58

4 RESULTADOS

4.1 Etapa de seleção

Os biofilmes foram elaborados e analisados quanto às propriedades de barreira

ao vapor de água e propriedades mecânicas (resistência máxima à tração e

porcentagem de alongamento na ruptura). Os biofilmes das formulações 17, 18 e 19

representam os pontos centrais da matriz de experimentos mostrada na Tabela 3.4.

4.1.1 Propriedades de barreira ao vapor de água

Os valores da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) calculados de

acordo com a eq. 3.1 para as formulações estudadas encontram-se na Tabela 4.1. A

variação da TPVA em relação ao biofilme controle pode ser melhor visualizada na

Figura 4.1.

59

Tabela 4.1 – Valores médios da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) dos

biofilmes e sua variação em relação ao controle, elaborados na etapa de

seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na

Tabela 3.4.

Formulação TPVA3

(g.dia-1.m-2)

Variação da TPVA em relação à formulação controle

(%) 1 55 ± 10 a,b,c,d,e 4,3 2 51 ± 5 a,b,c -2,7 3 60 ± 7 a,b,c,d,e,f 13,0 4 65 ± 11 a,b,c,d,e,f 23,2 5 47 ± 19 a,b -11,9 6 74 ± 6 c,d,e,f 39,5 7 84 ± 9 f,g 59,5 8 47 ± 6 a,b -10,3 9 62 ± 4 a,b,c,d,e,f 17,3 10 43 ± 2 a -18,9 11 52 ± 10 a,b,c -1,6 12 81 ± 6 e,f 52,4 13 83 ± 4 f,g 57,3 14 107 ± 9 g 103,2 15 45 ± 2 a -15,1 161 53 ± 6 a,b,c,d - 172 43 ± 3 a -17,8 182 71 ± 1 b,c,d,e,f 35,1 192 78 ± 15 d,e,f 47,6

1 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 2 Pontos centrais do delineamento experimental. 3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa (p>0,05).

DMS (diferença mínima significativa) = 25g.dia-1.m-2

60

Figura 4.1. Taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) dos biofilmes

elaborados na etapa de seleção de acordo com o delineamento

experimental apresentado na Tabela 3.4. Formulação 16 - sem

ingredientes antimicrobianos. Formulações 17, 18 e 19 representam

os pontos centrais (C).

A Tabela 4.2 indica os valores obtidos para a TPVA por ingrediente estudado na

etapa de seleção.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

(C)

18

(C)

19

(C)Formulação

TP

VA

(g.

dia-1

.m-2)

61

Tabela 4.2 – Valores médios da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) por

ingrediente estudado na etapa de seleção dos biofilmes (nível –1: 0,00%

para todos os ingredientes; nível +1 : cravo, canela e pimenta vermelha =

0,30%; óleo essencial de laranja = 0,20%; mel = 0,50%, extrato de

própolis = 0,70%; café = 1,00%).

Ingrediente TPVA (g.dia-1.m-2)

Níveis - 1 + 1

Cravo em pó 65,63 ± 3,85 60,54 ± 3,85

Canela em pó 67,58 ± 3,79 58,58 ± 3,79

Óleo essencial de laranja 68,50 ± 3,74 57,67 ± 3,74

Pimenta vermelha em pó 54,46 ± 3,51 71,71 ± 3,51

Mel 60,83 ± 3,86 65,33 ± 3,86

Extrato de própolis 65,29 ± 3,86 60,88 ± 3,86

Café em pó 55,96 ± 3,63 70,21 ± 3,63

Análise de variância (ANOVA) foi aplicada nos resultados indicando que a adição

de cravo em pó, canela em pó, mel, extrato de própolis e óleo de laranja não influenciou

estatisticamente a TPVA dos biofilmes. No entanto a adição de pimenta vermelha em

pó e café em pó aumentou significativamente a TPVA, conforme pode ser observado

nas Figuras 4.2 e 4.3.

62

Figura 4.2. Taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) em função da adição de

pimenta vermelha em pó (nível –1: 0,00%, nível 0: 0,15%, nível +1: 0,30%)

nos biofilmes.

Figura 4.3. Taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) em função da adição de

café em pó (nível –1: 0,00%, nível 0: 0,50%, nível +1: 1,00%).

Os valores de permeabilidade ao vapor de água (PVA) calculados de acordo com

as eq. 3.2a e 3.2b, para as formulações dos biofilmes são apresentados na Tabela 4.3.

Pimenta Vermelha em pó

.

- 1 0 1 4 8

53

58

63

68

73

78 T

PV

A (

g.di

a-1.m

-2)

Café em pó

TP

VA

(g.

dia-1

.m-2

)

- 1 0 1 49

54

59

64

69

74

79

63

Tabela 4.3 – Valores médios de permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos biofilmes

e sua variação em relação ao controle, elaborados na etapa de seleção de

acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4.

Formulação PVA3

(g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1)

Variação da PVA em relação

à formulação controle (%)

1 479 ± 82 c,d,e,f + 79,3 2 691 ± 104 g,h + 66,4 3 427 ± 61 b,c,d,e + 65,7 4 480 ± 96 c,d,e,f + 47,7 5 223 ± 78 a,b - 37,3 6 407 ± 22 b,c,d,e + 65,9 7 665 ± 98 f,g,h + 64,9 8 661 ± 97 f,g,h + 47,3 9 418 ± 8 b,c,d,e + 55,6 10 196 ± 6 a - 12,5 11 692 ± 90 g,h + 40,4 12 523 ± 17 d,e,f,g + 61,5 13 756 ± 50 h,i + 74,7 14 957 ± 41 i + 77,2 15 289 ± 18 a,b,c - 50,3

161 353 ± 27 a,b,c,d - 172 600 ± 34 e,f,g,h + 59,0 182 495 ± 20 c,d,e,f,g + 27,2 192 556 ± 119 d,e,f,g,h + 45,7

1 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 2 Pontos centrais do planejamento experimental. 3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa (p>0,05).

