04.Materiais e Metodos

MATERIAIS E MÉTODOS

________________________________________________Materiais e Métodos 30

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

3.1.1 Fases estacionárias para cromatografia

- Cromatografia em coluna de vidro:

Sílica gel 60 (63-200 µm) – MERCK

Sílica gel 60 H (70-230 µm) – MERCK

Sílica gel tipo flash (35-70 µm) – ACROS

Sephadex LH 20 - SIGMA

- Cromatografia em camada delgada preparativa:

Sílica gel 60 PF254 (5-25 µm) – MERCK

(placas de vidro: 20 x 20 cm, 1 mm de espessura) Placa comercial em sílica gel (5-17 µm)– ALDRICH

(placas de vidro: 5 x 20 cm, 1 mm de espessura)

- Cromatografia em camada delgada analítica:

Sílica gel 60 HF 254 – MERCK

(placas de vidro: 3 x 10 e 5 x 10 cm, 0,25 mm de espessura)

Sílica silanizada 60 HF 254 – MERCK

(placas de vidro: 3 x 10 e 5 x 10 cm, 0,25 mm de espessura)

3.1.2 Solventes

- para cromatografia:

Solventes P. A. – SINTH , VETEC e MALLINCKODT

Solventes grau cromatográfico - MALLINCKODT e MERCK

- para RMN:

Solventes deuterados - ACROS e ALDRICH

(acetona, água, clorofórmio, DMSO, metanol e piridina)


3.1.3 Equipamentos

§ Capela de fluxo laminar

- VECO VL FS – 09 M

§ Autoclaves verticais

- PHOENIX AV 75

§ Estufa de incubação

- FANEM Ltda – 347 CD

§ Mesa agitadora

- INNOVA T.M.4300 – New Brunswick Scientific

§ Estufa com ar circulante

- Soc. FABBE. Ltda

§ Microscópio

- OLYMPUS CH-2

§ Espectrômetro de RMN

- BRUKER DPX-300 MHz

- BRUKER DRX-400 MHz

- BRUKER DRX-500 MHz


§ Espectrômetro de Massas

- CG-EM: Shimadzu QP 5000 (coluna D 3-5; 25 m X 0,25 mm X 0,25 µm)

- ESI-EM: Micromass Quattro LC (ionização por electronspray)

§ Evaporador

- BÜCHI - modelo rotavapor R

§ Cromatógrafo a gás-CG

- Hewlett Packard HP 5890- série II (coluna HP-1; metilsilicone 100%; 25 m X 0,25 mm X 0,25 µm)

§ Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência-CLAE

- Shimadzu SHIM-PAK- Diode array detector (coluna CLC - ODS (M), 250 mm X 4,6 mm)

§ CLAE – Reciclante

- Shimadzu LC- GAV (U.V.-SPD-10AV) (coluna Shodex Asahipak GS-310 26 500 mm X 1,5 mm)

§ Espectrofotômetro no UV-VIS

- Shimadzu PC 1520 - Diode Array Spectrophotometer

§ Espectrofotômetro no Infravermelho

- Nicolet - Protege 460

§ Estufa de secagem e esterilização

- FANEM Ltda


3.1.4 Microrganismos

Os fungos foram isolados de amostras de solo brasileiro (P. viridicatum

da região do Rio Miranda-MS e os demais da região de São Carlos-SP) pela

Profa. Dra. Suraia Said, identificados na Fundação Tropical de Pesquisa

“André Tosello” e foram mantidos através de repiques sucessivos, a 4°C, em

meio PDA ("Potato Dextrose Agar") no Laboratório de Enzimologia Industrial

da FCFRP-USP.

3.2 Métodos

3.2.1 Condições de cultivo

Inicialmente, as espécies de Penicillium foram cultivadas em diferentes

meios de cultura semi-sólidos para seleção dos meios (tabela 4, p.32) nos

quais os fungos apresentaram maior produção de conídios.

Os fungos foram repicados, em duplicata, em tubos de ensaio

contendo cerca de 5,0 mL dos meios de cultura solidificados com inclinação

semelhante (garantindo mesma superfície de contato para multiplicação dos

conídios) e incubados a 30°C por 7, 10 e 16 dias. Em seguida, os conídios

produzidos foram coletados adicionando-se cerca de 5 mL de água estéril à

superfície da cultura e raspando-se levemente, formando uma suspensão de

conídios, que foram contados em Câmara de Neübauer (figura 7, p. 33).

Após a seleção do fungo, P. verrucosum foi cultivado em duas etapas.

Inicialmente em uma pré-cultura e em seguida na cultura fermentativa onde

as condições de cultivo foram variadas.


