Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 1 de 22

ANALÍTICA DEL VINO. PROTOCOLO nº 1. 1. -Acidez volátil. 1.1. -Introducción. La acidez volátil es el contenido en ácidos grasos(acético, fórmico, propiónico, butírico, etc.); excluyéndose los arrastrables por vapor como el láctico, succínico, sórbico, anhídrido sulfuroso. Valores entre 0,3 y 0,7 g/l, expresados en ácido acético son normales. Un valor superior puede ser índice de que el vino está siendo alterado por microorganismos del género Acetobacter o Gluconobacter o que está sufriendo alguna otra alteración bacteriana. La finalidad de la determinación de la acidez volátil es variada: -Verificar si el vino cumple los límites legales. -Seguimiento del estado del vino durante su almacenamiento. 1.2. -Reactivos y materiales necesarios. -Solución de hidróxido sódico N/49 -Solución de fenolftaleína al 1%. -Volatímetro. -Probetas de 5.1 y 3.2 ml. -Matraz Erlenmeyer o vaso de precipitados. -Bureta. 1.3. -Procedimiento. -Tomar con la pipeta adecuada 11 ml de vino y verterlos en un matraz de destilación. -Disponer convenientemente el refrigerante y la probeta de 5.1 ml a la salida de éste. -Encender el mechero Bunsen o de alcohol bajo el matraz procurando que la mecha no esté muy fuerte.

-Recoger el destilado hasta la marca de la probeta de 5.1. -Una vez que llegue, quitar ésta rápidamente y poner la probeta de 3.2 ml, dejando que se llene hasta la marca. 1.4. -Valoración. -Verter el contenido de la segunda probeta en el matraz o en el vaso de precipitados, apurándolo. El de la primera se desprecia. -Echar unas gotas de fenolftaleína. -Valorar con el Hidróxido Sódico hasta apreciar una coloración ligeramente rosada, tomando nota del volumen gastado. 1.5. -Expresión de los resultados. -El volumen gastado se multiplica por 0,369 dando el valor expresado en g/l de ácido acético.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 2 de 22 PROTOCOLO nº 2 2.Acidez total. 2.1-Introducción. La acidez total es la suma de los ácidos valorables en el vino cuando éste es llevado a pH 7 (según O.I.V.) o pH 8,2 (según A.O.A.C.) Los ácidos valorables son los siguientes. Tartárico, málico, láctico, succínico, acético, etc. Se excluyen el dióxido de carbono y el anhídrido sulfuroso. 2.2. -Reactivos y materiales necesarios. -Solución de hidróxido sódico de cierta concentración -Solución de fenolftaleína al 2%. -Pipeta de 10 ml -Bureta. -Matraz. 2.3. -Procedimiento. -Pipetear 10 ml de vino y verterlos a un matraz. -Añadir unas gotas de fenolftaleína. 2.4. -Valoración. -Añadir gotas de hidróxido sódico hasta que vire a color verdoso en tintos y rosados y a rosa en blancos. -Anotar el volumen gastado. 2.5. -Expresión de los resultados. -Operando con NaOH N/4.9 Si llamamos V ml al volumen de sosa gastada en la neutralización, tendremos que: *Acidez total g/l en ácido sulfúrico= V *Acidez total g/l en ácido tartárico= V * 1,53 -Operando con NaOH N/10 Si llamamos V´ ml al volumen de sosa gastada en la neutralización, tendremos que: *Acidez total g/l en ácido sulfúrico= V´* 0,49 *Acidez total g/l en ácido tartárico= V´* 0.75 *Acidez total en meq/l= V´ x 10

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 3 de 22 PROTOCOLO 3 3.Sulfuroso libre. 3.1. -Introducción. El gas sulfuroso tiene múltiples aplicaciones en el campo enológico, siendo sus funciones principales: -Antioxidante (destruye oxidasas). -Efecto selectivo de levaduras, mejorando la fermentación. -Antiséptico. -Bloquea el acetaldehído, conservando la frescura de los vinos, etc. El fundamento se basa en la reacción de oxidación-reducción del sulfuroso con yodo, con almidón como indicador. 3.2. -Reactivos y materiales necesarios. -Ácido sulfúrico al 33%. -Solución de almidón al 1% -Solución de iodato potásico 128/N como líquido de valoración. -Pipeta de 25 ml. -Toning con mosca y bureta o matraz Erlenmeyer y bureta 3.3. -Procedimiento. +Con Toning: -Pipetear 25 ml de vino y verterlos en el recipiente del Toning. -Añadir 5 ml del ácido. -Añadir unas gotas de la solución de almidón. -Echar la mosca.