DMS (diferença mínima significativa) : 206 g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1.

A partir dos dados apresentados na Tabela 4.3, observa-se que os biofilmes das

formulações 5, 10, 15 e 16 (controle) apresentaram os menores valores de

permeabilidade, sendo que a formulação 10 apresentou o menor valor médio e,

portanto representa a formulação de melhor desempenho em relação à esta

propriedade. A Figura 4.4 indica que a adição de alguns ingredientes ou combinação

deles promoveu modificações desejáveis na permeabilidade dos biofilmes, o que

também foi verificado para a variável taxa de permeabilidade ao vapor de água.

64

0

200

400

600

800

1000

1200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

(C)

18

(C)

19

(C)

Formulação

PV

A (

g.µ

m.m

-2.d

ia-1

.mm

Hg-1

)

Figura 4.4. Permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos biofilmes elaborados na

etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental

apresentado na Tabela 3.4. Formulação 16 - sem ingredientes

antimicrobianos. Formulações 17, 18 e 19 representam os pontos centrais

(C).

A Figura 4.5 indica que o café em pó foi o ingrediente que apresentou um efeito

mais significativo na permeabilidade ao vapor de água (PVA), confirmando os

resultados apresentados anteriormente. As formulações 5, 10 15 e 16 (controle)

possuem todos os ingredientes estudados exceto o café em pó.

65

Figura 4.5. Influência dos ingredientes antimicrobianos na permeabilidade ao vapor de

água (PVA) dos biofilmes estudados na etapa de seleção (p≤0,05).

Como observado anteriormente, a pimenta vermelha em pó influenciou

negativamente a TVPA, portanto pode-se concluir que o biofilme da formulação 15, que

contém este ingrediente, em relação a esta propriedade deve ser considerado como

aquele que apresenta restrições para a sua aplicação como material de embalagem.

4.1.2 Propriedades mecânicas

4.1.2.1 Resistência máxima à tração (Rmáx)

Os valores de Rmáx para as formulações dos biofilmes, calculados de acordo com

a eq. 3.3 estão apresentados na Tabela 4.4.

0 3 6 9 12 15

C:Mel A:Cravo AF+BG+DE F:P.Verm. G:Óleo de Laranja D:Própolis B:Canela AG+BF+CD BD+CF+EG AD+CG+EF AB+CE+FG AE+BC+DF AC+BE+DG E:Café

66

Tabela 4.4 – Valores médios de resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes e sua

variação em relação ao controle, elaborados na etapa de seleção de

acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4.

Formulação Rmáx 3

(MPa) Variação da Rmáx em

relação ao controle (%)

1 1,0 ± 0,1 a - 79,3 2 1,6 ± 0,2 b,c,d - 66,4 3 1,6 ± 0,1 c,d - 65,7 4 2,4 ± 0,4 f,g,h - 47,7 5 2,9 ± 0,4 h,i - 37,3 6 1,6 ± 0,2 b,c,d - 65,9 7 1,6 ± 0,3 c,d - 64,9 8 2,5 ±0,3 f,g,h - 47,3 9 2,1± 0,2 d,e,f - 55,6 10 4,1± 0,5 j - 12,5 11 2,8 ± 0,3 g,h - 40,4 12 1,8 ± 0,2 d - 61,5 13 1,2 ± 0,2 a,b,c - 74,7 14 1,1 ± 0,1 a,b - 77,2 15 2,3 ± 0,3 e,f,g - 50,3

161 4,7 ± 0,6 k - 172 1,9 ± 0,3 d,e - 59,0 182 3,4 ± 0,3 i - 27,2 192 2,5 ± 0,4 f,g,h - 45,7

1 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 2 Pontos centrais do planejamento experimental. 3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa (p>0,05).

DMS (diferença mínima significativa): 0,5.MPa.

Os resultados apresentados na Tabela 4.4 indicam que os valores obtidos para a

resistência máxima à tração dos biofilmes com adição de ingredientes antimicrobianos

são significativamente menores, em todos os casos, em relação ao do biofilme controle,

formulação 16 (sem ingredientes antimicrobianos) indicando que a adição dos

ingredientes afetou significativamente esta propriedade (ver Figura 4.6).

67

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

(C)

18

(C)

19

(C)Formulação

RM

áx (M

Pa)

Figura 4.6. Resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes elaborados na etapa de

seleção de acordo com o delineamento experimental apresentado na

Tabela 3.4. Formulação 16 – sem ingredientes antimicrobianos.

Formulações 17, 18 e 19 representam os pontos centrais (C).

A Figura 4.7 mostra que somente a canela não promoveu modificações na

resistência máxima à tração dos biofilmes em relação ao controle, enquanto que o café

em pó seguido da pimenta vermelha em pó e do cravo influenciaram significativamente

esta propriedade. A adição de própolis, mel e óleo essencial de laranja também

influenciou significativamente os resultados de resistência máxima à tração dos

biofilmes. A granulometria dos ingredientes antimicrobianos em pó pode ter sido a

causa da diminuição da resistência máxima à tração apresentada pelos biofilmes,

principalmente a do café em pó, significativamente maior que a da pimenta vermelha

em pó, conforme indicado na Tabela 3.1.

68

Figura 4.7. Influência dos ingredientes antimicrobianos sobre a resistência máxima à

tração (Rmáx) dos biofilmes estudados na etapa de seleção (p≤0,05).

A Tabela 4.5 mostra os valores da Rmáx obtidos, por ingrediente utilizado, de

acordo com os limites máximo (+1) e mínimo (-1).

Tabela 4.5 - Valores médios da Rmáx por ingrediente estudado na etapa de seleção

(nível –1: 0,00% para todos os ingredientes da tabela; nível +1 : cravo,

canela e pimenta vermelha = 0,30%; óleo essencial de laranja = 0,20%;

mel = 0,50%; extrato de própolis = 0,70%; café = 1,00%).