Tabela 4. Constituintes dos meios de cultura semi-sólidos

Meio YES, descrito por Larsen et al. (2000)

Extrato de levedura 20 g/L Merck

Sacarose 150 g/L Vetec

MgSO4. 7H2O 0,5 g/L Reagen

Ágar 20 g/L Oxoid

Meio CYA, descrito por Malmstrom et al. (2000)

Extrato de levedura 5 g/L Merck

Caldo de Czapek * 35 g/L -

Ágar 15 g/L Oxoid

Meio MEA, descrito por Kozlovsky et al. (2000)

Extrato de malte 20 g/L Merck

Peptona 1 g/L Oxoid

Glicose 20 g/L Synth

Ágar 20 g/L Oxoid

Meio AVEIA, descrito por Malmstrom et al. (2000)

Farinha de aveia 30 g/L Nestlé

Ágar 15 g/L Oxoid

Meio PDA, descrito por Nam et al. (2000)

PDA (Potato Dextrose Agar) 39 g/L Oxoid

* Caldo de Czapeck, descrito por Alviano et al. (1992) (tabela 2)

Cerca de 5 x 106 a 1 x 107 conídios por mL de P. verrucosum foram

inoculados em 60 mL de meio pré-fermentativo (tabela 5, p. 33) e incubados

inicialmente por 24 e 48 horas sob agitação constante (120 rpm) a 30°C. Em

seguida a massa micelial foi assepticamente coletada por filtração a vácuo.

Com objetivo de selecionar a melhor condição para produção de metabólitos

secundários ativos, a massa micelial obtida do meio pré-fermentativo foi

inoculada em 120 mL de 4 diferentes meios fermentativos (tabela 5, p. 33) e


incubada por 48, 72 e 144 horas sob agitação constante (120 rpm) a 30°C.

Novamente o fluido da cultura foi separado da massa micelial por filtração a

vácuo. Procedimento ilustrado na figura 8 (p. 36).

Figura 7. Fluxograma de seleção do meio de cultura semi-sólido que favorece a conidiogênese para cada espécie de Penicillium estudada

Tabela 5. Constituintes dos meios líquidos de cultura

Meio Pré-fermentativo, descrito por Jackson et al. (1993)

Pó de milho (fubá) 2,5 g/L Yoki


Farinha de aveia 10 g/L Nestlé

Pasta de tomate 40 g/L Quero

P. viridicatum

P. verrucosum

P. ochrochlorum

P.waksmanii

P.simplicissimum

Repique em duplicata para cada tempo de incubação

Meio

MEA

Meio

CYA

Meio

YES

Meio

PDA

Meio

AVEIA

Incubação a 30°C

7 dias7 dias 16 dias16 dias10 dias10 dias

5mL H2O estérilRaspagem, agitação, filtração

Suspensão conidial

Diluição

Contagem em Câmara de Neübauer


CaCl2. 2H2O 10 g/L Merck

Sol. traço de elementos de Jackson 10 mL/L -

- Solução traços de elementos de Jackson

FeSO4. 7H2O 1 g/L Reagen

MnCl2. 4H2O 1 g/L Carlo Erba Reagente

CuCl2. 2H2O 0,025 g/L Divisã0 QM

CaCl2. 2H2O 0,1 g/L Merck

H3BO3 0,56 g/L Reagen

(NH4)6.MoO2.4H2O 0,019 g/L Mallinckrodt

ZnSO4. 7H2O 0,2 g/L Mallinckrodt

Meio Fermentativo de Jackson, descrito por Jackson et al. (1993)

Glicerol 15 g/L Sigma

Melaço de cana de açúcar 15 g/L Usina da Pedra*

Peptona 6 g/L Oxoid

Extrato de levedura 1,5 g/L Merck

NaCl 30 g/L Synth

KH2PO4 0,6 g/L Synth

MgSO4. 7H2O 5 g/L Reagen

CuSO4. 5H2O 0,001 g/L Reagen

FeSO4. 7H2O 0,003 g/L Reagen

Meio Fermentativo de Vogel, descrito por Vogel (1956)


Solução salina de Vogel 20 g/L -

- Solução salina de Vogel concentrada 50 vezes

Na3 C6H5O7. 2H2O 125 g/L Synth

KH2PO4 250 g/L Synth

NH4NO3 100 g/L Nuclear

CaCl2. 2H2O 5 g/L Merck

MgSO4. 7H2O 10 g/L Reagen

Sol. traço de elementos de Vogel 5 mL/L -


Solução de biotina 1 ml/L -

- Solução traços de elementos de Vogel

H3C6H5O7. H2O 5 g Reagen

ZnSO4. 7H2O 5 g Mallinckrodt

Fe (NH4)2(SO4)2. 6H2O 1 g Synth

CuSO4. 5H2O 0,25 g Reagen

MnSO4. H2O 0,05 g Reagen

H3BO3 0,05 g Reagen

Na2MoO4. 2H2O 0,05 g Mallinckrodt

H2O destilada 95 mL -

- Solução de biotina

Biotina 0,005 g Sigma

Álcool 50% 100 mL Synth

Meio Fermentativo de Czapeck, descrito por Alviano et al. (1992)


NaNO3 2 g/L Vetec

K2HPO4 1 g/L Henrifarma


KCl 0,5 g/L Reagen

FeSO4. 7H2O 0,01 g/L Reagen

pH=5

Meio Fermentativo de Takeuchi, descrito por Takeuchi et al. (1989)

Amido 25 g/L Synth


Casamino ácido 10 g/L Fisher Scientific

KH2PO4 5 g/L Synth


* Ribeirão Preto- SP.


Figura 8. Fluxograma das condições de cultivo de Penicillium verrucosum

3.2.2 Obtenção dos extratos brutos

A massa micelial foi inicialmente extraída com MeOH por 24 horas

resultando num primeiro extrato metanólico. Seqüencialmente a massa foi

seca em estufa com ar circulante a 40°C, triturada, pesada e extraída com

CH2Cl2 e MeOH por processo de maceração durante 5 dias. Foram feitas 3

repetições consecutivas para cada solvente. O fluido da cultura foi submetido

a partição líquido-líquido com AcOEt por 3 vezes consecutivas, resultando

em um extrato orgânico e um aquoso (figura 9, p. 37).

