ProduProduçção de enzimas por ão de enzimas por

MOMO’’s utilizando ress utilizando resííduos duos

industriais como industriais como

substratosubstratoBrunele Weber ChavesBrunele Weber Chaves

Acadêmica de FarmAcadêmica de Farmáácia e Med.Veterincia e Med.Veterinááriaria

UFSMUFSM

Laboratório de Inspeção de Produtos de origem animal

Faculdade de Veterinária- UFPel

ResResííduos Industriaisduos Industriais

�� ResResííduos indduos indúústria alimentosstria alimentos-- fonte matfonte matééria ria orgânicaorgânica-- muito poluentemuito poluente

�� Minimizar, recuperar e aproveitarMinimizar, recuperar e aproveitar

�� PolPolííticas ambientaisticas ambientais-- substituir processos substituir processos ququíímicos convencionais por enzimmicos convencionais por enzimááticosticos

�� LactaseLactase-- catalisa degradacatalisa degradaçção compostos ão compostos fenfenóólicos e aminas de efluentes da indlicos e aminas de efluentes da indúústria têxtilstria têxtil

�� ResResííduos descartadosduos descartados-- produtos alto valor produtos alto valor agregadoagregado

ResResííduos industriaisduos industriais

�� Reaproveitar resReaproveitar resííduos sduos sóólidos processos industriaislidos processos industriais�� MOMO’’ss-- agentes redutores de matagentes redutores de matééria orgânicaria orgânica--eliminaeliminaçção/reduão/reduçção compostos tão compostos tóóxicosxicos

�� ResResííduos indduos indúústrias de alimentosstrias de alimentos-- fonte de matfonte de matééria ria orgânica, proteorgânica, proteíínas, enzimas e nas, enzimas e óóleos essenciaisleos essenciais

�� MOMO’’s desenvolvems desenvolvem-- consumo matconsumo matééria orgânicaria orgânica-- diminui diminui capacidade poluidoracapacidade poluidora

�� Bioconversão substrato residual em biomassa Bioconversão substrato residual em biomassa microbianamicrobiana-- extraextraçção substância produzidas no ão substância produzidas no crescimento dos mocrescimento dos mo’’ss

�� Aproveitamento proteAproveitamento proteíínas, lipnas, lipíídeos, enzimas, deos, enzimas, áácidos cidos nuclnuclééicos, icos, áácidos orgânicoscidos orgânicos

EnzimasEnzimas

�� Catalisadores biolCatalisadores biolóógicosgicos

�� Unidades funcionais metabolismo celularUnidades funcionais metabolismo celular

�� Natureza protNatureza protééicaica

�� Aceleram transformaAceleram transformaçção de molão de molééculasculas

�� 1 mol enzima1 mol enzima-- catalisa 10catalisa 1044 a 10a 1066 moles substrato/minmoles substrato/min

�� Diminuem energia ativaDiminuem energia ativaççãoão

�� ConcentraConcentraçções baixasões baixas

�� pH e tpH e tªªC ideaisC ideais

�� Especificidade substrato/enzimaEspecificidade substrato/enzima-- ““chavechave--fechadurafechadura””

EnzimasEnzimas

�� BrasilBrasil-- consumo produtos importadosconsumo produtos importados�� Aumenta comercializaAumenta comercializaççãoão-- diminui produdiminui produççãoão�� 90% produ90% produççãoão-- grandes empresasgrandes empresas-- Pfizer, GenencorPfizer, Genencor�� Interesse tecnologias enzimInteresse tecnologias enzimááticasticas-- meios não convencionaismeios não convencionais�� Mercado mundial tecnologia enzimMercado mundial tecnologia enzimááticatica-- crescecresce-- interesse interesse processos:processos:

-- Baixo custoBaixo custo-- Menor impacto ambientalMenor impacto ambiental-- MatMatéériasrias--primas renovprimas renovááveisveis-- Reaproveitar subprodutos agroindReaproveitar subprodutos agroindúústriastria

EnzimasEnzimas-- obtenobtenççãoão

FermentaFermentaçção resão resííduos industriaisduos industriais

-- Soro do leiteSoro do leite* Lactase* Lactase* Invertase* Invertase* Carboximetilcelulase* Carboximetilcelulase

-- Casca de coco verdeCasca de coco verde* Protease* Protease* Pectinase* Pectinase* Xilanase* Xilanase* Celulase* Celulase