Ingrediente Rmáx (MPa)

Níveis - 1 + 1 Cravo em pó 2,5 ± 1,0 1,9 ± 0,7

Canela em pó 2,2 ± 1,0 2,2 ± 0,9

Óleo essencial de laranja 2,0 ± 1,0 2,4 ± 1,0

Pimenta vermelha em pó 2,7 ±1,0 1,7 ± 0,6

Mel 2,5 ± 1,0 1,9 ± 1,0

Extrato de própolis 2,5 ± 1,0 1,9 ± 0,7

Café em pó 2,7 ± 1,1 1,7 ± 0,7

0 3 6 9 12 15

B:Canela BD+CF+EG AG+BF+CD AC+BE+DG AD+CG+EF G:O. Laranja AF+BG+DE AB+CE+FG

C:Mel D:Propolis

AE+BC+DF A:Cravo

F:Pimenta E:Café

69

Os valores apresentados na Tabela 4.5 auxiliam a interpretação dos resultados

da resistência máxima à tração dos biofilmes. O gráfico Pareto apresentado na Figura

4.7 indica que somente a canela em pó não influenciou esta propriedade, porém pode

ser observado na Tabela 4.5 que a adição de cravo em pó, pimenta vermelha em pó,

mel, extrato de própolis e café em pó diminuiu a resistência máxima à tração dos

biofilmes, ou seja, os valores da Rmáx foram inferiores nos biofilmes elaborados com

estes ingredientes antimicrobianos (nível +1). O óleo essencial de laranja, por outro

lado, aumentou a resistência máxima à tração do biofilme. Vale ressaltar que o valor

obtido para esta propriedade da formulação controle (sem ingredientes antimicrobianos)

foi de 4,7 ± 0,6 MPa e a do ponto central (nível 0) foi de 2,6 ± 0,6 MPa.

4.1.2.2 Alongamento na ruptura (%)

Na Tabela 4.6, estão apresentados os resultados obtidos da porcentagem de

alongamento na ruptura. A adição dos ingredientes antimicrobianos nos biofilmes

reduziu esta propriedade conforme pode ser observado na Figura 4.8.

70

Tabela 4.6 – Valores médios do alongamento na ruptura (%) dos biofilmes elaborados

na etapa de seleção de acordo com o delineamento experimental

apresentado na Tabela 3.4.

Formulação Alongamento na ruptura (%) 3 Variação do alongamento na ruptura (%)

1 61,0 ± 11 b - 63,0 2 41,0 ± 3,3 a - 75,1 3 112,1 ± 8,1 d - 31,9 4 81,4 ± 7,5 c - 50,6 5 103,1 ± 16,2 d - 37,4 6 111,2 ± 10,0 d - 32,5 7 60,3 ± 6,6 b - 63,4 8 67,4 ± 8,4 b,c - 59,1 9 65,9 ± 12,4 b,c - 60,0 10 67,9 ± 13,4 b,c - 58,8 11 39,6 ± 5,4 a - 76,0 12 65,8 ± 7,6 b,c - 60,0 13 65,2 ± 11,6 b,c - 60,4 14 55,0 ± 6,0 a,b - 66,6 15 112,8 ± 13,4 d - 31,5

161 164,7 ± 17,1 e - 172 70,9 ± 14,4 b,c - 56,9 182 59,9 ± 4,4 b - 63,6 192 61,3 ± 7,8 b - 62,8

1 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 2 Pontos centrais do planejamento experimental da etapa de seleção dos ingredientes. 3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa (p>0,05).

DMS (diferença mínima significativa): 16,7 %.

71

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

180,0

200,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

(C)

18

(C)

19

(C)

Formulação

Alo

ng

am

en

to n

a R

up

tura

(%

)

Figura 4.8. Alongamento na ruptura (%) dos biofilmes elaborados na etapa de seleção

de acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.4.

Formulação 16- sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 17, 18 e

19 representam os pontos centrais (C).

A Figura 4.9 mostra a influência de cada ingrediente isoladamente, no

alongamento na ruptura apresentado pelos biofilmes, indicando que somente o cravo

em pó não alterou significativamente esta propriedade. No entanto, o café em pó

seguido pela canela em pó, mel, óleo essencial de laranja, pimenta vermelha em pó e

extrato de própolis, influenciaram esta propriedade.

72

Figura 4.9. Influência dos ingredientes antimicrobianos no alongamento na ruptura

(%) na etapa de seleção dos bilfilmes.

A Tabela 4.7 mostra os valores numéricos obtidos do alongamento na ruptura, por

ingrediente, considerando a concentração nos limites máximos (+1) e mínimo (-1).

Tabela 4.7 - Valores médios do alongamento na ruptura (%) por ingrediente estudado

na etapa de seleção (nível –1: 0,00% para todos os ingredientes da tabela;

nível +1 : cravo, canela e pimenta vermelha = 0,30%; óleo essencial de

laranja = 0,20%; mel = 0,50%; extrato de própolis= 0,70%; café = 1,00%).

Ingrediente Alongamento na ruptura (%)

Níveis - 1 + 1

Cravo em pó 80 ± 39 79 ± 29

Canela em pó 92 ± 37 66 ± 23

Óleo essencial de laranja 85 ± 39 73 ± 25

Pimenta vermelha em pó 83 ± 41 76 ± 24

Mel 88 ± 39 70 ±25

Extrato de própolis 81 ± 38 77 ± 28

Café em pó 102 ± 33 57 ± 13

0 4 8 12 16 20 24

A:Cravo

AE+BC+DF AF+BG+DE

D:Propolis F:Pimenta

AG+BF+CD

BD+CF+EG G:Oleo de Laranja

AD+CG+EF

AB+CE+FG AC+BE+DG

C:Mel B:Canela

E:Café

73

Pode-se concluir que a adição dos ingredientes canela em pó, óleo essencial de

laranja, pimenta vermelha em pó, mel, extrato de própolis e café em pó nos biofilmes

diminuiu significativamente a porcentagem de alongamento na ruptura dos biofilmes.