Suspensão de conídios

5 X 106 à 1 X 107 conídios/mL

60 mL meio pré-fermentativo (MPF)

120 mL meio Takeuchi

Incubação a 30°C; 120 rpm

24 horas 48 horas

48 horas 72 horas 144 horas

120 mL meio Vogel

120 mL meio Czapeck

120 mL meio Jackson

A

B

C

A- Filtração e transferência da massa micelial para cada meio de cultura.

B- Incubação do meio pelos 3 tempos distintos a 30°C; 120rpm

C- Filtração a vácuo para cada condição de cultivo

B B B

A

C C

CCC

B

CC

B

CC

B

CC

Total = 23 condições de cultivo

*Perda: MPF 48 h., Vogel 144 h.

Massa micelial Fluido da cultura

B

CCC


Após o processo de extração tanto da massa micelial quanto do fluido

da cultura, os solventes foram evaporados até a secura em rotaevaporador

ou liofilizados.

Figura 9. Fluxograma de obtenção dos extratos brutos intra e extra celular de P. verrucosum

As condições de cultivo e rendimentos obtidos para os 115 extratos

brutos produzidos em pequena escala encontram-se na tabela 6 (p. 38).

Todos os extratos brutos obtidos em pequena escala foram avaliados

quanto a sua atividade tripanocida, atividade inibitória da enzima GAPDH de

T. cruzi e enzima APRT de L. tarentolae.

Massa micelial

Suspenção em MeOH24 horasFiltração

Massa micelial

Secagem a 40°C

Ressuspenção em MeOH

Ultra-som por 30 minutos

Extração por 5 dias (3 vezes consecutivas)

Filtração

Extrato Me MeOH - 2

Massa micelial

Ressuspenção em CH2Cl2

Extração por 5 dias (3 vezes consecutivas)

Extrato MaMeOH- 1

Extrato MaMeOH- 1

Extrato Dc

CH2Cl2

Fluido da cultura

Partição líquido-líquido com AcOEt

Extrato AqAquoso

Extrato Ac AcOEt

Cultura de Penicillium verrucosum

Total = 115 extratos brutos*Perda: MPF 48 h., Vogel 144 h.


Tabela 6. Quantidade dos 115 extratos brutos obtidos das 23 condições de cultivo de P. verrucosum em pequena escala

N° Condição

de cultivo Peso (mg)

N° Condição de cultivo

Peso (mg)

N° Condição de cultivo

Peso (mg)