-- Soro queijoSoro queijo* Lactase* Lactase

LactaseLactase

�� BB-- galactosidasegalactosidase

�� Vegetais (maVegetais (maççã, pêssego) e ã, pêssego) e óórgãos (crgãos (céérebro, placenta)rebro, placenta)

�� Fungos filamentosos, bactFungos filamentosos, bactéérias (EC e Bacillus sp.) e levedurasrias (EC e Bacillus sp.) e leveduras

�� Quebra a lactose em galactose e glicoseQuebra a lactose em galactose e glicose

�� 75% popula75% populaçção deficiente/não produzão deficiente/não produz-- alteraalteraçções intestinaisões intestinais

�� HidrHidróólise lactoselise lactose-- aaçúçúcar mais doce, solcar mais doce, solúúvel e digervel e digeríívelvel--intolerantesintolerantes

�� MMéétodo enzimtodo enzimááticotico-- menor temperatura e formamenor temperatura e formaçção produtos ão produtos indesejindesejááveisveis

�� Diferentes procedênciasDiferentes procedências-- pH e temperaturas pH e temperaturas óótimostimos

-- fungos: pH 2,5fungos: pH 2,5--4,5 e 304,5 e 30ººCC--4040ººCC

ProteaseProtease

�� Quebram ligaQuebram ligaçções peptões peptíídicas entre aminodicas entre aminoáácidos das cidos das proteproteíínasnas

�� Clivagem proteolClivagem proteolííticatica-- ativaativaçção e inativaão e inativaçção enzimão enzimááticatica

XilanaseXilanase

�� DegradaDegradaçção da xilanaão da xilana

PectinasePectinase

�� Degrada parede celular microorganismos e Degrada parede celular microorganismos e vegetais superioresvegetais superiores

CelulaseCelulase

�� Catalisam hidrCatalisam hidróólise da celuloselise da celulose

�� Produzidas fungos, bactProduzidas fungos, bactéérias e protozorias e protozoááriosrios

InvertaseInvertase

�� BB--frutofuranosidasefrutofuranosidase-- sacarasesacarase

�� Catalisa hidrCatalisa hidróólise sacaroselise sacarose-- glicose+frutoseglicose+frutose

�� FormaFormaçção de xarope de aão de xarope de açúçúcar invertidocar invertido

�� ObtenObtençção alto custo da frutoseão alto custo da frutose-- enzima caraenzima cara

�� PreferPreferíível utilizar glicose isomerasevel utilizar glicose isomerase

CarboximetilcelulaseCarboximetilcelulase

�� CMCaseCMCase

�� Degrada carboximetilceluloseDegrada carboximetilcelulose-- polpolíímero solmero solúúvel vel em em áágua q forma ggua q forma gééisis

FermentaFermentaççãoão

�� MOMO’’s catalisam conversão: substâncias catalisam conversão: substância--produto mais produto mais simplessimples

�� OxidaOxidaçção incompleta da glicose sem oxigênioão incompleta da glicose sem oxigênio�� GlicGlicóólise e redulise e reduçção do ão do áácido pircido pirúúvicovico�� ProduProduçção de energia (2 ATPs)ão de energia (2 ATPs)�� FormaFormaçção de ão de áácidos, cidos, áálcool e glcool e gááss�� Base processos industriaisBase processos industriais�� Conversão matConversão matéérias primas (grãos, arias primas (grãos, açúçúcares, cares, subprodutos)subprodutos)-- produtos sintprodutos sintééticos diferentesticos diferentes

�� Cepas selecionadas mofos, leveduras, bactCepas selecionadas mofos, leveduras, bactéériasrias

Aspergillus niger

Aspergillus nigerAspergillus niger

�� AerAeróóbiosbios-- ambientes ricos oxigênioambientes ricos oxigênio

�� Necessitam de matNecessitam de matééria orgânica (fonte de C)ria orgânica (fonte de C)

�� Contaminam restos alimentosContaminam restos alimentos

�� SaprSapróófitos cosmopolitasfitos cosmopolitas

�� ProduProduçção enzimas e biomolão enzimas e biomolééculasculas

�� Fungo de fFungo de fáácil obtencil obtenççãoão

�� Bom poder aminolBom poder aminolíítico em reatico em reaçções fermentativasões fermentativas