De fato, todos os ingredientes antimicrobianos utilizados, exceto o óleo essencial

de laranja, foram adicionados na forma de pó, o que pode justificar a redução da

porcentagem de alongamento na ruptura apresentada, em relação ao controle. Os

biofilmes elaborados com esses ingredientes não são homogêneos e portanto

apresentam mais de uma fase na sua estrutura, e por isso, nos locais do biofilme onde

existe ingrediente antimicrobiano pode ocorrer uma maior facilidade de ruptura.

Conclusão da etapa de seleção

Os resultados obtidos na etapa de seleção indicaram que as propriedades

mecânicas (porcentagem de alongamento na ruptura e a resistência máxima à tração)

dos biofilmes com adição dos ingredientes antimicrobianos foram modificadas em

relação aos obtidos para a formulação controle (formulação 16), que, em geral, diminuiu

os valores das propriedades mecânicas dos biofilmes.

O resultado era esperado, pois apesar dos ingredientes antimicrobianos em pó

(cravo, canela, pimenta vermelha e café) e do mel e extrato de própolis terem sido bem

incorporados na matriz de fécula de mandioca e plastificantes (sacarose e açúcar

líquido invertido), uma estrutura heterogênea foi formada na qual a ruptura do biofilme

foi facilitada e a resistência à tração diminuída.

A permeabilidade ao vapor de água e a taxa de permeabilidade ao vapor de água

de alguns biofilmes com ingredientes antimicrobianos apresentaram valores

estatisticamente iguais aos valores do biofilme controle (formulação 16). A presença de

sólidos (pós) na estrutura do biofilme pode justificar o fato de que alguns biofilmes

terem apresentado valores elevados com respeito às propriedades de barreira ao vapor

de água.

A adição de café em pó influenciou negativamente e de forma mais intensa que os

demais ingredientes todas as propriedades estudadas dos biofilmes. Uma provável

explicação é o fato do café possuir granulometria maior (Tabela 3.1) que a dos outros

74

ingredientes utilizados e por este motivo pode não ter sido incorporado de forma

homogênea na matriz do biofilme. É provável que a adição do café em pó tenha criado

pequenos furos no biofilme permitindo que o vapor de água permeasse mais facilmente.

Quanto às propriedades mecânicas, os prováveis furos criados no biofilme,

provavelmente alteraram o alongamento na ruptura por promoverem mais pontos onde

a ruptura foi facilitada.

Concluiu-se que os outros ingredientes antimicrobianos (cravo em pó, canela em

pó, mel, extrato de própolis, pimenta vermelha em pó e óleo essencial de laranja)

poderiam ser selecionados para a etapa de otimização, pois não foi possível identificar

claramente quais deles apresentaram melhor desempenho em todas as propriedades

de embalagem estudadas.

Como informação complementar, constatou-se que o mel e o extrato de própolis

requereram uma etapa a mais no processo de elaboração dos biofilmes pois foi

necessário o resfriamento do gel de amido formado antes da adição destes

ingredientes. Ainda, no caso do óleo essencial de laranja, o tempo de elaboração dos

biofilmes foi prolongado, uma vez que a adição deste ingrediente foi realizada,

previamente à sacarose, para posterior adição dos outros ingredientes da formulação,

para a sua incorporação homogênea.

A pimenta vermelha em pó também diminuiu a taxa de permeabilidade ao vapor de

água e a resistência máxima à tração dos biofilmes, pois assim como o café em pó,

apresenta dados de granulometria que também podem alterar a sua estrutura.

Existem vários relatos científicos referentes ao efeito dos ingredientes

antimicrobianos cravo em pó e canela em pó sobre microrganismos comumente

encontrados em produtos de panificação (GUYNOT et al., 2005; MATAN et al., 2005;

NIELSEN; RIOS, 2000). Além disso, os compostos antimicrobianos presentes no cravo

e na canela (eugenol, aldeído cinâmico entre outros) são citados na literatura como os

mais eficazes, entre os antimicrobianos naturais conhecidos, na inibição do crescimento

de microrganismos (BURT, 2004; DAVIDSON, 1997; FRAZIER; WESTHOFF, 1993;

PAULI, 2001).

De acordo com as conclusões acima citadas, na etapa de otimização, somente dois

ingredientes antimicrobianos, foram selecionados: cravo em pó e canela em pó.

75

4.2 Etapa de otimização

Os biofilmes foram elaborados e analisados quanto às propriedades de barreira

ao vapor de água e propriedades mecânicas (resistência máxima à tração e

porcentagem de alongamento na ruptura), conduzindo os mesmos procedimentos da

etapa de seleção. Os biofilmes das formulações 9, 10 e 11 representam os pontos

centrais da matriz de experimentos mostrada na Tabela 3.5.

4.2.1 Propriedades de barreira ao vapor de água

Os valores da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) e da

permeabilidade ao vapor de água (PVA) calculados de acordo com as eq. 3.1, 3.2a e

3.2b para as formulações estudadas encontram-se na Tabela 4.8. A variação da TPVA

e da PVA em relação ao biofilme controle pode ser melhor visualizada nas Figuras 4.10

e 4.11, respectivamente.

76

Tabela 4.8 – Valores médios da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) e

permeabilidade ao vapor de água (PVA) dos biofilmes elaborados na

etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental

apresentado na Tabela 3.5.

