2009nepomuceno-mrayersiniose

7/23/2019 2009nepomuceno-mrayersiniose

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FUNDAO OSWALDO CRUZ

CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHES

Mestrado Acadmico em Sade Pblica

EEppiiddeemmiioollooggiiaaMMoolleeccuullaarrddaasscceeppaassddeeYYeerrssiinniiaappeessttiiss

iissoollaaddaassnnooNNoorrddeesstteeddooBBrraassiillppeellaaAAnnlliisseeddoo

NNmmeerrooVVaarriivveellddeeRReeppeettiieesseemmTTaannddeemm((MMLLVVAA))

RECIFE

2009

Mirele Regina de Arajo Nepomuceno


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2

MMiirreelleeRReeggiinnaaddeeAArraajjooNNeeppoommuucceennoo

EEppiiddeemmiioollooggiiaaMMoolleeccuullaarrddaasscceeppaassddeeYYeerrssiinniiaappeessttiissiissoollaaddaassnnooNNoorrddeesstteeddooBBrraassiill

ppeellaaAAnnlliisseeddooNNmmeerrooVVaarriivveellddeeRReeppeettiieesseemmTTaannddeemm((MMLLVVAA))

Dissertao apresentada ao curso deMestrado em Sade Pblica do Centro dePesquisas Aggeu Magalhes, FundaoOswaldo Cruz, para obteno do grau deMestre em Cincias.

OOrriieennttaaddoorraa::DDrraa..TTeerreezzaaCCrriissttiinnaaLLeeaallBBaallbbiinnoo

CCoo--OOrriieennttaaddoorraa::DDrraa..AAllzziirraaMMaarriiaaPPaaiivvaaddeeAAllmmeeiiddaa

Recife2009


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Catalogao na fonte: Biblioteca do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes

N441e Nepomuceno, Mirele Regina de Arajo.Epidemiologia molecular das cepas de Yersinia pestis isoladas

no Nordeste do Brasil pela anlise do nmero varivel de repetiesem Tandem (MLVA)/ Mirele Regina de Arajo Nepomuceno, 2009.

93 f.: il.Dissertao (Mestrado em Sade Pblica) Centro de Pesquisas

Aggeu Magalhes, Fundao Oswaldo Cruz.Orientadora: Tereza Cristina Leal Balbino.

1. Yersinia pestis. 2. Peste. 3. Variao (Gentica).4. RepetiesMini-Satlites. 5. Sequncias Repetidas em Tandem. I. Balbino,Tereza Cristina Leal. II. Ttulo.

CDU 616.98


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4

MMIIRREELLEERREEGGIINNAADDEEAARRAAJJOONNEEPPOOMMUUCCEENNOO

EEppiiddeemmiioollooggiiaaMMoolleeccuullaarrddaasscceeppaassddeeYYeerrssiinniiaappeessttiissiissoollaaddaassnnooNNoorrddeesstteeddooBBrraassiill

ppeellaaAAnnlliisseeddooNNmmeerrooVVaarriivveellddeeRReeppeettiieesseemmTTaannddeemm((MMLLVVAA))

Dissertao apresentada ao curso deMestrado em Sade Pblica do Centro dePesquisas Aggeu Magalhes, Fundao

Oswaldo Cruz, para obteno do grau deMestre em Cincias.

Aprovado em: 15 / 04 / 2009

BBaannccaaEExxaammiinnaaddoorraa

__________________________________________________________________________________________________________Orientadora: Dra. Tereza Cristina Leal-Balbino

Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes Departamento de Microbiologia

__________________________________________________________________________________________________________Membro Externo / Titular: Dra. Maria Betnia Melo de Oliveira

Universidade Federal de Pernambuco Departamento de Bioqumica

__________________________________________________________________________________________________________Membro Externo / Suplente: Dra. Marise Sobreira Bezerra da Silva


__________________________________________________________________________________________________________Membro Interno / Ttitular: Dra. Valria Rgo Alves Pereira

Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes Departamento de Imunologia

__________________________________________________________________________________________________________Membro Interno / Suplente: Dra. Janana Campos de Miranda



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Dedico este trabalho aminha me, Margaret, e ao

meu esposo, Vilmar, por

sempre acreditarem em

mim!


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AGRADECIMENTOS

A minha mais que orientadora, a minha amiga Cris. A dedicao e carinho que ela tem pelo

que faz tornaram o desenvolvimento do mesmo muito mais prazeroso. Os seus ensinamentos

e ajuda foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho.

A amiga Betnia que esteve comigo desde o incio da minha vida cientfica e sempre

consegue acalmar nas horas mais complicadas de pr apresentaes.

A minha me, por ser a pessoa que mais acredita em mim, muitas vezes mais at que eu

mesma!

Ao meu esposo Vilmar pelo incentivo e apoio em todos os momentos da minha vida.

A minha pequena, minha irm Amanda, que mesmo sem entender muito do que se trata fazer

um mestrado no poupava preocupaes e questionamentos: Mi, e o mestrado? Ta tudo

certo?

Ao Dr. Valdir Balbino por toda ajuda com as anlises da parte de bioinformtica.

Aos amigos do laboratrio de microbiologia; Mari, Rosanny, Camila, Ana Paula, Paloma,

Vladmir, Fabo, Thiago e Ednaldo que esto sempre dispostos a ajudar.

Aos amigos Issac e Silvana, tcnicos do laboratrio de microbiologia do CpqAM, pela ajuda

indispensvel em todas as etapas deste trabalho.

A minha amiga Rochane, por estar presente em minha vida desde criana (mesmo sem saber)

e por estar sempre disposta a me ajudar em tudo que preciso, inclusive com o ABSTRACT

deste trabalho.

Minha gratido a todas as pessoas que se sensibilizaram e viabilizaram a concretizao deste

trabalho.


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ARAJO-NEPOMUCENO, Mirele Regina. Epidemiologia Molecular das cepas deYersinia pestisisoladas no Nordeste do Brasil pela Anlise do Nmero Varivel deRepeties em Tandem (MLVA). 2009. Dissertao (Mestrado em Sade Pblica) Centrode Pesquisas Aggeu Magalhes, Fundao Oswaldo Cruz, Recife, 2009.

RESUMO

AYersinia pestis o agente etiolgico da peste, uma doena primria de roedores, transmitidapor pulgas infectadas e que pode infectar o homem e outros mamferos. O objetivo dotrabalho foi realizar a tipagem de 63 cepas de Y. pestisde trs focos de peste do PE. As cepasforam isoladas de diferentes fontes e perodos. Das 63 cepas, 20 foram isoladas de umepizootia, em agosto de 1967, na Chapada do Araripe-PE. Tambm foram estudadas oitocepas de Y. pestis isoladas em outros pases, cinco cepas de Y. pseudotuberculosise nove de

Y. enterocolitica. Foram utilizados onze VNTRs pela tcnica do MLVA. Dos onze VNTRspara as cepas da epizootia apenas um revelouse polimrfico apresentando diferentes alelos.Os demais VNTRs revelaram-se monomrficos. Entre os onze VNTRs analisados para as 51cepas de Y. pestis (43 brasileiras e 8 estrageiras) dois se revelaram monomrficos gerandoampliconscom 7 e 2 unidades repetitivas (UR). Os outros nove VNTRs analisados revelaram-se polimrficos gerando dois a oito alelos. As cepas de Y. pseudotuberculosisapresentaram-sepolimrficas para 10 VNTRs gerando ampliconsde tamanhos diversos, o VNTR ms09 foi onico monomrfico gerando um amplicon de 700 pb com 28 UR. Das nove cepas de Y.enterocolitica analisadas com os onze locos, sete apresentaram-se monomrficos comamplicons de 700, 250, 270, 690, 231 e 379 pb. Os outros quatro VNTRs analisadosapresentaram um padro de amplificao polimrfico com ampliconsde tamanhos diferentes

para o mesmo loco. O padro de amplificao gerado com as cepas de Y. pestispossibilitoudistribui-las em 35 perfis genotpicos. A anlise das cepas pelo dendrograma permitiu agrup-las em cinco clados, onde no clado I ficaram agrupadas a maioria das cepas brasileiras de Y.

pestis, as cepas estrangeiras de Y. pestisficaram agrupadas nos clados II e IV, enquanto que Y.enterocolitica e Y. pseudotuberculosis ficaram nos clados III e V respectivamente. Diantedissso pode-se considerar que o MLVA mostrou-se uma ferramenta til em estudosfilogenticos e epidemiolgicos das cepas brasileiras de Y. pestis, alm de estudosintraespecficos com as espcies de Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis. As anlisesrevelaram diversidade gentica entre as cepas de Y. pestis isoladas de diferentes fontes eperodos e sua continuao poder gerar dados importantes para estabelecer relaesfilogenticas entre as cepas, contribuindo para um melhor entendimento da disseminao e

transmisso do agente etiolgico da peste na natureza e a dinmica da epidemiologia noBrasil.

Palavras Chave: Yersinia pestis,diversidade gentica, VNTR, MLVA, Peste.


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ARAJO-NEPOMUCENO, Mirele Regina. MolecularEpidemiology from Yersinia pestisstrains isolated in Brazil for Multiple Locus Variable Analisys (MLVA). 2009.Dissertation (Master of Public Health) Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes, FundaoOswaldo Cruz, Recife, 2009.

ABSTRACT

The Yersinia pestis is the agent who causes the plague, a primary illness of rodents,transmitted by infected fleas and it can infect human and other mammals. This work had asobjective to carry through the typing of 63 Y. pestis strains from Brazil northeast foci. Thestrains had been isolated of different sources and periods. By 63 strains, 20 had been isolatedduring an epizootic, 1967 August, in Chapada of Araripe PE. Also it had been studied eightY. pestis strains isolated in other countries, five Y. pseudotuberculosis strains and nine Y.

enterocoliticastrains. It had been used eleven VNTRs for the MLVA. Of the eleven VNTRsfor epizootic strains only one showed polymorphic presenting different alleles. The majorityVNTRs had shown monomorphics. From 51 Y. pestisstrains (43 Brazilians and 8 foreigners)two between eleven VNTRs analyzed had disclosed to monomorphics generating ampliconswith 7 and 2 repetitive units (UR). The others nine VNTRs analyzed had shown polymorphicsgenerating the two until eight alleles. From 10 VNTRs forY. pseudotuberculosisstrains hadbeen presented polymorphics, generating amplicons of diverse sizes. The ms09 VNTR wasthe only monomorphic generating one amplicon of 700 pb with 28UR. From nine Y.enterocolitica strains analyzed with the eleven VNTRs, seven had been presentedmonomorphics with amplicons by 700, 250, 270, 690, 231 and 379 pb. The others fouranalyzed VNTRs had presented a polymorphic standard of amplification for Y. enterocolitica

strains, showing amplicons of different sizes for the same lease. The standard of amplificationgenerated with Y. pestisstrains possible classify them in 35 genotypic profiles. The analysisof strains by the dendrogram allowed to group them in five clads, where in the clado I it hadbeen grouped the majority of Y. pestis Brazilian strains, Y. pestis foreign strains had beengrouped in clads II and IV, whereas Y. pseudotuberculosisand Y. enterocoliticahad been inclads III and the V respectively. Ahead this can be considered the MLVA like a useful tool infilogenetics and epidemiologists studies for Y. pestis Brazilian strains, beyond intraespecificsstudies with Y. pseudotuberculosisand Y. enterocoliticaspecies. The analyses had disclosedgenetic diversity between Y. pestis strains isolated of different sources and periods and itscontinuation will be able to generate given important to establish phylogenetics relationsbetween the Y. pestis Brazilians strains, contributing for a better understanding of the

dissemination and transmission of the plagues agent etiologic in the nature and the dynamicsof the plague epidemiology in Brazil.

