxa de incidência de malária (TIM) e a prevalência do Plasmodium. Foram coletados 3.189 anofelinos, pertencentes a 13 espécies. O Anopheles darlingi foi a espécie predominante no período (42,6%), seguida de Anopheles albitarsis (38,4%). An. darlingi demonstrou uma TPHH com tendência decrescente desde o início até ao final do estudo. De maneira inversa, An. albitarsis aumentou a sua contribuição na TPHH geral ao longo do estudo. Para o An. darlingi houve uma correlação positiva significativa entre TPHH e TIM (p=0,002). A TPHH para o An. albitarsis mostrou uma correlação negativa significativa com o TIM correspondente (p=0,045). A TIE de todos os anofelinos e de An. darlingi e An. albitarsis apresentaram padrões decrescentes nas coletas sucessivas. Quatro espécies de anofelinos (An. darlingi, An. albitarsis, Anopheles braziliensis e Anopheles nuneztovari) foram encontradas naturalmente infectados com Plasmodium, embora a taxas de infecção fossem muito baixas. Houve uma diminuição na TIM para malária vivax e falciparum, e na prevalência de infecções por P. vivax e P. falciparum durante o período de estudo. Existe uma forte evidência de associação entre a densidade de An. darlingi com a incidência de malária nos locais de estudos, ressaltando a importância deste vetor na transmissão da malária na região do estudo. A susceptibilidade de An darlingi frente ao controle usando MII e PRI foi alta nos assentamentos rurais estudados.

Palavras-chave: Malária, Anopheles darlingi, mosquiteiros impregnados,

pulverização residual interna, Amazonas.

vii

ABSTRACT

Studies on vector behaviour should be conducted in order to evaluate the effectiveness of vector control measures on malaria protection in endemic areas of Latin America, where P. vivax predominates. This work aims to investigate the fauna of anopheline mosquitoes and verify the impact of integrated vector management in two colonization projects in the Careiro Municipality, Western Brazilian Amazon. Four mosquitoes’ captures were carried out from August 2008 to March 2010, with an interval of six months between each collection. Since September 2009 a large programme to reduce the burden of malaria hás started in the two communities by distribution of insecticide-treated bed nets (ITN) and intensification of indoor residual spraying (IRS). Human biting rates (HBRs), entomological inoculation rates (EIRs), malaria incidence rate (MIR) and Plasmodium carrier’s prevalence were used as outcomes to estimate the impact of the control measures. Results: A total of 3,189 anophelines were collected, belonging to 13 species. Anopheles darlingi was the predominant species in the period (42.6%), followed by Anopheles albitarsis (38.4%). An. darlingi HBRs showed a notable decreasing trend from the start to the end of the study. Conversely, An. albitarsis increased its contribution to overall HBRs throughout the study. For An. darlingi there was a significant positive correlation between HBRs and MIR (p=0.002). Anopheles albitarsis HBRs showed a significant negative correlation with the corresponding MIR (p=0.045). EIR from total anophelines and from An. darlingi and An. albitarsis presented decreasing patterns in the successive collections. Four species of anophelines (An. darlingi, An. albitarsis, Anopheles braziliensis and Anopheles nuneztovari) were naturally infected with Plasmodium, albeit at very low infection rates. There were a decrease in the MIR for both vivax and falciparum malaria and in the prevalence of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum carriers during the period of study. Conclusions: There is strong evidence of association between the density of An. darlingi and the incidence of malaria in the studies sites, further highlighting the importance of this vector in malaria transmission in this region. An. darlingi susceptibility to control using ITN and IRS is likely to be high in the rural settlements studied.

Keywords: Malaria, Anopheles darlingi, Impregnated bed nets, Indoor residual spraying, Amazon.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Países e áreas afetados pela malária em 2010............................................... 1

Figura 02: Distribuição espacial da endemicidade do Plasmodium vivax em 2010........... 4

Figura 03: Mapa Regional mostrando a distribuição das espécies de vetores da Malária

no Continente Americano................................................................................................... 6

Figura 04: Seleção dos domicílios para o estudo............................................................. 14

Figura 05: Coleta intra e peridomicílio e Identificação dos Anofelinos............................. 15

ix

SUMÁRIO

1. Introdução................................................................................................................ 1

1.1 Epidemiologia da Malária........................................................................................ 1

1.2 Agente etiológico..................................................................................................... 3

1.3 Principais vetores.................................................................................................... 5

1.4 Controle de Malária no Brasil................................................................................. 7

2. JUSTIFICATIVA....................................................................................................... 10

3. OBJETIVOS............................................................................................................. 11

3.1 Objetivo Geral......................................................................................................... 11

3.2 Objetivos Específicos.............................................................................................. 11

4. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................ 12

4.1 Área de Estudo........................................................................................................ 12

4.2 Seleção dos domicílios............................................................................................ 13

4.3 Coleta de Anofelinos............................................................................................... 14

4.4 Extração de DNA - Chelex 100 resina............................................................. 16

4.5 Precipitação do DNA.............................................................................................. 16

4.6 Detecção da Infecção............................................................................................. 16

4.7 Controle vetorial..................................................................................................... 16

4.8 Estudos epidemiológicos........................................................................................ 17

4.9 Análise dos dados.................................................................................................. 17

4.10 Considerações Éticas........................................................................................... 18

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................... 19

6. CONCLUSÃO.......................................................................................................... 48

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 49

8. ANEXOS................................................................................................................... 55 8.1 Anexo A - Termo Consentimento Livre e Esclarecido........................................... 55

8.2 Anexo B - Aprovação do CONEP........................................................................... 58

8.3 Anexo C – PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO..................................... 61

1

1.1 Epidemiologia da Malária

A malária é uma doença infecciosa, causada por protozoários do gênero

Plasmodium e transmitida aos humanos por picadas de mosquitos infectados do

gênero Anopheles, sendo o Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi a principal espécie

no Brasil (20). Nas Américas, três espécies de protozoários causam a malária em

seres humanos: Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum e Plasmodium malariae

(33).

A carga global de doenças parasitárias é um problema de proporções

enormes, especialmente nos países em desenvolvimento (56). Esta doença continua

sendo um dos mais importantes problemas de saúde pública em todo o mundo, com

cerca de 3,3 bilhões de pessoas em risco de contraí-la e 655 mil óbitos estimados

anualmente, principalmente em crianças menores de cinco anos (62). A

Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que cerca de metade da população

mundial estivesse em risco de contrair malária em 2010 (60) (Figura 1). Dados da

OMS estimam ainda que haja entre 70 e 80 milhões de casos por ano de malária

decorrentes da infecção pela espécie Plasmodium vivax. As maiores prevalências

são observadas no Sul e Leste da Ásia (52%), Leste do Mediterrâneo (15%) e

América do Sul (13%) (37, 48).

Figura 01: Países e áreas afetados por Malária em 2010 (60).

Países e territórios afetados por Malária em 2010

2

Na América Latina (AL), cerca de 170 milhões de pessoas vivem em risco de

adquirir uma infecção por Plasmodium vivax ou Plasmodium falciparum, em 21

países (26). Aproximadamente 60% dos casos de malária nas Américas são

notificados no Brasil, onde 99,8% dos casos são relatados na Amazônia (42).

No ano de 2010, o estado do Amazonas notificou 74.130 casos de malária

(73.291 autóctones), correspondendo a 22,7% do total de casos notificados da

Amazônia Legal. Em comparação com 2009, o estado apresentou decréscimo de

27,6% (40).

Em 2010, 15 municípios do estado estavam entre os municípios que

contribuíram com 80% dos casos de malária na Amazônia Legal, sendo eles

Manaus, São Gabriel da Cachoeira, Eirunepé, Atalaia do Norte, Coari, Barcelos,

Tabatinga, Manicoré, Tefé, Lábrea, Borba, Tapauá, Rio Preto da Eva, Itacoatiara e

Guajará (40).

Segundo a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-

HVD), situada em Manaus, que funciona como um centro de referência para as

pesquisas científicas em doenças tropicais e infecciosas no Estado do Amazonas,

no ano de 2012 foram realizados 18.533 exames em pessoas que apresentavam

quadro clínico febril, tidas como casos suspeitos de malária. Destas, por meio do

exame da gota espessa em sangue periférico, 3.434 tiveram exames positivos,

confirmando a presença do protozoário (21).

Por ser uma doença tipicamente tropical a malária necessita de todos os

fatores envolvidos no seu ciclo para se manter endêmica. Geralmente essas

condições são próximas à florestas, onde reside o vetor, assim como a presença de

pessoas infectadas que podem ser portadores assintomáticos ou sintomáticos (59).

As áreas de alta transmissão têm como características epidemiológicas

floresta tropical úmida que favorece a transmissão perene e focalmente intensa,

principalmente em grupos de trabalhadores expostos, alta prevalência de P.

falciparum geralmente resistente a antimaláricos e populações migrantes com

3

escassa imunidade, expostas às altas densidades de Anopheles darlingi, dentro e

fora de moradias precárias que não oferecem proteção (22).

As áreas de menor risco de transmissão correspondem à floresta menos

densa por ocupação humana mais antiga; população residente com maior

imunidade; migração localizada especialmente e de áreas rurais a urbanas;

habitações mais protetoras com as densidades menores de Anopheles darlingi,

localizadas principalmente nas margens dos grandes rios; transmissão estacional

com reativação focal; predomínio de Plasmodium vivax; infra-estrutura social mais

desenvolvida, com maiores facilidades de comunicação (22).

O incremento do número de casos de malária no mundo ao longo dos anos se

deve, principalmente, ao aumento de resistência dos parasitos aos antimaláricos, ao

desenvolvimento de resistência dos mosquitos aos inseticidas e à falta de uma

política econômica e social nas regiões onde ocorre alta transmissão da doença (5).

1.2 Agente etiológico

Cinco espécies de Plasmodium são parasitas de seres humanos: Plasmodium

falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax e

Plasmodium knowlesi. Destes, P. falciparum e P. vivax estão associadas à

morbidade e mortalidade por malária (16).

Das cinco espécies de protozoários causadores da malária humana, o P.

vivax é a espécie que apresenta maior distribuição mundial, sendo responsável por

mais de 50% dos casos humanos diagnosticados fora da África, incluindo a Ásia, as

Filipinas e as Américas Central e do Sul (4, 5, 37). Esta espécie de parasito tem

como característica biológica o desenvolvimento de hipnozoítos, que são formas

hepáticas latentes que podem desencadear recaídas após uma infecção anterior,

tornando o seu portador um potencial reservatório de gametócitos. Como

consequência, na medida em que as técnicas de controle da doença se tornam mais

efetivas, a infecção pelo P. vivax tende a sobrepor aquela causada pelo P.

falciparum (31, 44).

4

Cerca de 44 milhões de quilômetros quadrados são endêmicos para o P.

vivax no mundo ilustrado na figura 02, representando cerca de um terço da

superfície terrestre do planeta. Metade dessa área está localizada na África (51%) e

o restante nas Américas (22%) e Ásia (27%). No entanto, a distribuição desigual das

populações mundiais, juntamente com a influência protetora do fator Duffy negativo

na África, faz com que a distribuição de populações em risco seja muito diferente.

Estima-se que 2.480 milhões de pessoas vivam em risco de se infectar por esse

Plasmodium (26).

Figura 02: Distribuição espacial da endemicidade do Plasmodium vivax em 2010, segundo Gething et al. (24).

O P. vivax é responsável pela maioria dos casos de malária no Brasil. No

entanto, nem sempre essa espécie foi predominante. O P. falciparum foi o mais

prevalente até a década de 80, quando o número de casos de P. vivax começou a

aumentar. Em 1988, a incidência relativa dessas duas espécies era de

aproximadamente 50% em cada uma. Essa relação mudou a partir de 1990, quando

P. vivax começou a predominar (44,3% dos casos eram devidos ao P. falciparum).

5

Em dados de 2008, observa-se que aproximadamente 85% dos casos de malária no

Brasil foram causados por P. vivax (38, 42). Os parasitas da malária que circulam na

região Amazônica são o P. falciparum, P. vivax e P. malariae (46).

1.3 Principais Vetores

Os protozoários da malária humana são transmitidos por mosquitos do gênero

Anopheles, que incluem 465 espécies descritas (27). Aproximadamente 70 destas

espécies tem a competência vetorial de transmitir os protozoários da malária

humana (53) e 41 são consideradas como vetores dominantes deste complexo de

espécies, capazes de transmitir a malária a um nível importante para a saúde pública

(54).

No Continente Americano, como está demonstrado na Figura 03 (54), mostra

a distribuição dos anofelinos no Continente Americano, sendo o An. freeborni

encontrado no noroeste e An. quadrimaculatus no sudeste, com alguma

sobreposição mínima de An. pseudopunctipennis no sul do continente. Na América

do Sul, o An. darlingi é mostrado como o vetor dominante. Na América Central, onde

An. darlingi está presente de forma mais esparsa, seu domínio é substituído por An.

albimanus e An. pseudopunctipennis. Outro anofelino é o Anopheles aquasalis,

presente em áreas costeiras da América Central e América do Sul, que não é

considerado um vetor eficiente, mas com grande capacidade de oviposição,

apresentando a utilização dos habitats salinos como característica de suas larvas

(54).

Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root, 1926 é um importante vetor de

malária humana nas Américas do Sul e Central, sendo que no Brasil, ele é

responsável por praticamente toda a transmissão da doença no interior do país (15,

51, 58). Possui ampla distribuição geográfica, estendendo-se desde o sul do México

até o norte da Argentina, e das vertentes orientais da Cordilheira dos Andes até as

margens do Oceano Atlântico. Esta espécie é descrita nas regiões tropicais e

subtropicais das Américas Central e do Sul, especialmente em áreas de baixa

altitude, preferindo grandes massas de água em áreas florestais (19).

6

Figura 03: Mapa Regional mostrando a distribuição das espécies de vetores da Malária no Continente Americano (54).

O An. darlingi está distribuído em cerca de 80% de todo território nacional (42)

e dados epidemiológicos demonstram que, mesmo após a prática de controle, a

densidade de An. darlingi, assim como em outros mosquitos, mantém-se alta em

localidades onde ocorrem os registros da malária na região (58). É o vetor principal

da malária no Brasil (15, 51, 57, 58), sendo altamente suscetível à infecção por

Plasmodium sp., altamente antropofílico e e com comportamento endofágico (11, 32,

57). O desenvolvimento das formas imaturas pode ocorrer em criadouros naturais de

diferentes características como rios, lagoas, açudes e represas formados nas curvas

dos rios onde há pouca correnteza (58), de preferência aquelas profundas, limpas,

ligeiramente nubladas, ensolaradas ou parcialmente sombreadas, escondidas entre

a vegetação ou detritos (35, 49).

Este anofelino é capaz de manter uma transmissão elevada de malária,

mesmo quando encontrados em densidades baixas. Esta espécie de mosquito é

7

considerado um excelente vetor, apesar das baixas taxas de infecção mesmo em

áreas de alto risco de malária (14). O An. darlingi tem relativamente elevada

susceptibilidade à infecção por Plasmodium sp. quando comparado com outras

espécies amazônicas (29). Entre os casos de malária, mesmo os assintomáticos

apresentando-se com parasitemias muito baixas podem ser infecciosos para An.

darlingi, mesmo que seja a uma taxa muito mais baixa do que para os casos

sintomáticos (1). A descoberta submicroscópica, mas altamente infecciosa, de baixa

densidade de gametócitos de Plasmodium sp. pode ser uma explicação adicional

para as infecções relativamente contínuas na Amazônia (52).