�� Tratamento de resTratamento de resííduosduos

Soro Leite Soro Leite

�� Subproduto indSubproduto indúústria laticstria laticííniosnios

�� Metade extrato seco leite (lactose, proteMetade extrato seco leite (lactose, proteíínas solnas solúúveis e sais)veis e sais)

�� 80% volume leite p/ queijos= soro80% volume leite p/ queijos= soro

�� muito volume geradomuito volume gerado

�� carga poluidoracarga poluidora-- problemas ambiente (rios)problemas ambiente (rios)

�� Pequena quantidade para alimentaPequena quantidade para alimentaçção animalão animal

�� Atender legislaAtender legislaçções ambientais:ões ambientais:

-- Aproveitamento soroAproveitamento soro-- recuperarecuperaçção de nutrientes!!!!ão de nutrientes!!!!

-- Aproveitado para sAproveitado para sííntese de enzimasntese de enzimas

Casca coco verdeCasca coco verde

�� Alto consumo Alto consumo ááguagua-- muito rejeito (casca)muito rejeito (casca)

�� Aproveita APENAS rejeito coco maduroAproveita APENAS rejeito coco maduro

�� Coco verdeCoco verde-- cascacasca-- aproveitar resaproveitar resííduo industrial duo industrial e diminuir lixo urbanoe diminuir lixo urbano-- lucro!!lucro!!

�� Muita celulose, hemicelulose, pectinaMuita celulose, hemicelulose, pectina-- indutores indutores produzir celulases, xilanases e pectinases produzir celulases, xilanases e pectinases (enzimas extracelulares)(enzimas extracelulares)

�� NÃO necessita muito suplementoNÃO necessita muito suplemento

Soro queijoSoro queijo

�� Produto dessora coProduto dessora coáágulo de leitegulo de leite�� Mais importante subprodutos do queijoMais importante subprodutos do queijo�� 94% 94% ááguagua�� Extrato seco= 80% lactoseExtrato seco= 80% lactose�� Descarte riosDescarte rios-- alta DBOalta DBO-- mto poluentemto poluente�� Descarte soloDescarte solo-- compromete estrutura compromete estrutura �� AlternativasAlternativas-- matmatéériri--prima produzir lactase, vitamina K, prima produzir lactase, vitamina K, fosfatos do leitefosfatos do leite

�� ProduProduçção soro em pão soro em póó, ricota, alimenta, ricota, alimentaçção animal ão animal (su(suíínos)nos)

ExperimentosExperimentos-- Soro do leiteSoro do leite

�� Cepas Cepas Aspergillus niger Aspergillus niger cultivadas em cultivadas em áágar batata dextrosegar batata dextrose

�� FermentaFermentaççõesões-- produproduçção enzimão enzimááticatica-- 48hs e 48hs e crescimento celularcrescimento celular-- 96hs96hs

�� Medida pH meio apMedida pH meio apóós fermentas fermentaççãoão

�� Atividade enzimAtividade enzimááticatica-- concentraconcentraçção no meioão no meio-- formaformaçção ão aaçúçúcar redutor da hidrcar redutor da hidróólise de CMC, lactose, sacaroselise de CMC, lactose, sacarose

�� EspectrofotometricamenteEspectrofotometricamente-- mméétodo DNStodo DNS

�� unidade de atividade= geraunidade de atividade= geraçção 1 micromol ão 1 micromol produto/minproduto/min

�� ConcentraConcentraçção celularão celular-- MS (centrifugaMS (centrifugaçção + secagem em ão + secagem em estufa do meio) estufa do meio)

Yx/s = (XYx/s = (X--Xo)/(SoXo)/(So--S)S)

X e Xo= ConcentraX e Xo= Concentraçções celularesões celulares

S e So= ConcentraS e So= Concentraçções de substratoões de substrato

Yx/s= fator estequiomYx/s= fator estequioméétrico de conversão de substrato em trico de conversão de substrato em produtoproduto

Tabela 1: Valores das atividades enzimáticas.

Cepa CMCase LAC INV Yx/S (g/L)

A 192.328999 251.204419 233.088905 0.133637B 311.589466 477.648344 462.552082 0.133637

C 189.309746 195.348251 193.838625 0.133637

D 181.761616 294.983578 204.406008 0.133637E 225.540774 432.359559 319.137597 0.133637

F 408.205540 557.658530 512.369746 0.133637

## As diferentes cepas do fungo cresceram de forma satisfatória no

meio do soro produzindo as enzimas em quantidades consideráveis!!!!

