000482329

7/26/2019 000482329

1/224

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SULFACULDADE DE FARMCIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

Avaliao da fotoestabilidade do cetoconazol e determinao da atividade

antifngica e da segurana biolgica in vivoe in vitrodo xampu de

cetoconazol

Tese de Doutorado

Inara Staub

Porto Alegre, 2005.

7/26/2019 000482329

2/224

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SULFACULDADE DE FARMCIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

Avaliao da fotoestabilidade do cetoconazol e determinao da atividade

antifngica e da segurana biolgica in vivoe in vitrodo xampu de

cetoconazol

INARA STAUB

Porto Alegre, 2005.

7/26/2019 000482329

3/224

7/26/2019 000482329

4/224

7/26/2019 000482329

5/224

Agradecimentos a CAPES, rgo que financiou

a bolsa de estudos para o desenvolvimento deste trabalho,

e aos Laboratrios de Qumica Farmacutica e Controle

de Qualidade que disponibilizaram todos equipamentos

e materiais necessrios para a realizao dos experimentos.

7/26/2019 000482329

6/224

A vida pode florescer

numa existncia inteira.

Mas tem de ser buscada, tem de ser

conquistada.

Lya Luft

7/26/2019 000482329

7/224

7/26/2019 000482329

8/224

Agradecimentos

Profa. Dra. Ana Maria Bergold meu agradecimento pela convivncia,

amizade, incentivo, conhecimento cientfico e ajuda de quem foi fundamental para a

realizao deste trabalho.

Profa. Dra. Elfrides Eva Scherman Schapoval pela receptividade,

esclarecimentos e incentivo durante o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Auro pelo amor, carinho, compreenso e constante incentivo.

A minha famlia pelo carinho e apoio em mais esta etapa da minha vida.

Aos Laboratrios de Qumica Farmacutica e Controle de Qualidade pela

disponibilizao dos equipamentos e materiais necessrios para o desenvolvimento

do trabalho.

Aos professores do Laboratrio de Qumica Farmacutica: Dr. Pedro

Eduardo Frehlich, Dr. Jarbas Alves Montanha e Dra. Grace Gosmann pelosesclarecimentos.

Profa. Dra. Adriana Pohlman pela receptividade e pelo auxlio na

interpretao dos dados dos mtodos espectroscpicos.

Profa. Dra. Terezinha de Jesus Andreoli Pinto e Dra. urea Silveira Cruz,

do Instituto Adolfo Lutz, pelo auxlio na execuo e interpretao dos dados da

avaliao da segurana biolgica.

Aos Laboratrios de Ressonncia Magntica Nuclear do Instituto de Qumica

(UFRGS) e Ressonncia Magntica Nuclear do Departamento de Qumica (UFSM)

pela execuo das anlises de RMN.

Ao Dr. Pascal Sonnet da Facult de Pharmacie, Universit Picardie Jules

Verne (Amiens-Frana) pela execuo das anlises de RMN.

Ao Centro Bioanaltico de Medicamentos (CBIM-UFRGS) pela execuo

das anlises de espectrometria de massas.

Aos amigos e colegas do Laboratrio de Qumica Farmacutica: Eliane,

Carolina, Vanessa, Alexandre, Sirlei, Andra, Marins, Lidiane, Liliana, Rochele,

7/26/2019 000482329

9/224

7/26/2019 000482329

10/224

viii

SUMRIO

AGRADECIMENTOS..........................................................................................................vi

SUMRIO..........................................................................................................................viii

LISTA DE TABELAS........................................................................................................xvi

LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................xx

LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................xxvii

RESUMO..........................................................................................................................xxixABSTRACT......................................................................................................................xxxi

1. INTRODUO...........................................................................................................01

2. OBJETIVOS................................................................................................................05

2.1. Objetivos gerais.............................................................................................................07

2.2. Objetivos especficos.....................................................................................................07

3. REVISO BIBLIOGRFICA...................................................................................09

3.1. Infeces fngicas.........................................................................................................11

3.2. Pele e anexos cutneos..................................................................................................12

3.3. Pitriase versicolor e dermatite seborrica.....................................................................14

3.4. Xampus..........................................................................................................................15

3.5. Antifngicos..................................................................................................................19

3.5.1. Histrico.....................................................................................................................19

3.5.2. Cetoconazol................................................................................................................22

3.5.2.1. Uso oral...................................................................................................................23

3.5.2.2. Uso tpico................................................................................................................25