Embora o An. darlingi predomine em regiões endêmicas brasileiras, outras

espécies de anofelinos também têm sido implicados como vetores da malária em

diferentes localidades da Amazônia, especialmente Anopheles albitarsis senso latu,

Anopheles nuneztovari e Anopheles triannulatus (11, 23, 45, 47). Em algumas

regiões do Brasil, os vetores de secundários, principalmente An. albitarsis podem

invadir casas e se alimentar em humanos. No entanto, na maior parte de seu

território, incluindo o nordeste seco e as áreas centrais, este anofelino é exofílico e

zoofílico, preferindo atacar o gado (14).

1.4 Controle da Malária no Brasil

O uso de medidas de prevenção contra a malária, como o uso de

mosquiteiros impregnados com inseticidas e de redes impregnadas com inseticidas

de longa duração, por populações que vivem em países endêmicos para a malária

tem sido um aspecto chave das metas estabelecidas no plano de ação global da

malária para 2015 (25, 34) e é fundamental para alcançar as metas estabelecidas

pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e da Parceria Roll Back Malaria (25, 34,

61). O impacto do uso de mosquiteiros impregnados tem sido mostrado na redução

da mortalidade e morbidade da malária (8, 25), através de campanhas de

distribuição em massa (25, 34, 61).

Avaliar o impacto das diferentes estratégias de controle sobre a redução da

malária é uma tarefa importante. No entanto, é uma tarefa extremamente complexa

e apresenta custos elevados. Além disso, as alterações positivas provavelmente não

8

resultam somente das estratégias de controle, mas também são o resultado de uma

combinação de fatores que incluem mudanças nas condições ambientais e

epidemiológicas que determinam a transmissão da malária (18).

Até o início da década de 1990, o controle da malária era realizado por meio da

utilização do dicloro-difenil-tricloroetano (DDT), inseticida de ação residual. Este

inseticida foi a principal medida adotada juntamente com uso de drogas

antimaláricas para o controle do vetor na década de 1960, utilizado em ciclos

semestrais de borrifação em domicílios. Esta estratégia visava prevenir a

mortalidade, reduzindo a morbidade e aliviando as perdas sociais e econômicas

produzidas pela malária. O uso do DDT no Brasil estendeu-se até 1992, quando foi

suspenso devido à ação indiscriminada em áreas ambientais, que atingiam tanto as

pragas quanto a fauna e a flora (39, 50).

Promovido pela Organização Mundial de Saúde, a partir de 1993, os antigos

programas de erradicação da doença foram substituídos pelo Programa de Controle

Integrado da Malária (PCIM), que inclui o tratamento do doente e o combate ao

mosquito. No Brasil, o Programa Nacional de Controle da Malária (PNCM) tem por

objetivos o diagnóstico, tratamento imediato e a eficácia dos casos (7, 39).

Muitos esforços a fim de controlar a população de vetores foram colocados

em prática, tais como o uso de mosquiteiros impregnados, pulverização residual de

interiores e limpeza do ambiente (3). É importante salientar que a eficácia de tais

ferramentas ainda não foi avaliar de uma forma integrada, em parte devido à falta de

informação de base sobre o comportamento natural dos An. darlingi e vetores

secundários relacionados com a transmissão da malária na Bacia Amazônica. Como

vetores de malária são capazes de se adaptar a diferentes condições ambientais

(inclusive os assentamentos recentemente ocupados), os estudos entomológicos

deveriam ser uma prática rotineira, apoiando medidas de controle vetorial.

No sul da Bacia Amazônica, a malária está concentrada em assentamentos

agrícolas e áreas de atividade de mineração (13). A ocupação recente destas

localidades resulta numa mudança da paisagem que favorece grandes densidades

9

de anofelinos (41), que, em associação com a chegada de pessoas não-imunes,

tendem a aumentar o risco de transmissão (9, 10, 13).

Mosquiteiros impregnados com inseticida têm demonstrado proteção contra a

malária em algumas partes do mundo, em especial na África subsariana (30),

mesmo quando as redes sofriam estragos.

A ineficácia das vacinas, a resistência do Plasmodium às drogas e de insetos

a inseticidas indica a necessidade de descobrir novas estratégias para combater

esta doença (2).

10

1. JUSTIFICATIVA

Apesar das diversas campanhas de controle de malária no Brasil, esta

doença ainda é considerada um dos mais importantes problemas de saúde pública

na Região Amazônica.

A doença é transmitida através da picada de mosquitos fêmeas do gênero

Anopheles, sendo o An. darlingi o principal vetor no Brasil, sendo altamente

susceptível a infecção do Plasmodium sp. E apresentando comportamento

antropofílico e endofágico. A espécie é considerada um excelente vetor, apesar das

baixas taxas de infecção mesmo em áreas de alto risco de malária.

O programa de controle de malária tem utilizado medidas de controle como o

uso de mosquiteiros impregnados, pulverização residual e o uso de inseticidas como

ferramentas que possam contribuir para o controle de vetores. Porém, existem

poucos estudos na Amazônia Brasileira abordando o efeito das medidas integradas

de controle sobre a incidência de malária, aliadas ao estudo da dinâmica da fauna

de anofelinos.

11

2. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar as medidas integradas de controle na diminuição da população de

Anopheles darlingi e na incidência de malária nas Comunidades do Panelão e Céu

Azul.

3.2 Objetivos Específicos

- Verificar a composição e a densidade da fauna de anofelinos;

- Verificar se existe correlação entre a densidade de anofelinos com a

incidência da malária;

- Descrever a taxa de infecção natural de anofelinos coletados por P. vivax

e P. falciparum;

- Estimar o efeito da intensificação das medidas de controle vetorial integrado

na população de anofelinos;

- Estimar o efeito da intensificação das medidas de controle vetorial integrado

na incidência de malária.

12

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Área de Estudo

O trabalho foi realizado em duas áreas nas Comunidades do Panelão e

Castanho Sítio localizadas no Município de Careiro na região central do Estado do

Amazonas (Amazônia Ocidental Brasileira) (03°06’S, 60°01’W), 112 km da capital do

Estado, Manaus.

A população estimada em 2010 era de 32.734 pessoas, a maioria vivendo em

áreas rurais (71,2%). A principal atividade econômica está relacionada com a

agricultura (mandioca, frutas, legumes, arroz e cana-de-açúcar), pecuária,

piscicultura e silvicultura. Estas atividades têm resultado numa diminuição da

cobertura vegetal e na fragmentação da cobertura vegetal. A cobertura vegetal

remanescente é composta principalmente de floresta ombrófila densa macrotérmica.

O clima, segundo a classificação de Köppen é equatorial superúmido, com o período

chuvoso que ocorre de novembro a abril, com média de precipitações pluviométricas

acima de 2.000 mm por ano, temperaturas médias variando de 26°C a 30°C e

umidade relativa entre 85 e 90%. O relevo do município é plano, com uma altitude

nunca superior a 100 metros acima do nível do mar (28).

As duas áreas de ocupação recente selecionadas para o estudo, as

Comunidades do Panelão e Céu Azul, são voltadas para a agricultura e

apresentavam uma população total de 736 pessoas segundo o censo (Vide Anexo -

POP_MAL_TC_001_v01_PT ) que foi realizado antes do início do estudo. Ambos os

assentamentos agrícolas foram estabelecidos pelo Instituto Nacional de Colonização

e Reforma Agrária (INCRA), que tem como principal objetivo resgatar o potencial

produtivo da agricultura familiar.

As comunidades utilizam para consumo água de reservatórios de chuva ou

riachos. A coleta de lixo e saneamento está ausente e apenas dois agentes de

saúde de cada comunidade são responsáveis pelos serviços de diagnóstico e

tratamento da malária.

13

4.2 Seleção dos domicílios

Foram feitas quatro coletas de agosto de 2008 a março de 2010, com um

intervalo de seis meses entre cada uma, compreendendo duas coletas no período

da seca (agosto) e duas no período chuvoso (março).

As coletas foram realizadas em 10 domicílios que foram selecionados

aleatoriamente, levando em consideração a distribuição espacial das áreas, sendo

uma em cada um das seis estradas vicinais na Comunidade do Panelão e quatro na

Comunidade de Céu azul, na qual as famílias estavam localizadas em ambos os

lados de uma estrada que liga Manaus a Porto Velho.

As capturas foram feitas simultaneamente por quatro horas nos ambientes

intra e peridomicíliar, nos horários das 18 às 22 horas, por técnicos treinados. Este

horário foi escolhido devido a estudos anteriores que mostram que as coletas feitas

por 12 horas em várias localidades da Amazônia brasileira, demonstram picos de

maiores atividades dos mosquitos entre 18 e 22 horas (12, 58). Os locais

selecionados ficavam a 20 metros distâncias das residências.

14

Figura 04: Seleção dos domicílios para o estudo.

4.3 Coleta de Anofelinos

Seis técnicos trabalharam em cada grupo, divididos em duplas, sendo que

uma pessoa capturava mosquitos dentro de casa e os outro no peridomicílio. Cada

capturador trabalhou durante 1 hora e depois descansou na próxima hora. Os

mosquitos que pousaram nas pernas dos captores foram capturados com o auxílio

de capturadores de Castro. Imediatamente os insetos foram colocados em

recipientes adequados identificados com data, hora, local e coletor e condições de

luminosidade. O fechamento de portas e janelas seguiu o comportamento rotineiro

dos moradores. As mesmas famílias foram visitadas em cada uma das quatro

coletas semestrais. Em ambas as comunidades estudadas, foram realizadas

capturas nos mesmos domicílios ao longo do período de estudo. Os dados de

temperatura e precipitação foram obtidos a partir do Instituto Nacional de

Meteorologia.

A identificação de anofelinos foi realizada utilizando as chaves de Consoli e

Lourenço-de-Oliveira (6) e Faran e Linthicum (17). As diferenças morfológicas

dos membros dos complexos nuneztovari e oswaldoi, com exceção de Anopheles

Fonte: André Siqueira.

15

deaneorum não foram definidas. Por conseguinte, An. nuneztovari, An. oswaldoi e

An. albitarsis, neste trabalho, referem-se a espécie sensu lato. O índice de

diversidade de Margalef (36) foi utilizado para determinar a diversidade de espécies

nos diferentes períodos de captura. Este índice foi calculado como D = (S - 1) / log

N, onde S = número de espécies e N = número de indivíduos.

Após a identificação, os mosquitos foram armazenadas em tubos de 2 ml de

Eppendorf com sílica gel. Em cada um dos tubos foram armazenados até 10

mosquitos da mesma espécie colhidos no mesmo ambiente, data e coletor. Os

tubos foram mantidos numa sala protegida da umidade e de temperaturas elevadas

até que a técnica de PCR para detecção de Plasmodium sp. fosse feita, após a

conclusão do último ponto do corte transversal.

Figura 05: Coleta intra e peridomicílio e identificação dos anofelinos.

Fonte: André Siqueira.

16

4.4 Extração de DNA – Chelex 100

Para a avaliação da infecção natural dos mosquitos por Plasmodium sp., a

extração de DNA total foi feita a partir da cabeça e do tórax de um conjunto de 10

mosquitos. Foi preparado 300 µL de CHELEX 100 a 5% e adicionados em cada

tubo. Os insetos foram macerados com um pistilo e colocados a 100°C durante 10

min e centrifugados a 14000 rpm durante 15 min. Duzentos microlitros do

sobrenadante foi transferido para um novo tubo e incubado a 20°C (Vide

POP_MAL_LB_001_v03D_PT no Anexo).

4.5 Precipitação do DNA

A precipitação foi realizada a partir da adição do sobrenadante em tubos

novos com 1000 µL de etanol 100% e 45 µL de acetato de sódio. Depois de

precipitado, retirou-se o sobrenadante e no mesmo tubo adicionaram-se 800 µL de

etanol a 80%, sendo finalizado com a adição de T.E. (Vide

POP_MAL_LB_001_v03D_PT no Anexo).

4.6 Detecção da Infecção

Foram utilizados 0,2 µL do DNA obtido para uma reação de PCR com volume

total de 10 μL. O DNA foi amplificado em um sistema da Applied Biosystem 7500,

utilizando os iniciadores (55) e as sondas TaqMan com fluorescência marcadas por

PCR em tempo real (43), descritas previamente (Vide POP_MAL_LB_002_v02D_PT

no Anexo).

4.7 Controle Vetorial

Em setembro de 2009 o Programa de Ações de Malária ampliaram as ações

de controles de vetores em locais escolhidos para o estudo, com a distribuição

gratuita de mosquiteiros impregnados com inseticidas, telagem das janelas e

intensificação da pulverização residual interna com o uso da cipermetrina.

17

4.8 Estudos Epidemiológicos

As taxas de incidência da malária foram obtidas a partir de um estudo

longitudinal realizado nas duas comunidades. A detecção passiva dos casos foi

realizada com base na microscopia examinando os esfregaços corados por Giemsa

(Conforme descrito no POP_MAL_TC_002_A02_v01_PT), realizados para cada

episódio de febre entre os membros do grupo.

Paralelamente à investigação entomológica, quatro estudos transversais

foram realizados a fim de se determinar a prevalência da malária através da

detecção ativa de casos. O diagnóstico laboratorial da infecção malárica foi baseada

na amplificação por PCR de um segmento espécie-específico do gene que codifica

a porção 18s do rRNA a partir de amostras coletadas em papel de filtro. A extração

de DNA total a partir de papel de filtro foi realizada utilizando o kit de DNA da

QIAamp (Qiagen, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA foi

amplificado no sistema da Applied Biosystems 7500 usando iniciadores (55) e

sondas TaqMan para PCR em tempo real (43) (Vide POP_MAL_LB_003_v02D_PT).

4.9 Análise dos dados

O potencial de transmissão de malária de mosquitos foi determinado pela

estimativa das taxas de picadas homem/hora (TPHH) e as taxas de inoculação

entomológica (TIE) para cada coleta em cada local. A TPHH foi determinada como o

número médio por hora de mosquitos capturados por pessoa. O TIE foi calculado

multiplicando a TPHH pelas taxas de infecção, ou seja, pela proporção de pools de

mosquitos positivos em que o Plasmodium sp. foi detectado por PCR.

O cálculo da prevalência da malária foi feito com base no número de casos

diagnosticados por PCR e o número de pessoas avaliadas durante os quatro

estudos transversais. A incidência da malária foi obtida a partir do estudo

longitudinal, sendo utilizado para calcular as taxas de incidência (casos/1000

pessoas/ano), tendo em conta os casos comunicados de cada local de coleta de

anofelinos e a população por tempo de seguimento. As taxas de incidência de

malária (TIM) foram determinadas para cada coleta de anofelinos usando a

18

população do local e do número de casos de malária registrados em um mês e meio

antes e depois da data da coleta.

Foi utilizado o teste de Pearson, com auxílio do software SPSS 16.0 para

verificar a correlação entre a TPHH (para o total de anofelinos e para An. darlingi e

An. albitarsis separadamente) e as taxas de incidência de malária (casos/1000

pessoas/ano).

As TPHH, TIE e TIM, bem como a prevalência de malária foram utilizados

como desfechos para estimar o impacto das medidas de controle estabelecidas na

metade do período de estudo.

O Índice de Margalef foi utilizado para avaliar a diversidade de espécies nas

duas Comunidades estudadas em relação aos habitantes que residem nas áreas de

estudo.

4.10 Considerações Éticas

O projeto foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

(CONEP), com o registro de número 15197 (vide Anexo – Aprovação do CONEP).

Todos os casos de malária detectados nos estudos longitudinais ou transversais que

foram tratados de acordo com o protocolo do Ministério da Saúde.