Words Key: Yersinia pestis, genetic diversity, VNTR, MLVA, Plague.


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LLIISSTTAADDEEFFIIGGUURRAASS

FFiigguurraa11:: reas de Peste no Brasil........................................................................... 17

FFiigguurraa22:: Esquema do ciclo epidemiolgico da Peste ............................................ 20

FFiigguurraa33:: Vizualizao por microscopia ptica da Y. pestis (seta) em tecido de

um paciente infectado.............................................................................. 21

FFiigguurraa44:: Bubes pestosos (setas) nas regies cervical (A), axilar (B) e inguinais

(C e D)..................................................................................................... 23

FFiigguurraa55:: Esquema representativo do genoma de uma cepa tpica de Y. pestis...... 28

FFiigguurraa66:: Esquema representativo do VNTR tetranucleotdeo CAAA .................. 33FFiigguurraa77:: Gel representativo de agarose a 2,0% das amplificaes por PCR dos

VNTR em cepas de Y. pestis ................................................................... 55

FFiigguurraa88:: Gel representativo de agarose a 2,0% das amplificaes por PCR dos




FFiigguurraa1100:: Dendrograma UPGMA mostrando a relao das cepas de Yersinia

estudadas, os nmeros de unidades repetitivas de cada cepa com os

onze locos VNTRs e seus perfis genotpicos ......................................... 58

FFiigguurraa1111:: Grfico de barras demonstrando a relao entre os VNTRs e o nmero

de alelos encontrados nas diferentes espcies de Yersinia...................... 59


VNTRs em culturas das cepas de Y. pestis isoladas durante a

epizootia.................................................................................................. 60


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LLIISSTTAADDEETTAABBEELLAASS

TTaabbeellaa11:: Dados epidemiolgicos das cepas de Y. pestis isoladas nos

focos do Nordeste do Brasil e Perfis Genotpicos gerados

neste estudo ......................................................................................... 51

TTaabbeellaa22:: Caractersticas das cepas de Y. pestis isoladas durante uma

epizootia de Peste na Chapada do Araripe PE, data de

isolamento e procedncia das cepas. Resultado da anlise pelo

MLVA com o VNTR ms06 ............................................................... 52

TTaabbeellaa33:: Dados epidemiolgicos e perfiis genotpicos das cepas de Y. pestisisoladas em focos de outros pases................................................... 52

TTaabbeellaa44:: Dados epidemiolgicos das cepas de Y. enterocolitica e Y.

pseudotuberculosis estudadas com os 11 VNTRs analisados e os

perfis genotpicos gerados .................................................................. 53

TTaabbeellaa55:: Caractersticas dos VNTRs analisados nas cepas de Yersinia............ 54


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LLIISSTTAADDEEAABBRREEVVIIAAEESSEESSIIGGLLAASS

BAB Blood Agar Base

BHI Brain Heart Infusion

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CDC Centro de Controle e Preveno de Doenas

CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes

DNA cido Desoxirribonuclico

dNTP desoxirribonucleotdeo trifosfato

FIOCRUZ Fundao Oswaldo Cruz

FUNASA Fundao Nacional de SadeIS Seqncia de Insero

Kb Kilobases

MLVA Anlise de Mtiplos Locos do Nmero Varivel de Repeties em

Tandem (Anlise do VNTR)

mM Milimolar

OMS Organizao Mundial de Sade

pb Pares de basePCR Reao em Cadeia da Polimerase

PFGE Eletroforese em gel de campo pulsado

RFLP Polimorfismo no Tamanho dos Fragmentos de Restrio

RNA cido Ribonuclico

SRP Servio de Referncia em Peste

TBE Tris-Borato, cido brico, EDTA

TE Tris: EDTAUR Unidade Repetitiva

UV Ultra Violeta

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean

VNTR Nmero Varivel de Repeties em Tandem

RAPD Polimorfismo do DNA amplificado aleatoriamente


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SSUUMMRRIIOO

11 IINNTTRROODDUUOO.............................................................................................. 13

22 RREEVVIISSOOBBIIBBLLIIOOGGRRFFIICCAA...................................................................... 15

2.1 Histrico da Peste........................................................................................... 15

2.2 Definio da Peste.......................................................................................... 16

2.3 Situao Atual da Peste no Brasil e no Mundo........................................... 16

2.4 Epidemiologia da Peste................................................................................. 18

2.5 Agente Etiolgico da Peste............................................................................ 20

2.6 Formas Clnicas.............................................................................................. 22

2.7 Diagnstico Laboratorial da Peste............................................................... 24

2.7.1 Diagnstico Bacteriolgico............................................................................. 24

2.7.1.1 Exame Direto .................................................................................................. 24

2.7.1.2 Cultura ............................................................................................................. 24

2.7.2 Diagnstico Sorolgico................................................................................... 25

2.7.3 Diagnstico Molecular.................................................................................... 25

2.8 Tratamento, Preveno e Controle da Peste............................................... 25

2.9 Genoma da Yersinia pestis............................................................................ 27

2.9.1 O cromossomo da Yersinia pestis.................................................................... 28

2.9.2 Os plasmdeos da Yersinia pestis..................................................................... 28

2.9.2.1 Plasmdeo pYV ou pCD1................................................................................. 29

2.9.2.2 Plasmdeo pPst ou pCP1.................................................................................. 29

2.9.2.3 Plasmdeo pFra ou pMT1................................................................................ 30

2.10 Epidemiologia Molecular.............................................................................. 30

33 JJUUSSTTIIFFIICCAATTIIVVAA.......................................................................................... 34

44 PPEERRGGUUNNTTAA.CCOONNDDUUTTOORRAA........................................................................ 36

55 HHIIPPTTEESSEE..................................................................................................... 37

66 OOBBJJEETTIIVVOOSS.................................................................................................. 38

6.1 Geral............................................................................................................... 38

6.2 Especficos....................................................................................................... 38


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7 MMAATTEERRIIAALLEEMMTTOODDOOSS.......................................................................... 39

7.1 Cepas Estudadas........................................................................................... 39

7.2 Bactrias e Condies de Cultivo.................................................................. 39

7.3 Extrao do DNA Genmico......................................................................... 40

7.4 Tipagem molecular pela anlisedos mltiplos locos VNTR(MLVA)...... 41

7.5 Anlise dos Dados obtidos pelo MLVA........................................................ 42

7.5.1 Determinao do Nmero de Repeties......................................................... 42

7.5.2 Anlise discriminatria dos locos VNTRs ....................................................... 42

88 RREESSUULLTTAADDOOSS ............................................................................................. 44

8.1 Tipagem Molecular pelo MLVA (Anlise dos VNTRs)............................. 44

8.1.1 Anlise das cepas de Y. pestis isoladas nos trs focos de peste do estado de

PE e de focos de outros pases....................................................................... 44

8.1.2 Anlise das cepas de Y. pestis isoladas durante uma epizootia de peste em

1967 no foco da Chapada do Araripe PE .................................................. 47

8.1.3 Anlise das cepas deY. enterocolitica.......................................................... 47

8.1.4 Anlise das cepas de Y. pseudotuberculosis ................................................. 4999 DDIISSCCUUSSSSOO.................................................................................................. 61

1100 CCOONNCCLLUUSSEESS............................................................................................. 67

RREEFFEERRNNCCIIAASS............................................................................................ 68

AAPPNNDDIICCEEAArrttiiggooCCiieennttffiiccoo.................................................................. 77


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1 IINNTTRROODDUUOO

A Yersinia pestis, bactria gram-negativa, da famlia Enterobacteriaceae, o agente

causador da Peste, uma doena primria de roedores geralmente transmitida pela picada de

pulgas infectadas. O homem se contamina acidentalmente ao entrar no ecossistema da

infeco. Equivocadamente, a populao e os profissionais de sade consideram a Peste como

uma doena j extinta, no entanto ela ainda persiste nos dias atuais entre diversos hospedeiros

/ reservatrios em numerosos focos silvestres de vrios pases da frica, sia e do Continente

Americano. No Brasil a incidncia de Peste humana e a ocorrncia de epizootias declinaram

nas reas de foco, entretanto, atividade residual de Peste tem sido detectada nos animaissentinelas, exigindo vigilncia permanente dos focos. O ltimo surto de Peste no Brasil

ocorreu em 1986, no estado da Paraba. Em 1997 ocorreu um caso humano no Cear e apenas

em 2005 houve outro caso sorolgico de Peste humana tambm no Cear (PERRY;

FETHERSTON, 1997).

A Peste foi introduzida no Brasil, em 1899, pelo porto de Santos-SP durante a ltima

pandemia, focalizando-se principalmente no Nordeste, tornando-se um agravo de interesse

regional. Os focos brasileiros esto localizados nos estados de Alagoas, Bahia, Cear, MinasGerais, Paraba, Piau, Pernambuco, Rio Grande do Norte e Rio de Janeiro (ORGANIZAO

MUNDIAL DE SADE, 1965).

A vigilncia da Peste no Brasil baseia-se na pesquisa da bactria em roedores e pulgas

e de anticorpos antipestosos em animais sentinela (algumas espcies de roedores resistentes

infeco e carnvoros domsticos, como os ces e gatos). A partir de 1966, com o Plano Piloto

de Peste em Exu (PPP), as atividades de vigilncia e controle da Peste no Brasil permitiram a

obteno de 917 cepas de Y. pestisoriundas de roedores, pulgas e humanos, com o ltimoespcime sendo isolado em 1997 e que so conservadas na bacterioteca do Servio de

Referncia em Peste do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes (SRP/CPqAM) (ALMEIDA et

al., 1985).

A tipagem molecular dos microrganismos importante para a epidemiologia porque

auxilia no monitoramento de surtos de infeces, reconhecimento de clones virulentos,

relao clonal entre cepas e avaliao de programas de controle ou erradicao das doenas.

Apesar dos vrios estudos realizados com Y. pestis utilizando diferentes tcnicas

moleculares, nenhuma correlao entre as diferenas observadas e as caractersticas

epidemiolgicas dos isolados foi encontrada. Alm de apresentarem um baixo poder


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discriminatrio, revelando na maioria das vezes, padres genmicos idnticos entre cepas

oriundas de diferentes fontes, ano e local de isolamento, demonstrando incoerncia para sua

aplicao em estudos epidemiolgicos.

O MLVA uma tcnica que tem sido padronizada pelo laboratrio de Microbiologia

do CPqAM que consiste na Anlise do Nmero Varivel de Repeties em Tandem e vem

mostrando poder discriminatrio entre as cepas brasileiras de Y. pestis. Os resultados obtidos

demonstraram baixa diversidade gentica intra-especfica nas cepas estudadas, sugerindo que

a diversidade gentica das cepas brasileiras foi subestimada. No entanto, os dados obtidos at

o momento contribuiro para uma melhor compreenso da epidemiologia da peste e para a

estrutura populacional da bactria no Brasil.