-Encender el toning, colocando convenientemente el recipiente. Apretar el botón de start.

+Sin toning: -Pipetear 25 ml de vino y verterlos en el matraz.

-Añadir 5 ml del ácido. - Añadir unas gotas de la solución de almidón.

3.4. -Valoración. +Con Toning:

-Esperar al primer pitido y entonces añadir el líquido de valoración hasta que pite tres veces. Anotar el volumen gastado.

+Sin toning: Igual al anterior, pero la valoración se debe confiar visualmente hasta que vire a morado tanto en tintos como en blancos. 3.5. -Expresión de los resultados. La diferencia entre mililitros finales e iniciales se multiplica por 10, obteniendo el contenido de anhídrido sulfuroso libre en mg/l.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 4 de 22 PROTOCOLO nº 4 4. -Sulfuroso total. 4.1. -Introducción. Es aplicable lo comentado lo mismo que para el caso anterior, pero es necesario hidrolizar el acetaldehído con una base fuerte a acetaldehído-α-hidroxisulfonato. 4.2. -Reactivos y materiales necesarios. -Disolución de álcali de hidróxido sódico 4%

-Ácido sulfúrico al 33%. -Solución de almidón al 1% -Solución de iodato potásico 128/N como líquido de valoración. -Pipeta de 25 ml. -Toning con mosca y bureta o matraz Erlenmeyer y bureta 4.3. -Procedimiento. +Con Toning: -Pipetear 25 ml de vino y verterlos en el recipiente del Toning. -Añadir 10 ml de la solución alcalina. -Tapar el recipiente y esperar 10 minutos -Añadir 5 ml del ácido. -Añadir unas gotas de la solución de almidón. -Echar la mosca. -Encender el toning, colocando convenientemente el recipiente. Apretar el botón de start. +Sin toning:

-Pipetear 25 ml de vino y verterlos en el recipiente del Toning. -Añadir 10 ml de la solución alcalina. -Tapar el recipiente y esperar 10 minutos -Añadir 5 ml del ácido. -Añadir unas gotas de la solución de almidón. 4.4. -Valoración. +Con Toning:

-Esperar al primer pitido y entonces añadir el líquido de valoración hasta que pite tres veces. Anotar el volumen gastado.

+Sin toning: Igual al anterior, pero la valoración se debe confiar visualmente hasta que vire a morado tanto en tintos como en blancos. 3.5. -Expresión de los resultados.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 5 de 22 La diferencia entre mililitros finales e iniciales se multiplica por 10, obteniendo el contenido de anhídrido sulfuroso total en mg/l. PROTOCOLO nº 5. 5.Materias reductoras. 5.1. -Introducción. El mosto de uva contiene fundamentalmente glucosa y fructosa; si posteriormente la fermentación es total, el vino apenas contendrá materias azucaradas. Un alto contenido en azúcares reductores (>2 g/l) puede conducir a refermentaciones posteriores (enturbiamientos). 5.2. -Reactivos y materiales necesarios. -Solución cúprica 0.168 M, 10 ml -Álcali, 5 ml -Granos de piedra pómez -Solución de Ioduro 1,6 M, 10 ml -Solución de almidón al 1%, 10 ml. -Ácido sulfúrico al 16%, 10 ml. -Líquido de valoración: Tiosulfato sódico -Placa calefactora. -Vidrio de reloj. -Matraz -Pipetas de 10 ml. -Pipetas de 5 ml. -Bureta. 5.3. -Procedimiento. +Blanco con agua. -Pipetear y verter en el Erlenmeyer 10 ml de la solución cúprica -Pipetear y verter en el mismo 5ml del álcali. -Añadir 2 ml de agua -Añadir unos fragmentos de piedra pómez. -Tapar con el vidrio y poner en la placa calefactora. Una vez que comience a hervir, contar un minuto y medio. -Enfriar con chorro de agua del frío. -Añadir 10 ml de ioduro, 10 ml de almidón y 10 ml de ácido. +Vino. -Exactamente igual que el blanco, pero se añaden 2 ml de vino. 5.4. -Valoración. -Añadir el líquido de la bureta en el Erlenmeyer hasta que vire a color crema. La valoración es igual para el blanco y para el vino. 5.5. -Expresión de los resultados.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 6 de 22 La diferencia entre los dos volúmenes gastados en mililitros en la valoración da el contenido en materias reductoras en g/l. PROTOCOLO nº 6 6.Grado alcohólico. 6.1. -Introducción. Se usa el método ebulliométrico, cuyo fundamento es la diferencia del punto de ebullición entre el vino y el agua. 6.2. -Reactivos y materiales necesarios. -Ebulliógrafo Barus con sus partes correspondientes (regla, termómetro y recipiente para medir volúmenes a utilizar. -Mechero Bunsen. 6.3. -Procedimiento. -Enrasar con agua en el recipiente hasta la marca Eau y verterlo dentro del Barus. -Colocar en el orificio no roscado el termómetro. -Colocar en el orificio roscado el refrigerante. -Encender el mechero y colocarlo donde corresponde. -Esperar a que suba el mercurio, vigilando hasta que se estabilice en una temperatura concreta. -Apagar el mechero -Alinear en la Regla Barus con el cero la temperatura anterior. -Desmontar el refrigerante. -Enjuagar el interior del Barus con el vino a medir. -Enrasar el recipiente del Barus con el vino hasta la marca Vin y verterlo en el interior del Barus. -Colocar el mechero de nuevo y esperar a que la temperatura suba y se estabilice de nuevo. 6.4. -Valoración y expresión de los resultados. -Leer directamente en la regla (la graduación superior)a qué grado alcohólico corresponde la temperatura del vino.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 7 de 22 PROTOCOLO 7 7.Determinación cromatográfica del ácido málico. 7.1. -Introducción. El ácido málico tiene sabor herbáceo. En blancos su presencia es buscada hasta cierto punto porque le da frescura. Sin embargo, en tintos, puede redundar en una dureza y astringencia excesiva; por lo que su transformación en ácido láctico (más suave), en tintos y sobremanera los tintos de crianza es indispensable. Esta transformación ocurre fundamentalmente en la fermentación maloláctica. Debe ser controlada día a día para cortarla en cuanto acabe sulfitando y trasegando para evitar posibles problemas de picado láctico. Es una cromatografía ascendente sobre un papel depositado sobre un solvente acético adicionado con un indicador. 7.2. -Reactivos y materiales necesarios. -Solventes: *M-Butanol con 1 g/l con azul de Bromotimol. (A) *Ácido acético al 50%. (B) -Patrones de ácido málico con 1,2,3,4,5 g/l de ácido málico. Mezcla hidroalcohólica con 15ºA con 5‰ formol -Micropipetas. -Papel Watman nº 1 7.3. -Procedimiento -Cortar papel Watman con altura entre 25-30 cms y longitud variable según las muestras a cromatografiar, sabiendo que debe haber 5 cm en los bordes y 3 cm entre cada muestra,