Ac1 F1 242 C3 484 32,0 Dc41 M 24 J 72 22,1 Ma81 M 48 V 144 *

Ac2 F 24 C 72 8,4 Dc42 M 24 J 144 5,5 Aq82 F 48 V 48 672,3

Ac3 F 24 C 144 43,2 Me43 M 24 J 48 56,6 Aq83 F 48 V 72 885,2

Ma4 M 24 C 48 56,6 Me44 M 24 J 72 105,1 Aq84 F 48 V 144 *

Ma5 M 24 C 72 343,3 Me45 M 24 J 144 135,3 Me85 M 48 V 48 151,8

Ma6 M 24 C 144 156,7 Ac46 F 24 T 48 5,6 Me86 M 48 V 72 94,4

Aq7 F 24 C 48 1485,9 Ac47 F 24 T 72 8,1 Me87 M 48 V 144 *

Aq8 F 24 C 72 1153,0 Ac48 F 24 T 144 51,9 Dc88 M 48 V 48 1,2

Aq9 F 24 C 144 273,8 Ma49 M 24 T 48 229,3 Dc89 M 48 V 72 6,4

Dc10 M 24 C 48 8,9 Ma50 M 24 T 72 311,1 Dc90 M 48 V 144 *

Dc11 M 24 C 72 26,0 Ma51 M 24 T 144 234,7 Ac91 F 48 J 48 16,3

Dc12 M 24 C 144 5,5 Aq52 F 24 T 48 2364,0 Ac92 F 48 J 72 12,1

Me13 M 24 C 48 83,7 Aq53 F 24 T 72 1251,8 Ac93 F 48 J 144 11,1

Me14 M 24 C 72 111,0 Aq54 F 24 T 144 747,4 Ma94 M 48 J 48 723,2

Me15 M 24 C 144 27,8 Dc55 M 24 T 48 37,9 Ma95 M 48 J 72 459,4

Ac16 F 24 V 48 37,8 Dc56 M 24 T 72 23,0 Ma96 M 48 J 144 482,3

Ac17 F 24 V 72 44,5 Dc57 M 24 T 144 5,4 Aq97 F 48 J 48 1910,6

Ac18 F 24 V 144 28,0 Me58 M 24 T 48 172,9 Aq98 F 48 J 72 2630,5

Ma19 M 24 V 48 153,6 Me59 M 24 T 72 149,8 Aq99 F 48 J 144 2756,8

Ma20 M 24 V 72 175,1 Me60 M 24 T 144 94,4 Me100 M 48 J 48 222,7

Ma21 M 24 V 144 99,7 Ac61 F 48 C 48 4,3 Me101 M 48 J 72 123,0

Aq22 F 24 V 48 528,1 Ac62 F 48 C 72 3,7 Me102 M 48 J 144 206,5

Aq23 F 24 V 72 318,4 Ac63 F 48 C 144 4,8 Dc103 M 48 J 48 9,0

Aq24 F 24 V 144 412,6 Ma64 M 48 C 48 205,0 Dc104 M 48 J 72 7,4

Dc25 M 24 V 48 6,8 Ma65 M 48 C 72 237,5 Dc105 M 48 J 144 4,8

Dc26 M 24 V 72 3,2 Ma66 M 48 C 144 231,2 Ac106 F 48 T 48 6,4

Dc27 M 24 V 144 1,9 Aq67 F 48 C 48 1555,0 Ac107 F 48 T 72 14,5

Me28 M 24 V 48 40,9 Aq68 F 48 C 72 1186,3 Ac108 F 48 T 144 5,3

Me29 M 24 V 72 54,5 Aq69 F 48 C 144 309,4 Ma109 M 48 T 48 469,8

Me30 M 24 V 144 10,2 Me70 M 48 C 48 194,4 Ma110 M 48 T 72 357,5

Ac31 F 24 J 48 23,7 Me71 M 48 C 72 203,2 Ma111 M 48 T 144 415,8

Ac32 F 24 J 72 15,8 Me72 M 48 C 144 156,9 Aq112 F 48 T 48 1443,4

Ac33 F 24 J 144 59,9 Dc73 M 48 C 48 40,5 Aq113 F 48 T 72 1189,0

Ma34 M 24 J 48 284,1 Dc74 M 48 C 72 52,7 Aq114 F 48 T 144 889,8

Ma35 M 24 J 72 477,8 Dc75 M 48 C 144 11,6 Me115 M 48 T 48 214,7

Ma36 M 24 J 144 349,9 Ac76 F 48 V 48 3,6 Me116 M 48 T 72 210,2 Aq37 F 24 J 48 1349,9 Ac77 F 48 V 72 5,2 Me117 M 48 T 144 361,8

Aq38 F 24 J 72 1647,4 Ac78 F 48 V 144 * Dc118 M 48 T 48 23,8

Aq39 F 24 J 144 3715,5 Ma79 M 48 V 48 123,8 Dc119 M 48 T 72 93,4

Dc40 M 24 J 48 31,1 Ma80 M 48 V 72 330,9 Dc120 M 48 T 144 52,0 1 Origem: M= massa micelial e F= fluido da cultura; 2 Tempo de incubação na pré-cultura: 24 e 48 horas; 3 Meio de cultura fermentativo: C= Czapeck, J= Jackson, V= Vogel e T= Takeuchi; 4 Tempo de incubação no meio fermentativo: 24, 48 e 72 horas (meios de cultura e procedimentos previamente descritos (p..32-39). * perda da massa micelial durante o processo de filtração a vácuo.


3.2.3 Perfis cromatográficos via CLAE

Cerca de 30 extratos brutos, de origem intra e extracelular, tiveram seu

perfil cromatográfico determinado via CLAE. As condições de trabalho

incluem coluna CLC - ODS (M), 25 cm X 4,6 mm, partículas de 5 µm,

detecção simultânea a 220, 254 e 270 nm a temperatura ambiente de 22 a

25°C. As amostras foram filtradas em membrana millipore de 0,45 µm e 20 µl

de uma solução a 1 mg/mL foram analisadas em 60 min. de eluição, fase

H2O - MeOH 30% , fluxo de 0,5 mL/min e sistema de integração

computadorizado com software CLASS-VP versão 5,02.

A escala do eixo das ordenadas (mAU) e do eixo das abcissas (min)

foram expandidas para visualizar a presença dos picos de baixa intensidade

de absorção e ampliar a visualização de cada pico em seu tempo de

retenção.

3.2.4 Aumento da produção dos extratos Ac47 e Me59

Os extratos Ac47 e Me59 foram selecionados para fracionamento

cromatográfico. Inicialmente foram produzidos em escala intermediária.

Porém, após os fracionamentos preliminares do extrato Ac47 verificou-se que

a quantidade não era suficiente para isolamento das substâncias, portanto o

fungo foi novamente cultivado em escala ampliada (tabela 7, p. 40).


Tabela 7. Produção em diferentes escalas do extrato bruto Ac47 e Me59

Escala de produção

Quantidade de cultura fermentada (L)

Quantidade de extrato Ac (mg)

Quantidade de extrato Me (mg)

Pequena 0,12 8,1 149,8 Intermediária 2,80 448,3 2.170,0

Ampliada 9,60 1.751,0 4.358,1

3.2.5 Fracionamento cromatográfico de Ac47 e Me59

3.2.5.1 Extrato Ac47 produzido em escala intermediária (i)

O extrato Ac47i foi fracionado através de diversos processos

cromatográficos: coluna líquida a vácuo (CLV) usando como fase

estacionária (FE) sílica gel 60 H e fase móvel (FM) hexano, hexano:AcOEt

nas proporções 5%,10%,20%, 30%, 50% e 80% além de AcOEt:MeOH 50%

e MeOH, originando 10 frações. Destas frações, Ac47.6i foi fracionada por

cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) usando como FM

hexano:AcOEt 1:1, originando 5 frações. A fração Ac47.9i foi fracionada em

coluna flash isocrática com FM CH2Cl2:MeOH 9:1, originando 17 frações,

das quais, Ac47.9.8i foi fracionada por CCDP comercial usando como FM

CH2Cl2:MeOH 9:1, originando 4 novas frações (figura 10, p. 41).