A obteno de marcadores capazes de diferenciar cepas provenientes de diversosfocos, disseminados em numerosos pases, tem interesse epidemiolgico, pois poder

identificar os clones de Y. pestis existentes no Brasil e detectar o surgimento de um novo

clone ou a introduo de uma nova cepa.

A proposta do presente trabalho foi caracterizar algumas cepas da coleo de Y. pestis

isoladas nos trs focos de peste do estado de PE entre os anos de 1966 a 1980, pela tcnica do

MLVA, analisando 11 locos VNTRs, para estabelecer a relao clonal das cepas e com isso

tentar obter um marcador molecular capaz de identificar o perfil gentico entre as cepasbrasileiras de Y. pestisexistentes na bacterioteca do SRP/CPqAM.


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22RREEVVIISSOOBBIIBBLLIIOOGGRRFFIICCAA

22..11HHiissttrriiccooddaaPPeessttee

A peste teve origem provavelmente no Planalto Central Asitico e foi responsvel por

grande mortalidade em diferentes pocas (PERRY; FETHERSTON, 1997). Muitas vezes a

histria da peste confundida com o prprio registro histrico da humanidade. Casos de peste

foram relatados em vrios textos antigos, inclusive no Antigo Testamento, no II Livro de

Samuel (GAGE; KOSOY, 2005). Apesar de vrias doenas terem sido erroneamenteclassificadas como peste durante a era Crist, trs grandes pandemias foram bem

caracterizadas.

A primeira pandemia, denominada Peste de Justiniano (542-605 d.C) teve origem no

Egito e se disseminou por todo mundo civilizado, atingindo sia, frica e Europa. Estima-se

que esta pandemia chegou a matar 100 milhes de pessoas (PERRY; FETHERSTON, 1997).

A segunda pandemia, a temvel Peste Negra, teve incio na sia e estendeu-se por toda

a Europa e Norte da frica, persistiu do sculo XIV ao sculo XVIII e matou um quarto dapopulao europia entre os anos de 1347 e 1353 (PERRY; FETHERSTON, 1997).

A terceira pandemia, ou Pandemia Contempornea, originou-se na Monglia

estendendo-se para Hong Kong em 1894 e rapidamente se espalhou pelo mundo, atravs do

transporte martimo, para os Estados Unidos, Amrica do Sul, frica do Sul e Madagascar

(PERRY; FETHERSTON, 1997; POLLITZER, 1954). A expanso desta pandemia declinou

com a Segunda Guerra Mundial, devido substituio dos antigos navios pelos novos a prova

de ratos. No entanto, foi a partir dela que se estabeleceram vrios focos endmicos espalhadospor todos os continentes, exceto na Austrlia (MOLLARET, 1989).

Em junho de 1884, Alexander Yersin isolou o agente etiolgico da peste e em 1898

Paul - Louis Simond descobriu o papel da pulga na transmisso da doena (GAGE; KOSOY,

2005). Yersin descreveu a doena em Hong Kong, verificou que 75% dos casos eram devido

peste bubnica e ainda relatou a relao entre ratos e a peste (DRANCOURT; RAOULT,

2002).

Em todos os continentes ainda so encontrados focos estveis de peste, embora a taxa

de mortalidade e disseminao dos surtos espordicos que ocorrem atualmente seja reduzida.

Assim a peste ainda considerada como um problema em sade pblica em alguns pases e


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est classificada pela Organizao Mundial de Sade (OMS), como uma doena reemergente

devido ao aumento do nmero de casos relatados (ORGANIZAO MUNDIAL DE

SADE, 2004).

A peste chegou ao Brasil em 1899, durante a ltima pandemia, pelo porto de Santos no

estado de So Paulo, onde ocorreu o primeiro caso humano da doena, quando o navio Zeyer,

procedente de Roterd, chegou ao Brasil e trouxe com ele a doena por meio de roedores. No

incio a peste alcanou vrias cidades litorneas (peste porturia), em seguida pelas estradas

de ferro e outras vias atingiu vrias cidades do interior (peste urbana) de onde foi eliminada

por medidas sanitrias adequadas, mas focalizou-se na zona rural (peste silvestre) entre os

roedores silvestres (ORGANIZAO MUNDIAL DE SADE, 1965).

A peste chegou a Pernambuco pela cidade do Recife em 1902 devido difuso dadoena para as cidades litorneas. A partir de 1906, a doena dispersou-se pelas rotas

comerciais terrestres e fluviais, instalando-se entre os roedores silvestres em reas rurais,

principalmente nas regies Nordeste e Sudeste. Essas regies apresentavam condies

ecolgicas adequadas para a sobrevivncia do bacilo, como a presena dos roedores

reservatrios (ALMEIDA et al., 1985; ORGANIZAO MUNDIAL DE SADE, 1965).

22..22DDeeffiinniiooddaappeessttee

A peste uma zoonose, primordialmente uma doena de roedores, causada pela

bactria Y. pestis, transmitida de um animal ao outro atravs da picada de pulgas infectadas. O

homem infectado acidentalmente quando penetra no ecossistema dos roedores reservatrios

da infeco, em atividades de caa, agricultura, ou lazer. Em circunstncias especiais a pestepode ser transmitida de homem a homem por meio por meio da peste pneumnica

(ALMEIDA et al., 2005).

22..33SSiittuuaaooAAttuuaallddaaPPeesstteennooBBrraassiilleennooMMuunnddoo

No Brasil existem dois principais focos naturais de peste: na regio Nordeste e na

Serra dos rgos, no estado do Rio de Janeiro. O foco do Nordeste est localizado na regio


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semi-rida do Polgono da Seca, que se estende do estado do Cear ao Norte de Minas Gerais.

Este foco est situado em regies serranas como a Serra da Ibiapaba e de Baturit (Cear),

Chapada do Araripe (Pernambuco, Cear e Piau), Chapada da Borborema (Rio Grande do

Norte, Paraba, Pernambuco e Alagoas), na Serra de Triunfo (Paraba e Pernambuco), Planalto

Oriental (Bahia) e piemonte da Chapada Diamantina (Minas Gerais). Ainda existe outra zona

pestosa no estado de Minas Gerais, fora do Polgono das Secas, o Vale do Rio Doce. O foco

da Serra dos rgos abrange os municpios de Terespolis, Sumidouro e Nova Friburgo, do

estado do Rio de Janeiro (ALMEIDA et al., 2005) (Figura 1).

Figura 1: reas de Peste no Brasil.Fonte: Almeida et al. (2005).

O foco do Nordeste produzia at 1980 de 20 a 100 casos de peste por ano,

principalmente nos estados de Pernambuco, Cear e Bahia. Desde ento, houve um

decrscimo substancial no registro dos casos. Os ltimos registros de peste humana ocorreram

nos Estados do Cear e Paraba nos anos 80. Durante a ltima dcada, alguns casos humanos

suspeitos, clnicos e epidemiologicamente ainda foram notificados no Cear e na Bahia.

Contudo, somente dois deles, ocorridos no Cear, foram confirmados, um por isolamento da

bactria, em Ipu no ano de 1997 e,


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19

um por exame sorolgico, em Guaraciaba do Norte no ano de 2005, o que refora a

importncia da vigilncia permanente nestes focos (ALMEIDA et al., 2005).

Nos focos de Minas Gerais e Rio de Janeiro no h notificao de casos humanos h

dcadas e raramente foram encontrados anticorpos antipestosos nos animais sentinelas

(FUNDAO NACIONAL DE SADE, 2002). A histria do foco da Serra dos rgos

resume-se a cinco surtos de curta durao, com o ltimo ocorrendo em 1967, com oito casos

humanos e duas mortes (ALMEIDA et al., 2005; COURA et al., 1967).

Nos ltimos dez anos, graves epidemias de peste foram registradas na frica

principalmente em Madagascar, Moambique, Uganda e Tanznia, e recentemente na RDC

(Repblica Democrtica do Congo). Casos espordicos de peste tm ocorrido em vrios

pases das Amricas (EUA, Peru, Brasil e Bolvia), na sia Central (Uzbekisto,Turkmenisto e Kazakhsto), China, Monglia e Vietnam (ORGANIZAO MUNDIAL DE

SADE, 2006). Em 2006, um total de 13 casos de peste humana foi registrado entre

habitantes de quatro estados dos EUA: Novo Mxico (sete casos), Colorado (dois casos),

Califrnia (trs casos) e Texas (um caso). Este o maior nmero de casos registrados em um

ano nos Estados Unidos desde 1994 (HUMAN PLAGUE, 2006). Depois de dcadas de

silncio a peste reemergiu na ndia, Arglia e Equador (BERTHERAT, 2007).

22..44EEppiiddeemmiioollooggiiaaddaaPPeessttee

A transmisso da peste ocorre principalmente pela picada da pulga infectada. A pulga

tambm pode infectar outros animais como coelhos, camelos, ces e gatos (PERRY;

FETHERSTON, 1997). A peste pode acometer o homem quando ele interfere no cicloselvtico, durante ou aps uma epizootia, ou pela introduo de roedores silvestres, ou de

pulgas infectadas no habitat humano (ALMEIDA et al., 2005) (Figura 2).

A peste est includa, segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS), entre as

doenas re-emergentes, em vista da ocorrncia de epidemias em vrios pases da frica, sia

e do Continente Americano (ORGANIZAO MUNDIAL DE SADE, 2006). No Brasil a

incidncia de peste humana e a ocorrncia de epizootias declinaram nas reas de foco,

entretanto, atividade residual de peste tem sido detectada nos animais sentinelas, exigindo

vigilncia permanente dos focos.


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Os roedores so os principais reservatrios da peste e estima-se que cerca de 200

espcies estejam envolvidas no ciclo epidemiolgico da doena. Nos focos do Nordeste do

Brasil, os principais roedores envolvidos pertencem aos gneros: Bolomys, Calomys,

Oligoryzomys, Oryzomys, Galea, Trychomys eRattus. Alguns roedores, como o Galea(pres)

e R. rattus (ratos), so pouco suscetveis doena, enquanto outros, como o Bolomys, so

muito sensveis, passveis de grande mortandade nas epizootias, ampliando e difundindo a

infeco (KARIMI et al., 1974).

As pulgas so vetores do bacilo da peste. Das 1.200 espcies de pulgas conhecidas, 55

so encontradas no Brasil e as espcies Polygenis bohlsi jordanie P. tripusso os principais

vetores da peste entre os roedores. AXenopsylla cheopise Pulex irritanstambm participam

da transmisso. A Polygenis spquando infectada, transmite a peste entre os roedores e podeser encontrada, embora em pequeno nmero, no vesturio ou livres nas moradias (ALMEIDA

et al., 2005).

Outros animais como: os lagomorfos (coelhos e lebres), alguns marsupiais (timb,

cassaco), insetvoros (porcoespinho e musaranho), carnvoros selvagens (raposas) e

carnvoros domsticos (ces e gatos) assim como os camelos e macacos tambm podem

contrair a infeco. As aves so refratrias infeco pela Y. pestis, mas podem participar

eventualmente do ciclo carreando pulgas para outras regies pelo transporte das carcaas deanimais infectados, principalmente as aves de rapina e outras que utilizam as tocas dos

roedores para ninho (Figura 2) (STENSETH et al., 2008).