-Trazar una línea con lápiz a 3-4 cms de la base, donde se marcan los puntos a poner las muestras. Si se anota la muestra, hacerlo con lápiz.

-Pipetear las micropipetas y poner un microlitro en los puntos previamente definidos. Dejar secar y repetir una o dos veces. -Grapar los extremos cuidando que no se toquen e introducirlo grapado en la cubeta de cromatografía, en la que habrá dos volúmenes del solvente A por cada volumen del solvente B (Color amarillo). El papel se meterá en el líquido medio centímetro. -Mantenerlo dentro unas 2-3 horas; hasta que hay ascendido alrededor de 20 cm. -Sacarlo y dejarlo secar al aire. 7.4. -Valoración y expresión de resultados. Cuando se evapora el ácido acético, quedará todo azul, salvo tres franjas amarillas, que son: -1ª A.Acético -2ªA.Málico. -3ªA. Succínico y Láctico. Si cuando seque sólo aparecen la primera y la tercera, es que ya se ha hecho la maloláctica.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 8 de 22 PROTOCOLO 8 8.Determinación del pH. 8.1. -Introducción. El pH es la medida del grado de acidez o alcalinidad de una disolución acuosa y se define como el logaritmo negativo de la concentración de iones H+. 8.2. -Reactivos y materiales necesarios. -pH metro -Electrodo y sonda de temperatura -Soluciones tampón. -Agua destilada -Vaso de precipitados 8.3. -Procedimiento -Conectar correctamente el electrodo y sonda de temperatura y enchufar el pHmetro.

-Calibrar el pHmetro si es necesario. -Introducir el electrodo y sonda en la muestra a medir.