Formulação TPVA3

(g.dia-1.m-2)

PVA3

(g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1)

Variação da TPVA

(%)

Variação da PVA

(%) 1 114 ± 11 c 786 ± 116 a -26,9 0,1

2 111 ±18 b,c 1203 ± 195 b -28,8 53,2

3 81 ± 7 a,b 620 ± 109 a -48,1 -21,0

4 82 ± 13 a,b 816 ± 290 a,b -47,4 3,9

5 105 ± 15 a,b,c 770 ± 155 a -32,7 -1,9

6 91 ± 4 a,b,c 923 ± 49 a,b -41,7 17,6

7 90 ± 12 a,b,c 724 ± 160 a -42,3 -7,8

8 83 ± 5 a,b 710 ± 7 a -46,8 -9,6

91 84 ± 2 a,b 677 ± 18 a -46,2 -13,8

101 77 ± 10 a 639 ± 47 a -50,6 -18,6

111 79 ± 3 a 729 ± 102a -49,4 -7,1 122 156 ± 8 d 785 ± 107 a - -

1 Pontos centrais do delineamento experimental. 2 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa (p>0,05). DMS (Diferença Mínima Significativa): 30 g.dia-1.m-2 para TPVA e 416 g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1 para PVA.

Observa-se na Figura 4.10 que o biofilme controle (12) apresenta TPVA

significativamente superior aos demais biofilmes. Estes resultados indicam que os

ingredientes antimicrobianos cravo em pó e canela em pó reduziram esta propriedade

nas condições utilizadas neste estudo. É provável que os ingredientes antimicrobianos

tenham formado uma barreira à passagem do vapor de água por serem menos

permeáveis que os ingredientes utilizados na formulação base do biofilme (fécula de

mandioca, açúcar invertido e sacarose).

Os resultados encontrados podem ser considerados coerentes e em alguns

casos mais promissores do que em dados encontrados na literatura. García et al.

(2004) obtiveram o valor de 870 g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1 para a permeabilidade ao vapor

77

de água para biofilmes à base de metilcelulose (1% da formulação do biofilme) e 1040

g.µm.m-2.dia-1.mmHg-1para biofilmes elaborados com 1% de quitosana na formulação

total do biofilme. Rhim et al. (1998) relataram o valor de 19.006 g.µm.m-2.dia-1.

mmHg-1para a permeabilidade ao vapor de água para filmes elaborados com adição de

proteína isolada de soja, glicerina e amido dialdeído (10% sobre o peso da proteína de

soja).

Fakhouri et al. (2005) produziram biofilmes com 5% de glúten de trigo e 10% de

gelatina usando sorbitol como plastificante e obtiveram o valor de 225 g.µm.m-2.dia-

1.mmHg-1 para a permeabilidade ao vapor de água. Os resultados são similares aos

apresentados por Aydinli e Tutas (2000) que reportaram o valor de 244 g.µm.m-2. dia-1.

mmHg-1para biofilmes à base de goma locusta (LBG) tendo o polietileno glicol (PGE

200) como plastificante.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Formulação

TP

VA

(g

.dia

-1.m

-2)

Figura 4.10. Valores médios da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA) dos

biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com o

delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. Formulação 12 –

biofilme controle sem ingredientes antimicrobianos e formulações 9, 10 e

11, pontos centrais.

78

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Formulação

PV

A (

g.

µµ µµm

.m-2

.dia

-1.m

mH

g-1

)

Figura 4.11. Valores médios da permeabilidade ao vapor de água dos biofilmes

elaborado na etapa de otimização de acordo com o delineamento

experimental apresentado na Tabela 3.5. Formulação 12, biofilme controle

sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 9, 10 e 11 – pontos

centrais.

Observa-se na Figura 4.11 que o efeito da adição dos ingredientes

antimicrobianos na formulação do biofilme não foi similar ao obtido para a taxa de

permeabilidade ao vapor de água. Este fato ocorreu porque no cálculo da TPVA (eq.

3.1) a espessura dos bilfilmes não é considerada e por ser , em geral, muito variável, a

mesma pode influenciar os resultados da PVA (eq. 3.2a) calculados e mascarar

possíveis efeitos positivos ou não da adição dos ingredientes.

A Figura 4.12 ilustra como os ingredientes influenciaram a TPVA dos biofilmes,

indicando que a adição de cravo em pó até uma dada concentração reduziu

significativamente esta propriedade. Concentrações acima de 0,34% (nível + 1) deste

ingrediente, no entanto aumentaram a TPVA do biofilme. A mesma tendência ocorreu

79

para a canela em pó, porém o aumento da TPVA somente foi verificado para

concentrações próximas de 0,4% (nível máximo +1,41).

Figura 4.12 Influência dos ingredientes cravo e canela em pó sobre a taxa de

permeabilidade ao vapor de água (TPVA) de biofilmes elaborados de

acordo com o delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.

4.2.2 Propriedades mecânicas

4.2.2.1 Resistência máxima à tração

Na Tabela 4.9 estão mostrados os resultados obtidos de resistência máxima à

tração dos biofilmes elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento

experimental apresentado na Tabela 3.5. A adição de cravo em pó e canela em pó

reduziu esta propriedade de todos os biofilmes em relação ao controle, conforme pode

se melhor visualizado na Figura 4.13.

TP

VA

(g.

dia-1

.m-2

)

Cravo em pó

- 1,41 1, .41

Canela em pó

- 1,41 1,41

73

83

93

103

113

80

Tabela 4.9 - Valores médios da resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes

elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento

experimental apresentado na Tabela 3.5.

Formulação Rmáx 3

(MPa)

Variação da Rmáx em

relação ao controle (%) 1 2,21 ± 0,38 d - 41,99

2 1,94 ± 0,32 c,d - 49,08

3 2,24 ± 0,32 d - 41,21

4 2,07 ± 0,28 d - 45,67

5 2,06 ± 0,23 c,d - 45,93

6 1,85 ± 0,29 b,c,d - 51,44

7 2,16 ± 0,27 d - 43,31

8 1,71 ± 0,20 b,c - 55,12

91 1,52 ± 0,18 b - 60,10

101 2,21 ± 0,20 d - 41,99

111 1,20 ± 0,17 a - 68,50 122 3,81 ± 0,69 e -

1 Formulações 9, 10 e 11 – pontos centrais. 2 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 3Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa (p>0,05).