Os animais domsticos (ces e gatos), alm de desenvolver a infeco tambm podem

carrear pulgas infectadas pela Y. pestisde roedores silvestres para dentro de casa e transmitir a

doena por arranhaduras e mordidas (Figura 2). Normalmente os ces no expressam

manifestaes clnicas, mas os gatos podem apresentar as formas ganglionar, farngea e a

pneumnica, o que os torna extremamente perigosos, pois podem transmitir peste pneumnicapara humanos. Os ces e gatos que sobrevivem carreiam os anticorpos especficos at durante

um ano (ALMEIDA et al., 2005).

A transmisso pessoa a pessoa pode ocorrer por aerossis na forma pneumnica ou

pelo contato com o contedo do bubo e ainda por acidentes com tecidos e materiais em

trabalhos de campo ou no laboratrio ou na utilizao da bactria como agente de guerra

biolgica (STENSETH et al., 2008; INGLESBY et al., 2000).


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21

Figura 2: Esquema do ciclo epidemiolgico da Peste.Fonte: Leal-Balbino et al. 2009.

22..55AAggeenntteeEEttiioollggiiccooddaaPPeessttee

A Y. pestis, agente causador da peste, uma bactria Gram-negativa da famlia

Enterobacteriaceae. O gnero Yersiniainclui 11 espcies: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y.

enterocolitica, Y. aldovae, Y. mollareti, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y.kristensenii, Y. rodhei eY. ruckeri.AY. pseudotuberculosis eY. enterocolitica so espcies

enteropatognicas e causam distrbios gastrointestinais. So transmitidas pela via oral-fecal e

provocam um quadro clnico denominado yersiniose. A Y. kristensenii pode ser

enteropatognica para o homem e a Y. ruckeri um patgeno de peixe (PERRY;

FETHERSTON, 1997).

Normalmente a Y. pseudotuberculosisno causa doena em humanos sadios, porm

em indivduos imunocomprometidos que ingerem alimentos contaminados, ela pode causar

complicaes linfticas (PERRY; FETHERSTON, 1997).


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Pela microscopia ptica a Y. pestisapresenta-se como um bacilo curto, ovide (0,5 a

0,8m de dimetro e de 1 a 3m de comprimento) e de colorao bipolar (extremidades

escuras) (Figura 3). uma bactria aerbia ou anaerbia facultativa, que cresce bem em

meios usuais a 28C e pH entre 5 e 9. O bacilo imvel, resistente ao frio, conserva-se em

cadveres e sobrevive em dejetos de pulgas (PERRY; FETHERSTON, 1997).

Figura 3:Visualizao por microscopia ptica da Y. pestis(seta) em tecido sangneo de um paciente infectado.Fonte: http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/plague/index.htm.

As cepas de Y. pestis so fenotipicamente muito homogneas, caracterizam-se por

apresentar um sorotipo, um fagotipo e trs biovars definidos pela capacidade das cepas em

fermentar o glicerol e reduzir nitratos a nitritos. Segundo Devignat (1951) essas variedades

foram associadas as trs ltimas pandemias, o biovar Antiqua ou Continental (glicerol+,

nitrato+) foi associado com a primeira pandemia, Medievalis (glicerol+, nitrato-) com a

segunda e o biovar Orientalisou Ocenica(glicerol-, nitrato+) foi associada com a terceira

pandemia. Estes biovars no diferem quanto ao nvel de patogenicidade, nem forma clnica

da doena (PERRY; FETHERSTON, 1997).

Mais recentemente foi caracterizado um novo biovar em uma cepa denominada

Microtus isolada na China. Esta cepa foi diferenciada por no ter capacidade de utilizar o

acar arabinose, diferente das outras cepas de Y. pestis. O biovarMicrotus avirulento para

humanos. Diante disso, agora baseado no s na capacidade de fermentar o glicerol e reduzir

nitrato a nitrito, mas tambm na habilidade em fermentar a arabinose, a Y. pestisest dividida

em quatro biovars: Antiqua (glicerol+, arabinose+ e nitrato+); Medievalis (glicerol+,


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arabinose+ e nitrato-); Orientalis (glicerol-, arabinose+ e nitrato+) e Microtus (glicerol+,

arabinose - e nitrato-) (ZHOU et al., 2004).

22..66FFoorrmmaassCCllnniiccaass

A peste humana pode apresentar trs formas clnicas principais: bubnica, septicmica

e pneumnica. A penetrao do bacilo da peste no hospedeiro pode ocorrer pela via

sangnea, pela pele, pela conjuntiva ocular ou atravs das mucosas respiratrias e digestivas.

A inoculao do bacilo pela conjuntiva ocular determina a peste septicmica, enquanto a viasubcutnea reproduz a peste bubnica e pela via respiratria a peste pneumnica (ALMEIDA

et al., 2005).

A peste bubnica a forma mais comum no Brasil, correspondendo a 98% dos casos

ocorridos na regio Nordeste e caracteriza-se pela presena de um bubo (tumefao dos

linfonodos superficiais). O bubo aparece no segundo ou terceiro dia, sendo extremamente

doloroso. Quando a picada da pulga ocorre nas regies superiores surgem os bubes axilares

ou cervicais, quando acontece nos membros inferiores formam-se ndulos inguinais oufemurais (FUNDAO NACIONAL DE SADE, 2002; ORGANIZAO MUNDIAL DE

SADE, 1999) (Figura 4). A sintomatologia da peste bubnica identificada por: calafrios,

cefalia, febre alta, mialgias, anorexia, nuseas, vmitos e dores generalizadas. O perodo de

incubao de 2 a 6 dias, porm, em alguns casos mais rpido (FUNDAO NACIONAL

DE SADE, 2002).

A peste septicmica geralmente aparece na fase terminal da peste bubnica no

tratada. Esta forma clnica pouco freqente e caracterizada pela presena do bacilo nosangue no apresentando reaes ganglionares visveis. Clinicamente, a peste septicmica

assemelha-se s septicemias causadas por outras bactrias Gram-negativas. Os sintomas so:

febre, dor de cabea, mal estar, calafrios e distrbios gastrointestinais. Essa forma tem um alto

grau de letalidade (30 a 50%) quando no tratada (FUNDAO NACIONAL DE SADE,

2002).

A peste pneumnica a forma mais grave da doena, devido ao seu quadro clnico,

sua alta letalidade e seu alto potencial de contgio, podendo provocar epidemias. Pode ser

secundria peste bubnica ou septicmica por disseminao hematgena. Tambm pode ser

primitiva, produzida diretamente por contato com tecidos de animais infectados ou inalao


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de aerossis de gotculas de outro doente com a pneumonia pestosa ou mesmo de um artefato

terrorista, com inculos de 100 a 500 bacilos (ALMEIDA et al., 2005). Tem incio com um

quadro infeccioso grave de evoluo rpida, com abrupta elevao trmica, calafrios, arritmia,

hipotenso, nuseas, vmitos e perturbao mental. Inicialmente os sinais e sintomas

pulmonares so discretos ou ausentes, s depois surgem dores no trax, respirao curta e

rpida, expectorao sanguinolenta, rica em bacilos pestosos. Se no tratada precocemente,

surgem os sintomas de delrio e coma podendo causar a morte (FUNDAO NACIONAL

DE SADE, 2002).

Tambm existe a pestis minor, que diferente dessas formas graves, uma forma

benigna ou ambulatorial, com discreto comprometimento ganglionar, febre baixa e cura

espontnea, tambm chamada peste benigna (FUNDAO NACIONAL DE SADE,2002).

Figura 4: Bubes pestosos (setas) nas regies cervical (A), axilar (B) e inguinais (C e D).Fonte: http://www.cpqam.fiocruz.br/aggeu/doc/manual_peste.pdf

A B

C D


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22..77DDiiaaggnnssttiiccooLLaabboorraattoorriiaallddaaPPeessttee

O diagnstico laboratorial da peste realizado por tcnicas bacteriolgicas

(identificao e isolamento da bactria), sorolgicas (deteco de anticorpos antipestosos) e

mais recentemente por tcnicas moleculares. Para anlise bacteriolgica podem ser utilizadas

cepas de sangue, aspirado de bubo, lquor cefalorraquidiano, secreo brnquica no homem,

alm de sangue, vsceras de roedores e macerados de pulgas. O diagnstico sorolgico

realizado em soro humano, de roedores e de outros mamferos. O diagnstico molecular

consiste na identificao de genes plasmidiais e/ou cromossomais da Y. pestis(CHU, 2000).

A forma mais segura para confirmao da infeco pestosa o isolamento da bactria,mas nem sempre as cepas procedentes de casos humanos so possveis. A puno do bubo

um procedimento cruento e doloroso, mesmo com a utilizao de anestesia local, e que

determina em alguns casos o agravamento do quadro clnico (ALMEIDA et al., 2005).

22..77..11DDiiaaggnnssttiiccooBBaacctteerriioollggiiccoo

22..77..11..11EExxaammeeDDiirreettoo

O diagnstico bacteriolgico por exame direto emprega as tcnicas de colorao pelo

mtodo de Gram, corante de Wayson ou mtodo de Giemsa. Para as anlises so utilizados

esfregaos de aspirado de bubo, cepas de sangue, medula, vsceras dos roedores e macerados

de pulgas (CHU, 2000).

22..77..11..22CCuullttuurraa

Para identificao da Y. pestis as cepas so cultivadas em duas placas para Agar

sangue (Blood Agar Base = BAB, Difco) a 28C em pH na faixa de 7,4 a 7,6 por 48 a 72

horas. Depois do semeio adiciona-se uma gota do fago antipestoso especfico em uma das


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placas. As colnias apresentam tamanho pequeno, forma convexa, aspecto brilhante-

translcido e bordas inteiras. No ponto da cultura onde foi colocado o bacterifago forma-se

uma rea de lise das colnias (KARIMI, 1978).

22..77..22DDiiaaggnnssttiiccooSSoorroollggiiccoo

A tcnica de hemaglutinao (HA) a mais utilizada no diagnstico sorolgico. Essa

tcnica consiste da utilizao de hemcias de carneiro sensibilizadas com o antgeno capsular

F1 da Y. pestis para deteco de anticorpos em soros de humanos, roedores e carnvoros(CHU, 2000).

22..77..33DDiiaaggnnssttiiccooMMoolleeccuullaarr

A utilizao da biologia molecular no diagnstico da peste uma opo em que seidentificam genes plasmidiais e cromossomais da Y. pestisem cepas de humanos, roedores e

pulgas. As tcnicas moleculares permitem um diagnstico da peste mesmo quando as

bactrias esto inviveis (ALMEIDA et al., 2005).

Diferentes protocolos foram desenvolvidos baseados na tcnica da PCR (Reao em

Cadeia da Polimerase) e suas variaes para o diagnstico da peste em pulgas, material de

roedores ou humanos (CHASE et al., 2005; LOIEZ et al., 2003). No laboratrio de

microbiologia do SRP/CPqAM j foram padronizadas algumas delas; Nested-PCR (LEAL et

al., 1996), MultiplexPCR (LEAL; ALMEIDA, 1999) e NPCRTbU (SOUZA, 2005).