-Esperar a la lectura de la pantalla. -Repetir los dos pasos anteriores tantas veces como muestras sean precisas medir. -Limpiar el electrodo con agua destilada y secarlo con muy suavemente con un trozo de papel suave. Una vez terminada la medición, tapar el electrodo verificando que queda solución de electrolito en el protector de membrana Siempre seguir las instrucciones del aparato a utilizar 8.4. -Valoración y expresión de resultados. La medición del pH tiene una fundamental importancia durante: -Los controles de madurez de vendimia. Es uno de los parámetros que se miran junto con la acidez total, azúcares y polifenoles (si es el caso). -Durante la entrada de vendimia. Si el mosto tiene una acidez total mayor de 3,6 y el pH resulta de 4 o más; es necesario o al menos conveniente; acidificar. -Al medir la acidez total de un mosto o un vino, resulta más fácil determinar cuándo es el momento de parar la adición de líquido de valoración usando el pHmetro; puesto que el fundamento de esta práctica es llevar la acidez titulable a pH 7.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 9 de 22 PROTOCOLO 9 9.Sulfuroso libre. 9.1. -Introducción. El gas sulfuroso tiene múltiples aplicaciones en el campo enológico, siendo sus funciones principales: -Antioxidante (destruye oxidasas). -Efecto selectivo de levaduras, mejorando la fermentación. -Antiséptico. -Bloquea el acetaldehído, conservando la frescura de los vinos, etc. El fundamento se basa en la reacción de oxidación-reducción del sulfuroso con yodo, con almidón como indicador. 9.2. -Reactivos y materiales necesarios. -Ácido sulfúrico al 33%. -Solución de almidón al 1% -Solución de yodo 0.01 M como líquido de valoración. -Toning con mosca y bureta o matraz Erlenmeyer y bureta 9.3. -Procedimiento. +Con Toning: -Pipetear 20 ml de vino y verterlos en el recipiente del Toning. -Añadir 5 ml del ácido. -Añadir unas gotas de la solución de almidón. -Echar la mosca.

-Encender el toning, colocando convenientemente el recipiente. Apretar el botón de start.

+Sin toning: -Pipetear 20 ml de vino y verterlos en el matraz.

-Añadir 5 ml del ácido. - Añadir unas gotas de la solución de almidón.

9.4. -Valoración. +Con Toning:

-Esperar al primer pitido y entonces añadir el líquido de valoración hasta que pite tres veces. Anotar el volumen gastado.

+Sin toning: Igual al anterior, pero la valoración se debe confiar visualmente hasta que vire a morado tanto en tintos como en blancos. 9.5. -Expresión de los resultados. Los mililitros gastados se miran en la tabla adjunta y el resultado se expresa en mg/l SO2 libre. (También si se multiplican por 32)

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Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 11 de 22 PROTOCOLO 10 10. Polifenoles totales 10.1.-Introducción Los polifenoles están formados por una o más moléculas de fenol y contribuyen de forma notable en las características organolepticas del vino (color, astringencia, etc.). Los vinos blancos contienen menos polifenoles que los tintos, porque en su proceso de elaboración no se incluye la maceración del mosto con la piel y partes sólidas de la uva, principal origen de los polifenoles. Los principales métodos de medida de los polifenoles son el índice de Folin-Ciocalteu (IFC) y el indice de polifenoles totales (IPT) *Índice de Folin-Ciocalteu (IFC) Fundamento: El conjunto de los compuestos polifenólicos del vino se oxida por el reactivo Folin-Ciocalteu (mezcla de ácido fosfotúngstico y fosfomolíbdico), dando una coloración azul directamente proporcional al contenido de polifenoles y medible a 750 nm. 10.1.2. -Reactivos y materiales necesarios. - Espectrofotómetro UV-VIS. - Cubeta de vidrio de 1 cm de recorrido óptico. - Pipetas de 1, 5, 20 y 50 mL. -Pipetas de 1,5,20 y 50 ml - Matraz aforado de 100 mL. - Agua PA-ACS, Código 131074. - Reactivo de Folin-Ciocalteu VINIKIT, Código 621567. - Sodio Carbonato anhidro PA-ACS-ISO, Código 131648. - Solución al 20% (p/v) de carbonato de sodio. - Patrón de Referencia para Enología (Vino Blanco) CRS, Código 345271. - Patrón de Referencia para Enología (Vino Tinto) CRS, Código 345268. 10.1.3.-Procedimiento a) Vino blanco En un matraz aforado de 100 mL, se introducen respetando el orden, 1 ml de vino, 50 ml de agua destilada, 5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu, 20 ml de la solución de carbonato de sodio y se enrasa a 100 ml con agua destilada. Se agita el matraz para homogeneizar, se espera 30 min para estabilizar la reacción y se mide la absorbancia a 750 nm (A750) con una cubeta de 1 cm frente a un blanco preparado con agua destilada. b) Vino tinto Se debe trabajar igual que en el caso del vino blanco, pero diluyendo la muestra 5 veces con agua destilada. c) Mosto concentrado rectificado La muestra de mosto concentrado rectificado se ha de estandarizar previamente a 25±0,5 °Brix por dilución con agua destilada. 10.1.4.-Cálculo y valoración a) Vino blanco indice de Folin-Ciocalteu - A750 x 20 b) Vino tinto indice de Folin-Ciocalteu - A750 x 100 c) Mosto concentrado rectificado