81

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Formulação

Rm

áx (

MP

a)

Figura 4.13. Valores médios da resistência máxima à tração (Rmáx) dos biofilmes

elaborados na etapa de otimização de acordo com o delineamento

experimental apresentado na Tabela 3.5. Formulação 12 – biofilme

controle sem ingredientes antimicrobianos. Formulações 9, 10 e 11 –

pontos centrais.

Os biofilmes das formulações 9, 10 e 11 (pontos centrais) apresentaram valores

médios para esta propriedade significativamente diferente, que pode ser explicado

pelos diferentes valores da área do corpo de prova considerados para o cálculo da Rmáx

(eq. 3.3). Os biofilmes elaborados nesta etapa contêm ingredientes antimicrobianos na

forma de pó incorporados na matriz e estes naturalmente apresentam grânulos de

tamanho variado (dentro da mesma granulometria) o que pode causar diferenças de

espessura mínima do corpo de prova, medida necessária ao cálculo da área dos

biofilmes.

4.2.2.2 Alongamento na ruptura (%)

82

Os resultados obtidos para o alongamento na ruptura dos biofilmes estão

apresentados na Tabela 4.10. Como pode ser observado na Figura 4.14, os

ingredientes antimicrobianos cravo em pó e canela em pó também reduziram esta

propriedade. No entanto, em geral, quanto menor a quantidade de ingredientes, maior

foi a porcentagem de alongamento na ruptura, fato comprovado pelos valores obtidos

em corpos de prova dos biofilmes das formulações 1 e 5, valores estes próximos ao

obtido do controle.

Tabela 4.10 –Valores médios do alongamento na ruptura (%) dos biofilmes elaborados

na etapa de otimização de acordo com delineamento experimental

apresentado na Tabela 3.5.

Formulação Alongamento na ruptura (%) 3 Variação do alongamento na ruptura (%)

1 139,97 ± 11,48 g - 41,99

2 119,91 ± 10,12 f - 49,08

3 101,52 ± 13,47 d,e - 41,21

4 61,95 ± 8,36 a,b - 45,67

5 116,16 ± 15,84 e,f - 45,93

6 57,66 ± 8,94 a - 51,44

7 85,4 ± 15,6 c,d - 43,31

8 88,01 ± 14,29 c,d - 55,12

91 93,92 ± 10,02 d - 60,10

101 77,94 ± 11,51 b,c - 41,99

111 93,99 ± 13,63 d - 68,50 122 171,17 ± 19,14 h -

1 Pontos centrais do delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. 2 Formulação controle, sem ingredientes antimicrobianos. 3 Valores com letras iguais indicam que não há diferença significativa (p>0,05).

83

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Formulação

Alo

ng

am

en

to n

a R

up

tura

(%

)

Figura 4.14. Valores médios do alongamento na ruptura (%) dos biofilmes elaborados

na etapa de otimização de acordo com o delineamento experimental

apresentado na Tabela 3.5. Formulação 12 – biofilme controle sem

ingredientes antimicrobianos. Formulações 9, 10 e 11 – pontos centrais.

A Figura 4.15 mostra a influência da adição dos ingredientes sobre o alongamento

na ruptura dos biofilmes e a adição da canela em pó indicou uma redução de forma

menos acentuada desta propriedade se comparada à adição do cravo em pó. A

granulometria do cravo em pó indica que este ingrediente possui maior tamanho de

partículas que a canela em pó, fato que pode explicar esta diferença no comportamento

dos biofilmes, pois as partículas podem estar facilitando a ruptura do filme durante sua

tração.

84

Figura 4.15 Influência dos ingredientes cravo e canela em pó sobre o alongamento na

ruptura (%) de biofilmes elaborados de acordo com o delineamento

experimental apresentado na Tabela 3.5.

O efeito da adição dos ingredientes antimicrobianos sobre o alongamento na

ruptura é melhor visualizado na Figura 4.16, indicando que houve diferenças

significativas para as distintas concentrações de cravo em pó, exceto para 0,34% e

0,20% (níveis +1 e 0). Esta informação pode ser importante na definição da formulação

de um biofilme a ser utilizado como embalagem antimicrobiana uma vez que o

incremento da concentração do ingrediente no biofilme pode representar efeito

antimicrobiano mais pronunciado, sem afetar o alongamento na ruptura.

Alo

ng

am

en

to n

a r

up

tura

(%

)

Cravo em pó

-1. ,41 1,41 Canela em pó

-1,41 1,41 70

80

90

100

110

120

130

85

Figura 4.16 Porcentagem de alongamento na ruptura em função da quantidade de

cravo em pó na formulação dos biofilmes elaborados de acordo com o

delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.

A canela em pó modificou, no entanto, de forma menos acentuada o

alongamento na ruptura dos biofilmes em comparação à adição do cravo em pó, como

pode ser observado na Figura 4.17, que indica claramente que a adição deste

ingrediente até 0,06% (nível –1), promoveu um maior alongamento em relação às

demais concentrações estudadas (de 0,20% até 0,40%).

Cravo em pó

Alo

ng

am

en

to n

a r

up

tura

(%

)

-

-1,41 -1 0 1 1,41 40

60

80

100

120

140

160

86

Figura 4.17 Porcentagem de alongamento na ruptura em função da quantidade de

canela em pó na formulação dos biofilmes, elaborados de acordo com

delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5.