22..88TTrraattaammeennttoo,,PPrreevveennooeeCCoonnttrroolleeddaaPPeessttee

O tratamento da peste deve ser precoce e intensivo devido rapidez e a gravidade da

evoluo da doena, visando deter a bacteremia e superar a toxemia. A coleta de espcimes

para os exames bacteriolgicos deve ser realizada antes do uso do antimicrobiano, mas no se


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pode retardar os procedimentos a espera da confirmao laboratorial. No Centers for Diseases

Control and Prevention (CDC) recomenda-se o isolamento do paciente durante as primeiras

48 horas do tratamento devido ao risco de pneumonia (ALMEIDA et al., 2005).

A Y. pestis sensvel maioria dos antibiticos, com exceo da penicilina e

derivados. Embora os testes laboratoriais demonstrem sensibilidade da Y. pestis penicilina,

esta completamente ineficaz in vivo (FUNDAO NACIONAL DE SADE, 2002). A

estreptomicina e gentamicina so eficazes no tratamento da peste. A estreptomicina

considerada o padro-ouro no tratamento da peste e uma indicao bastante utilizada no

caso de pneumonia. H autores que recomendam a associao da estreptomicina com a

tetraciclina ou com o clorafenicol, principalmente nos casos com pneumonia e meningite. A

gentamicina uma excelente opo teraputica em quaisquer situaes, podendo ser indicadapara gestantes e crianas. A tetraciclina um antimicrobiano usado no tratamento de casos

no complicados. O cloranfenicol considerado uma boa alternativa no tratamento da peste

bubnica, septicmica e pneumnica. As sulfonamidas so conhecidas pela sua eficcia na

preveno e tratamento apenas dos casos no complicados, mas s devem ser usados quando

outros antimicrobianos mais potentes no estiverem disponveis (ALMEIDA et al., 2005).

Uma cepa de Y. pestis com resistncia aos antimicrobianos mais utilizados no

tratamento da peste foi isolada em Madagascar. Esta resistncia est relacionada aquisiode um plasmdeo, o pIP1202, que pode ser transmitido para outras cepas disseminando esse

padro de resistncia (GALIMAND et al., 1997).

A vigilncia da peste no Brasil baseia-se no rastreamento da infeco nos campos

atravs da captura de roedores suscetveis, coleta de pulgas e pesquisa da bactria nestas

fontes, alm de inquritos sorolgicos entre roedores e outros pequenos mamferos e em

animais sentinelas e o controle realizado pela eliminao das pulgas com inseticidas

apropriados, pela desratizao e a antiratizao, que consiste da destruio de abrigos ealimentao para os roedores, nas reas endmicas de peste (ALMEIDA et al., 2005;

FUNDAO NACIONAL DE SADE, 2002).

O uso de vacinas recomendvel apenas para indivduos que esto continuamente

expostos situao de risco. Estes indivduos compreendem profissionais que trabalham em

contato com roedores e manipulam cepas vivas. No entanto, a imunidade que a vacinao

confere pouco eficaz contra a peste bubnica e no protege contra a pneumnica primria

(ORGANIZAO MUNDIAL DE SADE, 1999). Assim sendo ela pode atrepresentar um

risco, pois pode induzir ao vacinado uma falsa sensao de proteo, o que pode levar a

exposio de risco, no foco, hospital ou laboratrio (ALMEIDA et al., 2005).


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22..99GGeennoommaaddaaYYeerrssiinniiaappeessttiiss

Os fatores de virulncia da Y. pestis so codificados no cromossomo e nos trs

plasmdeos (pPst, pFra e pYV) presentes no genoma da bactria (DENG et al., 2002;

PARKHILL et al., 2001; SONG et al., 2004) (Figura 5). O sequenciamento completo do

genoma de algumas cepas: CO92 (PARKHILL et al., 2001), KIM (DENG et al., 2002), 91001

(SONG et al., 2004) e Antiqua e Nepal (CHAIN et al., 2006) mostrou que esta bactria sofreu

grande fluxo gnico, atravs da aquisio de genes de outras bactrias e vrus, sugerindo uma

grande mobilidade nas seqncias, resultado de rearranjos genmicos, como translocaes e

inverses.Devido ao tamanho do genoma da Y. pestisser considerado relativamente pequeno, a

aquisio de genes, pode ser equilibrado pela perda de atividades de outros genes

(pseudogenes), encontrados com alta freqncia no genoma das cepas de Y. pestis j

seqenciadas (DENG et al., 2002; PARKHILL et al., 2001; SONG et al., 2004).

As chamadas seqncias de insero (ISs) so encontradas em mltiplas cpias no

genoma da Y. pestis; IS100, IS285, IS1661, IS1541, tanto no cromossomo como nos trs

plasmdeos (DENG et al., 2002; SONG et al., 2004). Essas seqncias so pequenossegmentos de DNA bacteriano (


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Figura 5:Esquema representativo do genoma de uma cepa tpica de Y. pestis.Fonte: Cedido por Leal Balbino, TC.

22..99..11OOccrroommoossssoommooddaaYYeerrssiinniiaappeessttiiss

O genoma da Y. pestis tem aproximadamente 4.650 kb com um contedo mdio de

GC de 47,46% (DENG et al., 2002; PARKHILL et al., 2001; SONG et al., 2004). Foramidentificados no cromossomo da Y. pestis numerosos genes estruturais e reguladores que

codificam para funes relacionadas ao metabolismo e patogenicidade assim como alguns

genes inativos.

No cromossomo h uma regio de 102 kb dividida em dois segmentos fsicos e

funcionalmente distintos: um relacionado captao de ferro mediado por um siderforo

(yersiniabactina), localizado na HPI (ilha de patogenicidade), composto de 11 genes

organizados em quatro operons (CARNIEL, 2001). E outro segmento relacionado transmisso da Y. pestispela pulga (HINNEBUSCH et al., 1996).

22..99..22OOssppllaassmmddeeoossddaaYYeerrssiinniiaappeessttiiss

Nos diversos focos de peste, inclusiveno Nordeste do Brasil, foram encontradas cepas

atpicas faltando algum plasmdeo ou contendo plasmdeos adicionais (FILIPPOV et al.,

1990; LEAL et al., 1997; 2000). Tambm j foram relatados casos de cepas de alguns focos


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de peste que apresentaram plasmdeos crpticos com a aquisio de genes de resistncia

(GUIYOULE et al., 2001; PERRY; FERTHERSTON, 1997).

Os diversos tipos de manipulaes em laboratrios como: repiques sucessivos,

incubao ou estocagem em diferentes temperaturas, podem ocasionar alteraes na

virulncia das culturas pela perda dos plasmdeos de virulncia, de regies do cromossomo ou

mutaes pontuais nos genes de virulncia (LEAL et al., 1997; 2000; LEAL-BALBINO,

2004; 2006).

22..99..22..11PPllaassmmddeeooppYYVVoouuppCCDD11

O plasmdeo pYV de aproximadamente 70kb, indispensvel a virulncia e est

presente nas trs espcies patognicas de Yersinia. Este plasmdeo contm uma regio de

dependncia ao clcio (lcrV) para crescimento a 37C. Fora dessa regio esto localizados

vrios genes que codificam para um sistema de secreo tipo III que permitem a

sobrevivncia e multiplicao das bactrias nos tecidos linfides dos hospedeiros

(CORNELIS, 2000). Este plasmdeo contm seqncias de insero (IS100 e IS285) queesto dispersas ao longo da sua molcula (HU et al., 1998).

22..99..22..22PPllaassmmddeeooppPPssttoouuppCCPP11

O plasmdeo pPst de cerca de 9,5kb, especfico de Y. pestise parece ser responsvel

pelas protenas implicadas no bloqueio do trato digestivo das pulgas e na disseminao da

bactria no organismo do hospedeiro a partir do stio da picada (HINNEBUSH et al., 1996).

Neste plasmdeo esto presentes os genes que codificam a pesticina (pst), uma protena de

imunidade a pesticina (pim) e um ativador do plasminognio (pla) (SODEINDE; GOGUEN,

1988; SODEINDE et al., 1988). Este plasmdeo possui uma nica cpia do elemento de

insero IS100 (HU et al., 1998).


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22..99..22..33PPllaassmmddeeooppFFrraaoouuppMMTT11

O plamdeo pFra (90 110kb) codifica uma protena capsular ou frao F1 que

desempenha uma atividade antifagoctica (DU et al., 2002) e a toxina murina, Ymt, que

parece estar envolvida na transmisso da peste pelas pulgas (HINNEBUSH, 2002). A F1

imunognica para o homem e outros mamferos e largamente utilizada nos testes de

diagnstico da peste, seja pela pesquisa de anticorpos anti-F1 ou pela identificao do gene

estrutural da F1, o caf 1 (CHU, 2000). Este plasmdeo possui uma cpia do elemento de

insero IS200, duas cpias do IS100 e uma cpia do IS285 (LINDLER et al., 1998).

22..1100EEppiiddeemmiioollooggiiaaMMoolleeccuullaarr

Para a epidemiologia de grande importncia determinar a origem dos organismos

envolvidos em uma doena. A identificao exata do patgeno indispensvel para deteco

do reservatrio e fonte de infeco da doena, e tambm para monitorar sua disperso napopulao estudada. A epidemiologia molecular baseia-se na identificao e comparao da

estrutura gentica e os dados epidemiolgicos dos isolados bacterianos permitindo estabelecer

correlao entre eles e elaborar estratgias efetivas de controle epidemiolgico (TENOVER et

al., 1995).

A tipagem de bactrias patognicas realizada por diversos mtodos que diferem

quanto ao poder discriminatrio, reprodutibilidade e facilidade de interpretao

(LINDSTEDT, 2005). Determinar o poder discriminatrio de um mtodo de tipagem importante, devido a alguns mtodos agruparem organismos dentro de poucos grupos,

enquanto outros dividirem as colees dos isolados relacionados epidemiologicamente.

Diante disso, existe uma necessidade de se estabelecer um mtodo de tipagem apropriado para

diferenciar os isolados bacterianos dentro da populao estudada (TENOVER et al., 1995).

Atualmente existem numerosos mtodos de tipagem molecular com capacidade

discriminatria diferente.

A identificao e comparao de isolados bacterianos pode ser realizada por diferentes

tcnicas moleculares. Algumas delas utilizam a Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) e

suas variaes, como RAPD, PCR-Ribotipagem, PCR-IS, MLVA, etc. Estas tcnicas so


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importantes para a deteco de rearranjos de algumas regies do genoma, monitoramento e

distribuio dos patgenos (LEAL et al., 1999; HUANG et al., 2002; OLIVEIRA, 2006;

PEREIRA et al., 2002).

A tcnica de RAPD (DNA polimrfico amplificado aleatoriamente) relativamente

simples, pois no necessita conhecimento prvio da seqncia da bactria e mostra o perfil do

genoma todo incluindo seqncias plasmidiais. No entanto, uma tcnica de difcil

reprodutibilidade, sofrendo interferncia da qualidade e quantidade do DNA, variao do

modelo do termociclador, da marca e at do lote da enzima utilizada nas reaes (LEAL et al.,

2004). Apesar disto, estudos de RAPD com cepas de Y. pestisbrasileiras revelaram um padro

homogneo para as cepas de diversos focos (LEAL, 1998).