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 12 de 22 indice de Folin-Ciocalteu - A750 x 16 Los valores más habituales del índice Folin-Ciocalteu para vino blanco son 3-5, 5-10 para rosados y de 20-50 para tintos. 10.2.1.- Índice de polifenoles totales (IPT) Introducción Es un índice que se obtiene por la medida de la absorbancia del vino a 280 nm (UV), porque el núcleo bencénico característico de los compuestos polifenólicos tiene su máximo de absorbancia a esta longitud de onda. 10.2.2.-Material y reactivos - Espectrofotómetro UV-VIS. - Cubeta de cuarzo de 1 cm de recorrido óptico. - Pipeta de 1 ml. - Matraces aforados de 20 y 100 ml. - Agua PA-ACS, Código 131074. - Patrón de Referencia para Enología (Vino Blanco) CRS, Código 345271. - Patrón de Referencia para Enología (Vino Tinto) CRS, Código 345268. 10.2.3.-Procedimiento El vino diluido 20 (vino blanco) o 100 veces (vino tinto) con agua destilada se introduce en la cubeta de cuarzo y se realiza la lectura de la absorbancia a 280 nm (A280), utilizando como blanco agua destilada. 10.2.4.-Cálculo y valoración a) Vino blanco IPT = A280 x 20 b) Vino tinto IPT = A280 x 100 Los valores más habituales del IPT son 4-10 para vino blanco, 20-25 Para rosados, 35-60 para tintos y 50-100 para crianza y reserva. PROTOCOLO 11 11. Extracto seco total y extracto no reductor 11.1.-Introducción El extracto seco total (EST) es el conjunto de todas las substancias que no se volatilizan a 100'C y el extracto no reductor (ENR) es la diferencia entre el EST y el azúcar total. *Método densimétrico Fundamento El extracto seco total se calcula indirectamente a partir de la masa volúmica y el grado alcohólico volumétrico del vino. 11.2.-Material y reactivos - Patrón de Referencia para Enología (Vino Blanco) CRS, Código 345271. - Patrón de Referencia para Enología (Vino Tinto) CRS, Código 345268. Procedimiento Se ha de determinar la masa volúmica y el grado alcohólico volumétrico del vino según los procedimientos anteriormente descritos para que posteriormente podamos calcular el EST y el ENR. 11.3.-Cálculo y valoración

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 13 de 22 El extracto seco total (EST) y el extracto no reductor (ENR) se expresan en g/L de sacarosa y con un decimal. Se calculan a partir de las fórmulas siguientes que han sido deducidas a partir de las Tablas de EST del Método Oficial: EST g/L = (2589,8 x MV) - (0,026 x GAV2) + (3,64 x GAV) - 2584,2 ENR=EST-A MV = masa volúmica, g/ml GAV - grado alcohólico volumétrico, % vol A = azúcar total, g/L Los valores habituales de EST en vino seco están entre 16 y 23 para blanco y entre 22 y 30 para tinto. Los valores habituales de ENR en vino están entre 14 y 21 para blanco y entre 20 y 25 para tinto. 7.2• Legislación Tabla 7.1. Límites legales del extracto seco no reductor (ENR). Tipo de muestra Extracto seco no reductor g/L vino base para espumoso1 13-22 vino espumoso1 13-22 vino aromatizado ≥ 13 sidra ≥ 13 1 Orden 28079 BOE núm. 278 de) 20.11.91 PROTOCOLO 12 12. Calcio 12.1.-Introducción En enología, el conocer la concentración de calcio es de sumo interés, porque un exceso de este catión puede generar en la botella un precipitado cristalino de tartrato de calcio. El Ca en el vino procede del suelo, tratamientos enológicos, conservación en tanques de hormigón, etc. La precipitación del tartrato de calcio se encuentra afectada por factores como el pH, la temperatura y el grado alcohólico. Fundamento del método La determinación se basa en la valoración complexométrica con la sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (Na2EDTA) usando calceína como indicador. 12.2.-Material y reactivos - Espátula. - Pipeta de 20 mL. - Matraz aforado de 100 mí - Erlenmeyer de 250 mL. - Bureta de 10 mL. Papel de filtro. - Carbón activo PA, Código 121237. - Sodio Hidróxido de 1 mol /L (1 N) SV, Código 181691. -Agua PA-ACS, Código 131074. - Ácido Etilendiaminotetraacético sal Disódica 0,01 mol/L (0,010 M)