3.5.2.3. Mtodos para determinao do cetoconazol...........................................................27

7/26/2019 000482329

11/224

7/26/2019 000482329

12/224

7/26/2019 000482329

13/224

7/26/2019 000482329

14/224

xii

4.7.2. Degradao alcalina...................................................................................................63

A) Matria-prima.................................................................................................................63

B) Formas farmacuticas.....................................................................................................64

4.7.3. Degradao com perxido de hidrognio...................................................................64

A) Matria-prima.................................................................................................................64

B) Formas farmacuticas.....................................................................................................64

4.8. ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DOS PRODUTOS DE DEGRADAO.......65

4.8.1. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (RMN)........................................65

4.8.1.1. Degradao das amostras........................................................................................65

4.8.1.2. Cromatografia lquida de alta eficincia semipreparativa.......................................65

4.8.1.2.1. Equipamento.........................................................................................................66

4.8.1.2.2. Fase mvel............................................................................................................66

4.8.1.2.3. Condies cromatogrficas..................................................................................66

4.8.1.3. Determinao da pureza..........................................................................................664.8.1.4. Concentrao das fraes........................................................................................67

4.8.1.5. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear de 1H e 13C...............................67

4.8.2. Espectrometria de massas (MS).................................................................................68

4.8.2.1. Degradao das amostras........................................................................................68

4.8.2.2. Equipamento e condies cromatogrficas.............................................................68

4.8.2.3. Condies da espectrometria de massas - ionizao eletrospray............................69

4.9. AVALIAO DA SEGURANA BIOLGICA........................................................69

4.9.1. Avaliao da toxicidade aguda com efeito local........................................................69

4.9.1.1. Teste de irritao ocular..........................................................................................70

4.9.2. Avaliao in vitro.......................................................................................................72

4.9.2.1. Avaliao do potencial de citotoxicidade in vitro...................................................72

4.9.2.1.1. Culturas celulares.................................................................................................73

4.9.2.1.2. Mtodo de difuso em gar..................................................................................73

7/26/2019 000482329

15/224

7/26/2019 000482329

16/224

7/26/2019 000482329

17/224

xv

5.6.1. Cromatografia lquida de alta eficincia semipreparativa........................................145

5.6.2. Determinao da pureza...........................................................................................145

5.6.3. Anlise do cetoconazol.............................................................................................149

5.6.4. Anlise do produto de degradao denominado Fr1................................................156

5.6.5. Anlise do produto isolado denominado Fr2...........................................................163

5.7. AVALIAO DA SEGURANA BIOLGICA......................................................170

5.7.1. Avaliao da toxicidade aguda com efeito local......................................................171

5.7.2. Avaliao in vitro.....................................................................................................173

6. CONCLUSES.....................................................................................................177

7. CONSIDERAES FINAIS...............................................................................183

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...............................................................187

ANEXO 1...........................................................................................................................199

ANEXO 2...........................................................................................................................203

ANEXO 3...........................................................................................................................213CURRICULUM VITAE..................................................................................................219

7/26/2019 000482329

18/224

7/26/2019 000482329

19/224

7/26/2019 000482329

20/224

7/26/2019 000482329

21/224

7/26/2019 000482329

22/224

7/26/2019 000482329

23/224

xxi

utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetatode amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel......................................98

Figura 17- Cromatograma do placebo (Xb), obtido por CLAE com comprimento de ondade 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol(2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fasemvel..................................................................................................................................101

Figura 18- Curva de pureza apresentada para Form1, indicando a pureza total do pico docetoconazol de 0,999993, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm,utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetatode amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel....................................101

Figura 19- Curva de pureza apresentada para Form2, indicando a pureza total do pico do

cetoconazol de 0,999997, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm,utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetatode amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel....................................102

Figura 20- Cromatograma da soluo de cetoconazol SQR (300 g/ml), obtido por CLAEcom comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e fase mvelcom diferente proporo de metanol e gua (6,5:3,5 v/v) pH 5,5......................................104

Figura 21- Cromatograma da soluo de cetoconazol SQR (300 g/ml), obtido por CLAEcom comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 emonoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3,

V/V) pH 4,5 como fase mvel............................................................................................105

Figura 22 Doseamento microbiolgico (mtodo de difuso em gar- cilindros emplacas), utilizando Candida albicans ATCC 10231 como microrganismo teste, meio decultura gar Sabouraud-dextrose 2%, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C. Cetoconazol SQR com concentraes de 20 (P1); 100 (P2) e 500 (P3) g/ml exampu de cetoconazol (Xb-ceto) com concentraes de 20 (A1); 100 (A2) e 500 (A3)g/ml..................................................................................................................................110