A PCR-ribotipagem baseada na amplificao da regio espaadora intergnica dosgenes ribossomais que codificam o rRNA 16S ou 23S. Esta regio codifica vrios tRNA o que

permite mostrar a diferena entre as bactrias. Para esta tcnica so usados primers que

anelam na regio conservada do 16S e do 23S, gerando perfis que so utilizados para

identificao de eubactrias e para subtipagem de muitos gneros bacterianos. Os genes

ribossomais so teis na deteco do polimorfismo gentico entre diferentes bactrias.

Existem de 2 a 11 cpias do gene rRNA por clula bacteriana (KOSTMAN et al., 1992).

Entretanto, estudos da PCR-ribotipagem com Y. pestis do Brasil revelaram um padrohomogneo para as cepas de diversos focos (SOBREIRA, 2002).

As ISs tambm so utilizadas nos estudos de tipagem molecular devido a capacidade

de se inserir em mltiplos stios de uma molcula alvo participando de rearranjos

cromossmicos causando inseres, delees e recombinaes, podendo desta forma

diferenciar os isolados. Esses marcadores genticos so utilizados para tipagem de cepas de Y.

pestisem estudos epidemiolgicos (HUANG et al., 2002; MOTIN et al., 2002).

Alguns grupos tm utilizado o Nmero Varivel de Repeties em Tandem (VNTR),como marcador molecular para identificao das diferenas genticas entre bactrias

patognicas (LE FLCHE et al., 2001; DE BENITO et al., 2004). Estudos dos VNTRs so

realizados pelo MLVA (Anlise dos VNTRs atravs da tcnica da PCR). O MLVA baseia-se

na identificao do polimorfismo no tamanho dos fragmentos amplificados, como resultados

dos eventos de insero e deleo dentro do VNTR (DE BENITO et al., 2004; LE FLCHE et

al., 2001; POURCEL et al., 2004). Esta tcnica utilizada como uma ferramenta para estudos

epidemiolgicos, especialmente por identificar polimorfismo no genoma de espcies

bacterianas que so geneticamente homogneas quando analisadas por outras tcnicas

moleculares (VAN BELKUM, 1999).


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33

Os VNTRs ou regies repetitivas (Figura 6) sofrem freqentemente mutaes

resultando, na maioria das vezes, em alteraes no nmero de repeties. Essas mutaes

ocorrem durante a replicao do DNA e podem surgir em combinao com falhas durante o

mecanismo de reparo (STRAND et al., 1993). Dependendo da localizao destes VNTRs no

genoma da bactria podem ocorrer alteraes modificando a expresso gnica e

conseqentemente alterando a seqncia de aminocidos em uma cadeia polipeptdica

interferindo, portanto, na patogenicidade da bactria e na adaptao do patgeno ao

hospedeiro (ADAIR et al., 2000).

Os VNTRs variam em tamanho, localizao e complexidade (VAN BELKUM et al.,

1998). Quanto ao tamanho, podem ser classificados como mini ou microssatlites. Os

microssatlites correspondem a unidades repetidas que variam de um a cinco pares de base e

os minissatlites apresentam mais de seis pares de bases. Esses VNTRs podem ser

encontrados em tandem ou dispersos no genoma (JEFFREYS et al., 1985).

Os DNAs repetitivos ainda podem ser classificados como: homopolimrico simples

constitudo de um nico tipo de nucleotdeo (poli A, poli G, poli C, poli T) ou ainda de

nmeros grandes ou pequenos de vrias classes multimricas de repeties. Estas repeties

so constitudas de unidades idnticas (repeties homogneas), unidades mistas (repeties

heterogneas) ou repeties degenerativas (VAN BELKUM, 1998).

O MLVA mostrou-se como uma boa ferramenta para estudos epidemiolgicos e

filogenticos em espcies bacterianas por revelar quantitativamente as similaridades e

diferenas entre isolados (RORING et al., 2002). Dentre as diferentes espcies bacterianas

analisadas com o MLVA destacam-se: Y. pestis de outros focos (ADAIR et al., 2000; LE

FLCHE et al., 2001; KLEVYSTSKA et al., 2001; POURCEL et al., 2004), Y. enterocolitica

(DE BENITO et al., 2004), Bacillus anthracis (KEIM et al., 2000), Haemophilus influenzae

(VAN BELKUM et al., 1997), Enterococcus faecalis (TITZE-DE-ALMEIDA, 2004),Mycoplasma genitalium (RORING et al., 2002) e Francisella tularensis (FARLOW et al.,

2001).

Em Y. pestis, o estudo da variao no nmero de repeties de alguns locos VNTRs

auxiliou nos estudos de tipagem (ADAIR et al., 2000; KLEVYTSKA et al., 2001) e

epidemiologia molecular dessa espcie permitindo identificar os clones de Y. pestis

circulantes em uma determinada rea geogrfica (GIRARD et al., 2004; LOWELL et al.,

2005).


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No Brasil, estudos de tipagem molecular para Y. pestisutilizando diferentes tcnicas:

RAPD (LEAL, 1998), PCR-ribotipagem (SOBREIRA, 2002), PFGE (BARROS, 2007)

demonstraram na maioria das vezes, padres genmicos idnticos entre cepas provenientes de

diferentes fontes, ano e local de isolamento. Recentemente uma anlise de algumas cepas

isoladas no Nordeste do Brasil pelo MLVA revelou que elas apresentavam diversidade

gentica (ARAJO, 2005, 2007; OLIVEIRA, 2006; VALDEVINO NETO, 2006).

Figura 6:Esquema representativo do VNTR tetranucleotdeo CAAA.

Fonte: Baseado em Adair et al. (2000).


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33 JJUUSSTTIIFFIICCAATTIIVVAA

A peste, no mundo contemporneo, pode ser considerada uma doena rara e, portanto,pouco conhecida, mesmo sendo atualmente classificada pela Organizao Mundial de Sade

(OMS) como uma doena reemergente. O seu potencial epidmico no pode ser

negligenciado e o Brasil possui focos onde mantida como enzootia de roedores silvestres-

comensais, ocasionalmente atingindo o homem, podendo determinar srias conseqncias

mdicas e scio-econmicas ao pas, o que a torna um problema atual e merecedor de ateno

(ALMEIDA et al. 2005; ORGANIZAO MUNDIAL DE SADE, 2004).

A peste ainda continua sendo uma ameaa em vrias reas do mundo: Amrica doNorte, no oeste dos EUA, Amrica do Sul, no Brasil, Equador, Peru e Bolvia; frica,

principalmente em Madagascar; sia, na China, Laos, Myanmar, Vietn e ndia e sudeste da

Europa (ORGANIZAO MUNDIAL DE SADE, 2006).

Em 2005, ocorreram 1.124 casos de peste em nove pases sendo 99 fatais

(ORGANIZAO MUNDIAL DE SADE, 2006). No Brasil, em 1997, ocorreu um caso

humano em Ipu-Cear e em 2005 houve outro caso humano curado tambm no Cear, o que

refora a importncia de manter a vigilncia nos focos (CDTV/CGDT/SVS/MS).

O Departamento de Microbiologia do CPqAM/Fiocruz desenvolveu diferentes estudos

com as cepas isoladas nos focos do Nordeste do Brasil. Os mtodos PCR-ribotipagem

(SOBREIRA, 2002) e RAPD-PCR (LEAL, 1998) empregados no estudo destas cepas

demonstraram uma homogeneidade, padres genmicos idnticos entre cepas de diferentes

caractersticas epidemiolgicas, diferentes fontes, ano e local de isolamento. O PFGE

(Eletroforese em Gel de Campo Pulsado) em cepas do surto da Paraba indicou uma baixa

variabilidade gentica (BARROS, 2007).

O MLVA uma tcnica que tem sido padronizada pelo laboratrio de Microbiologia

do CPqAM e que vem mostrando poder discriminatrio entre as cepas brasileiras de Y. pestis

(ARAJO, 2005, 2007; OLIVEIRA, 2006; VALDEVINO NETO, 2006). Os resultados

obtidos demonstraram diversidade gentica intra-especfica nas cepas estudadas e relao com

algumas caractersticas epidemiolgicas. No entanto, ainda necessrio um maior

aprimoramento da tcnica e de sua anlise para sua aplicao e correlao com os dados

epidemiolgicos e assim esclarecer se existe diversidade entre as cepas brasileiras de Y. pestis

e estabelecer um marcador molecular eficiente para a tipagem das cepas de Y. pestis.


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A obteno de marcadores capazes de diferenciar cepas provenientes de diversos

focos, disseminados em numerosos pases, tem interesse epidemiolgico, pois poder

identificar os clones de Y. pestis existentes no Brasil e detectar o surgimento de um novo

clone ou a introduo de uma nova cepa. Com um sistema de tipagem adequado ser possvel

planejar e implementar novas medidas de controle nas reas de foco de peste do Brasil.


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44 PPEERRGGUUNNTTAACCOONNDDUUTTOORRAA

Existe relao ou diversidade gentica entre as cepas de Y. pestis isoladas em

diferentes perodos, hospedeiros e municpios dos trs focos de peste do estado de PE?


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55 HHIIPPTTEESSEE

Existe relao gentica entre as cepas de Y. pestis isoladas de diferentes eventos

epidemiolgicos dos trs focos de peste do estado de PE.

O MLVA permite demonstrar a relao gentica entre as cepas de Y. pestis isoladas de

diferentes eventos epidemiolgicos dos trs focos de peste do estado de PE.

O MLVA um marcador molecular eficaz no estudo intraespecfico do gnero Yersinia.


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66 OOBBJJEETTIIVVOOSS

66..11GGeerraall

Realizar tipagem molecular das cepas de Y. pestisisoladas no Nordeste do Brasil pela

anlise do nmero varivel de repeties em tandem.

66..22EEssppeeccffiiccooss

Identificar os padres de tipagem das cepas brasileiras de Y. pestis pela anlise dos

locos VNTRs (MLVA), estabelecendo a relao gentica entre as cepas e os dados

epidemiolgicos;

Avaliar a aplicao de diferentes locos VNTRs para tipagem molecular das cepas de Y.pestis;

Verificar a eficcia do MLVA como marcador molecular na caracterizao das cepas

brasileiras de Y. pestis.

Comparar o perfil genotpico encontrado nas cepas de Y. pestis com as cepas de Y.

pseudotuberculosise Y. enterocolitica para estabelecer a relao entre essas espcies e avaliar

o MLVA como marcador molecular intraespecfico para o gnero Yersinia.


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77 MMAATTEERRIIAALLEEMMTTOODDOOSS

77..11CCeeppaassEEssttuuddaaddaass

Foram analisadas 63 cepas de Y. pestis estocadas na bacterioteca do Servio de

Referncia em Peste (SRP) Laboratrio de nvel de segurana 3 (NB3) do CPqAM. Das 63

cepas 43 foram isoladas em diferentes perodos (1966 a 1980), diferentes hospedeiros

(humanos, roedores e pulgas) e de diversos municpios dos trs focos de peste do estado de

PE (Tabela 1). As outras 20 cepas so provenientes de roedores e pulgas que foram isoladas

durante uma epizootia que ocorreu em agosto de 1967 no stio de Alagoinha, uma propriedade

localizada na Chapada do Araripe no estado de Pernambuco (Tabela 2) (ALMEIDA et al.,

1985).