19

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Esta seção será apresentada na forma de artigo científico, publicado no periódico

Malária Journal:

Martins-Campos KM, Pinheiro WD, Vítor-Silva S, Siqueira AM, Melo GC, Rodrigues

IC, Fé NF, Barbosa MGV, Tadei WP, Guinovart C, Bassat Q, Alonso PL, Lacerda

MVG, Monteiro WM. Integrated vector management targeting Anopheles darlingi

populations decreases malaria incidence in an unstable transmission area, in the

rural Brazilian Amazon. Malaria Journal 2012, 11:351.

http://www.malariajournal.com/content/11/1/351



20

Integrated vector management targeting Anopheles darlingi

populations decreases malaria incidence in an unstable

transmission area, in the rural Brazilian Amazon

Keillen M Martins-Campos1,2, Waléria D Pinheiro2, Sheila Vítor-Silva1,3, André M

Siqueira1,3, Gisely C Melo1,3, Íria C Rodrigues1, Nelson F Fé1, Maria das Graças

V Barbosa1,3,5, Wanderli P Tadei3, Caterina Guinovart6, Quique Bassat6, Pedro L

Alonso6, Marcus VG Lacerda1,3,5 and Wuelton M Monteiro1,3,4*

1 Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Av. Pedro Teixeira, 25,

Dom Pedro, Manaus, AM, 69040-000, Brazil

2 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Av. André Araújo, 2936, Aleixo,

Manaus, AM, 69060-001, Brazil

3 Universidade do Estado do Amazonas, Av. Pedro Teixeira, 25, Dom Pedro,


4 Universidade Federal do Amazonas, Rua Afonso Pena, 1053, Praça 14, Manaus,

AM, 69020-170, Brazil

5 Universidade Nilton Lins, Av. Prof. Nilton Lins, 3259, Parque das Laranjeiras,


6 Barcelona Centre for International Health Research (CRESIB, Hospital Clínic-

Universitat de Barcelona), Rosselló 132, 4°, Barcelona, 08036, Spain

21

Abstract

Background

Studies on vector behaviour should be conducted in order to evaluate the

effectiveness of vector control measures on malaria protection in endemic areas of

Latin America, where P. vivax predominates. This work aims to investigate the fauna

of anopheline mosquitoes and verify the impact of integrated vector management in

two colonization projects in the Careiro Municipality, Western Brazilian Amazon.

Methods

Four mosquitoes’ captures were carried out from August 2008 to March 2010, with

an interval of six months between each collection. Since September 2009 a large

programme to reduce the burden of malaria has started in the two communities by

distribution of insecticide-treated bed nets (ITN) and intensification of indoor residual

spraying (IRS). Human biting rates (HBRs), entomological inoculation rates (EIRs),

malaria incidence rate (MIR) and Plasmodium carrier’s prevalence were used as

outcomes to estimate the impact of the control measures.

Results

A total of 3,189 anophelines were collected, belonging to 13 species. Anopheles

darlingi was the predominant species in the period (42.6%), followed by Anopheles

albitarsis (38.4%). An. darlingi HBRs showed a notable decreasing trend from the

start to the end of the study. Conversely, An. albitarsis increased its contribution to

overall HBRs throughout the study. For An. darlingi there was a significant positive

correlation between HBRs and MIR (p = 0.002). Anopheles albitarsis HBRs

showed a significant negative correlation with the corresponding MIR (p = 0.045).

EIR from total anophelines and from An. darlingi and An. albitarsis presented

decreasing patterns in the successive collections. Four species of anophelines (An.

darlingi, An. albitarsis, Anopheles braziliensis and Anopheles nuneztovari) were

naturally infected with Plasmodium, albeit at very low infection rates. There were a

decrease in the MIR for both vivax and falciparum malaria and in the prevalence of

22

Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum carriers during the period of study.

Conclusions

There is strong evidence of association between the density of An. darlingi and the

incidence of malaria in the studies sites, further highlighting the importance of this

vector in malaria transmission in this region. An. darlingi susceptibility to control using

ITN and IRS is likely to be high in the rural settlements studied.

Keywords: Malaria; Anopheles darlingi; Impregnated bed nets; Indoor residual

spraying; Amazon

Background

Malaria remains one of the most important public health problems worldwide, with

about 3.3 billion people at risk of contracting the disease and 655,000 deaths

estimated annually, mainly in children under five years [1]. In Latin America (LA),

approximately 170 million people live at risk of Plasmodium vivax and Plasmodium

falciparum transmission distributed in 21 countries [2]. Approximately 60% of the

malaria cases in the Americas are reported from Brazil, where 99.8% of the cases

are reported in the Amazon Region [3].

Anopheles darlingi is the major vector of malaria in Brazil [4-7], being highly

susceptible to Plasmodium sp. infection, with highly anthropophilic and endophagic

behaviour [7-9]. This species is described in tropical and subtropical regions in

Central and South Americas especially in areas of low altitude, preferring large

bodies of water in forested areas [10]. The larvae are adapted to the water margins,

preferably deep, clean, slightly cloudy, sunny or partially shaded ones, hiding among

the vegetation or debris. During rainy seasons they change their behaviour with a

preference for breeding at smaller size and depth water bodies [11,12]. Although An.

darlingi predominates in Brazilian endemic areas, other species of anophelines have

also been implicated as malaria vectors in distinct Amazonian settings, namely

Anopheles albitarsis s.l., Anopheles nuneztovari, Anopheles triannulatus and

23

Anopheles intermedius[8,13-15]. In some regions of Brazil, these secondary vectors,

mainly An. albitarsis may invade houses and feed in humans. However, in most of its

territory, including the dry north-east and the central areas, this anopheline is

exophilic and zoophilic, preferring to attack the cattle [16].

The Malaria Control Brazilian Programme focuses their strategies on the early

diagnosis and treatment of infected individuals. However, many efforts in order to

control the vectors’ population have been put into practice, such as the use of

impregnated bed nets, indoor residual spraying and environmental cleaning [17]. It is

important to point out that the effectiveness of such tools has not yet been evaluated

in an integrated manner, in part due to the lack of baseline information on the natural

behaviour of An. darlingi and secondary vectors related to malaria transmission in the

Amazon Basin. As malaria vectors are able to adapt to different environmental

conditions (more and more frequent in recent occupied settlements in LA),

descriptive entomological studies should become a routine practice, supporting

vectorial control measures.

In the Southern Amazon Basin, malaria is often concentrated in agricultural

settlements and areas of mining activity [18]. Recent occupation of landscape results

in higher anopheline population densities [19] which, in association with the arrival of

non-immune newcomers, tend to sustain the disease transmission [18,20,21].

Therefore, the aims of this study were to describe the dynamics of the anopheline

population in a rural area of recent colonization in the Western Brazilian Amazon,

and secondarily to correlate the mosquitoes’ density variation with the incidence of

clinical malaria in this area after implementation of integrated control measures

focusing on the vector.

Methods

Study sites

The Municipality of Careiro is located in the central region of the Amazonas State

(Western Brazilian Amazon) (03°06’ S; 60°01’ W), 112 km from the capital of the

24

state, Manaus (Figure 1). The estimated population in 2010 was 32,734 people,

mainly living in rural areas (71.2%). The main economical activity is related to

agriculture (cassava, fruits, vegetables, rice, and sugar cane), cattle breeding, fish-

farming, and forestry. These activities have resulted in a decrease in vegetation

cover and habitat fragmentation. The remaining vegetal cover is primarily composed

of dense macrothermic ombrophilous forest. The climate according to Köppen

classification is Af (super-humid equatorial), with the rainy season occurring from

November to April, mean pluviometric precipitations above 2,000 mm per annum,

average temperatures ranging from 26°C to 30°C, and relative humidity between 85

and 90%. The relief of the municipality can be considered plane, at an altitude never

exceeding 100 meters above the sea level [22].

Two areas of recent occupation devoted to agriculture were chosen (Panelão and

Céu Azul Communities) (Figure 1), with a total population of 736 persons (census

performed immediately before the beginning of the study). Water for drinking comes

from rainwater reservoirs or creeks. Garbage collection and sanitation are absent.

Two health agents in each community are responsible for health care. Both those two

agricultural settlements were established by the National Institute for Colonization

and Agrarian Reform (INCRA), which primarily aims to rescue the productive

potential of the family agriculture.

Anopheline sampling

Four mosquitoes’ captures were carried out from August 2008 to March 2010, with a

6-month-interval, comprising two collections in the dry season (August) and two in

the rainy (March) seasons. The collections were performed in 10 households,

randomly selected having in consideration the spatial distribution of the areas, being

one in each of the six ancillary roads in the community of Panelão, a more densely

populated and more fragmented area, and four in the community of Céu Azul, in

which the household are located in both sides of a main road that connects Manaus

with Porto Velho. Simultaneous 4-hour captures were performed indoors and

outdoors from 6 to 10 pm by harmonized and trained technicians, due to previous

http://www.malariajournal.com/content/11/1/351/figure/F1


25

12- h collections studies in several localities of the Brazilian Amazon demonstrating

the mosquitoes’ peaks of host-seeking activity [6,23]. Outdoor collection sites were at

20 metres distances from the households. Six technicians worked in each group,

divided in pairs, one person capturing mosquitoes indoors and the other outdoors.

Each capturer worked for 1 hr and then rested for the next hour. Mosquitoes that

landed on the capturers’ legs were captured with Castro aspirators. Immediately the

insects were placed in appropriate containers identified with date, time, location and

collector. The light conditions and closing of doors and windows followed the same

as of the normal behavior of the residents. The same households were visited in

each of the four six-monthly collections. In both studied communities, captures were

performed predominantly in the same house over the entire study period.

Temperature and rainfall data were obtained from satellite imaging from the National

Institute of Meteorology.

The identification of anophelines was performed using Consoli and Lourenço-de-

Oliveira [24] and Faran and Linthicum [25] keys. The morphological differences of the

members of the nuneztovari and oswaldoi complexes, with exception of Anopheles

deaneorum were not defined. Therefore, An. nuneztovari, Anopheles oswaldoi and

An. albitarsis in this work refer to the species sensu latu. Margalef’s diversity index

[26] was used for determining species diversity in the different capturing periods. This

index was calculated as D = (S – 1)/ln N, where S = number of species and

N = number of individuals.

After identification, mosquitoes were stored in 2 mL Eppendorf tubes with silica gel.

In each tube, up to 10 mosquitoes from the same species collected at the same time,

environment, and collector were stored. The tubes were kept in a room protected

from high temperatures and humidity until the PCR technique for Plasmodium sp.

detection was made, after the conclusion the last cross-sectional time point.

Natural infection of mosquitoes by Plasmodium sp.

For total DNA extraction from a pool of head and thorax of 10 mosquitoes, 300 μL of

5% w/v Chelex 100 in water were added to each tube. The insects were smashed

26

with a pestle and placed at 100°C for 10 min and spinned at 14,000 g for 15 min.

Two hundred microlitres of supernatant were transferred into a new tube and

incubated to -20°C. We used 0.5 μL as template in a 10 μL PCR reaction. DNA was

amplified in an Applied Biosystems 7500 Fast System® using primers [27] and

TaqMan fluorescence labeled probes for real-time PCR [28] as previously described.

Vector control measures

In September 2009, the local Malaria Control Programme improved vector control

actions, such as the free distribution of insecticide-treated bed nets, window

screening and intensification of indoor residual spraying (cypermethrin).

Epidemiological study

Malaria incidence rates (MIR) were obtained from a longitudinal study carried out in

the two communities in the period. Passive case detection based on microscopic

examination of Giemsa stained thick blood smears (TBSs) was performed for every

episode of fever among the members of the cohort.

Concurrently to the entomological investigation, four cross-sectional surveys of the

cohorts under study were conducted in order to determine the prevalence of malaria

through active case detection. The laboratory diagnosis of malarial infection was

based on nested PCR amplification of a species-specific segment of the 18 S rRNA

gene of human malaria parasites in blood samples collected in filter paper. The

extraction of total DNA from filter paper was performed using the QIAamp® DNA

Blood Mini Kit (Qiagen®, USA), according to the manufacturer’s protocol. DNA was

amplified in an Applied Biosystems 7500 Fast System® using primers [27] and

TaqMan fluorescence labeled probes for real-time PCR [28] as previously described.

27

Data analysis

The malaria transmission potential of mosquitoes was determined by estimating the

human biting rates (HBR) and entomological inoculation rates (EIR) for each

collection in each location. HBR was scored as the average hourly number of

mosquitoes captured per person. The EIR was estimated by multiplying the HBR and

infection rates (IR). The IR is the proportion of positive pools in which Plasmodium

sp. was detected by PCR.

Malaria prevalence calculations were based on the number of cases diagnosed by

PCR and the number of people found during the four cross-sectional surveys.

Incidence of malaria obtained from the longitudinal study was used to calculate the

incidence rates (cases/1,000 persons/year) taking into account the cases

communicated from each site of anopheline collection and the population follow-up

time. Malarial incidence rates (MIRs) were determined for each anopheline collection

site using the population of the site and the number of cases of malaria registered

one month and a half before and after the collection’s date.

Pearson’s test performed in SPSS 16.0 software was used to verify the correlation

between HBRs (for total anophelines and for An. darlingi and An. albitarsis

separately) and the malarial incidence rates (cases/1,000 persons/year).

HBR, EIR, MIR and malaria prevalence were used as outcomes to estimate the

impact of the control measures established in the middle of the period of study.

Ethics procedures

Human surveys and entomological investigation were approved by the National

Ethics Review Committee (protocol number 15197). Mosquitoes’ collection using the

above mentioned capture methodology was preceded by ethical clearance. All

malaria cases detected in the longitudinal or cross-sectional studies were treated

according to the Brazilian Ministry of Health’s National guidelines.

28

Results

Rainfall and temperature were homogeneous throughout the period of the study,

showing the expected typical seasonality, with increased rainfall during the first six

months of the year, followed by increased mean temperatures in the second

semester of the years (Figure 2).

A total of 3,189 anophelines were collected from the households under entomological

surveillance at the 4 different timepoints. Anopheline mosquitoes belonged to 13

different species (Table1). Anopheles darlingi was the predominant species in the

period, representing 42.6% of the total of anophelines collected, followed nearly by

An. albitarsis, with 38.4%. In all the collections there was a predominance of

mosquitoes in the peridomicilliary environment (77.1%). Anopheles darlingi and An.

albitarsis, the two major species, predominated outdoors, where 83.3% and 65.5%

were collected, respectively. All the other species also prevailed in this environment

(Additional file 1). Margalef’s index ranged from 0.59 to 1.54, with values slightly

higher in collections carried out in the peridomiciliary area. This index showed a

decreasing trend in the diversity of anopheline species along the period of study

(Additional file 1).

The HBRs calculated for all anophelines and for An. darlingi and An. albitarsis by

collection and specific locality are shown in Additional file 2. Overall HBRs did not

show an important variation in the different localities of collection along the period.

The first collection showed HBRs ranging from 3.1 to 16.3, the second collection 0.4

to 3.6, the third collection 0.3 to 14.3 and the last collection 0.8 to 21.0. HBRs

calculated for An. darlingi showed a notable decreasing trend from the start to the

end of the study. The first collection showed An. darlingi maximum HBRs of 15.6,

falling to 2.8 and 4.0 in the last collections. On the other hand, An. albitarsis

increased its contribution to overall HBRs along the time. The first collection showed

An. albitarsis maximum HBRs of 2.0, subsequently peaking at 21.0 during the fourth

collection. In the end of the study, in some localities the overall HBRs were almost

exclusively due to An. albitarsis. The increase in the HBRs for this species was most

notable in the localities of the Céu Azul Community. The other species showed very

low HBRs and great fluctuations along the collections.


http://www.malariajournal.com/content/11/1/351/table/T1

http://www.malariajournal.com/content/11/1/351/suppl/S1



29

Figure 3 summarizes the correlation between the two major vector specific HBRs and

MIRs in the corresponding period and locality. For An. darlingi there seemed to be a

significant positive correlation between HBRs and MIR (p=0.002). This positive

correlation was maintained for An. darlingi HBRs obtained outdoors (p=0.001), but

the correlation was lost indoors (p=0.107). Conversely, overall An. albitarsis HBRs

showed a significant negative correlation with the corresponding MIR (p=0.045)

(Figure 3).