Os espectros de RMN1H das frações Ac47.9.9i e Ac47.9.10i

apresentaram-se muito semelhantes portanto as duas frações foram

reunidas e novamente separadas por lavagens consecutivas com MeOH e

CHCl3, originando Ac47.b1i e Ac47.b2i respectivamente. A fração Acb1i foi

fracionada por CLAE reciclante nas condições especificadas na figura 11 (p.

41).


Figura 10. Fluxograma de fracionamento do extrato Ac47i de P. verrucosum

Figura 11. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.9i e Ac47.9.10i

Ac47.9.9i

6,8 mg

Ac47.9.10i

5,7 mg

Lavagem com MeOH

Ac47.b1i

8,9 mg

MeOH

Resíduo

3,6 mg

Lavagem com CHCl3

Ac47.b2i

1 mg

Resíduo

2,6 mg

CLAE reciclante

Coluna polimérica 500 X 21,5mm

Fluxo = 5mL/min. (10 ciclos)

FM= MeOH:CH2Cl2 50%

λ = 254 nm, 365 nm

20 Fr.

Frações analisadas via RMN1H

AC47i

448,3 mg

CLV (FE = sílica gel 60 H)

13 X 5 cm (h X ø)FM = Hexano, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH10 Fr.

Ac47.6i

16,2 mg

CCDP (20 X 20cm)

FM= Hex : AcOEt 50%

5 Fr.

Ac47.6.1i

1,7 mg

Coluna em sílica flash40 X 2 cmFM = CH2Cl 2:MeOH 9:117 Fr.

CCDP 5 X 20cm

FM = CH2Cl 2:MeOH 9:1

4 Fr.

Ac47.9i

200 mg

Ac47.6.2i

1,1 mg

Ac47.6.3i

1,2 mg

Ac47.6.5i

3,1 mg

Ac47.6.4i

2,2 mg

Ac47.9.8i

2,9 mg

Ac47.9.9i

6,8 mg

Ac47.9.10i

5,7 mg

Ac47.9.8.1i

0,7 mg

Ac47.9.8.2i

1,6 mg

Ac47.9.8.3i

0,4 mg

Ac47.9.8.4i

0,8 mg


3.2.5.2 Extrato Ac47 produzido em escala ampliada

O extrato Ac47, produzido em escala ampliada, também foi submetido

a processos cromatográficos, inicialmente por CLV usando como FE sílica

gel 60 H e FM Hexano, Hexano:AcOEt nas proporções 5%,10%, 20%, 30%,

50% e 80% além de AcOEt, AcOEt:MeOH 50% e MeOH. A fração Ac47.9 foi

fracionada novamente por CLV usando como FE sílica gel 60 H e FM

CH2Cl2, CH2Cl2:MeOH nas proporções 5%,10%, 20%, 30%, 50% e 80% e

MeOH, originando 8 frações (figura 12, p. 42). As frações Ac47.9.2, Ac47.9.3

e Ac47.9.4 foram submetidas a novos processos cromatográficos. Para a

fração Ac479.2 utilizou-se coluna flash isocrática (CHCl3:MeOH 9:1),

procedimento ilustrado na figura 13 (p. 43).

Ac471,75 g


9 X 9 cm

FM = Hexano, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH

10 Fr.

Ac47.9683,2 mg


18 X 4 cm

FM = CH2Cl2, CH2Cl2:MeOH 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, MeOH

8 Fr.

Ac47.9.1

4 mg

Ac47.9.2

98,3 mg

Ac47.9.3

269,4 mg

Ac47.9.4

131 mg

Ac47.9.5

62,2 mg

Ac47.9.6

25,7 mg

Ac47.9.7

10,7 mg

Ac47.9.8

13,7 mg


Figura 12. Fluxograma de fracionamento do extrato Ac47

Figura 13. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.2

Para a fração Ac47.9.3 utilizou-se coluna em sílica gel com FM

CHCl3:MeOH 9:1, originando 14 frações, das quais Ac47.9.3.8 foi separada

em CLAE reciclante nas condições especificadas na figura 14 (p. 43).

Coluna em sílica gel

15 X 2 cm

FM = CHCl3:MeOH 9:1

14 Fr.

Ac47.9.3.8

35,7 mg

CLAE reciclante

Coluna polimérica 500 X 21,5mm

Fluxo =3mL/min. (12 ciclos)