As cepas foram identificadas por P (Peste), Exu (isoladas do Plano Piloto de Peste em

Exu) segundo nmero de ordem dos isolados (ALMEIDA et al., 1985). Em relao s cepas

da epizootia foram realizados dois cultivos subseqentes em diferentes perodos emsubstituio as culturas originais. Neste trabalho, os subcultivos foram identificados como 1S

e 2S referentes ao 1 e 2 subcultivos respectivamente (Tabela 2).

Tambm foi includo no estudo oito cepas de Y. pestis isoladas em outros pases

(EUA, Madagascar, Iran, Birmnia, Curdisto e Peru) (Tabela 3), assim como cinco cepas de

Y. pseudotuberculosis e nove de Y. enterocolitica para anlise gentica comparativa com o

marcador molecular MLVA (Tabela 4).

77..22BBaaccttrriiaasseeCCoonnddiieessddeeCCuullttiivvoo

As cepas mantidas na coleo de culturas esto acondicionadas em camada alta do

meio Blood Agar Base (BAB, Difco) sob refrigerao a 4C. Para os estudos as culturas

foram renovadas por repique em caldo BHI (Brain Heart Infusion broth, Difco) e incubadas a28C por 48 horas. As colnias isoladas foram repicadas individualmente e crescidas em BHI

para extrao do DNA genmico.


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Cada cultura crescida foi plaqueada em duas placas de BAB (Blood Agar Base,

Difco), uma para teste com o bacterifago antipestoso para a confirmao da identificao e

pureza do cultivo, incubadas a 28oC e inspecionadas diariamente por at cinco dias para a

visualizao da lise pelo fago e observao da morfologia das colnias desenvolvidas. A outra

placa foi usada para reativao das colnias em BHI caso seja comprovada a pureza deste

isolado na placa com o fago antipestoso.

77..33EExxttrraaooddooDDNNAAGGeennmmiiccoo

Para a extrao do DNA genmico das cepas de Y. pestisestudadas foram utilizados

dois protocolos. Um deles o DNA genmico das culturas foi extrado baseado no protocolo de

lise por aquecimento desenvolvido por KEIM et al (2000) para Bacillus anthracise adaptado

para Y. pestisno Departamento de Microbiologia CPqAM. A lise bacteriana foi realizada

por fervura a partir de uma colnia isolada em BAB e ressuspendida em 200uL de TE (Tris

EDTA, pH 7.0), fervida por 20 minutos e centrifugada a 14.000 rpm por 1min. O

sobrenadante, contendo o material gentico, foi usado para as reaes do MLVA.O outro protocolo foi realizado como descrito em SOUZA et al (2007). Foi utilizado

um mililitro da cultura em BHI que foi centrifugado a 14.000 rpm a 4C, o sobrenadante foi

descartado, o sedimento suspenso em 500l de TE e novamente centrifugado. O sobrenadante

foi desprezado, o precipitado homogeneizado com 500l de TE, 10l de lisozima (10mg/ml)

e 10l de proteinase K (5mg/ml). A suspenso foi incubada a 60C por 20 minutos seguido da

adio de 100l de STE (SDS 2,5%, Tris-HCl 10nM pH8,0; EDTA 0,25M), 15 minutos de

incubao a 60C, 5 minutos a temperatura ambiente e 5 minutos em banho de gelo. Asuspenso foi neutralizada com 130l de acetato de amnio 7,5M, mantida no banho de gelo

por mais 15 minutos e depois centrifugada por 5 minutos. Aproximadamente 700l de

sobrenadante foi transferido para outro tubo, adicionando o mesmo volume de fenol-

clorofrmio-lcool isoamlico (25:24:1) e centrifugado por 5 minutos. O sobrenadante foi

transferido para outro tubo e o DNA precipitado com aproximadamente 420l de isopropanol

a -70C por 30 minutos ou a -20C por 24 horas seguido de centrifugao e descarte do

sobrenadante. O precipitado foi ressuspenso em 10l de gua mili Q e conservado a -20C. A

qualidade do DNA obtido foi avaliada atravs de eletroforese em gel de agarose 1% a 100 V

usando tampo TBE (Tris-borato 0,089 M; cido brico 0,089M; EDTA 0,002M), a 100V. A


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visualizao do DNA foi observado sob luz UV aps colorao em soluo de brometo de

etdio (15mg/ml). A quantificao foi realizada por comparao com uma quantidade

conhecida de DNA do fago lambda clivado pela enzima HindIII usando o programa 1D

Image Analysis, verso 3.5 (Kodak Digital Science).

77..44TTiippaaggeemmmmoolleeccuullaarrppeellaaaannlliisseeddoossmmllttiipplloossllooccoossVVNNTTRR((MMLLVVAA))

Foram selecionados 11 locos VNTRs que apresentaram um alto potencial para

polimorfismo revelados em trabalhos descritos na literatura: ms04, ms05, ms06, ms 07, ms09,

ms20, ms30, ms45, ms46, ms54 e ms 62 (LE FLCHE et al., 2001) (Tabela 5).

Os ensaios de PCR foram realizados para um volume final de 25l por tubo, contendo

20ng de DNA, 20pmol de cada primer, tampo (pH8) 50mM, desoxinucleotdeo trifosfato

0,16mM (dNTP-Invitrogen, Brasil), 1,5mM MgCl2, 1U da enzima Taq DNA polimerase

(Invitrogen, Brasil).

Em todas as reaes de PCR o termociclador (Biometra) foi programado para 96C

por 5 minutos para desnaturao, seguida de 34 ciclos de 96C por 20 segundos para

anelamento dos primers, 60C por 30 segundos e a 65C por 1 minuto para sntese,

terminando com 65C por 5 minutos para alongamento das fitas do DNA.

Os produtos de amplificao da PCR (amplicons) foram separados por eletroforese em

gel de agarose 2% em tampo Tris-Borato-EDTA sob voltagem de 100V, por cerca de trs

horas, corados com brometo de etdeo (1ug/mL), visualizados em transiluminador de luz

ultravioleta (UV) e digitalizados em cmera Kodak para posterior anlise. Foi utilizado

como padro de massa molecular o 50 ou 100 base-pair DNA ladder (Invitrogen, Brasil)dependendo do tamanho da unidade repetitiva.


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77..55AAnnlliisseeddoossDDaaddoossoobbttiiddoossppeellooMMLLVVAA

77..55..11DDeetteerrmmiinnaaooddooNNmmeerrooddeeRReeppeettiieess

O tamanho dos amplicons foi determinado atravs do programa 1D Image Analysis

software, verso 3.5 da Kodak Digital Science. O nmero das repeties de cada ampliconfoi

calculado usando a frmula deduzida, segundo Adair et al. (2000):

Nmero de repeties = Tamanho do amplicon(pb) Regio flanqueadora dos repeats (pb)

Tamanho da repetio das unidades repetitivas (pb)

O grau de similaridade entre os diferentes perfis foi determinado pelo coeficiente de

Hamming (1950) e o agrupamento dos perfis genotpico das cepas foi analisado pela

construo de dendrogramas atravs do algoritmo UPGMA Unweighted Pair Group Method

with Arithmatic Mean (SNEATH; SOKAL, 1962) usando o programa MEGA, version 4.0

(KUMAR et al. 2008).

Para verificar a localizao dos VNTRs no genoma completo de cepas de Y. pestis

previamente seqenciados, foram realizadas anlises in silicoutilizando o programa BLAST

Basic Local Alignment Search Toll(ALTSCHUL et al., 1997).

77..55..22AAnnlliisseeddiissccrriimmiinnaattrriiaaddoossllooccoossVVNNTTRRss

O poder discriminatrio para o mtodo de tipagem molecular MLVA e pela anlise de

cada VNTR estudado, foi determinado de acordo com o ndice numrico descrito por Hunter e

Gaston (1988). O valor D indica a probabilidade em que dois isolados, aleatoriamente


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selecionados dentro da populao testada, sero classificados em diferentes tipos. A seguinte

frmula foi utilizada:

onde D = ndice discriminatrio, s = nmero total dos tipos diferentes, nj = nmero de

isolados representando cada tipo e N = nmero total de isolados na amostra populacional.

Segundo Hunter e Gaston (1988), um ndice D superior a 0,90 pode ser interpretado como

confiante e desejvel.


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88RREESSUULLTTAADDOOSS

88..11TTiippaaggeemmMMoolleeccuullaarrppeellooMMLLVVAA((AAnnlliisseeddoossVVNNTTRRss))

88..11..11AAnnlliisseeddaasscceeppaassddeeYY.. ppeessttiiss iissoollaaddaassnnooss ttrrss ffooccoossddeeppeesstteeddooeessttaaddooddeePPEE eeddee

ffooccoossddeeoouuttrroossppaasseess

As 51 cepas de Y. pestisestudadas (43 cepas de Y. pestisbrasileiras e oito cepas de Y.

pestis estrangeiras) pertencentes a bacterioteca do SRP do CPqAM amplificaram os onze

locos VNTRs analisados (ms04, ms05, ms06, ms07, ms09, ms20, ms30, ms45, ms46, ms54 e

ms62). Entre os onze VNTRs investigados, dois (ms54 e ms30) revelaramse monomrficos

demonstrando o mesmo tamanho de amplicons e consequentemente o mesmo nmero de

cpias das unidades repetitivas (UR) para as cepas de Y. pestisisoladas nos trs focos de peste

do estado de PE. Quando os mesmos VNTRs foram comparados com as cepas de Y. pestis

estrangeiras, tambm apresentam-se monomrficos. O VNTR ms54 gerou sete unidadesrepetitivas (7UR) referentes ao ampliconde aproximadamente 270 pb e o VNTR ms30 gerou

2UR referentes a um ampliconde 690 pb em todas as cepas de Y. pestisanalisadas (Figuras 7

A B e 10). Os demais VNTRs analisados revelaram-se polimrficos, diferindo entre as

cepas deY. pestispelo tamanho do amplicone no nmero de cpias das unidades repetitivas,

gerando de dois a oito alelos para as cepas de Y. pestisdos trs focos de peste do estado de PE

e estrangeiras (Figura 11).

O VNTR ms06 gerou seis alelos diferentes entre as cepas de Y. pestis brasileiras eestrangeiras, com 2, 4, 5, 7, 8 e 9 UR referentes respectivamente aos ampliconsde 245, 365,

425, 545, 605 e 665 pb. Apenas duas cepas brasileiras de Y. pestis obtiveram perfis

exclusivos; a P. Exu 387 gerou 5UR referente a um ampliconde 425pb, assim como a cepa P.

Exu 340 que obteve 7UR referente ao ampliconde 545 pb. A cepa brasileira de Y. pestisP.

Exu 16 apresentou o mesmo nmero de unidades repetitivas (4UR) que as cepas estrangeiras

Kim e PKR684 (Figuras 8 A B, 10 e 11).

O VNTR ms09 gerou trs alelos com 20, 23 e 28 UR referentes a 496, 550, e 700 pb

respectivamente entre as cepas de Y. pestisestudadas. Apenas a cepa P. Exu 16 apresentou

23UR referente ao fragmento de 550 pb e duas cepas estrangeiras (Kim e PKR 684)


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apresentaram 20UR (496 pb). Todas as outras cepas brasileiras e estrangeiras geraram 28UR

(Figuras 8C, 10 e 11).