HBRs for all the mosquitoes ranged from 9.2 in the first collection to 7.5 in the fourth.

Figure4 shows that An. darlingi HBRs showed a decreasing pattern, especially after

the second collection, when control measures were intensified. An. albitarsis HBRs

behaved in a contrary manner, with an increasing trend along the period. This trends

were confirmed when we analysed the HBRs calculated for indoor and outdoor

environments separately, for both species.

EIR from total anophelines and for An. darlingi and An. albitarsis presented

decreasing patterns in the successive collections. This decrease was particularly

notable for the two major collected anophelines, which demonstrated near to zero

EIRs after the beginning of control measures intensification.

Four species of anophelines were found naturally infected with Plasmodium sp. In

the first collection one pool of An. albitarsis was positive for Plasmodium vivax. The

second collection showed two pools of An. darlingi and one pool of An. albitarsis

positive for P. vivax. In the third collection, one pool of An. braziliensis was positive

for P. vivax and one pool of An. nuneztovari was positive for P. vivax/Plasmodium

falciparum mixed infection. One pool of An. braziliensis of the fourth collection was

positive for P. vivax/P. falciparum mixed infection. Four infected pools came from

outdoor and three from indoor captures (in this case only for An. darlingi and An.

albitarsis).

Figures5 and 6 show a clear decrease in the MIR for both vivax and falciparum

malaria and in the prevalence of P. vivax and P. falciparum carriers, respectively,

during the period of study.






30

Discussion

Insecticide-treated nets, indoor residual spray, and the use of biolarvicides are the

major vector control tools used in the fight against malaria. When integrated vector

management (IVM) strategies have been consistently implemented in African

countries, they have successfully controlled malaria transmission [29]. However, IVM

has been slowly introduced for malaria control in LA and it has not been sufficiently

evaluated in this region [30]. Considering the long-term challenge of malaria

eradication, it is essential to increase knowledge on the ecology and behavior of

malaria vectors [31,32]. In LA, current methods for vector control are based primarily

on the use of long-lasting insecticide treated nets and indoor residual spraying, but

there is no available information on the impact that these measures have on

suppressing anopheline populations and reducing levels of malaria parasite

transmission in recent agrarian reform projects in the Amazon.

Studies focusing on mosquito bionomics may provide solid baseline information to

direct malaria control strategies. All the anopheline species collected in this study

have been previously reported in the Amazon Region [4,6]. Margalef’s index

observed in the period was low, irrespective of the collection environment. Anopheles

darlingi was the predominant species in the period, followed by An. albitarsis. Eleven

species showed infrequent human biting habits. Anopheles darlingi is considered as

the primary malaria vector in Brazil based on its high susceptibility to Plasmodium

sp., and its anthropophilic and endophagic behaviour [7-9]. In a previous report,

87.8% out of 27,428 An. darlingi specimens collected in the Amazon were collected

within households, confirming its strong anthropophilic habits [33]. In this study,

however, in all collections there was a predominance of mosquitoes in the peri-

domiciliary environment, in agreement with collections performed during the

construction of the Manaus-Boa Vista Highway [6]. It is not possible to conclude that

peri-domiciliary transmission in the two communities occurs more frequently than

indoor transmission, but there was evidence of strong association between malaria

incidence and An. darlingi outdoor HBRs.

In the state of Roraima, Northern Brazilian Amazon, the decrease in distribution and

density of anophelines corresponded to a malaria decrease in surrounding areas

31

[34]. In Manaus, a relationship between An. darlingi density increases and the

number of malaria cases 30 days later was observed [6]. However, few studies have

demonstrated a correlation between longitudinal data on malarial incidence with

abundance and HBRs for this species, confirming its effective contribution to

transmission, as strongly suggested by the present data. In the State of Amapá,

Brazil [35], and in French Guiana [36], significant correlations were detected between

malaria cases and suspected vector species abundance. As shown in this study, and

despite the low diversity of the anopheline fauna, malaria remains in endemic levels

at these sites possibly because of the abundance and vectorial competence of the

major anophelines. In fact, results from entomological investigations carried out in

recent rural Amazon settlements suggest that an intensification of anthropic

environmental changes increases the abundance of An. darlingi[19], contributing to

maintain several malarial foci with high incidence rates in recent colonization places

[18-20].

Anopheles darlingi showed to be the vector responsible for the transmission of

malaria in the communities, as demonstrated by the strong correlation between its

HBRs and MIRs. The decrease in malaria incidence during the period of study is

likely to be linked to the vector control measures. The other species of anophelines,

especially An. albitarsis, were not sensible to the control strategies. On the other

hand, the latter species increases in abundance along the investigation, correlating

negatively with malaria incidence and showing that theirs densities does not have

major importance in the transmission of malaria in the communities. Although the

abundance and infection by Plasmodium sp. in entomological investigations carried

out in the Brazilian Amazon [6-9,15,16,37], the present data pointed that the role of

An. albitarsis as a malaria vector is unclear and needs to be further investigated in

this region. In some regions of Brazil, An. albitarsis may invade houses and feed in

humans. However, in most of its territory, including the dry northeast and the central

areas, this anopheline is exophilic and zoophilic, preferring to attack the cattle [16]. It

can be speculated that the substitution of An. darlingi by An. albitarsis was due to the

increase in the bovine cattle breeding that occurred in the communities in the recent

years, particularly in the Céu Azul Community, diminishing the breeding sites for An.

darlingi, and intensifying attraction of An. albitarsis in neighbouring houses.

Four outcomes were used to evaluate the impact of the vector control measures

32

(HBRs, EIRs, MIR and prevalence of P. vivax and P. falciparum carriers). All these

indicators suggested an effectiveness of the use of impregnated bed nets and

residual spraying in two rural communities. Although very low infection rates were

seen, EIRs decreased throughout the study. HBRs seem to decrease in parallel to

the prevalence of P. vivax and P. falciparum carriers, and with MIR, reinforcing the

potential of these vector control approaches in the rural Amazonian areas. A clear

limitation of this study that needs to be highlighted is the descriptive methodology

employed in this study, without any controlled strategy, which would be considered

unethical. Moreover, the use of bed nets was not appropriately evaluated.

Unfortunately, there is no systematic information concerning acceptability of these

methods in the two communities. In Southern Brazilian Amazon, impregnated

mosquito nets were not effective in controlling malaria [38]. In Guatemala and

Nicaragua, malaria incidence was significantly lower in populations using insecticide-

impregnated bed nets [39,40]. A high proportion of P. falciparum was listed between

the most important factors for the success of the bed net programme in Ecuador,

Colombia and Peru [41]. In the Colombian Amazon, promotion of mosquito net use

and impregnation had a benefit as evidenced by a case-control study [42].

Conclusions

Data presented here represent an important contribution to the knowledge of the

epidemiology of malaria transmission and vector control in agricultural settlements in

the Amazon, indicating that An. darlingi is the vector responsible by the transmission

in these sites, and that integrated measures using impregnated bed nets and residual

spraying may reduce substantially the man-vector contact and malaria incidence.

Fortunately An. darlingi susceptibility to control is likely to be high in the rural

settlements studied, but a major long-term threat for malaria vector control is the

development of insecticide resistance, which stresses the necessity to develop local

and systematic evaluation. In malaria endemic areas of Latin America, where P.

vivax is predominant, studies on vector behaviour should be conducted in order to

predict the impact of vector control measures on malaria transmission.

33

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author's contributions

KMMC, WDP, IR, GCM and NFF participated in data collection and laboratory

procedures. SVS participated in field-works. MVGL and AMS participated in overall

study conception and design, data collection, analysis, interpretation and manuscript

preparation. WMM, MGVB, WPT, CG, QB e PLA were involved in data interpretation

and manuscript preparation. All authors read and approved the final manuscript.

Aknowledgements

We acknowledge the collaboration of the local microscopists Juscelino Torres dos

Santos, Eliana Lima and Irailton dos Santos. This study was supported by Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (grant number

575788/2008-9) and by Fundació Cellex (P. vivax Consortium).

34

References

1. World Health Organization: WHO Malaria Report. Geneva: World Health

Organization; 2011.

2. Guerra CA, Howes RE, Patil AP, Gething PW, Van Boeckel TP, Temperley WH,

Kabaria CW, Tatem AJ, Manh BH, Elyazar IR, Baird JK, Snow RW, Hay SI: The

international limits and population at risk of Plasmodium vivax

transmission in 2009. PLoS Negl Trop Dis 2010, 4:e774.

3. Oliveira-Ferreira J, Lacerda MV, Brasil P, Ladislau JL, Tauil PL, Daniel-Ribeiro CT:

Malaria in Brazil: an overview. Malar J 2010, 9:115.

4. Deane LM CO, Deane MP: Malaria vectors in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz

1986, 81:5-14.

5. Rubio-Palis Y, Zimmerman RH: Ecoregional classification of malaria vectors in

the neotropics. J Med Entomol 1997, 34:499-510.

6. Tadei WP, Thatcher BD, Santos JM, Scarpassa VM, Rodrigues IB, Rafael MS:

Ecologic observations on anopheline vectors of malaria in the Brazilian

Amazon. Am J Trop Med Hyg 1998, 59:325-335.

7. Tadei WP, dos Santos JM, Costa WL, Scarpassa VM: Biology of Amazonian

Anopheles. XII. Occurrence of Anopheles species, transmission dynamics

and malaria control in the urban area of Ariquemes (Rondonia). Rev Inst

Med Trop Sao Paulo 1988, 30:221-251.

8. de Arruda M, Carvalho MB, Nussenzweig RS, Maracic M, Ferreira AW, Cochrane

AH: Potential vectors of malaria and their different susceptibility to

Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax in northern Brazil identified

by immunoassay. Am J Trop Med Hyg 1986, 35:873-881.

9. Lourenço-de-Oliveira R, Guimaraes AE, Arle M, da Silva TF, Castro MG, Motta

MA, Deane LM: Anopheline species, some of their habits and relation to

malaria in endemic areas of Rondonia State, Amazon region of Brazil.

Mem Inst Oswaldo Cruz 1989, 84:501-514.

10. Foratini OP: Culicidologia Médica. São Paulo: Editora USP; 2002.

11. Manguin S, Roberts DR, Andre RG, Rejmankova E, Hakre S: Characterization

of Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae) larval habitats in Belize, Central

America. J Med Entomol 1996, 33:205-211.

35

12. Rejmankova E, Rubio-Palis Y, Villegas L: Larval habitats of anopheline

mosquitoes in the Upper Orinoco, Venezuela. J Vector Ecol 1999, 24:130-

137.

13. Povoa MM, de Souza RT, Lacerda RN, Rosa ES, Galiza D, de Souza JR, Wirtz

RA, Schlichting CD, Conn JE: The importance of Anopheles albitarsis and

An. darlingi in human malaria transmission in Boa Vista, state of Roraima,

Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2006, 101:163-168.

14. Galardo AK, Arruda M, D’Almeida Couto AA, Wirtz R, Lounibos LP, Zimmerman

RH: Malaria vector incrimination in three rural riverine villages in the

Brazilian Amazon. Am J Trop Med Hyg 2007, 76:461-469.

15. Povoa M, Wirtz R, Lacerda R, Miles M, Warhurst D: Malaria vectors in the

municipality of Serra do Navio, State of Amapa, Amazon Region, Brazil.

Mem Inst Oswaldo Cruz 2001, 96:179-184.

16. Deane LMCO, Deane MP: Notes on the distribution and biology of

anophelines in the Northeastern and Northern regions of Brazil [in

Portuguese]. Rev Ser Esp Saúde Publ 1948, 1:827-965.

17. Barata RC: Malaria in Brazil: trends in the last ten years [in Portuguese].

Cad Saude Publica 1995, 11:128-136.

18. de Oliveira EC, dos Santos ES, Zeilhofer P, Souza-Santos R, Atanaka-Santos M:

Spatial patterns of malaria in a land reform colonization project, Juruena

municipality, Mato Grosso, Brazil. Malar J 2011, 10:177.

19. Moutinho PR, Gil LH, Cruz RB, Ribolla PE: Population dynamics, structure

and behavior of Anopheles darlingi in a rural settlement in the Amazon

rainforest of Acre, Brazil. Malar J 2011, 10:174.

20. da Silva-Nunes M, Codeco CT, Malafronte RS, da Silva NS, Juncansen C, Muniz

PT, Ferreira MU: Malaria on the Amazonian frontier: transmission dynamics,

risk factors, spatial distribution, and prospects for control. Am J Trop Med

Hyg 2008, 79:624-635.

21. da Silva NS, da Silva-Nunes M, Malafronte RS, Menezes MJ, D’Arcadia RR,

Komatsu NT, Scopel KK, Braga EM, Cavasini CE, Cordeiro JA, Ferreira MU:

Epidemiology and control of frontier malaria in Brazil: lessons from

community-based studies in rural Amazonia. Trans R Soc Trop Med Hyg

2010, 104:343-350.

22. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística: Censo Demográfico 2010. Brasília:

36

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística; 2010.

23. de Barros FS, Honorio NA: Man biting rate seasonal variation of malaria

vectors in Roraima, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007, 102:299-302.

24. Consoli R, Lourenço-de-Oliveira R: Principais mosquitos de importância sanitária

no Brasil. Rio de Janeiro: Fiocruz; 1994.

25. Faran ME LK: A handbook of the Amazonian species of Anopheles

Nyssorhynchus) (Diptera: Culicidae). Mosq Syst 1981, 13:1-81.

26. Margalef D: La teoría de la información en ecología] [in Spanish]. Mem R

Acad Cienc Artes 1957, 32:373-379.

27. Snounou G, Viriyakosol S, Zhu XP, Jarra W, Pinheiro L, do Rosario VE,

Thaithong S, Brown KN: High sensitivity of detection of human malaria

parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Mol Biochem

Parasitol 1993, 61:315-320.

28. Perandin F, Manca N, Calderaro A, Piccolo G, Galati L, Ricci L, Medici MC,

Arcangeletti MC, Snounou G, Dettori G, Chezzi C: Development of a real-time

PCR assay for detection of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, and

Plasmodium ovale for routine clinical diagnosis. J Clin Microbiol 2004,

42:1214-1219.

29. Beier JC, Keating J, Githure JI, Macdonald MB, Impoinvil DE, Novak RJ:

Integrated vector management for malaria control. Malar J 2008, 7(Suppl

1):S4.

30. Arevalo-Herrera M, Quinones ML, Guerra C, Cespedes N, Giron S, Ahumada M,

Pineros JG, Padilla N, Terrientes Z, Rosas A, Padilla JC, Escalante AA, Beier

JC, Herrera S: Malaria in selected non-Amazonian countries of Latin

America. Acta Trop 2012, 121:303-314.

31. Ferguson HM, Dornhaus A, Beeche A, Borgemeister C, Gottlieb M, Mulla MS,

Gimnig JE, Fish D, Killeen GF: Ecology: a prerequisite for malaria elimination

and eradication. PLoS Med 2010, 7:e1000303.

32. MalERA: A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS

Med 2010, 8:e1000401.

33. Deane L: Observations on malaria in the Brazilian Amazon in [Portuguese].

Rev Serv Saúde Públ 1947, 1:3-60.