Resultados

Tabela 2: Valores das medidas de pH.

Cepa pHA 4,74

B 5,11

C 3,35D 3,90

E 3,22F 5,11

Resultados

## Valores de pH do meio após a fermentação= evidente diferença entre os

metabolismos das diferentes cepas do fungo!!!

Resultados

## Cepas de Aspergillus niger crescem forma satisfatória no soro

do leite sem adição de suplementos de nutrientes no meio!!!

Figura 1: Concentração celular após 96hs de fermentação

ExperimentosExperimentos-- ConclusõesConclusões

§§§§ Foi comprovada experimentalmente a produFoi comprovada experimentalmente a produçção ão de enzimas e o crescimento de de enzimas e o crescimento de Aspergillus niger Aspergillus niger

em soro de leite!!em soro de leite!!

§§§§ Processos promissores e de interesse ambientalProcessos promissores e de interesse ambiental

§§§§ NecessNecessáários ensaios para avaliar cinrios ensaios para avaliar cinéética de tica de crescimento celularcrescimento celular

ExperimentosExperimentos-- soro do queijosoro do queijo

�� Aspergillus niger Aspergillus niger e e Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae

�� NutrientesNutrientes-- extrato de levedura, peptona bacteriolextrato de levedura, peptona bacteriolóógica, fosfato gica, fosfato monobmonobáásico de potsico de potáássio, sulfato de amônio e casessio, sulfato de amônio e caseíínana

�� Influência suplementaInfluência suplementaççãoão

�� Diferentes concentraDiferentes concentraçções de lactose e nutrientesões de lactose e nutrientes-- diferente diferente crescimento celularcrescimento celular

�� Testes massa celular, aTestes massa celular, açúçúcar redutor, atividade enzimcar redutor, atividade enzimáática (stica (sííntese ntese lactase)lactase)

�� LactaseLactase-- produproduçção intracelularão intracelular-- rompimento por autrompimento por autóólise lise (esmagamento e solventes) (esmagamento e solventes) -- isolamentoisolamento-- extrato livre de cextrato livre de céélulaslulas--

ExperimentosExperimentos-- soro do queijosoro do queijo

•• MMéétodo todo áácido Dinitrossaliccido Dinitrossalicíílicolico-- avalia quantidade aavalia quantidade açúçúcares cares redutoresredutores-- espectrofotômetro (curva)espectrofotômetro (curva)

•• Teste enzimTeste enzimáático colorimtico coloriméétricotrico-- determina glicosedetermina glicose-- atividade atividade enzimenzimááticatica

-- Unidade atividade= unidade glicose produzida/minUnidade atividade= unidade glicose produzida/min•• Crescimento celularCrescimento celular-- SobrenadanteSobrenadante-- evaporaevapora-- peso final e inicialpeso final e inicial•• Meio para fermentaMeio para fermentaççãoão-- soro do queijo e nutrientessoro do queijo e nutrientes•• Tratar soroTratar soro-- retira fraretira fraçção protão protééicaica-- acidificaacidificaçção e aquecimentoão e aquecimento--

precipita proteprecipita proteíínas e filtranas e filtra•• Ajuste pH com Ajuste pH com áácido lcido lááticotico•• Amostras cada 24hsAmostras cada 24hs-- concentraconcentraçção celular, aão celular, açúçúcares totais, atividade cares totais, atividade

enzimenzimááticatica

Aspergillus oryzae apresentou

concentração máxima em

menor tempo que Aspergillus

niger!!!!

Concentração de açúcares no

meio decresce mais rapidamente

para o Aspergillus oryzae!!!

Considerável maior crescimento

celular com adição de nutrientes!!