O VNTR ms46 gerou quatro alelos de 7, 10, 18 e 26 UR referentes a 250, 271, 327 e

383 pb respectivamente nas cepas de Y. pestis brasileiras e estrangeiras. A anlise deste

VNTR demonstrou que apenas a cepa estrangeira PKR 684 apresentou 18UR referente ao

amplicon de 327 pb diferente de todas as cepas estrangeiras e brasileiras de Y. pestis

analisadas com este VNTR. A cepa P. Exu 16 apresentou o mesmo nmero de unidades

repetitivas que a cepa estrangeira Kim (26UR), enquanto que as demais cepas foram

distribudas entre os diferentes alelos observados (Figuras 8D, 10 e 11).

O VNTR ms62 revelou-se o mais polimrfico dos marcadores moleculares analisados

entre as cepas de Y. pestisestudadas, gerando oito alelos com 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 e 12 URreferentes a 197, 206, 215, 224, 233, 251, 260 e 278 pb respectivamente. Dos oito alelos

gerados, quatro foram exclusivos para as cepas estrangeiras; EV 76, PKOL, PB8, PBM5,

PKR 684 e Alex que obtiveram 3, 7, 10 e 12 UR correspondentes a 197, 233, 260 e 278 pb

(Figuras 8E, 10 e 11). As cepas brasileiras obtiveram apenas trs alelos com 4, 5 e 6UR. A

cepa brasileira P. Exu 16 obteve o mesmo nmero de unidades repetitivas que a cepa

estrangeira Kim com 9UR (Figura 10).

O VNTR ms07 tambm revelou se bastante polimrfico, gerando sete alelos com 6,7, 8, 9, 10, 11 e 12 UR referentes a 296, 306, 316, 326, 336, 346 e 356 pb respectivamente.

Neste VNTR o nico fragmento de amplificao exclusivo foi referente a cepa estrangeira

Kim que gerou 6UR referente a um ampliconde 296 pb (Figuras 8F, 10 e 11). Todas as outras

cepas estrangeiras estudadas apresentaram o mesmo nmero de unidades repetitivas (7UR),

alm disso a cepa brasileira P. Exu 16 apresentou o perfil idntico as cepas estrangeiras com

7UR. As demais cepas brasileiras obtiveram perfil prprio de 8, 9, 10, 11 e 12UR (Figura 10).

O VNTR ms45 gerou apenas um alelo de 3UR referente a 231 pb entre as cepasbrasileiras e estrangeiras deY. pestis (Figuras 10 e 11). Exceto para uma cepa brasileira P.

Exu 16 e duas estrangeiras Kim e PKR684 que apresentaram perfil exclusivo de 2UR

referente a 219 pb (Figuras 8G, 10 e 11).

O VNTR ms20 gerou quatro alelos de 2, 3, 4 e 5 UR referentes a 248, 263, 278 e 293

pb respectivamente de maneira que os amplicons variaram entre as cepas de Y. pestis

analisadas, mas com predominncia do perfil de 4UR (Figuras 9A e 11). No entanto, as cepas

brasileiras de Y. pestisobtiveram 4 e 5UR, enquanto que as estrangeiras 2 e 3UR. Apenas a

cepa brasileira P. Exu 16 apresentou perfil idntico com algumas cepas estrangeiras (Figura

10).


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O VNTR ms04 gerou quatro alelos com 4, 6, 7 e 8UR referentes a 328, 362, 379 e 396

pb entre as cepas de Y. pestis brasileiras e estrangeiras analisadas (Figuras 9B e 11). Apenas

duas cepas estrangeiras PKR 684 e Kim obtiveram perfil exclusivo com 4UR (Figura 10). As

demais cepas analisadas foram distribudas entre os alelos de 6, 7 e 8UR (Figura 10).

O VNTR ms05 gerou trs alelos com 6, 7 e 8UR referentes aos ampliconsde 267, 284

e 301 pb respectivamente nas cepas de Y. pestis analisadas. Todas as cepas brasileiras

obtiveram o mesmo nmero de repeties 7UR, exceto a P. Exu 16 que apresentou o mesmo

perfil de 6UR das estrangeiras Kim e PKR 684. As cepas estrangeiras obtiveram 6, 7 e 8UR,

no entanto, apenas uma cepa estrangeira P. Peru gerou 8UR diferente de todas as demais

cepas brasileiras e estrangeiras analisadas com este VNTR (Figuras 9C, 10 e 11).

Com base nos padres de amplificao obtidos com os onze VNTRs pela tcnica doMLVA, as 51 cepas de Y. pestis (brasileiras e estrangeiras) foram distribudas em 35 perfis

genotpicos denominados neste trabalho de P1 a P35 (Tabelas 1 e 3; Figura 10).

A anlise das cepas de Y. pestisde acordo com o coeficiente de Hamming (1950) e da

construo do dendrograma atravs do algoritmo UPGMA pode ser visto na figura 10. De

acordo com o dendrograma as cepas de Y. pestisestudadas foram agrupadas em trs clados (I,

II e IV). O primeiro clado (I) agrupou todas as 42 cepas brasileiras de Y. pestis, exceto uma

(P. Exu 16) que ficou agrupada no clado IV juntamente com duas cepas de Y. pestisestrangeiras; Kim e PKR684 (Figura 10). As cepas de Y. pestisestrangeiras foram agrupadas

em dois clados separados o II e IV. As cepas brasileiras de Y. pestisforam distribudas em 27

perfis genotpicos P1 a P27 (Tabela 1; Figura 10) e as estrangeiras foram distribudas em oito

perfis genotpicos P28 a P35 (Tabela 3; Figura 10).

De acordo com o ndice numrico descrito por Hunter e Gaston (1988) o poder

discriminatrio com os 11 VNTRs analisados nas cepas de Y. pestisisoladas nos trs focos de

peste do estado de PE foi de 0,95. O ndice discriminatrio foi calculado tambmindividualmente para cada VNTR analisado neste estudo nas cepas brasileiras de Y. pestis.

Para o VNTR ms06 o ndice foi de 0,44; VNTR ms 09 foi 0,05; VNTR ms46 foi 0,38; VNTR

ms62 foi 0,26; VNTR ms07 foi 0,68; para o VNTR ms20 foi 0,14; para o VNTR ms04 foi

0,61; para o VNTR ms05 foi 0,046 e para os VNTRs ms54, ms 30 e ms45 foi 0 (zero);

A localizao dos VNTRs no genoma das cepas de Y. pestis previamente seqenciadas

foi realizada pela anlise in silicoutilizando o programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1997).

A ferramenta indicou que dos onze locos VNTRs estudados dez foram localizados no DNA

cromossomal da bactria, enquanto apenas um, o VNTR ms09, foi localizado no plasmdeo de

virulncia (pYV) de Y. pestis(Tabela 5).


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88..11..22AAnnlliisseeddaasscceeppaassddeeYY..ppeessttiissiissoollaaddaassdduurraanntteeuummaaeeppiizzoooottiiaaddeeppeesstteeeemm11996677nnooffooccoo

ddaaCChhaappaaddaaddooAArraarriippeePPEE..

As 20 cepas de Y. pestis estocadas na bacterioteca do SRP do CPqAM estavam

armazenadas em dois subcultivos (duas culturas por cepa). Estes subcultivos foram referentes

a repiques subseqentes realizados em diversos anos. Os diferentes repiques levaram a

tentativa de recuperao das 40 culturas, aps sete dias de crescimento em meio BAB a 28oC.

Dessas apenas 22 foram recuperadas, sendo seis do primeiro subcultivo e 16 do segundo. Em

apenas duas cepas foi possvel recuperar os dois subcultivos das culturas pareadas (P. Exu 57

1S e 2S e P. Exu 60 1S e 2S (Tabela 2).Todos os 11 locos VNTRs analisados foram amplificados nas culturas de Y. pestis

isoladas durante a epizootia de Peste. Desses, dez se revelaram monomrficos, apresentando o

mesmo tamanho do amplicone o mesmo nmero de unidades repetitivas: VNTR ms09 28UR

referentes a 700pb; 250 pb com 7UR para o VNTR ms46; 270 pb com 7UR para o VNTR

ms54; 690 pb com 2UR para o VNTR ms30; 206 pb com 4UR para o VNTR ms62; 306 pb

com 7UR para o VNTR ms07; 231 pb com 3UR para o VNTR ms45; 293 pb com 5UR para o

VNTR ms20; 379 pb com 7UR para o VNTR ms04 e 284 pb com 8UR para o VNTR ms05(Figura 12 A I).

Apenas o VNTR ms06 revelou-se polimrfico, gerando trs alelos com 8, 9 e 10 UR

referentes a 605, 665 e 725 pb respectivamente (Figura 12 J; Tabela 2). O alelo de 605 pb foi

encontrado em 18 culturas, cinco do primeiro subcultivo e em 13 do segundo; o alelo de 665

pb foi observado em trs culturas, uma do primeiro subcultivo e duas do segundo e para o

alelo de 725 pb apenas uma cultura do segundo subcultivo foi verificada (Tabela 2). As

culturas pareadas das duas cepas (P. Exu 57 1S e 2S e P. Exu 60 1S e 2S) demonstraram paraeste VNTR 8UR referentes a 605 pb (Tabela 2).

88..11..33AAnnlliisseeddaasscceeppaassddeeYY..eenntteerrooccoolliittiiccaa

Nove cepas de Y. enterocolitica foram analisadas pelo marcador molecular MLVA

para comparao com as cepas deY. pestis eY. pseudotuberculosis e avaliao do marcador.

Os onze locos VNTRs foram amplificados nas nove cepas de Y. enterocolitica, com exceo


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da cepa Ye 37 analisada com o VNTR ms06, e das cepas Ye 43p e Ye 25L analisadas com o

VNTR ms05, que no foi possvel obter a amplificao desta regies nestas cepas(Tabela 4).

Nas nove cepas de Y. enterocoliticaanalisadas com os onze locos VNTR, sete VNTRs

apresentaram um padro de amplificao monomrfico demonstrando apenas um amplicone

o mesmo nmero de unidades repetitivas para todas as cepas de Y. enterocolitica (Tabela 4).

Estas cepas geraram 28 UR referente ao segmento de 700 pb com o VNTR ms09, 7 UR (250

pb) com o VNTR ms46, 7 UR (270 pb) com o VNTR ms54, 2 UR (690 pb) com o VNTR

ms30, 3 UR (231 pb) com o VNTR ms45, 3 UR (263 pb) com VNTR ms20 e 7 UR (379 pb)

com o VNTR ms04 (Tabela 4).

Apenas quatro locos VNTRs analisados apresentaram um padro de amplificao

polimrfico para as nove cepas de Y. enterocolitica, onde as cepas demonstraram tamanhos deampliconse nmeros de unidades repetitivas diferentes (Tabela 4). Nas cepas analisadas com

o VNTR ms06 foi observado alelos com 8 UR referente a 605 pb e 9 UR referente a 665 pb.

Com o VNTR ms62 foram observados alelos com 5UR referente ao segmento de 215 pb e

com 6 UR referente ao ampliconde 224 pb. O VNTR ms07 gerou alelos com 8 UR referente

ao segmento de 316 pb e 9 UR referente ao segmento de 326 pb. Por fim, aps anlise do

VNTR ms05 foram observados alelos com 5 UR e 6 UR correspondentes aos segmentos de

250 pb e 267 pb respectivamente ( Figura 11; Tabela 4).Baseado no padro de amplificao das cepas de Y. enterocoli

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