Figura 23 - Representao grfica da curva padro de cetoconazol e sua respectivaequao da reta, obtida atravs de ensaio microbiolgico - mtodo de difuso em gar-

cilindros em placas utilizando meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, Candidaalbicanscomo microrganismo teste, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C.....................................................................................................................................111

Figura 24 Representao grfica dos teores de cetoconazol matria-prima obtidos porCLAE, aps exposio lmpada UV-C (Light express LEUV (254 nm)) por um perodode 8 horas............................................................................................................................118

Figura 25 - Cromatograma do cetoconazol matria-prima (concentrao terica de400 g/ml), aps exposio lmpada UV-C por 8 horas, obtido atravs de CLAE comcomprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e

monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V) /acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3,V/V) pH 5,5 como fase mvel............................................................................................119

7/26/2019 000482329

24/224

xxii

Figura 26 - Representao grfica dos teores da soluo metanlica de cetoconazolobtidos por CLAE, aps exposio lmpada UV-C (Light express LEUV (254 nm)) eUV-A (Blacklight blue lamp Orion(352 nm)) por um perodo de 24 horas...................120

Figura 27- Cromatograma da soluo metanlica de cetoconazol (concentrao terica de400 g/ml), aps exposio lmpada UV-A por 8 horas, obtidos atravs de CLAE comcomprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 emonoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3,V/V) pH 5,5 como fase mvel............................................................................................121

Figura 28 -Cromatograma da soluo metanlica de cetoconazol (concentrao terica de400 g/ml), aps exposio lmpada UV-C por 4 horas, obtidos atravs de CLAE comcomprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 emonoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3,

V/V) pH 5,5 como fase mvel............................................................................................122

Figura29- Cromatograma da soluo metanlica de cetoconazol (concentrao terica de400 g/ml), aps exposio lmpada UV-C por 24 horas, obtidos atravs de CLAE comcomprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 emonoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3,V/V) pH 5,5 como fase mvel............................................................................................122

Figura 30- Representao grfica dos teores de xampu de cetoconazol obtidos por CLAE,aps exposio lmpada UV-C (Light express LE UV (254 nm)) e lmpada UV-A(Blacklight blue lamp Orion(352 nm)) por um perodo de 24 horas..............................123

Figura 31 -Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml), aps exposio lmpada UV-A por 24 horas, obtidos atravs de CLAE com comprimento de onda de225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol(2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fasemvel..................................................................................................................................125

Figura 32-Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml), aps exposio lmpada UV-C por 24 horas, obtidos atravs de CLAE com comprimento de onda de225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol(2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase

mvel..................................................................................................................................125

Figura 33Doseamento microbiolgico (mtodo de difuso em gar- cilindros em placas),utilizando Candida albicans ATCC 10231 como microrganismo teste, meio de culturagar Sabouraud-dextrose 2%, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C.Cetoconazol SQR com concentraes de 20 (P1); 100 (P2) e 500 (P3) g/ml e xampu decetoconazol (Xb-ceto), aps exposio lmpada UV-C por 22 horas, com concentraesde 20 (D1); 100 (D2) e 500 (D3) g/ml.............................................................................127

Figura 34 - Representao grfica dos teores da soluo metanlica de cetoconazolobtidos por CLAE. Amostras armazenadas em frasco transparente e em frasco opacoexpostas luz natural por um perodo de 26 meses...........................................................130

7/26/2019 000482329

25/224

7/26/2019 000482329

26/224

7/26/2019 000482329

27/224

7/26/2019 000482329

28/224

7/26/2019 000482329

29/224

7/26/2019 000482329

30/224

xxviii

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

NCTC National Collection for Type Culture

Rf fator de reteno

RMN ressonncia magntica nuclear

SFB - soro fetal bovino

Sol-ceto soluo metanlica de cetoconazol 2 %

SQR substncia qumica de referncia

UV ultravioleta

VIH vrus da imunodeficincia humana

Vis - visvel

VMNA volumetria em meio no-aquoso

Xb xampu base

Xb-ceto xampu de cetoconazol 2 % preparado no laboratrio

7/26/2019 000482329

31/224

xxix

RESUMO

Cetoconazol um agente antifngico que possui ao tpica e sistmica,

podendo ser incorporado em diferentes formas farmacuticas. Como exemplo,

pode-se citar o xampu de cetoconazol, que efetivo no tratamento da dermatite

seborrica e pitirase versicolor. reconhecido que o cetoconazol, nas formas

farmacuticas xampu e soluo, rapidamente altera a colorao se tornando

avermelhado. A exposio de frmacos radiao pode influenciar a estabilidade da

formulao, levando a modificaes nas propriedades fsico-qumicas do produto. Oobjetivo deste trabalho foi avaliar a fotoestabilidade do cetoconazol em xampu e