De maneira análoga que para o ingrediente cravo em pó pode-se dizer que a

informação acima é relevante e pode contribuir na definição de uma possível

formulação de um biofilme antimicrobiano. O valor para a porcentagem de alongamento

na ruptura foi mantido mesmo quanto houve a utilização de 0,20% (nível 0), 0,34%

(nível +1) ou 0,40% (nível +1,41) de canela em pó na formulação base do biofilme. A

adição de canela em pó em maior quantidade pode por outro lado, significar um

incremento no poder de inibição microbiana do biofilme.

4.3 Ensaios preliminares com produtos de panificação

Realizou-se a avaliação de amostras de pão tipo forma e pão doce tipo

“bisnaguinha” embaladas de acordo com a Figura 4.18. Esta avaliação foi realizada

tanto com a utilização de biofilmes elaborados de acordo com formulações definidas

para a etapa de seleção (Tabela 3.4) quanto para a etapa de otimização de

ingredientes (Tabela 3.5).

Canela em pó

Alo

ng

am

en

to n

a r

up

tura

(%

)

-1,41 -1 0 1 1,41 72

92

112

132

152

87

Figura 4.18 Pão de forma embalado com biofilme (embalagem primária) e o conjunto

embalado em filme plástico.

Os resultados mostraram que em geral o biofilme teve suas características

preservadas após contato com a amostra de pão e às vezes tornava-se mais frágil e

pegajoso. As amostras dos pães por outro lado na maioria das vezes tornaram-se mais

secas (perda de umidade) após 24 horas em contato com o biofilme (sob distintas

condições de temperatura e umidade). Os biofilmes elaborados, por terem como base

fécula de mandioca, são hidrofílicos e provavelmente absorveram a umidade dos pães

embalados.

Amostras de pão tipo forma e pão doce tipo “bisnaguinha” embaladas de acordo

com a Figura 4.19 foram avaliadas e os resultados indicaram que tanto a textura dos

pães quanto as características dos biofilmes foram mantidas nestas condições.

88

Figura 4.19 Pão de forma embalado com biofilme (posicionado sob a amostra de pão)

e o conjunto embalado em filme plástico.

4.4 Efeito do biofilme antimicrobiano em amostra de pão tipo forma

Os conjuntos formados por biofilme, amostra de pão tipo forma e embalagem

plástica selada foram preparados de acordo com o planejamento apresentado na

Tabela 3.7 e Figura 3.12 e conjuntos formados sem a presença de amostra de biofilme

foram utilizados como amostras controle.

Na Tabela 4.11 são apresentados os valores da população de bolores e leveduras

obtidos nas amostras de pão tipo forma armazenadas em contato com os biofilmes por

3 dias (3D) e sete dias (7D). Os resultados são expressos em log UFC/g. Os resultados

das amostras controle C1 e C2 respectivos para cada biofilme também estão

apresentados.

89

Tabela 4.11 – População de bolores e leveduras encontrada em fatias de pão tipo

forma após 3 dias (3D) e 7 dias (7D) de armazenamento.

Biofilme População de bolores e leveduras (log UFC/g)1,2 3 dias de embalagem (3D) 7 dias de embalagem (7D) 1 2,9 est.3 5,0 C1 3,1 est.3 4,9 C2 2,3 est.3 3,5 2 2,7 est.3 5,1 C1 2,5 est.3 3,1 C2 2,3 est.3 2,3 3 2,6 est.3 5,0 C1 3,4 est.3 5,1 C2 1,7 est.3 4,3 4 2,3 est.3 4,2 C1 2,5 est.3 3,1 C2 2,3 est.3 2,3 5 3,1 est.3 5,1 C1 3,1 est.3 3,0 C2 3,1 est.3 2,8 6 2,8 est.3 5,7 C1 3,1 est.3 4,9 C2 2,4 est.3 3,6 7 3,2 est.3 5,0 C1 3,1 est.3 4,9 C2 2,4 est.3 3,6 8 2,9 est.3 6,0 C1 1,7 est.3 2,8 C2 1,7 est.3 2,2 94 3,0 est.3 4,5 C1 3,4 est.3 5,1 C2 1,7 est.3 4,3 104 1,7 est.3 4,3 C1 3,1 est.3 4,9 C2 2,3 est.3 3,5 114 2,5 est.3 5,2 C1 3,1 est.3 3,0 C2 3,1 est.3 2,8 125 3,3 est.3 5,2 C1 1,7 est.3 2,8 C2 1,7 est.3 2,2 1 Média da contagem em duplicata.

2 UFC/g: unidades formadoras de colônias/g. 3 est.: estimado. Utilizado para valores médios abaixo de 25 UFC. 4 Biofilme 9, 10 e 11 :pontos centrais do delineamento experimental apresentado na Tabela 3.5. 5 Biofilme 12, biofilme sem ingredientes antimicrobianos.

90

O número de colônias de bolores e leveduras nas fatias de pão tipo forma

embaladas (com presença ou não de biofilme) por 3 dias, na grande maioria dos casos,

esteve abaixo do limite mínimo da faixa de contagem considerada (25 UFC). Nesse

período não se observou, visualmente, colônias de bolores ou leveduras nas fatias.

Após 7 dias de armazenamento, no entanto, verificou-se a presença de colônias de

bolores na superfície de fatias de pão tipo forma, que na maioria dos casos, aumentou

de forma relevante em relação ao valor obtido para 3 dias de armazenamento, como

pode ser observado na Tabela 4.11.

De um modo geral, as fatias de pão tipo forma embaladas com os biofilmes

apresentaram valores similares ou maiores que seus respectivos controles (C1 e C2) o

que indica que a presença dos biofilmes, nas condições dos ensaios, após 7 dias de

embalagem, não promoveu efeito inibitório do crescimento dos microrganismos

estudados. As amostras de pão tipo forma elaboradas com propionato de cálcio (C2) e

armazenados por 7 dias apresentaram, em geral, populações de bolores e leveduras

menores que os respectivos valores da amostra controle (C1) e do biofilme.