ExperimentosExperimentos-- ConclusõesConclusões

§§§§ Importante retirar proteImportante retirar proteíínas soronas soro-- não interferir não interferir precipitaprecipitaçção cão céélulaslulas

§§§§ PresenPresençça nutrientes meioa nutrientes meio-- influência crescimento influência crescimento celularcelular

§§§§ MeioMeio-- soro com lactose como fonte de Csoro com lactose como fonte de C--ADEQUADO crescimento fungosADEQUADO crescimento fungos

§§§§ Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae consumo lactose menor tempoconsumo lactose menor tempo

§§§§ NecessNecessáária adiria adiçção extrato de leveduraão extrato de levedura-- bom bom crescimentocrescimento

§§§§ Sulfato de amônio não adicionarSulfato de amônio não adicionar-- menor crescimentomenor crescimento

ExperimentosExperimentos-- casca coco verdecasca coco verde

�� FermentaFermentaçção semião semi--ssóólida cascalida casca

�� Casca desidratada e moCasca desidratada e moíída da

�� 3 granulometrias (1, 2 e 3)3 granulometrias (1, 2 e 3)

�� Aspergillus niger Aspergillus niger isolado do soloisolado do solo

�� SoluSoluçção nutrientesão nutrientes-- sulfato amônio, fosfato de potsulfato amônio, fosfato de potáássio ssio (fonte N, S e P)(fonte N, S e P)

�� Objetivo: melhor granulometria crescer fungo e Objetivo: melhor granulometria crescer fungo e produzir enzimasproduzir enzimas

�� Verificar influência microbiota natural cascaVerificar influência microbiota natural casca-- substrato substrato não autoclavado e não inoculadonão autoclavado e não inoculado

ResultadosResultados

-- Diferentes granulometriasDiferentes granulometrias-- diferentes enzimas com diferentes enzimas com picos de produpicos de produçção distintosão distintos

-- Diferentes aplicaDiferentes aplicaççõesões-- escolher granulometria mais escolher granulometria mais adequadaadequada

-- Diminui produDiminui produçção enzimasão enzimas-- aaçção proteolão proteolíítica/ tica/ instabilidade molinstabilidade molééculasculas

-- Atividade enzimaAtividade enzima-- unidade/mL extrato enzimunidade/mL extrato enzimááticotico

-- Influência microbiota naturalInfluência microbiota natural-- cresce meios não cresce meios não estestééreisreis-- MO matMO matééria prima ou do ambienteria prima ou do ambiente--morfologia diferente meios inoculadosmorfologia diferente meios inoculados

ExperimentosExperimentos-- ConclusõesConclusões

§§§§ Validada hipValidada hipóótese aproveitar casca coco para produtese aproveitar casca coco para produçção ão enzimas enzimas

§§§§ TODAS enzimas produTODAS enzimas produçção mão mááxima 24xima 24--96hs96hs-- tempo tempo produproduçção industrial correnteão industrial corrente

§§§§ 7 dias7 dias-- produproduçção enzimas meio não esterilizadoão enzimas meio não esterilizado--microorganismos nativosmicroorganismos nativos

§§§§ NecessNecessáário esterilizar meiorio esterilizar meio-- influência MOinfluência MO’’s naturais s naturais ééindesejada indesejada

§§§§ MO nativoMO nativo-- uso diminui custos, prejudica controle uso diminui custos, prejudica controle processo e qualidade produto final e não garante processo e qualidade produto final e não garante mesma linhagem fmesma linhagem fúúngica cada bateladangica cada batelada

Referências BibliogrReferências Bibliográáficasficas

�� COELHO, Maria Alice Zarur et. Al. COELHO, Maria Alice Zarur et. Al. Aproveitamento Aproveitamento de resde resííduos agroindustriais: produduos agroindustriais: produçção de enzimas ão de enzimas a partir da casca de coco verde.a partir da casca de coco verde. B.CEEPPA, B.CEEPPA, Curitiba, v.19, n.1, p 33Curitiba, v.19, n.1, p 33--42, 2001.42, 2001.

�� BARBOSA, Mariana Ricken et. Al. BARBOSA, Mariana Ricken et. Al. Estudo da Estudo da produproduçção da enzima Lactase utilizando soro de ão da enzima Lactase utilizando soro de queijo e fungo filamentoso queijo e fungo filamentoso Aspergillus nigerAspergillus niger. .

�� CARDOSO, Izabela Cortes et. Al. CARDOSO, Izabela Cortes et. Al. FermentaFermentaçção do ão do soro do leite por soro do leite por Aspergillus niger Aspergillus niger para produpara produçção ão enzimenzimáática.tica. 55ªª Semana Acadêmica. Universidade Semana Acadêmica. Universidade Federal de Uberlândia.Federal de Uberlândia.