34. de Barros FS, Honorio NA, Arruda ME: Survivorship of Anopheles darlingi

(Diptera: Culicidae) in relation with malaria incidence in the Brazilian

37

Amazon. PLoS One 2011, 6:e22388.

35. Galardo AK, Zimmerman RH, Lounibos LP, Young LJ, Galardo CD, Arruda M,

D’Almeida Couto AA: Seasonal abundance of anopheline mosquitoes and

their association with rainfall and malaria along the Matapi River, Amapá,

[corrected] Brazil. Med Vet Entomol 2009, 23:335-349.

36. Fouque F, Gaborit P, Carinci R, Issaly J, Girod R: Annual variations in the

number of malaria cases related to two different patterns of Anopheles

darlingi transmission potential in the Maroni area of French Guiana. Malar

J 2010, 9:80.

37. Deane LM CO, Deane MP: An illustrated key by adult female characteristics

for identification of thirty-five species of Anophelini from Northeast and

Amazon regions of Brazil, with note on the malaria vectors (Diptera:

Culicidae). Am J Trop Med Hyg 1946, 18:1-18.

38. Santos JB, dos Santos F, Marsden P, Tosta CE, Andrade AL, Macedo V: Effect

of bed nets impregnated with deltamethrin on malaria morbidity in an area

of the Brazilian Amazon [in Portuguese]. Rev Soc Bras Med Trop 1998,

31:1-9.

39. Richards FO Jr, Flores RZ, Sexton JD, Beach RF, Mount DL, Cordon-Rosales C,

Gatica M, Klein RE: Effects of permethrin-impregnated bed nets on malaria

vectors of northern Guatemala. Bull Pan Am Health Organ 1994, 28:112-

121.

40. Kroeger A, Gonzalez M, Ordonez-Gonzalez J: Insecticide-treated materials for

malaria control in Latin America: to use or not to use? Trans R Soc Trop

Med Hyg 1999, 93:565-570.

41. Kroeger A, Mancheno M, Alarcon J, Pesse K: Insecticide-impregnated bed

nets for malaria control: varying experiences from Ecuador, Colombia, and

Peru concerning acceptability and effectiveness. Am J Trop Med Hyg 1995,

53:313-323.

42. Alexander N, Rodriguez M, Perez L, Caicedo JC, Cruz J, Prieto G, Arroyo JA,

Cotacio MC, Suarez M, de la Hoz F, Hall AJ: Case-control study of mosquito

nets against malaria in the Amazon region of Colombia. Am J Trop Med

Hyg 2005, 73:140-148.

38

Figure 1. Location of the Careiro Municipality, highlighting the areas of study.

39

Figure 2. Rainfall (A) and temperature (B) parameters, in the studied localities during

the period of the study (2008-2010).


40

Table 1. Anopheline species collected in the Panelão and Castanho Sítio

Communities during the four cross-sectional studies.

http://www.malariajournal.com/content/11/1/351/table/T1

41

Additional file 2. Human biting rates for the total of anophelines, Anopheles darlingi and Anopheles albitarsis presented by collection

and localities.

Localities

1st collection 2nd collection 3rd collection 4th collection

Overall An.

darlingi

An.

albitarsis

Overall An.

darlingi

An.

albitarsis

Overall An.

darlingi

An.

albitarsis

Overall An.

darlingi

An.

albitarsis

Major road 3.1 2.8 0.1 3.1 2.5 0 2.1 1.6 0.1 1.1 0.1 0.8

Sideroad 1 6.9 5.4 1.0 9.6 8.8 0.8 0.6 0.5 0.1 3.0 1.4 1.5

Sideroad 2 7.4 5.6 1.6 11.6 9.6 1.5 0.3 0.1 0.1 6.9 1.3 5.0

Sideroad 3 11.9 11.4 0.4 10.1 10.1 0 1.1 1.0 0.0 3.8 2.5 1.3

Sideroad 4 5.4 5.4 0.0 0.4 0.4 0 2.8 2.3 0.0 0.8 0.4 0.4

Sideroad 5 16.3 15.6 0.1 6.4 5.9 0 0.5 0.3 0.0 4.0 4.0 0.0

Km 114-123 8.5 6.4 2.0 8.9 6.4 0.9 1.5 0.8 0.5 6.9 0.3 5.1

Km 124-133 9.0 4.6 1.5 1.9 0.3 0.8 14.0 0.1 10.8 9.3 0.0 7.4

Km 134-143 15.1 13.4 0.9 6.0 0.0 3.1 14.0 2.8 5.6 15.4 0.3 10.1

Km 144-151 11.5 4.3 1.1 2.8 0.1 0.4 14.3 0.5 14.0 21.0 0.0 21.0

42

Additional file 1. Abundance and diversity of the anopheline fauna presented by collection.

Species

1st collection 2nd collection 3rd collection 4th collection All collections

Total (%) Indoor Outdoor Indoor Outdoor Indoor Outdoor Indoor Outdoor Indoor (%) Outdoor (%)

An. darlingi 116 623 95 323 11 107 4 78 226 1131 1357

An. albitarsis 31 72 42 83 136 246 213 401 422 802 1224

An. braziliensis 14 80 2 27 9 136 18 85 43 328 371

An. argyritarsis 6 34 1 64 0 0 0 0 7 98 105

An. nuneztovari 6 2 2 12 5 3 7 26 20 43 63

An. deaneorum 2 25 0 0 0 0 0 0 2 25 27

An. triannulatus 5 4 3 1 0 5 2 3 10 13 23

An. oswaldoi 0 1 0 4 0 2 0 0 0 7 7

An. mediopunctatus 0 1 0 3 0 0 0 0 0 4 4

An. matogrossensis 0 3 0 0 0 0 0 0 0 3 3

An. evansae 0 1 0 0 0 0 0 1 0 2 2

43

An. punctimacula 0 0 0 2 0 0 0 0 0 2 2

An. peryassui 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1

Total 180 846 145 519 161 499 244 595 730 2459 3189 (100)

Margalef’s index 1.16 1.48 1.00 1.28 0.59 0.80 0.73 0.94 0.91 1.54

44

Figure 3. Correlation between malaria incidence rates (MIRs) and human biting rates

(HBRs) for Anopheles darlingi (A) and Anopheles albitarsis (B), with 95% confidence

intervals (dashed lines), respectively.


45

Figure 4. Patterns of human biting rates (HBRs) for Anopheles darlingi (black line)

and Anopheles albitarsis (gray line) presented by timepoint of collection.


46

Figure 5. Decreasing patterns of overall malaria incidence rates (A), vivax malaria

(B) and falciparum malaria (C) (trend line in red) throughout the 18 months of the

study in the study areas.


47

Figure 6. Decreasing pattern of prevalence of Plasmodium vivax (black line) and

Plasmodium falciparum (gray line) carriers, detected by peripheral blood PCR

positivity, in the four cross-sectional evaluations performed in the study areas.

48

6. CONCLUSÃO

Os dados representam uma contribuição importante para o conhecimento

sobre a diversidade de anofelinos, tendo o Anopheles darlingi como o principal vetor

responsável pela transmissão nestes locais, além da composição da fauna de

anofelinos ser similar a de trabalhos anteriores.

As coletas realizadas durante o período de estudo foi possível observar que a

incidência de malária está intimamente ligada a presença do principal vetor An.

darlingi, pois nas primeiras coletas a incidência de malária foi alta nas comunidades

assim como a grande abundância do vetor, sendo bem diferente nas últimas coletas

já que a suscetibilidade de An. darlingi à medidas de controle foi alta nos

assentamentos rurais estudados, apresentando uma queda devido a utilização por

parte dos moradores de mosquiteiros impregnados, o uso de telagens que acabaram

mudando no ambiente.

As medidas de controle influenciaram na diminuição desse anofelino já que o

mesmo possui o comportamento antropofágico. Apesar de outras outras espécies

terem sido positivas detectando a resença do Plasmodium isso não teve nenhum

influência com a incidência de malária na região.

Porém, ressalta-se a necessidade de estudos com períodos maiores de

acompanhamento e incluindo informações sobre à resistência dos vetores aos

inseticidas.

Nas áreas endêmicas para malária da América Latina, onde P. vivax é a

espécie predominante, os estudos sobre o comportamento dos vetores locais

deveriam ser conduzidos na rotina dos programas de controle de malária para

predizer o impacto do controle integrado sobre a transmissão da doença.

49

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Alves FP, Gil LH, Marrelli MT, Ribolla PE, Camargo EP, Da Silva LH. Asymptomatic carriers of Plasmodium spp. as infection source for malaria vector mosquitoes in the Brazilian Amazon. J Med Entomol. 2005 Sep;42(5):777-9.

2. Bahia AC, Kubota MS, Tempone AJ, Pinheiro WD, Tadei WP, Secundino NF, et al. Anopheles aquasalis Infected by Plasmodium vivax displays unique gene expression profiles when compared to other malaria vectors and plasmodia. PLoS One. 2010;5(3):e9795.

3. Barata RC. [Malaria in Brazil: trends in the last ten years]. Cad Saude Publica. 1995 Jan-Mar;11(1):128-36.

4. Carter R, Mendis KN. Evolutionary and historical aspects of the burden of malaria. Clin Microbiol Rev. 2002 Oct;15(4):564-94.

5. Cerávolo IP. Caracterização Imunológica e Molecular da Duffy Binding Protein do Plasmodium vivax em Áreas de Transmissão de Malária da Região Amazônica e Extra-Amazônica Brasileira. Belo Horizonte: Fundação Oswaldo Cruz; 2007.

6. Consoli RLO. Principais mosquitos de importância sanitária no Brasil. Janeiro Rd, editor: Fiocruz; 1994.

7. Coura JR, Suarez-Mutis M, Ladeia-Andrade S. A new challenge for malaria control in Brazil: asymptomatic Plasmodium infection--a review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006 May;101(3):229-37.

8. D'Alessandro U, Olaleye BO, McGuire W, Langerock P, Bennett S, Aikins MK, et al. Mortality and morbidity from malaria in Gambian children after introduction of an impregnated bednet programme. Lancet. 1995 Feb 25;345(8948):479-83.

9. da Silva-Nunes M, Codeco CT, Malafronte RS, da Silva NS, Juncansen C, Muniz PT, et al. Malaria on the Amazonian frontier: transmission dynamics, risk factors, spatial distribution, and prospects for control. Am J Trop Med Hyg. 2008 Oct;79(4):624-35.

10. da Silva NS, da Silva-Nunes M, Malafronte RS, Menezes MJ, D'Arcadia RR, Komatsu NT, et al. Epidemiology and control of frontier malaria in Brazil: lessons from community-based studies in rural Amazonia. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2010 May;104(5):343-50.

11. de Arruda M, Carvalho MB, Nussenzweig RS, Maracic M, Ferreira AW, Cochrane AH. Potential vectors of malaria and their different susceptibility to

50

Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax in northern Brazil identified by immunoassay. Am J Trop Med Hyg. 1986 Sep;35(5):873-81.

12. de Barros FS, Honorio NA. Man biting rate seasonal variation of malaria vectors in Roraima, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2007 Jun;102(3):299-302.

13. de Oliveira EC, dos Santos ES, Zeilhofer P, Souza-Santos R, Atanaka-Santos M. Spatial patterns of malaria in a land reform colonization project, Juruena municipality, Mato Grosso, Brazil. Malar J. 2011;10:177.

14. Deane L, Deane M. Notes on the distribution and biology of anophelines in the Northeastern and Northern regions of Brazil [in Portuguese]. Rev Ser Esp Saúde Publ. 1948:827-965.

15. Deane LM. Malaria vectors in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1986:5-14.

16. Escalante AA, Cornejo OE, Rojas A, Udhayakumar V, Lal AA. Assessing the effect of natural selection in malaria parasites. Trends Parasitol. 2004 Aug;20(8):388-95.

17. Faran ML, K. A handbook of the Amazonian species of Anopheles Nyssorhynchus) (Diptera: Culicidae). Syst M, editor1981.

18. Flores W, Chang J, Barillas E. Rapid assessment of the performance of malaria control strategies implemented by countries in the Amazon subregion using adequacy criteria: case study. Malar J. 2011;10:379.

19. Forattini OP: Culicidologia Médica, Volume 2. São Paulo: Editora USP; 2002.

20. Forattini OP. Culicidologia Médica. São Paulo: Edusp, 2003.

21. Fundação de Medicina Tropical. 2013 [cited Jan, 30]. Available from: http://www.fmt.am.gov.br/layout2011/vigiweb/vigiwebcons4.asp.

22. Fundação Nacional de Saúde. Controle de Malária. Diretrizes técnicas. In: Ministério da Saúde. Brasília/DF; 1996.

23. Galardo AK, Arruda M, D'Almeida Couto AA, Wirtz R, Lounibos LP, Zimmerman RH. Malaria vector incrimination in three rural riverine villages in the Brazilian Amazon. Am J Trop Med Hyg. 2007 Mar;76(3):461-9.

24. Gething PW, Elyazar IR, Moyes CL, Smith DL, Battle KE, Guerra CA, et al. A long neglected world malaria map: Plasmodium vivax endemicity in 2010. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6(9):e1814.

http://www.fmt.am.gov.br/layout2011/vigiweb/vigiwebcons4.asp

51

25. Grietens KP, Muela Ribera J, Soto V, Tenorio A, Hoibak S, Aguirre AR, et al. Traditional nets interfere with the uptake of long-lasting insecticidal nets in the Peruvian Amazon: the relevance of net preference for achieving high coverage and use. PLoS One. 2013;8(1):e50294.

26. Guerra CA, Howes RE, Patil AP, Gething PW, Van Boeckel TP, Temperley WH, et al. The international limits and population at risk of Plasmodium vivax transmission in 2009. PLoS Negl Trop Dis. 2010;4(8):e774.

27. Harbach RE: Genus ANOPHELES Meigen, 1818. Mosquito Taxonomic Inventory. Book Genus ANOPHELES Meigen, 1818 Mosquito Taxonomic Inventory. 2011.

28. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística: Censo Demográfico 2010. Brasília: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística; 2010.

29. Klein TA, Lima JB, Tada MS. Comparative susceptibility of anopheline mosquitoes to Plasmodium falciparum in Rondonia, Brazil. Am J Trop Med Hyg. 1991 Jun;44(6):598-603.

30. Lengeler C. Insecticide-treated bed nets and curtains for preventing malaria. Cochrane Database Syst Rev. 2004(2):CD000363.

31. Lomar AV, Vidal JE, Lomar FP, Barbas CV, de Matos GJ, Boulos M. Acute respiratory distress syndrome due to vivax malaria: case report and literature review. Braz J Infect Dis. 2005 Oct;9(5):425-30.

32. Lourenco-de-Oliveira R, Guimaraes AE, Arle M, da Silva TF, Castro MG, Motta MA, et al. Anopheline species, some of their habits and relation to malaria in endemic areas of Rondonia State, Amazon region of Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1989 Oct-Dec;84(4):501-14.

33. Machado P, Mendes C, Rosálio VED, Arez AP. A contribuição dos polimorfismos humanos do eritrócito na proteção contra a malária. Rev Pan-Amaz Saude. 2010;1(4):85-96.

34. Malaria RB. Refined/Updated GMAP Objectives, Targets, Milestones and Priorities Beyond 2011. 2011.

35. Manguin S, Roberts DR, Andre RG, Rejmankova E, Hakre S. Characterization of Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae) larval habitats in Belize, Central America. J Med Entomol. 1996 Mar;33(2):205-11.