Visualmente, as colônias que cresceram no meio de cultura utilizado na análise

microbiológica apresentaram aspecto algodonoso com coloração variada: verde, rosa,

ou branca. Algumas vezes, constatou-se numa mesma placa o crescimento de colônias

com as três cores diferentes.

Na Figura 4.20 são apresentados exemplos das colônias formadas no meio de

cultura provenientes de amostras de pão tipo forma em contato com biofilmes

armazenadas por 7 dias.

91

Figura 4.20. Aspecto das colônias de bolores e leveduras formadas no meio de cultura

de fatias de pão tipo forma embaladas e armazenadas por 7 dias.

A Figura 4.21 apresenta o aspecto visual de algumas amostras de pães tipo forma

armazenadas em contato com os biofilmes após 10 dias de embalagem.

92

Figura 4.21. Aspecto visual de fatias de pão tipo forma embaladas em contato com

biofilmes antimicrobianos e armazenadas por 10 dias à temperatura

ambiente (valor médio de 25 ºC): Biofilme de formulação 4 (A); Biofime de

formulação 2 (B); Biofilme de formulação 1 (C), (Tabela 3.5).

A determinação dos valores da atividade de água dos biofilmes e das fatias de

pão tipo forma não foi prevista no início do presente trabalho porém a medida que os

resultados da contagem microbiológica começaram a ser determinados, julgou-se que a

avaliação desta propriedade era importante para a melhor compreensão desses

resultados. Desta forma, os valores de atividade de água de alguns biofilmes e das

respectivas fatias de pão tipo forma embaladas junto com os mesmos foram

determinados e são indicados na Tabela 4.12, assim como os valores da atividade de

água dos respectivos controles C1 e C2. As avaliações foram realizadas após 7 dias da

embalagem dos biofilmes com as fatias de pão. Após 3 dias de armazenamento os

biofilmes apresentaram aspecto muito similar, visualmente ao inicial ou seja antes de

ser embalado junto com as amostras de pão tipo forma.

A B C

93

Tabela 4.12 – Atividade de água (aw) de biofilmes e fatias de pão tipo forma embalados

por 7 dias.

Amostra aw do pão aw do biofilme

Biofilme 6 + fatia de pão1 0,958 (25,0 ºC) 0,937 (25,2 ºC)

Biofilme 7 + fatia de pão1 0,962 (25,2 ºC) 0,957 (25,2 ºC)

C1 (pão sem propionato) 0,958 (25,2 ºC) Não se aplica

C2 (pão com propionato) 0,966 (24,9 ºC) Não se aplica

Biofilme3 + fatia de pão1 0,960 (25,2 ºC) 0,952 (25,1 ºC)

Biofilme 9 + fatia de pão1 0,959 (25,3 ºC) 0,947 (25,2 ºC)

C1 (pão sem propionato) 0,964 (25,1 ºC) Não se aplica

C2 (pão com propionato) 0,964 (25,2 ºC) Não se aplica 1 Fatia de pão sem propionato de cálcio. Conforme citado anteriormente, (FARKAS, 1997), a atividade de água de pães

apresenta valores em torno de 0,95 enquanto a dos biofilmes, antes do contato com

fatias de pão, encontrava-se ao redor de 0,75 devido à atividade de água do ambiente

interno dos dessecadores nos quais foram acondicionados.

Os valores apresentados na Tabela 4.12 mostram que os biofilmes apresentaram

aumento nos valores de atividade de água ao longo do armazenamento com as fatias

de pão tipo forma. Após 7 dias de contato, os biofilmes analisados apresentaram

valores de atividade de água próximos aos valores apresentados para as fatias de pão

tipo forma indicando que aumentou a umidade do biofilme.

O aspecto dos biofilmes armazenados com as fatias após período superior a sete

dias foi alterado conforme pode ser visualizado na Figura 4.22, apresentando aspecto

enrrugado, destacando-se facilmente das placas de petri e umedecidos de maneira

perceptível ao tato. Apesar disso, apresentavam-se flexíveis, coesos e com os

ingredientes antimicrobianos adicionados ainda incorporados à matriz dos biofilmes. O

crescimento de bolores no próprio biofilme foi constatado visualmente e, em geral, foi

observado na superfície de contato das fatias de pão tipo forma. O motivo provável é o

possível maior valor de atividade de água nesta região do biofilme do que nas demais.

94

Figura 4.22. Aspecto visual de amostras de biofilmes anteriormente embaladas em

contato com amostras de pão tipo forma por 10 dias à temperatura

ambiente (valor médio de 25ºC).

Pode-se supor que os biofilmes, ao terem sua atividade de água elevada a valores

acima de 0,80 tornaram-se um meio propício ao desenvolvimento de bolores e

leveduras. Segundo Jay (1992), a atividade de água mínima, para a maioria dos bolores

é de 0,80 e para as leveduras esse valor é de 0,88. Desta forma, é provável que os

bolores e leveduras presentes nas fatias de pão tipo forma tiveram maior

disponibilidade de substrato pois além da própria fatia, o biofilme à base de fécula de

mandioca também tornou-se um meio para o seu crescimento pela adequada atividade

de água adequada e por ser fonte de carboidratos.

Devido às alterações na atividade de água dos biofilmes embalados em contato

com as fatias de pão, a avaliação do efeito antimicrobiano do cravo e da canela em pó

aplicados no biofilme à base de fécula de mandioca foi prejudicada uma vez que o

material estudado (biofilme) modificou-se de forma importante ao longo do período de

embalagem. Apesar deste fato, a possibilidade da aplicação dos ingredientes cravo e

canela em pó em biofilmes para promoção de efeito antimicrobiano em sistemas

alimentícios não pode ser descartada e talvez possa ser observada em estudos

conduzidos em condições diferentes às utilizadas no presente trabalho.