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 14 de 22 SV, Código 181671. - Calcio Indicador, tabletas VINIKIT, Código 625516. - Patrón de Referencia para Enología (Vino Blanco) CRS, Código 345271. -Patrón de Referencia para Enología (Vino Tnto) CRS, Código 345268. 12.3-Procedimiento A 20 mL de vino se añade 80 ml de agua destilada y 1 g de carbón activo para decolorarlo. La suspensión se lleva a ebullición y se filtra en caliente por papel de filtro. A 50 ml del filtrado se añade 10 mL de hidróxido de sodio 1 M y 2 tabletas indicadoras, tomando la solución una coloración verde fluorescente. Se valora con Na2EDTA 0,01M hasta viraje a color violeta claro. También se ha de realizar un ensayo en blanco con agua destilada. Sea v los ml de Na2EDTA 0,01M consumidos en la valoración del vino y v' los del blanco. 12.4.-Cálculo y valoración El calcio se expresa en mg/l y sin decimales. (v - v') x 0,01 x 40 x 100 x 1000 Ca mg/L = ------------------------------------------- =(v - v') x 40

50x20 Pm calcio = 40 g/mol Los niveles de Ca más habituales en vino se encuentran entre 70 y 100 mq/L. PROTOCOLO 13 13. Hierro 13.1.-Introducción Aunque en la elaboración moderna los niveles de hierro son reducidos, el enólogo debe tener en consideración que niveles superiores a 8-10 mg/l pueden causar enturbiamientos debido a precipitaciones férricas (casse blanca), o cambios de color ya que interviene en los fenómenos de oxidación de los vinos. -Método de FERRE MICHEL Fundamento El método analítico se basa en la determinación colorimétrica, previa oxidación del Fe2+ a Fe3+ mediante el peróxido de hidrógeno en medio ácido, con tiocianato de potasio formándose complejos de tiocianato de hierro (Fe(SCN)63- o Fe(SCN)2+] de color rojizo. La determinación es directa en el caso de vino blanco, o por extracción del color con eter tert-butil metílico, en el caso de vino tinto. 13.2.-Material y reactivos - Espectrofotómetro UV-VIS. - Pipetas de 1, 5 y 10 mL. - Tubos de ensayo con tapón de rosca. - Cuentagotas de 25 gotas/mL. - Agua PA-ACS, Código 131074. - Hidrógeno Peróxido 10% plv (30 vol), Código 625513. - Solución patrón de Fe 125 mg/l VINIKIT, Código 625515. - Ácido Clorhídrico-Agua solución 50:50 VINIKIT, Código 624574. - Potasio Tiocianato solución 20%, Código 625514.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 15 de 22 - Eter ter-Butil Metílico PA, Código 123312. - Patrón de Referencia para Enología (Vino Blanco) CRS, Código 345271. - Patrón de Referencia para Enología (Vino Tinto) CRS, Código 345268. 13.3.-Procedimiento a) Vino blanco En dos tubos de ensayo se añaden 1 mL de ácido clorhídrico y 1 ml de tiocianato de potasio. En el primer tubo se añade 5 mL de vino y en el segundo 5 mL de agua destilada y 4 gotas de peróxido de hidrógeno en cada tubo. Se agitan ambos tubos y el tubo que contiene el vino quedará más o menos coloreado. Sobre el tubo de ensayo que contiene el agua se irá añadiendo gota a gota la solución patrón de Fe, agitando después de cada adición hasta que la coloración del tubo sea lo más parecido al del vino. Sea n el número de gotas gastadas para equilibrar el color de ambos tubos de ensayo. b) Vino tinto En el caso de vino tinto se procede de forma similar a la del vino blanco pero extrayendo el color con 10 mL de éter ter-butil metílico. En el tubo con agua destilada también se añaden 10 mi- de éter ter-butil metílico que cada vez que se añade una gota de la solución patrón de hierro es necesario agitar y dejar reposar para que se separe la capa orgánica coloreada (capa superior) y poder así comparar el color entre los dos tubos. Una posible variante de este método sería la de medir el color de la reacción con un espectro fotómetro a 480 0 508 nm y compararlo con una curva patrón. Es muy importante que los tubos de ensayo estén bien lavados porque pequeñas trazas de hierro pueden dar interferencias en la determinación, por la gran sensibilidad del método. 13.4.-Cálculo La concentración de hierro, expresada en mg/L, será: nx125x1x1000 Fe mg/L =-------------------------= n