36. Margalef D. La teoría de la información en ecología] [in Spanish]. Mem R Acad Cienc Artes. 1957:373-9.

52

37. Mendis K, Sina BJ, Marchesini P, Carter R. The neglected burden of Plasmodium vivax malaria. Am J Trop Med Hyg. 2001 Jan-Feb;64(1-2 Suppl):97-106.

38. Ministério da Saúde. Aspectos epidemiológicos. Available from: http://portal.saude.gov.br/portal/saude/profissional/area.cfm?id_area=1526. 2010.

39. Ministério da Saúde. Manual da terapêutica da Malária. In: Fundação Nacional de Saúde. Brasília/DF; 2001. p. 104.

40. Ministério da Saúde. Relatório de Situação - Amazonas. In: Sistema Nacional de Vigilância. 5ª edição. Brasília/DF; 2011.

41. Moutinho PR, Gil LH, Cruz RB, Ribolla PE. Population dynamics, structure and behavior of Anopheles darlingi in a rural settlement in the Amazon rainforest of Acre, Brazil. Malar J. 2011;10:174.

42. Oliveira-Ferreira J, Lacerda MV, Brasil P, Ladislau JL, Tauil PL, Daniel-Ribeiro CT. Malaria in Brazil: an overview. Malar J. 2010;9:115.

43. Perandin F, Manca N, Calderaro A, Piccolo G, Galati L, Ricci L, et al. Development of a real-time PCR assay for detection of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, and Plasmodium ovale for routine clinical diagnosis. J Clin Microbiol. 2004 Mar;42(3):1214-9.

44. Picot S. [Is Plasmodium vivax still a paradigm for uncomplicated malaria?]. Med Mal Infect. 2006 Aug;36(8):406-13.

45. Povoa M, Wirtz R, Lacerda R, Miles M, Warhurst D. Malaria vectors in the municipality of Serra do Navio, State of Amapa, Amazon Region, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2001 Feb;96(2):179-84.

46. Povoa MM, Conn JE, Schlichting CD, Amaral JC, Segura MN, Da Silva AN, et al. Malaria vectors, epidemiology, and the re-emergence of Anopheles darlingi in Belem, Para, Brazil. J Med Entomol. 2003 Jul;40(4):379-86.

47. Povoa MM, de Souza RT, Lacerda RN, Rosa ES, Galiza D, de Souza JR, et al. The importance of Anopheles albitarsis E and An. darlingi in human malaria transmission in Boa Vista, state of Roraima, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006 Mar;101(2):163-8.

48. Price RN, Tjitra E, Guerra CA, Yeung S, White NJ, Anstey NM. Vivax malaria: neglected and not benign. Am J Trop Med Hyg. 2007 Dec;77(6 Suppl):79-87.

53

49. Rejmankova E, Rubio-Palis Y, Villegas L. Larval habitats of anopheline mosquitoes in the Upper Orinoco, Venezuela. J Vector Ecol. 1999 Dec;24(2):130-7.

50. Rocha MdNA. Adesão ao tratamento da malária: um estudo em comunidades do entorno da usina hidrelétrica de Tucuruí – Pará. Belém: Universidade Federal do pará; 2008.

51. Rubio-Palis Y, Zimmerman RH. Ecoregional classification of malaria vectors in the neotropics. J Med Entomol. 1997 Sep;34(5):499-510.

52. Schneider P, Bousema JT, Gouagna LC, Otieno S, van de Vegte-Bolmer M, Omar SA, et al. Submicroscopic Plasmodium falciparum gametocyte densities frequently result in mosquito infection. Am J Trop Med Hyg. 2007 Mar;76(3):470-4.

53. Service MW, H T. The Anopheles vector. edition F, editor: 2002.

54. Sinka ME, Bangs MJ, Manguin S, Rubio-Palis Y, Chareonviriyaphap T, Coetzee M, et al. A global map of dominant malaria vectors. Parasit Vectors. 2012;5:69.

55. Snounou G, Viriyakosol S, Zhu XP, Jarra W, Pinheiro L, do Rosario VE, et al. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Mol Biochem Parasitol. 1993 Oct;61(2):315-20.

56. Snow RW, Guerra CA, Noor AM, Myint HY, Hay SI. The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria. Nature. 2005 Mar 10;434(7030):214-7.

57. Tadei WP, dos Santos JM, Costa WL, Scarpassa VM. [Biology of Amazonian Anopheles. XII. Occurrence of Anopheles species, transmission dynamics and malaria control in the urban area of Ariquemes (Rondonia)]. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1988 May-Jun;30(3):221-51.

58. Tadei WP, Thatcher BD, Santos JM, Scarpassa VM, Rodrigues IB, Rafael MS. Ecologic observations on anopheline vectors of malaria in the Brazilian Amazon. Am J Trop Med Hyg. 1998 Aug;59(2):325-35.

59. Veronesi R, Focaccia R. Tratado de Infectologia. São Paulo: Atheneu, 1999.

60. World Health Organization. Map production. Public Health Information and Geographic Information Systems. World Health Organization; 2012.

61. World Health Organization. Vector Control. Available: http://www.who.int/malaria/vector_control/en/. Accessed 2013 Feb 10.

54

62. World Health Organization: WHO Malaria Report. Geneva: World Health Organization; 2011.

55

8 ANEXOS

8 ANEXO A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Projeto Epidemiologia da Malária no

Município do Careiro (Amazonas)

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM) está estudando a malária

em algumas pessoas que moram no Município do Careiro-Castanho. Os

pesquisadores não sabem quantas vezes as pessoas pegam malária durante o ano,

na sua comunidade, e também não sabemos os efeitos destas várias infecções

sobre sua saúde. Para nos ajudar a entender o que acontece, pedimos que você

participe deste estudo. Precisamos acompanhar mais ou menos 1.200 pessoas de

todas as idades para ver os tipos de malária que elas têm durante o ano.

Este é um estudo de observação sobre a malária (especialmente a malária vivax)

em toda a população do P. A. Panelão e do Castanho Sítio, que deve durar por volta

de 2 (dois) anos. Você não vai precisar fazer nada de especial para participar do

projeto. Você vai receber o diagnóstico de malária todas as vezes que tiver algum

sintoma da doença e receberá o tratamento de graça, como já acontece. Durante

todo o tempo do estudo, você ficará com um cartão de identificação individual, que

deverá apresentar todas as vezes em que fizer um exame para o diagnóstico de

malária.

Um grupo de pessoas treinadas pela equipe de pesquisadores permanecerá na área

do estudo a fim de realizar o diagnóstico de malária de maneira mais rápida. Todas

as vezes em que você estiver com sintomas de malária, será colhida uma amostra

de sangue do dedo para realizar uma lâmina para o diagnóstico de malária e para a

realização de testes mais específicos para malária e avaliação de anemia e o tipo do

sangue. A cada 6 (seis) meses, mesmo que você não tenha nenhum sintoma de

malária, será feita uma visita a todas as pessoas que aceitarem participar do estudo

em que será feito um exame clínico e será colhido sangue do dedo para realizar

uma lâmina para o diagnóstico de malária, avaliação de anemia e outros testes mais

específicos para malária. Se a lâmina de malária for positiva, você receberá

novamente o tratamento. No caso de outro exame mais específico que indique que

56

você pode ter o parasito da malária no sangue sem ter sintomas, você será

acompanhado semanalmente por um pesquisador para avaliar a real necessidade

do tratamento, já que o tratamento desnecessário quando não houver sintomas

também pode trazer complicações.

Portanto, nós queremos sua permissão para testar seu sangue para malária. Depois

desses testes, queremos também sua permissão para guardar o restante de sangue

que sobrar para poder fazer algum outro estudo no futuro, relacionado à malária. O

material deverá ficar guardado sem nenhuma identificação pessoal na Fundação de

Medicina Tropical do Amazonas (Hospital Tropical), em Manaus, sob a

responsabilidade dos pesquisadores.

Para coletar a amostra de sangue do dedo, você poderá sentir um pouco de dor,

mas que deve parar dentro de alguns minutos. Se a limpeza do dedo não for correta,

pode haver uma infecção, mas isto é muito infreqüente e se acontecer será

acompanhada por nossa equipe de trabalho. Não há nenhum outro risco em

participar desse estudo.

O principal benefício em participar desse estudo é o recebimento de mais

informações sobre malária e o diagnóstico e tratamento mais rápido da doença,

porque nossa equipe ficará morando na área durante todo o tempo. Com o

diagnóstico e tratamento mais rápido, é possível que haja uma diminuição do

número de casos de malária na sua comunidade. Entretanto, você não receberá

nenhum incentivo financeiro. Se tiver algum prejuízo em participar desta pesquisa,

converse com um de nossos pesquisadores para que ele possa lhe ajudar.

Se você concordar em participar, todas as informações coletadas serão

confidenciais. Todo o material será guardado com um número-código, sem colocar

seu nome. Seu nome nunca será usado em público. Se em qualquer momento você

quiser se retirar do estudo, você poderá fazer isso, e mesmo assim terá direito ao

diagnóstico e ao tratamento da malária, por nossa equipe.

Contato dos pesquisadores

Se você tiver alguma pergunta ou dúvida sobre esse estudo, procure um de nossos

pesquisadores no Careiro para que eles possam tirar sua dúvida. Você poderá

também fazer contato com o Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda,

57

responsável pelo projeto, na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

(Gerência de Malária), em Manaus (Av. Pedro Teixeira, 25). Nosso telefone para

contato é o 3656 0620. Você ficará com este termo de consentimento assinado e

outra cópia será arquivada pelos pesquisadores.

Eu, ……………………………………………………………………………………......,

entendi tudo sobre o Estudo da Epidemiologia da Malária no Careiro e autorizo a

minha participação no estudo ou a participação do menor por quem sou responsável

........................................................................................................................................

.....

Nome do menor (se o consentimento for para um menor)

....................................................................................................................

Assinatura do voluntário (ou responsável)

……………………………………………................................. Data: ….. / ….. / …..

Polegar direito

Assinatura do pesquisador que conversou com o voluntário

…………………………………………………………………………………………….

Data: ….. / ….. / …...

58

8. ANEXO B – Aprovação do CONEP

9.

61

Código POP POP_MAL_TC_001_v01_PT

Título Censo populacional e recrutamento dos participantes no

estudo “Epidemiologia da Malária no Município do Careiro,

Amazonas”.

Idioma da versão

original

PORTUGUÊS

Traduzido por:

Data & assinatura

Revisado por:

Marcus Vinícius G.

Lacerda

Data & assinatura

Aprovado por:

Pedro Alonso

Data & assinatura

Data de

aplicação:

02 de junho de

2008

Data da próxima

revisão:

Emenda Razão da emenda

1 OBJETIVOS

Descrever os procedimentos para conduzir o censo completo da população vivendo

em P.A. Panelão e Castanho Sítio (Careiro) e recrutar participantes para o estudo

“Epidemiologia da Malária no Município do Careiro, Amazonas” a ser conduzido

nestas localidades.

2 DEFINIÇÕES

3 APLICÁVEL A

Atividades do censo e recrutamento.

4 RESPONSABILIDADES

Todo pessoal envolvido na condução do censo ou do recrutamento dos

participantes.

POP_MAL_TC_001_v01_PT

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

GERÊNCIA DE MALÁRIA

62

5 POP'S RELACIONADOS

Seguimento de participantes no estudo “Epidemiologia da Malária no Município do

Careiro, Amazonas” (versão atual do POP_MAL_TC_002_PT).

6 PROCEDIMENTOS

O estudo epidemiológico da malaria será conduzido em duas localidades do Careiro

(Estado do Amazonas): P.A. Panelão e Castanho Sítio. Previamente ao início do

estudo será realizado um censo completo da população destas áreas.

6.1 Mapeamento da área

Previamente ao início do censo da população será construído um mapa do P.A. Panelão e Castanho Sítio.

Todas as casas serão marcadas no mapa.

6.2 Censo da população

Uma equipe visitará cada casa em cada uma das duas localidades. Durante a visita na casa a equipe cumprimentará a família e explicará a razão

da visita. Eles pedirão para falar com o chefe da família ou outro membro responsável

da mesma que possa responder questões sobre a casa e os seus ocupantes. Se o chefe/respondedor concordar em participar do censo, começará a

numeração da casa e a coleta da informação.

6.2.1 Informação referente à casa

O número da casa será concedido (na ordem seqüencial aos números das casas prévias)

o O número será pintado na parte externa da casa (parede). A casa será georeferenciada usando um GPS. O número da casa será registrado no mapa. Será preenchido um Questionário de censo (versão atual do

POP_MAL_TC_001_A01) para cada casa. O chefe da casa ou responsável responderá todas as perguntas sobre a casa

e seus membros. Será coletada a seguinte informação para cada casa e registrada na ficha do questionário:

o Número da casa (igual ao código do GPS da casa) o Endereço o Número de pessoas morando permanentemente na casa o Características da casa e dos bens de valor, como indicadores do

estado sócio-econômico o Medidas de controle da malária usadas na casa

6.2.2 Informação sobre os membros da casa

Será coletada informação de todas as pessoas que moram permanentemente na casa, mesmo se elas não estiverem presentes no momento da visita.

Não serão registrados os visitantes que estiverem na casa temporariamente.

63

Na segunda parte do Questionário de censo, será registrada informação sobre cada um dos membros da casa. Cada linha da tabela será usada para um membro diferente.

Cada membro será registrado seguindo uma ordem específica: o membro 01 será o chefe da casa, o membro 02 a esposa/parceira (o) do chefe, logo os outros adultos e depois as crianças em ordem de idade decrescente (primeiro o mais velho e no final o mais jovem).

A informação sobre o nome, data de nascimento, gênero, parentesco com o chefe da casa e entrada na comunidade será coletada para cada membro.

A pessoa da equipe do projeto que preencher a informação anotará seu código, assinatura e a data ao final de cada linha.

6.2.3 Número de identificação permanente

Cada membro do censo receberá um número de identificação permanente, o mesmo que será usado para a sua identificação em todas as seguintes visitas do estudo e do censo.

O formato do número de identificação permanente será: |__|-|__|__|__| - |__|__|

o O primeiro número será o código da comunidade o Os seguintes três números corresponderão ao número da casa o Os últimos dois números corresponderão ao código do membro dentro

da casa Portanto, todos os membros da mesma casa terão os mesmos quatro

primeiros números e um código de membro diferente. O número de identificação permanente é único e identifica o sujeito durante

toda a duração do censo/estudo. Um número de identificação permanente nunca deve mudar e o número de

identificação permanente de um membro que sai da comunidade nunca deverá ser concedido para um novo membro.

No momento do censo, um cartão (Cartão de identificação, versão atual do POP_MAL_TC_001_A02) com o número de identificação permanente, nome, data de nascimento e gênero do sujeito será entregue para todos os participantes.

Toda vez que os participantes procurem o estabelecimento de saúde ou tenham uma visita do estudo marcada lhes será solicitado o cartão.

6.2.4 Atualização do censo

O censo será atualizado durante as visitas nos cortes transversais e toda vez que os investigadores sejam comunicados de novas entradas.

Perguntar-se-á aos participantes se eles passaram períodos ≥ 2 semanas fora da área de estudo. Caso seja afirmativa a resposta, as datas de saída e entrada serão registradas no Questionário de visita transversal (versão atual do POP_MAL_TC_002_A01), de acordo com o POP do Seguimento dos participantes no estudo epidemiológico de malária no Careiro (versão atual do POP_MAL_TC_002).

Os nascimentos ou imigrantes serão registrados durante as visitas dos cortes transversais ou toda vez que eles sejam comunicados aos investigadores.