FM = MeOH:CH2Cl2 50%

λ = 225 nm, 276 nm

9 Fr.

Ac47.9.3.8.1

2 mg

Ac47.9.3.8.2

0,8 mg

Ac47.9.3.8.3

0,8 mg

Ac47.9.3.8.4

1,4 mg

Ac47.9.3.8.5

1,1 mg

Ac47.9.3.8.6

0,8 mg

Ac47.9.3.8.7

0,9 mg

Ac47.9.3.8.8

0,7 mg

Ac47.9.3.8.9

0,7 mg

Ac47.9.3

269,4 mg

Ac47.9.2

98,3 mg

Coluna em sílica flash

19 X 2 cm

FM = CHCl3:MeOH 9:1

9 Fr.

Ac47.9.2.1

0,2 mg

Ac47.9.2.2

3,2 mg

Ac47.9.2.3

48,3 mg

Ac47.9.2.4

32,6 mg

Ac47.9.2.5

9,7 mg

Ac47.9.2.6

2,5 mg

Ac47.9.2.7

1,6 mg

Ac47.9.2.8

1,5 mg

Ac47.9.2.9

2,7 mg


Figura 14. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.3

A fração Ac47.9.4 foi fracionada inicialmente por coluna em Sephadex

LH 20 usando como FM MeOH, originando 8 frações das quais duas

(Ac47.9.4.4 e Ac47.9.4.5) foram separadas em CLAE reciclante nas

condições especificadas na figura 15 (p. 44). Na CLAE foram geradas 9 e 13

frações respectivamente. Destas frações foi isolada uma substância que

corresponde a fração Ac47.9.4.4.7 e Ac47.9.4.5.12 que apresentaram

espectro de RMN 1H iguais e foram reunidas de acordo com a figura 15 (p.

44).

Figura 15. Fluxograma de isolamento da substância F1

Ac47.9.4

131 mg

CLAE reciclanteColuna polimérica 500 X 21,5mm Fluxo =5mL/min. (6 ciclos)FM= MeOH:CH2Cl2 50%λ = 225 nm, 276 nm9 Fr.

Coluna em Sephadex LH 20

40 X 4 cm

FM= MeOH

8 Fr.

Ac47.9.4.4

34,9 mg

Ac47.9.4.5

24,3 mg

CLAE reciclanteColuna polimérica 500 X 21,5mm Fluxo =3mL/min. (22 ciclos)FM= MeOH:CH2Cl2 50%λ = 225 nm, 276 nm13 Fr.

Ac47.9.4.4.7

1,8 mg

Ac47.9.4.5.12

1 mg

RMN1H RMN1H

Substância F1

2,8 mg


Em todos os fracionamentos utilizou-se cromatografia em camada

delgada (CCDA) em sílica gel ou sílica silanizada para reunião de frações

semelhantes, escolha de FM, entre outros procedimentos.

3.2.5.3 Extrato Me59 produzido em escala ampliada

Inicialmente o extrato Me59 foi particionado com solventes orgânicos,

originando 5 frações (figura 16, p. 45).

Figura 16. Fluxograma de partição líquido-líquido do extrato Me59

A fração Me59.1 foi fracionada por CLV, usando como FE sílica gel

60H e FM hexano, hexano:AcOEt nas proporções 5%,10%, 20%, 30%, 50%

Me59

4,36g

Fração Hidroalcoólica

CH2Cl2

Suspensão em MeOH:H2O 1:3Partição líq-líq com CH2Cl2

Me59.5

194,7 mg

ConcentraçãoSuspensão em MeOHPartição líq-líq com Hex

Me59.1

335,6 mg

Partição líq-líq com AcOEt

Me59.4

56 mgFração

Hidroalcoólica

Partição líq-líq com n-BuOH

Me59.3

1,44 g

Me59.2

1,81 g

Me59.1- MeOH

Me59.2- n-BuOH

Me59.3- Aquoso

Me59.4- AcOEt

Me59.5- Hex


e 80% além de AcOEt, AcOEt:MeOH 50% e MeOH, originando 9 novas

frações. A fração Me59.1.9 foi fracionada novamente por coluna em

Sephadex LH 20 usando como FM MeOH, originando 6 frações das quais

uma, Me59.1.9.2, foi fracionada por CCDP usando como FM

nBuOH:AcOH:H2O 6:1:3 (figura 17,p. 46).

A fração Me59.2 também foi fracionada por CLV usando como FE

sílica gel 60 H e FM AcOEt, AcOEt:(MeOH:H2O/1:1)1%, 2%, 3%, 5%, 10%,

20%, 50%, 80%, 100%, originado 10 frações. Para a fração Me59.2.1 utilizou-

se coluna flash isocrática (Hex:Me2CO:AcOH 9:1:0,3), seguida de CCDP para

Me59.2.1.3 usando como FM Hex:Me2CO:AcOH 19:1:0,6 (figura 18, p. 47).

Figura 17. Fluxograma de fracionamento de Me59.1

Me59.1

335,6 mg

CLV (FE = sílica gel 60 H)18 X 5 cmFM = Hex, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH9 Fr.

M59.1.9

205,4 mgColuna em Sephadex LH 20

28 X 2 cm

FM= MeOH

6 Fr.

Me59.1.9.2

13,9 mgCCDP (5 X 20cm)

FM= n-BuOH:AcOH:H2O 6:1:3

6 Fr.

Me59.1.9.2.1

5,4 mg

Me59.1.9.2.2

0,3 mg

Me59.1.9.2.3

5,2 mg

Me59.1.9.2.4

2,3 mg

Me59.1.9.2.5

1,6 mg

Me59.1.9.2.6

2,8 mg


A fração Me59.2.8 foi acetilada e purificada por CCDP originando a

substância M3a, conforme a figura 18 (p. 47). Além disso, esta fração

também foi esterificada com diazometano, originando a mistura de

substâncias M2, analisada por CG/EM.