25x1000x5 n = número de gotas de la solución patrón de hierro 1 gota = 1 mg/l de Fe PROTOCOLO 14 14. Sobrepresión por dióxido de carbono. 14.1.-Introducción El dióxido de carbono es el gas más frecuente en enología. Se produce en gran proporción en la fermentación alcohólica, fermentación maloláctica y sobre todo en la 2ª fermentación del vino base (tiraje) para espumoso y de aguja. La medida de la sobrepresión de dióxido de carbono en vino espumoso y de aguja se realiza directamente en la botella utilizando un afrómetro (método manométrico). 14.2.-Material y reactivos - Afrómetro (aguja perforadora y manómetro) graduado en kilopascal (kPa) o bar que según el tapón de la botella (corona, corcho, etc.) se utiliza un modelo u otro (Fig. 14.1). - Termómetro contrastado de 0-35°C, con apreciación 0,5°C.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 16 de 22 Procedimiento La medida debe efectuarse en botellas cuya temperatura esté estabilizada 24 h antes a unos a 20°C. Tras haber perforado el tapón, procurando evitar cualquier pérdida de gas, la botella debe agitarse vigorosamente hasta obtener una presión constante para efectuar la lectura. 14.3.-Cálculo y valoración La sobrepreslón a 20°C (Paph20) se expresa en kPa o bar con un decimal. Cuando la temperatura de medida difiera de 20°C, se ha de corregir la sobrepresión medida (Papht) por el factor de corrección (c) de la Tabla 14.1 según la fórmula siguiente: Paph20 = Papht x c La concentración de dióxido de carbono (C02) en vino espumoso y de aguja se puede calcular por la siguiente relación. C02 g/L = 1,951 x (Paph20 + 1) x (0,86 - 0,01 x GAV) x (1 - 0,00144 x A) GAV = grado alcohólico volumétrico, % vol A = azúcar total, g/l 14.4. Legislación

Figura 14.1. Diferentes tipos de afrómetros según el tipo de tapón a perforar: sobre tapón corona y obturador (a), sobre tapón de 'corcho y plaqueta con morrión (b) y directamente sobre la botella (c).

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 17 de 22 Tabla 14.1. Factores de corrección (c) de la sobrepresión de dióxido de carbono según la temperatura de lectura. Tipo de vino Sobrepresión de dióxido de carbono g/L Tranquilo <0,5 de aguja >1 espumoso1 ≥3 Tabla 14.2. Límites legales de la sobrepresión de dióxido de carbono. 1 Reglamento CE 1493/99 de 17.05.99 PROTOCOLO 15 15. Recuento de levaduras 15.1.-Introducción La levadura más frecuente en enología es Saccharomyces cerevisiae -hongo unicelular eucariota de 2-10 μm de tamaño que suele ser el principal responsable de la fermentación alcohólica y de la generación de aromas secundarios en el vino. El recuento de levaduras se realiza en el control de los vinos, pero de forma más generalizada en "pie de cuba" y en el "tiraje" para la elaboración de vino espumoso. Asimismo por medio de tinciones adecuadas se pueden identificar las levaduras viables. *Recuento: Fundamento El recuento de levaduras totales y viables se realiza por microscopia mediante la tinción con azul de Evans y/o azul de metileno. 15.2.-Material y reactivos - Microscopio de 600-900 aumentos. - Cámara de recuento Thoma o Neubauer (Fig. 15.1, 15.2 y 15.3). - Cubreobjetos. - Pipeta semiautomática de volumen variable de 100 μL. - Pipeta semiautomática de volumen variable de 1000 μL. - Microtubo de 500 μL. -Agua PA-ACS, Código 131074. - Etanol 96% v/v PA, Código 121085. - Azul de Evans, Código 255486. - Azul de Metileno Fenicado según Khüne DC, Código 251172. 15.3.-Procedimiento Todo el material de vidrio que se utilice ha de ser lavado con agua destilada y alcohol del 96%. Se colocan 400 μL de muestra homogeneizada en un microtubo y se añaden 40 μL de azul de Evans o azul de metileno fenicado. La muestra y el colorante se mezclan y se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 5 min. Se deposita una gota en una de las 2 cuadrículas del portaobjetos procurando que quede llena la superficie y se tapa con el cubreobjetos evitando la presencia de burbujas de aire. La cámara de recuento se ha de fijar en la platina del microscopio para realizar la observación microscópica.