soluo. As formulaes foram expostas radiao UV-A (352 nm), UV-C

(254 nm) e luz diurna. Mtodos foram desenvolvidos e validados para a

determinao quantitativa do cetoconazol: cromatografia lquida de alta eficincia e

ensaio microbiolgico utilizando o mtodo de cilindros em placa. Estudos

comparativos entre xampu de cetoconazol e xampu de cetoconazol contendo

produtos de degradao foram feitos para avaliar a atividade antifngica e a

segurana biolgica in vivo (teste de Draize) e in vitro (teste de citotoxicidade). Os

resultados demonstraram diminuio na atividade antifngica, mas no

demonstraram alterao na segurana biolgica. Os mtodos utilizados para anlise

do cetoconazol (ensaio microbiolgico e CLAE) demonstraram ser lineares,

precisos e exatos, sendo teis no controle de qualidade do frmaco. Os resultados

indicam alterao do cetoconazol em presena da luz. Dois produtos de degradaoforam isolados e identificados: 1-acetil-4-{4-[2-(2-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1-

metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina e 1-acetil-4-{4-[2-(4-clorofenil)-2-

(1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina. Conseqentemente,

adequada proteo da luz deve ser adotada durante armazenamento das duas formas

farmacuticas contendo o frmaco.

7/26/2019 000482329

32/224

xxx

Palavras-chave: cetoconazol, xampu, cromatografia lquida de alta

eficincia, ensaio microbiolgico, estudos de fotoestabilidade, segurana

biolgica.

7/26/2019 000482329

33/224

7/26/2019 000482329

34/224

xxxii

piperazine. Consequently, adequate light protection should be adopted for storage

of these two dosage forms containing the drug.

Key words: ketoconazole, shampoo, high performance liquid

chromatography, microbiological assay, photostability studies, biological

reactivity.

7/26/2019 000482329

35/224

INTRODUO

7/26/2019 000482329

36/224

7/26/2019 000482329

37/224

Introduo 4

Frmacos sensveis luz freqentemente aumentam os problemas de uma

formulao farmacutica. Reaes fotoqumicas so complexas e um bom

entendimento do processo de fotodecomposio necessrio a fim de otimizar a

estabilidade do produto.

Sendo assim, justifica-se o desenvolvimento, validao e utilizao de

mtodos fsico-qumicos e microbiolgicos para caracterizao, identificao e

doseamento do frmaco, visando obteno de dados para o estudo da estabilidade

fotoqumica do cetoconazol em formulaes farmacuticas, em especial o xampu,

com avaliao dos possveis produtos de degradao formados. Apesar do frmacoter sido sintetizado na dcada de 70, no foram encontrados estudos publicados

sobre seus produtos de degradao.

7/26/2019 000482329

38/224

7/26/2019 000482329

39/224

7/26/2019 000482329

40/224

7/26/2019 000482329

41/224

Reviso bibliogrfica 11

3.1. Infeces fngicas

As micoses humanas podem ser causadas por fungos patognicos primrios

ou por fungos oportunistas. Patognicos primrios so aqueles que tm capacidade

de invadir os tecidos de um hospedeiro normal; os oportunistas, no entanto, somente

so invasores de tecidos de indivduos com alteraes do sistema imunolgico do

organismo (VERONESI e FOCACCIA, 1998). Nos ltimos anos, a incidncia de

infeces fngicas tem aumentado em funo do vrus da imunodeficincia humana

(VIH), cncer e transplantes. importante salientar, que tanto os fungos

patognicos como os oportunistas so conhecidos como causadores de micosesseveras e algumas vezes fatais em pacientes imunocomprometidos (ESPINEL-

INGROF,1996).

As doenas por fungos podem ser classificadas em trs grupos

(FREEDBERG et al., 2003):

Micoses sistmicas

As micoses sistmicas so caracterizadas por serem adquiridas, geralmente

por inalao de fungos patgenos dimrficos, dando origem, na maioria das vezes, a

uma leso pulmonar primria que tem tendncia regresso espontnea. As leses

extrapulmonares resultam da disseminao hematognica do fungo. As micoses

sistmicas esto apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1 Micoses sistmicas e fungos causadores.