Usando coluna em sephadex LH 20, FM H2O:MeOH 7:3, a fração

Me59.3 originou 5 novas frações e a substância M3. Para Me59.3.2 e

Me59.3.3 foi utilizado fracionamento em coluna em sílica gel com FM

H2O:Me2CO 4:1. Da fração Me59.3.3. foram isolada a substância M5 e a

Me59.2

1,81 g

Me59.2.1

259,5 mg

Me59.2.8

242,2 mg

Me59.2.1.3

127,2 mg


20 X 5 cm

FM = AcOEt, AcOEt:(MeOH:H2O/1:1)1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 50%, 80%, 100%

10 Fr.

Coluna em sílica flash

22 X 2 cm

FM = Hex:Me2CO:AcOH 9:1:0,3

7 Fr.

CCDP 3X (20 X 20cm)

FM= Hex:Me2CO:AcOH 19:1:0,6

2 Fr.

Me592.1.3.1

77 mg

Me59.2.1.3.2

62,7 mg

Acetilação 40mg

(piridina/anidrido acético)

12 horas.Extração com AcOEt

Me59.2.8.1

30 mg

CCDP (20 X 20cm)

FM= Me2CO:Hex 9:1

2 Fr.

Me59.2.8.1.2

13,9 mg

CCDP (20 X 20cm)

FM= MeOH:Me2CO 1:1

2 Fr.

Substância M3a

8,2 mg

diazometano

Coluna em sílica gel22 X 2 cmFM = MeOH:CHCl3 Mistura de

substâncias M2

32 mg

CG/EM

Ésteres metílicosde ácidos

graxos


substância M4 que foi acetilada e purificada por coluna em sílica gel,

originando a substância M4a, conforme a figura 19 (p. 48).


Me59.3

1,44 g

Coluna em Sephadex LH 20

44 X 2,5 cm

FM= MeOH:H2O 7:3

6 Fr.

Me59.3.2

18 m g

Me59.3.3

183,1 mgColuna em sílica gel

13 X 1 cm

FM = H2O:Me2CO 4:1

3 Fr.

Me59.3.2.1

8,4 m g

Me59.3.2.2

2,2 m g

Me59.3.2.3

10 m g

Substância M3

187,7 mg

Substância M5

16,3 mg

Substância M4

118,3 mgAcetilação 30mg

(piridina/anidrido acético)

12 horas.Extração com AcOEt

Coluna em sílica gel18 X 1 cmFM = Hex:Me2CO 3:2

Substância M4a

10,2 mg

Coluna em sílica gel

22 X 2 cm

FM = H2O:Me2CO 4:1

6 Fr.

Me59.4

56 mgCCDP (20 X 20cm)

FM= CHCl3 :AcOEt 7:3

6 Fr.

Mistura de substâncias M6

30 mg

Transesterificação 30mg

(MeOH/H2SO4 )

2 horas em refluxo.Extração com Hex

Mistura de substância M6b

5,5 mg

CG/EM

Ésteres metílicos

dos ácidos graxos



A fração Me59.4 foi fracionada em CCDP usando como FM

CHCl3:AcOEt 7:3, gerando 5 frações e a mistura de substâncias M6 que foi

transesterificada originando a mistura de substâncias M6b que foi analisada

via CG-EM (figura 20, p. 48).

3.2.6 Reações químicas efetuadas em algumas substâncias

- Acetilação

As reações de acetilação foram feitas com 1,0 mL de anidrido acético

e 0,5 mL de piridina para 30 mg da substância M4 e 40mg da fração

Me59.2.8. As misturas reacionais foram deixadas em agitação por 14 horas

à temperatura ambiente. A mistura reacional foi vertida sobre água gelada e

os produtos extraídos com AcOEt. A fase orgânica foi lavada com solução

de ácido acético 10%. O solvente foi evaporado após a secagem com sulfato

de sódio anidro (Santos, 2001).

- Transesterificação de triglicerídeos

A transesterificação foi feita com 30 mg da mistura de substâncias M6

que foi solubilizada em 2,0 mL de MeOH. Pedaços de porcelana e 30µl de

H2SO4 foram adicionados à mistura reacional que foi refluxada por 2 horas

sob agitação ocasional. A extração foi feita com hexano após adição de


20,0mL de H2O e a fase orgânica foi lavada com solução bicarbonatada 5%,

seca com sulfato de sódio e rotaevaporada até a secura (Santos, 2001).

- Esterificação com diazometano

A fração Me59.2.8 foi esterificada com uma solução de diazometano.

Para isso foi adicionada uma solução de diazometano em éter ao substrato

até não ser mais observada a eliminação de gás de N2.

A solução de diazometano foi preparada dissolvendo-se 2,14g de p-

toluilsulfonilmetilnitrosamida (diazald) em 30 mL de éter etílico (em balão de

destilação) e resfriando-se a solução em banho de gelo. Foi adicionada uma

solução de 0,4 g de KOH em 10,0 mL de etanol. Após 5 minutos a solução

etérea de diazometano foi destilada com aquecimento por banho de óleo. O

reagente foi recolhido sobre éter etílico resfriado em banho de gelo (Pupo,

1997).

3.2.7 Elucidação estrutural das substâncias

A elucidação das estruturas químicas foi feita através das técnicas

espectroscópicas: IV, EM, RMN1H, RMN13C, COSY 1H1H, HMBC, HMQC.