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 18 de 22 El enfoque del microscopio se empieza con un objetivo de pocos aumentos que posteriormente pasaremos a uno de más. Se coloca el objetivo lo más cerca posible del cubreobjetos pero sin tocarlo y posteriormente se irá alejando hasta que la imagen sea lo más clara y nítida posible. Sea cual fuese el modelo de cámara empleado, el procedimiento es el mismo, el recuento se realizará sobre 20 de los 400 (20 x 20) cuadrados pequeños de 0,0025 mm2 (volumen total de 0,1 mm3) elegidos al azar. Si el número de células/cuadrado es >10 es conveniente diluir la muestra. Por convenio para evitar contar dos veces la misma levadura, consideraremos que las levaduras que se encuentren en la intersección de una cuadrícula se apuntarán a la de abajo y a la de la izquierda, y las gemaciones se cuentan como 1/2 levadura. Las levaduras vivas se pueden diferenciar de las muertas porque el azul de Evans colorea las células viables mientras que el azul de metileno sólo colorea las no viables. Sea n el número total de levaduras en las 20 cuadrículas. 15.4.-Cálculo y valoración

nx20x1000xf Recuento levaduras totales/mL =----------------------= n x 200.000 x f 0,1 0,1 f = factor de dilución

Recuento levaduras viables x 100 % levaduras viables = -------------------------------------------------

Recuento levaduras totales Los valores de carácter orientativo del recuento de levaduras totales en un "pie de cuba" son de ≈80 millón/mL, con ≥70% de viables; y en el caso del "tiraje" 1-2 millón/mL con ≥60% de viables. Figura 15.1. Portaobjetos de las cámaras de recuento Thoma y Neubauer: portaobjetos de ≈5 mm de grosor con 4 ranuras transversales y 1 perpendicular para recoger el líquido sobrante. En el segmento central rebajado 0,1 mm, se encuentran grabadas las 2 cuadrículas de recuento con ligeras variaciones entre ellas.

Ranura perpendicular

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3mm

Figura 15.2. Detalle del cuadriculado de la cámara de recuento Thoma.

1 mm

Figura 15.3. Detalle del cuadriculado de la cámara de recuento Thoma.

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Restricciones relacionadas con la analítica:

Habitualmente estos controles que realizamos en bodega, podemos pensar en

un principio que los hacemos para verificar si nuestro vino está en buenas

condiciones según nuestro criterio. Relativamente. También tenemos que

darnos cuenta de que es un producto sometido a reglamentación y por lo tanto

esos parámetros químicos en su mayoría están condicionados:

Así mismo, han de tenerse en cuenta las siguientes legislaciones:

-Reglamento CEE num 997/81 de 26 de marzo de 1.981.

-Reglamento CEE num 3309/85 de 18 de noviembre de 1.985.

-Reglamento CEE num 2676/90 de la Comisión de 17 de

septiembre de 1.990 por el que se determinan los métodos de análisis

comunitarios aplicables al sector del vino; Diario Oficial de las

Comunidades Europeas(1.990).

De las que se extraen las siguientes limitaciones:

Producto Acidez total

Vino ≥ 4,5 g/l expresado en ácido

tartárico.

Producto Acidez volátil (en g/l ácido

acético)

Blancos y rosados ≤1

Tintos ≤1,2

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 21 de 22

Vino g/l de materias reductoras

Seco ≤ 4

≤ 9*

Semi-seco ≤ 12

≤ 18*

Semi-dulce > 12 y ≤ 45

Dulce ≤ 45

Reglamento CEE nº 997/81

*( Cuando el contenido de acidez total expresado en ácido tartárico por litro no

sea inferior en más de 2 g/l al contenido de azúcar residual).

Tipo de vino SO2 total mg/l

5 g/l de azúcares reductores Blanco y rosado 210

Tinto 160

> 5 g/l de azúcares reductores Blanco y rosado 260

Tinto 210

Debemos así mismo atenernos a las limitaciones impuestas por la Orden

del 11 de Diciembre de 1.989; por la que se aprueba el Reglamento de la

Denominación de Origen Bierzo y su Consejo Regulador:

BLANCOS TINTOS ROSADOS

Grado volumétrico

natural

9,5 10,5

Graduación

alcohólica adquirida

10-13 11-14 11-14

Anhídrido sulfuroso

máximo en mg/l

190 140 190

Acidez volátil

real(en ácido

acético)

0,7 0,7 0,7

Materias primas Bloque II. Tema 5 Analítica del vino Página 22 de 22 En vinos sometidos a D.O.; aparte de los controles internos, también son

recibidas periódicamente las visitas de veedores del Consejo Regulador de la

Denominación de Origen:

Aparte de vigilar estos parámetros; previo embotellamiento; los veedores

también determinan un análisis organoléptico del vino. Durante el año los

veedores controlan la vendimia, y el resto del año el aforo de la bodega

mensualmente.

En los vinos de mesa, aunque no tienen estas limitaciones, los

parámetros químicos deberán ser controlados y seguidos igualmente.