64

o A nova criança será registrada como um novo membro no Questionário de censo da casa onde ele/ela mora (uma nova linha será adicionada ao questionário já existente). Esse registro será feito usando uma caneta de cor diferente, de tal forma que este dado permita saber qual é o novo registro que deve ser adicionado à base de dados do censo.

o O novo participante será registrado como um novo membro no Questionário de censo da casa onde eles forem morar ou um novo Questionário de censo será preenchido se eles forem morar numa nova casa não censada.

o Será emitido então um cartão do estudo com um novo número de identificação permanente.

o Um termo de consentimento será obtido dos pais/responsáveis ou do participante e um questionário de recrutamento (Questionário de entrada no estudo (versão atual do POP_MAL_TC_001_A03) será preenchido.

Quando um participante recrutado deixa o estudo por emigração, renúncia ao consentimento ou morte, um Questionário de retirada (versão atual do POP_MAL_TC_001_A04) será preenchido especificando a data e o motivo da saída.

6.2.5 Mudança de residência

Quando um participante mudar de residência, um Questionário de mudança de residência (versão atual do POP_MAL_TC_001_A05) será preenchido.

O novo endereço e a data da mudança de residência serão registrados.

6.2.6 Entrada dos questionários na base de dados

Todos os questionários serão digitados duplamente nas bases de dados em Manaus, usando o software OpenClinicaTM (versão atual do POP_MAL_GE_001).

Quando for feita uma atualização do Questionário de censo (cada atualização será feita com caneta de cor diferente), a nova informação será digitada.

6.3 Termo de Consentimento e recrutamento de participantes no estudo.

O recrutamento de participantes será feito depois que o censo esteja completo.

Será feita uma lista a parte de todos os membros do censo, os quais serão convidados a participar do estudo.

A visita de recrutamento pode ser realizada antes ou no mesmo dia da visita do primeiro corte transversal (versão atual do POP_MAL_TC_002). Será pedido a eles para apresentarem o seu cartão do censo (Cartão de identificação).

65

6.3.1 Termo de consentimento

No dia da visita de recrutamento a equipe do estudo obterá um termo de consentimento de todos os participantes.

O consentimento para menores será obtido dos pais/responsáveis. Um membro da equipe do estudo convidará cada sujeito a participar no

estudo. Ele/ela lerá o termo de consentimento completo para o sujeito da pesquisa, resumindo os pontos mais importantes e respondendo qualquer pergunta que possa surgir.

Ele/ela perguntará ao sujeito questões acerca dos aspectos mais cruciais do estudo. Se o sujeito não responde corretamente, o membro da equipe esclarecerá e explicará esses aspectos novamente.

O termo de consentimento não será assinado até que as perguntas cruciais tenham sido respondidas.

Duas cópias do termo de consentimento serão então assinadas e datadas pelo membro da equipe do estudo e pelo participante. Participantes analfabetos que não possam assinar deixarão uma impressão digital no termo de consentimento.

Uma cópia do termo de consentimento será entregue ao participante e outra cópia ficará no arquivo da equipe do estudo.

6.3.2 Recrutamento

Só sujeitos que assinem o termo de consentimento serão recrutados no estudo.

Um Questionário de entrada no estudo (versão atual do POP_MAL_TC_001_A03) será preenchido para todos os sujeitos convidados a participar.

o Para aqueles que aceitem e assinem o termo de consentimento serão preenchidas todas as perguntas.

o Para aqueles que forem convidados a participar, mas recusarem assinar o termo de consentimento, só será preenchida a informação sobre identificação do sujeito e especificado que o termo de consentimento não foi assinado. Estes sujeitos não serão convidados para as próximas visitas do estudo, porém será coletada informação através da detecção passiva de casos se eles procurarem o estabelecimento de saúde.

Sujeitos recrutados no estudo terão seu Cartão de identificação marcado com um carimbo no verso do mesmo, para permitir que sejam identificados durante a detecção passiva de casos e as visitas do estudo.

7 REFERÊNCIAS

66

8 REGISTRO DOS ANEXOS

TÍTULO DO ANEXO CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo

versão/idioma):

Título do anexo 1: Questionário de censo POP_MAL_TC_001_A01_v01_PT

Título do anexo 2: Cartão de identificação POP_MAL_TC_001_A02_v01_PT

Título do anexo 3: Questionário de entrada no

estudo

POP_MAL_TC_001_A03_v01_PT

Título do anexo 4: Questionário de retirada POP_MAL_TC_001_A04_v01_PT

Título do anexo 5: Questionário de mudança de

residência


NOME DO ANEXO: CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo

versão/idioma):

Novo Justificativa Criado por:

Data e

assinatura

Aprovado por:

Data e

assinatura

Revisão

Tradução


versão/idioma):


Data e

assinatura

Aprovado por:

Data e

assinatura

Revisão

Tradução


versão/idioma):


Aprovado por:

Revisão

67

Tradução

Data e

assinatura

Data e

assinatura


versão/idioma):


Data e

assinatura

Aprovado por:

Data e

assinatura

Revisão

Tradução


versão/idioma):


Data e

assinatura

Aprovado por:

Data e

assinatura

Revisão

Tradução


versão/idioma):


Data e

assinatura

Aprovado por:

Data e

assinatura

Revisão

Tradução

A versão atual deste POP foi traduzida a

____________________ e a versão traduzida entra em efeito

em ___/___/_____.

dd mm aa

68

Assinatura do responsável: ______________________

69

IDENTIFICAÇÃO DA COLETA E CARACTERIZAÇÃO DA CASA

1. 9 Data da coleta

|__|__| / |__|__|__| /|__|__|

2. 10 Código do dia de coleta

|__|__|

3. Número da casa (vide dados da casa no censo populacional) |__|__|

4. Hora da coleta (1=18-19h; 2=19-20h; 3=20-21h; 4=21-22h) |__|

5. Local da coleta (1=intradomiciliar; 2=peridomiciliar) |__|

6. Pessoa que realizou a coleta (1=Nelson; 2= Iria; 3=Elcimar) |__|

7. 11 Temperatura inicial do meio-ambiente (°C)

|__|__|,|_

_|

8. Temperatura final do meio-ambiente (°C) |__|__|,|__|

9. Tempo desde a última borrifação (dias) |__|__|__|

10. Criação de caprinos? (1=sim; 2=não) |__|

11. Criação de cachorro? (1=sim; 2=não) |__|

12. Criação de eqüinos? (1=sim; 2=não) |__|

13. Criação de aves? (1=sim; 2=não) |__|

14. Criação de felinos? (1=sim; 2=não) |__|

QUANTIDADE DE VETORES IDENTIFICADOS

15. An. darlingi |__|__|

16. An. nuneztovari |__|__|

17. An. albitarsis |__|__|

18. An. oswaldoi |__|__|

19. An. braziliensis |__|__|

20. An. rangeli |__|__|

21. An. mediopunctatus |__|__|

22. An. evansae |__|__|

23. An. matogrossensis |__|__|

EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA NO CAREIRO

IDENTIFICAÇÃO DE VETORES CAPTURADOS


70

24. An. galvaoi |__|__|

25. An. triannulatus |__|__|

26. An. deoneorum |__|__|

27. An. punctimacula |__|__|

28. An. peryassui |__|__|

29. An. rondoni |__|__|

30. An. argyritaris |__|__|

31. Ma. titiians |__|__|

32. Ma. amazonensis |__|__|

33. Ma. indubitans |__|__|

34. Ma. humeralis |__|__|

35. Ma. sp. |__|__|

36. Cq. Jusctamansonia |__|__|

37. Cq. Venezuelensis |__|__|

38. Cq. Hermanoi |__|__|

39. Cq. Albicosta |__|__|

40. Cq. Niquicans |__|__|

41. Cq. Sp |__|__|

42. Cx. quinquefasciatus |__|__|

43. Cx. dectator |__|__|

44. Cx. nigripalpus |__|__|

45. Cx. coronator |__|__|

46. Cx. declarator |__|__|

47. Cx. usquatus |__|__|

48. Ad. squamipennis |__|__|

49. Ur. lowii |__|__|

50. Ur. pulcherrima |__|__|

71

51. Ur. geometrica |__|__|

52. Ur. ditaenionota |__|__|

53. Ur. nataliae |__|__|

54. Ur. calosomata |__|__|

55. Ae. albopictus |__|__|

56. Ae. aegypti |__|__|

57. Ae. serratus |__|__|

58. Ae. scapularis |__|__|

59. Ae. fuhuis |__|__|

60. Ae. arborealis |__|__|

61. Ps. amazonica |__|__|

62. Ps. albipes |__|__|

63. Ps. albigenu |__|__|

64. Ps. ferox |__|__|

65. Ps. dimidiata |__|__|

66. Ps. cingulata |__|__|

67. Outra espécie (1=sim, 2=não)

|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|_

_|__|

|

_

_

|

68. Código, assinatura, data |__|__|__|

________________

|__|__| / |__|__|__| /|__|__|

72

Código POP POP_MAL_LB_001_v02D_PT

Título Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a

partir da cabeça e do tórax dos mosquitos.

Idioma da versão

original

PORTUGUÊS

Elaborado por:

Gisely Cardoso de

Melo

Keillen Monick M.

Campos

Data & assinatura

Revisado por:

Gisely Cardoso de

Melo

Data & assinatura

Aprovado por:

Data & assinatura

Data de

aplicação:

06 de fevereiro

de 2011

Data da

próxima

revisão:


V02

Revisão dos procedimentos de extração de DNA de Plasmodium spp. dos

mosquitos

1 OBJETIVOS

Descrever o procedimento da extração de DNA de Plasmodium spp. a partir da

cabeça e do toráx dos mosquitos.

2 DEFINIÇÕES

Não se aplica

3 APLICÁVEL A

Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa.

4 RESPONSABILIDADES

Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa.

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

GERÊNCIA DE MALÁRIA

POP_MAL_LB_001_v03D_PT

73

Equipe do laboratório de biologia molecular e entomologia.


Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de plasmódio

(versão atual do POP_MAL_LB_002).

Procedimento para extração de Plasmodium spp. a partir de sangue total (versão atual do POP_MAL_LB_003). Procedimento para realização de PCR Nested para detecção de plasmódio (versão atual do POP_MAL_LB_004).

6 PROCEDIMENTOS

6.1 Recursos necessários

6.1.1 Mosquitos coletados de ambiente rural intra e peridomiciliar, armazenados em sílica.

6.1.2 Materiais

1. Chelex 100 (RESINA)

2. Tubos de 1,5mL

3. Estiletes entomológicos

4. Lâminas

5. PBS 1x

6. Pipetas automáticas de 100 µL e 200 µL

7. Ponteiras com filtro para pipetas automáticas

6.1.3 Equipamentos

1. Banho Maria

2. Balança Analítica

3. Agitador Magnético

4. Vórtex

5. Centrífuga

74

6.2 Obtenção do DNA

6.2.1 Protocolo de Chelex 100 (RESINA) Chelex® Molecular Biology Grade

Resin (Bio-Rad Laboratories)

1. Esterilizar uma espátula, bailarina e um béquer antes de utilizar

2. Preparar 50 mL de Chelex 100 a 5% da resina

3. Pesar 2,5 gramas em uma balança analítica e acrescentar 50 mL de Água milliq

em um béquer juntamente com a resina e a bailariana

4. Colocar o béquer sobre um agitador magnético misturando o Chelex rapidamente

evitando variações em sua concentração e resultado

5. Retirar 300 µL e adicionar em tubos de 1,5 mL tampando-os imediatamente.

6.2.2 Extração de DNA com Chelex 100 (RESINA)

1. Identificar os tubos de 1.5 mL

2. Separar os mosquitos (um a um ou em pool)

3. Adicionar 300 µL da solução de Chelex e transferir os mosquitos (a cabeça e o

tórax) para esses tubos que contém a resina

4. Vortexar

5. Aquecer as amostras 100°C durante 10 minutos

6. Centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos (para depositar a resina)

7. Transferir o sobrenadante com o uso de pipetas automáticas de 100 µL e 200 µL

para tubos novos com a mesma identificação dos tubos anteriores

8. Armazenar a -20°C.

6.2.3 Precipitação do DNA

1. Adicionar o sobrenadante em tubos novos e autoclavados com 1000µL de etanol

100% e 45µL de acetato de sódio

2. Vortexar

75

3. Precipitar a 14000rpm por 15 min

4. Retirar o sobrenadante cuidadosamente para não tocar na parede do tubo (pellet)

5. No mesmo tubo adicionar 800 µL de etanol a 80%

6. Centrifugar a 14000rpm por 10 min

7. Retirar o sobrenadante deixando um pouco de etanol no fundo do tubo (20 µL)

para não retirar o pellet

8. Deixar secar completamente na câmara de fluxo

9. Adicionar 20 µL de T.E

10. Armazenar no -20ºC

OBS:

Deve se quantificar a amostra (nanodrop) e se caso a quantidade exceda 100 µL de

DNA, é necessário diluir a amostra, podendo se utilizar 15 nanogramas.

6.3 Biossegurança

odo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1)

7 REFERÊNCIAS

1. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.

43. REGISTRO DOS ANEXOS


versão/idioma):

NOME DO ANEXO:

CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo

versão/idioma):

Novo Criado por: Aprovado por:

76

Revisão

Data e assinatura

Data e assinatura

Traduçã

o

A versão atual deste POP foi traduzida a ____________________ e

a versão traduzida entra em efeito em ___/___/_____.


dd mm aa

77

Código POP_MAL_TCCódigo POP POP_MAL_LB_002_v02D_PT

Título Procedimento para realização de PCR em tempo real para

detecção de plasmódio.

Idioma da versão

original

PORTUGUÊS

Elaborado por:

Gisely Cardoso de

Melo

Keillen Monick Martins

Campos

Data & assinatura

Revisado por:

Gisely Cardoso de

Melo

Data & assinatura

Aprovado por:

Data & assinatura

Data de aplicação:

06 de fevereiro de

2011

Data da próxima

revisão:


V02

Revisão dos procedimentos de PCR em tempo real

.

1 OBJETIVOS

Descrever o procedimento de realização de PCR em tempo real para detecção de

plasmódio.

2 DEFINIÇÕES

PCR: a reação em cadeia da polimerase é definida como uma técnica molecular que

permite a amplificação de

Procedimento Operacional Padrão

Gerência de Malária


78

pequenas quantidades de um DNA específico a partir de um molde do DNA, usando

uma reação enzimática simples, sem um organismo vivo. O limiar de detecção da

técnica é muito superior ao da gota espessa (técnica padrão utilizada no diagnóstico

rotineiro da malária): cerca de 0,004 parasitos/<L.

PCR Tempo Real (PCR TR): Variação da técnica de PCR para detecção de sinal

fluorescente permitindo a quantificação de ácidos nucléicos em tempo real, assim

como a detecção qualitativa de seqüências de ácidos nucléicos utilizando análises

de curvas de dissociação ou por meio de sondas marcadas. Não requer tratamento

pós-PCR para visualização do resultado.

Iniciador (primer): uma pequena seqüência de DNA ou RNA a partir da qual pode

começar a replicação do DNA.

3 APLICÁVEL A

Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa

clínica.

4 RESPONSABILIDADES

Equipe do laboratório de biologia molecular envolvida na realização da PCR em

tempo real.


Seguimento dos participantes no estudo “Epidemiologia da Malaria no Municipio do

Careiro, Amazonas (versão atual do POP_MAL_TC_002).

Caracterização da Malária Grave por Plasmodium vivax na Fundação de Medicina

Tropical do Amazonas, Brasil (versão atual do POP_MAL_HO_001).

Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de mosquitos

inteiros ou cabeça + tórax (versão atual do POP_MAL_LB_001).

Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de sangue total

(versão atual do POP_MAL_LB_003)

79

6 PROCEDIMENTOS

6.1 Recursos necessários

6.1.1 Amostra obtida por extração de DNA seguindo POP_MAL_LB_003 e POP_MAL_LB_001.

6.1.2 Materiais

1. Pipetas automáticas de 10 µL, 100 µL e 1000 µL


3. Tubos de 1,5 e 2,0 mL

4. Microplacas de 0,1mL, com 96 poços, para sistema de PCR em Tempo Real

5. Filme óptico para vedar as microplacas

6.1.3 Equipamentos

1. Vórtex

2. Sistema de PCR em Tempo Real 7500 Fast Applied Biosystems

6.1.4 Reagentes

Reagente Armazenamento

Taqman Universal PCR Master Mix -20°C

Sondas (Tamra Taqman® Probe) -20°C

Iniciadores (primers) da reação -20°C

Água MiliQ Temperatura

ambiente

Iniciadores:

Plasmodium vivax

80

VIV-F 5’ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT

VIV-R 5’ATTTACTCAAAGTAACAAGGACTTCCAAGC

Plasmodium falciparum

FAL-F 5’CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAA

FAL-R 5’TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAA

Sondas

FAL probe (FAM) 5_-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA 3'

TAMRA

VIV probe (VIC) 5_-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC 3' TAMRA

6.2 PCR em Tempo Real

Para a detecção dos principais parasitos que infectam humanos, foi padronizada

uma reação de PCR em Tempo Real baseada no gene que codifica a menor

subunidade do rRNA (1). Os iniciadores (primers) usados para amplificação do P.

vivax, P. falciparum e P. malarie flanqueiam regiões espécie-específicas de 120pb,

396pb e 144pb respectivamente.

6.2.1 Reação de PCR em Tempo Real

P. vivax

Extrato de DNA (50 a 100ng) 2µL

Taqman Master Mix 10 µL

VIV Probe 200nM

Iniciador F 300 nM

Iniciador R 300 nM

H2O para PCR 1µL

P. falciparum

Extrato de DNA (50 a 100ng) 2µL

Taqman Master Mix 2X 10 µL

81

FAL Probe 200 nM

Iniciador F 300 nM

Iniciador R 300 nM

H2O para PCR 1µL

Condições de amplificação:

1: 50ºC/2 minutos

2: 95ºC/10 minutos

3: 95ºC/15 segundos- total de 45 ciclos

4. 60 ºC/ 1 minuto

Modulo de corrida: Standard 7500

6.2.2 Em cada reação de PCR, é realizado um controle negativo (água miliQ) e um

controle positivo contendo DNA de Plasmodium sp (P. falciparum - MR4, P. vivax –

amostras de cultivo in vitro e in vivo, respectivamente).

82

6.2.3 As amostras são testadas em duplicatas em cada experimento.

CP

V

CP

V

CP

F

CP

F CN CN

CPV: Controle positivo de Plasmodium vivax

CPF: Controle positivo de Plasmodium falciparum

CN: Controle negativo

6.2.4 As análises são realizadas pelo software distribuído pelo fabricante – Applied

Biosystems “7500 Fast System SDS Software”, e utiliza-se como ponto de corte Cts

abaixo de 40 ciclos.

6.2.5 Os valores do CT são comparadas às dos controles para verificar a

especificidade da reação e do produto gerado.

6.3 Restrições e limitações do procedimento

Como se faz a amplificação de DNA, a técnica não permite distinguir as diferentes

formas biológicas do parasito (trofozoíto, esquizonte, merozoíto ou gametócito).

Existe a possibilidade de contaminação da reação no momento

1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 11 10

A

B

C

D

E

F

G

H

83

da extração do DNA e no momento do preparo da reação do PCR, dada a

sensibilidade de amplificação da técnica.

6.4 Biossegurança

Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (2).

6.5 Registro dos resultados

O resultado da PCR será preenchido pelo responsável do procedimento no

questionário Resultado da PCR (POP_MAL_LB_002_A01_v01_PT), indicando

resultado por espécie, o motivo em caso de não ter realizado o

exame, a ordem de armazenamento, o código e a assinatura do membro da equipe

do projeto e a data do resultado.

7 REFERÊNCIAS

1. De Monbrison F, Angei C, Staal A, Kaiser K, Picot S. Simultaneous identification of

the four human Plasmodium species and quantification of Plasmodium DNA load in

human blood by real-time polymerase chain

reaction. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg 2003;97:387–390.

2. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de

microbiologia. Brasília: Ministério

da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.

84



versão/idioma):

Título do anexo 1: Resultado da PCR POP_MAL_LB_002_A01_v02_PT

NOME DO ANEXO:


versão/idioma)

POP_MAL_LB_002_A01_v02_PT:

Novo Justificativa

Adequação da numeração dos itens

Criado por:

Gisely Cardoso

de Melo

Data e assinatura

Aprovado por:

Data e assinatura

Revisão X

Traduçã

o



em ___/___/_____.


dd mm aa

85

INFORMAÇÃO PESSOAL

1. Data da visita (DD/MM/AA) |__|__| / |__|__| / |__|__|

2. Número de identificação permanente |__|-|__||__||__| - |__|__|

3. Nome |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|_

_|__|

4. Sobrenome |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|_

_|__|

5. Se for mulher, está grávida? (1=sim, 2=não, 3=não sabe, 9=NA) |__|

6. Se a resposta for sim, quantos meses de gestação?

(1=1,2 ou 3 meses, 2=4,5 ou 6 meses,

3=7,8 ou 9 meses, 9=NA)

|__|

7. Número de gestações (incluindo a gravidez atual) (99=não aplicável) |__|__|

HISTÓRIA DA DOENÇA

8. Número de dias desde o início deste episódio |__|__|

9. Febre (1=sim, 2=não; número de

dias)

|__|; |__|__|

10. Calafrios (1= sim, 2=não) |__|

11. Sudorese (suor intenso) (1= sim, 2=não) |__|

12. Cefaléia (dor de cabeça) (1= sim, 2=não) |__|

13. Mialgia (dor muscular) (1= sim, 2=não) |__|

14. Artralgia (dor nas juntas) (1= sim, 2=não) |__|

15. Mal-estar (1= sim, 2=não) |__|

16. Náusea (1= sim, 2=não) |__|

17. Vômito (1= sim, 2=não) |__|

18. Diarréia (1= sim, 2=não) |__|

Consórcio P. vivax

EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA NO

CAREIRO

Questionário de detecção passiva de casos

(POP_MAL_TC_002_A02_v01_PT)

86

19. Tosse (1= sim, 2=não) |__|

20. Dispnéia (falta de ar) (1= sim, 2=não) |__|

21. Convulsão (1= sim, 2=não) |__|

22. Hiporexia ou anorexia (falta de apetite) (1= sim, 2=não) |__|

23. Lombalgia (dor nas costas) (1= sim, 2=não) |__|

24. Dor abdominal (dor na barriga) (1= sim, 2=não) |__|

25. Fraqueza (1= sim, 2=não) |__|

26. Outro sintoma (1= sim, 2=não) |__|

27. Se a resposta for sim, qual? |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|_

_|__|

28. Nos últimos 30 dias, a pessoa tomou algum antimalárico? (1= sim, 2=não) |__|

29. Se sim, especificar (1=CQ, 2=CQ+PQ, 3=MQ+AS, 4=Coartem, 5=outro,

9=NA)

|__|

EXAME CLÍNICO

30. Temperatura axilar (ºC) |__|__|.|__|

31. Batimento de asa de nariz (só crianças) (1=sim, 2=não,

9=NA) |__|

32. Tiragem (1=sim, 2=não,

9=NA)

|__|

33. Crepitações (1=sim, 2=não,

9=NA)

|__|

34. Sibilos ou roncos (1=sim, 2=não,

9=NA)

|__|

35. Palidez cutâneo-mucosa (1= sim, 2=não) |__|

36. Desidratação (1=Não, 2=leve, 3=moderada,

4=grave)

|__|

37. Edema (1= sim, 2=não) |__|

38. Icterícia (1= sim, 2=não) |__|

EXAMES LABORATORIAIS

87

39. Foram coletadas duas gotas espessas? (1= sim, 2=não) |__|

40. Foi coletado um papel de filtro? (1= sim, 2=não) |__|

41. Se sim, número de identificação da amostra

42. Se não, por quê (1=sem critério, 2=amostra prévia <24 h, 3=recusa, 4=outro) |__|

43. Hemoglobina (g/dl) (99.9=não realizado) |__|__|.|__

|

44. Código, assinatura, data. |__|__|__|

_____________________

|__|__| / |__|__| / |__|__|

DIAGNÓSTICO PRELIMINAR

45. Resultado preliminar

da gota espessa

(0=Negativo, 1=P. falciparum, 2=P. vivax, 3=P.

malariae, 4=infecção mista por P. falciparum + P. vivax,

9=não realizado)

|__|

TRATAMENTO

46. Cloroquina (1= sim, 2=não) |__|

47. Primaquina (1= sim, 2=não) |__|

48. Artemeter+Lumefantrina (Coartem) (1= sim, 2=não) |__|

49. Quinino+doxiciclino (1= sim, 2=não) |__|

50. Mefloquina (1= sim, 2=não) |__|

51. Mefloquina+Artesunato (1= sim, 2=não) |__|

52. Clindamicina (1= sim, 2=não) |__|

53. Outros tratamentos? (1= sim, 2=não) |__|

54. Se sim, especificar |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|

55. Código, assinatura, data. |__|__|__|

_____________________

|__|__| / |__|__| / |__|__|

Etiqueta

88

Código POP POP_MAL_LB_003_v02D_PT

Título Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a

partir de sangue total.

Idioma da versão

original

PORTUGUÊS

Elaborado por:

Gisely Cardoso de

Melo

Data & assinatura

Revisado por:

Data & assinatura

Aprovado por:

Data & assinatura

Data de aplicação:

05 de julho de 2010

Data da próxima

revisão:


V02 Revisão dos procedimentos de extração

.

1 OBJETIVOS

Descrever o procedimento da extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de

sangue total..

2 DEFINIÇÕES

Não se aplica

3 APLICÁVEL A

Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa.

4 RESPONSABILIDADES

Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa.

Equipe do laboratório de biologia molecular.


Procedimento Operacional Padrão

Gerência de Malária

S

89


Seguimento dos participantes no estudo “Epidemiologia da Malária no Município do

Careiro, Amazonas” (versão atual do POP_MAL_TC_002).

Caracterização da Malária Grave por Plasmodium vivax na Fundação de Medicina

Tropical do Amazonas, Brasil (versão atual do POP_MAL_HO_001).

Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de plasmódio

(versão atual do POP_MAL_LB_002).

6 PROCEDIMENTOS

6.1.1 Sangue total de paciente a ser testado, armazenado em tubo ou papel de filtro.

6.1.2 Materiais

1. Pipetas automáticas de 10 µL, 100 µL e 1000 µL


3. Tubos para 1,5 e 2,0 mL

6.1.3 Equipamentos

1. Centrífuga

2. Vortex

3. Banho Maria

6.1.4 Reagentes

Reagente Armazenamento

1. Tampão Lise dos tecidos (Tampão ATL) Temperatura

ambiente

2. Proteinase K Temperatura

ambiente

3. Tampão de Lise (Tampão AL) Temperatura

ambiente

90

4. Etanol 95% PA Temperatura

ambiente

5. Tampão de Lavagem 1 (Tampão AW1) Temperatura

ambiente

6. Tampão de Lavagem 2 (Tampão AW2) Temperatura

ambiente

7. Tampão de Eluição (Tampão AE) Temperatura

ambiente

6.2 Obtenção de sangue total

6.2.1 Em papel de filtro

1. Abrir o envelope que contém o papel de filtro.

2. Realizar a punção digital utilizando lanceta estéril descartável depois de limpar a

área.

3. Limpar a primeira gota obtida após a punção e coletar no papel de filtro

quantidade suficiente para saturação do papel de filtro.

4. Secar em Temperatura ambiente. Fechar o envelope. Armazenar entre 2ºC a 8ºC.

5. No laboratório de biologia molecular, os papéis de filtro serão armazenados

seguindo a mesma ordem que as lâminas. Isto é, seguindo a numeração das caixas

de lâminas: cada caixa de papéis de filtro terá no máximo 50 amostras, seguindo a

ordem das lâminas.

6.2.2 Por punção endovenosa

1. Obter 5 ml de sangue venoso em tubo de EDTA identificado.

2. Centrifugar a 14000 rpm por 10 min.

3. Desprezar o soro e colocar a papa de hemácias em criotubo identificado.

4. Armazenar os criotubos a – 20ºC em caixa de plástico ou papelão identificada e

numerada.

5. No laboratório de biologia molecular, os criotubos serão armazenados seguindo a

mesma ordem que as lâminas.

91

6.3 Extração do DNA.

Para a extração do DNA a partir de sangue total será usado o Protocolo de Extração

do QIAMP® DNA Mini Kit da Qiagen.

6.3.1 Procedimento para extração do DNA a partir de papel de filtro

1. Cortar 3 círculos de 3 mm de diâmetro do papel de filtro e colocá-los em um tubo

eppendorf de 1,5 mL. Pipetar 180 µL do Tampão ATL.

2. Incubar a 85°C no banho Maria por 10 minutos. Remover as bolhas por

centrifugação.

3. Adicionar 25 µL de Proteinase K e agitar no vórtex. Incubar a 56° C por 1 hora.

Remover as bolhas por centrifugação.

4. Continuar com o procedimento comum (6.3.3)

6.3.2 Procedimento para extração do DNA a partir de tubo

1. Pipetar 20 µL de Proteinase K (2) num tubo eppendorf de 1,5 mL.

2. Adicionar 200 µL de amostra ao tubo. Se não houver 200 µL de amostra,

adicionar o volume apropriado de PBS.

3. Adicionar 200 µL de Tampão AL (3) a amostra. Vortexar por 15 segundos.

4. Incubar por 56 por 10 minutos.

5. Continuar com o procedimento comum (6.3.3)

6.3.3 Procedimento comum para extração do DNA

1. Adicionar 200 µL de Etanol absoluto (96 a 100%) e agitar no vórtex

imediantamente. Remover as bolhas por centrifugação.

92

2. Cuidadosamente transferir o conteúdo do tubo para o tubo filtro. Tampar e

centrifugar a 8000 rpm por 1 munto. Descartar o filtrado com o tubo. Colocar o tubo

filtro em um novo tubo coletor.

3. Cuidadosamente adicionar 500 µL de tampão AW1 e centrifugar a 8000 rpm por 1

minuto. Descartar o filtrado com o tubo. Colocar em um novo tubo coletor.

4. Cuidadosamente adicionar 500 µL de tampão AW2 e centrifugar a 14000 rpm por

3 minutos.

5. Descartar o tubo coletor com o filtrado. Colocar o tubo filtro em novo tubo coletor e

centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto.

6. Colocar o tubo filtro em um tubo eppendorf de 1,5 mL novo. Descartar o filtrado e

o tubo coletor. Adicionar cuidadosamente 150 µL de tampão AE ou água destilada e

incubar à temperatura ambiente por 1 minuto. Centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.

7. Armazenar por -20°C.

7 BIOSSEGURANÇA

Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1).

8 RERERÊNCIAS

1. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de

microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.

93



versão/idioma):

NOME DO ANEXO:


versão/idioma):

Novo Criado por:

Data e

assinatura

Aprovado por:

Data e

assinatura

Revisão

Tradução



em ___/___/_____.


dd mm aa

AÇÕES INTEGRADAS DE CONTROLE DIMINUEM A … · Anopheles Darlingi e a incidência de malaria em...

Documents

Transcript of AÇÕES INTEGRADAS DE CONTROLE DIMINUEM A … · Anopheles Darlingi e a incidência de malaria em...