3.2.8 Ensaios antiparasitários in vitro para avaliação da atividade

tripanocida

Esse ensaio foi realizado pelo Prof. Dr. Sérgio de Albuquerque

(FCFRP-USP). O bioensaio foi realizado em amostras sangüíneas coletadas


de ratos albinos Swiss no sétimo dia de parasitemia após a infecção com a

linhagem Y de T. cruzi (Silva & Nussenzweig, 1953). O sangue infectado foi

diluído a uma concentração de 2x106 tripomastigotas/mL. Os ensaios foram

realizados em microplacas (96 orifícios) com 400 µL de sangue em triplicata.

Para extratos brutos a concentração utilizada nos ensaios foi de 500 µg/mL e

1 mg/ml. Para substâncias puras a concentração foi de 8, 32 e 128 µM. As

placas foram incubadas a 4oC e o número de parasitas contados após 24

horas, de acordo com o procedimento descrito por Brener, 1962. Sangue

infectado com o mesmo volume de DMSO foi usado como controle negativo e

a violeta de genciana foi usada como controle positivo (250 µg/mL).

3.2.9 Ensaios de inibição das atividades enzimáticas

As enzimas utilizadas neste trabalho são obtidas de forma

recombinante a partir dos plasmídeos inseridos em bactérias Escherichia coli.

A preparação e a purificação das enzimas são feitas rotineiramente de

acordo com os procedimentos estabelecidos no Laboratório de Cristalografia

de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos da

Universidade de São Paulo. O procedimento para GAPDH já foi descrito

(Souza et al., 1998).

- Enzima GAPDH de T. cruzi


Os ensaios foram realizados no Laboratório de Química Farmacêutica

da FCFRP-USP e foram feitos conforme procedimento previamente descrito

(Vieira et al., 2001), pela medida espectrofotométrica de NADH formado em

340 nm durante 30 s. A mistura reacional contém (volume final 1 mL): 50 mM

tampão Tris-HCl pH 8,6 com 1 mM EDTA e 1mM β-mercaptoetanol, 30 mM

arseniato de sódio, 2,5 mM NAD, 0,3 mM gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e 1,5

µg de enzima. A reação é iniciada pela adição do substrato.

Para o teste de inibição, as soluções dos extratos (1 mg/mL) foram

preparadas em DMSO e 100 µL foi adicionado à mistura reacional.

Substâncias puras são inicialmente testadas em 100 µg/ml e esta

concentração é diminuída até a obtenção de aproximadamente 50% de

inibição (IC50). A concentração final de DMSO usada foi 10% e este volume

foi subtraído do volume do tampão. Substâncias puras são inicialmente

testadas em 100 µg/mL e esta concentração é diminuída até a obtenção de

aproximadamente 50% de inibição (IC50). Ensaios controle foram feitos na

ausência de extratos, onde um volume equivalente de DMSO foi adicionado.

As medidas foram feitas em triplicata e considerou-se o valor da média.

- Enzima APRT de L. tarentolae

Os ensaios foram realizados no Laboratório de Cristalografia de

Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos da

Universidade de São Paulo. Utilizou-se a enzima APRT de L. tarentolae,

clonada e caracterizada por Thiemann e colaboradores em 1998 e estes


ensaios foram feitos de acordo com a modificação de um procedimento

previamente descrito (Tuttle & Krenistsky, 1990) pela medida

espectrofotométrica da formação de AMP. Os ensaios de atividade foram

acompanhados por 60 segundos e o comprimento de onda utilizado é 259

nm. A mistura reacional contém (volume final de 0,5 mL): tampão Tris - HCl

100 mM (pH 7,4); MgCl2 5 mM; Adenina 100 mM; PRPP 560 mM e APRT 7,5

µg. Para o teste de inibição, as soluções dos extratos (1 mg/ml) foram

preparadas em DMSO e 100µL foi adicionado à mistura reacional. A

concentração final de DMSO usada foi 10% e este volume foi subtraído do

volume do tampão. Ensaios controle foram feitos na ausência de extratos,

onde um volume equivalente de DMSO foi adicionado. As medidas foram

feitas em triplicata e considera-se o valor da média.

Os resultados obtidos para GAPDH e APRT foram avaliados conforme

procedimento previamente descrito (Vieira et al., 2001). Todas as medidas

são feitas em triplicata, onde se calcula a média e em seguida aplica-se a

fórmula:

onde:

∆t = min.

εNADH= 6,22 mM-1 cm-1

εAMP= 1,24 mM-1 cm-1

volumes expressos em mililitros (mL)

Atividade específica =(U/mg)

∆Abs

∆t (min)

_________ x volume da cubeta

__________________________________

εNADH, AMP

Ax vol. enzima na cubeta x [enzima]


A atividade específica das enzimas (unidade/mg) é calculada através

de medidas espectrofotométricas da formação do produto (NADH) pela

diferença de absorbância entre os tempos específicos de reação para cada

enzima.

Através da atividade específica é possível calcular a porcentagem de

inibição da enzima GAPDH de T. cruzi (tabela 13, p. 61) e enzima APRT de

L. tarentolae (tabela 15, p. 65) frente aos extratos brutos testados. Pela

fórmula:

As enzimas foram armazenadas a 4°C e utilizadas nos experimentos

nas concentrações de 0,3 mg/mL para GAPDH e 0,9 mg/mL para APRT .

% = 100 X U/mg (controle) – U/mg (amostra) U/mg (controle)

04.Materiais e Metodos

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