Micoses Fungos

Histoplasmose Histoplasma capsulatum (capsulatum, duboisii)Blastomicose Blastomyces dermatitidis

Coccidioidomicose Coccidioides immitisParacoccidioidomicose Paracoccidioides brasiliensis

Peniciliose Penicillium marneffei

Criptococose Cryptococcus neoformans

7/26/2019 000482329

42/224

7/26/2019 000482329

43/224

7/26/2019 000482329

44/224


3.3. Pitirase versicolor e dermatite seborrica

Pitirase versicolor e dermatite seborrica so doenas da pele muito comuns.

Pitirase versicolor uma doena fngica superfcial crnica, usualmente localizada

na parte superior do tronco e braos, e no pescoo (FAERGEMANN, 2000).

A leso caracterizada por uma descamao, entretanto uma leso extensa

pode ser evidenciada como uma mancha hipopigmentada ou hiperpigmentada.

reconhecido que o microrganismo causador da pitirase versicolor a Malassezia

spp, que um comensal da pele humana normal (GUPTA et al., 2002).

A Malassezia apresenta sete espcies da levedura lipoflica: Malassezia

furfur (Pityrosporum orbiculare, Pityrosporum ovale e Malassezia ovalis), M.

pachydermatis,M. sympodialis,M. globosa,M. restricta, M. slooffiae eM. obtusa.

M. furfur h muito tempo tem sido identificada como causador da pitirase

versicolor, entretanto estudos recentes indicam queM. globosapode estar envolvida

na patogenia da doena (ERCHIGA et al., 2000).

Fatores endgenos e exgenos esto relacionados ao aparecimento da

doena. Entre os fatores exgenos pode-se citar alta temperatura e umidade, por isso

mais comum nos pases tropicais. Entre os fatores endgenos pode-se citar

hiperidrose, imunodeficincia, fatores hereditrios e pele muito oleosa; por isso a

doena mais comum em adolescentes e adultos jovens (FAERGEMANN, 2000).

A dermatite seborrica uma desordem dermatolgica comum. A etiologiada doena pouco conhecida. Alguns autores focalizam o papel da Malassezia

furfur no desenvolvimento da dermatite seborrica (GUPTA et al., 2004).

Entretanto, muitos fatores tm sido citados como possveis contribuintes para o

desenvolvimento da doena: fatores hormonais (nvel de sebo), nutricionais e

imunolgicos (GUPTA e BLUHM, 2004).

O nome dermatite seborrica significa uma inflamao oleosa da pele. Noentanto, a doena muito mais complexa do que o nome sugere, pois estudos

7/26/2019 000482329

45/224

7/26/2019 000482329

46/224

7/26/2019 000482329

47/224

7/26/2019 000482329

48/224


Tabela 2 Relao das principais categorias de matrias-primas e respectiva ao predominanteem formulaes de xampu.

Categoria Exemplos Ao predominante

Estabilizadoresde espuma

alcanolamidas de cido graxo(monoetanolamida e dietanolamida do

cido lurico), polmeros (metilcelulose)

aumentar o volume e aqualidade da espuma e

estabilizar a mesma

Espessantes derivados da celulose (metilcelulose),eletrlitos (cloreto de sdio), polmeros

carboxivinlicos (carbopol), gomas naturais,alcanolamidas de cido graxo

alterar a viscosidade

Conservantes imidazolidiniluria, metil e propilparabeno,formaldedo, dimetilidantona

proteger dacontaminao

microbiolgica

Condicionadores silicone, protenas hidrolisadas (queratina,colgeno), derivados da lanolina, lcoois

graxos (lurico, mirstico e olico)

doador de maciez esuavidade ao cabelo eredutor da eletricidade

esttica

Opacificantes eclarificantes

lcoois graxos (cetlico e estearlico),alcanolamidas de cidos graxos (esterico),steres (monoestearato de glicerila), xido

de zinco ou dixido de titnio

melhorar a apresentaodo produto final

Quelantes EDTA e seus sais,cido tartrico

capturarons presentes na gua

Acidulantes cido ctrico, cido clordrico, cido ltico diminuir pH

Fonte: BOUILLON, 1996, WILKINSON e MOORE, 1982.

Produtos aromatizantes e corantes tambm podem ser adicionados em

formulaes de xampu. Os aromatizantes auxiliam a mascarar odores dos

tensoativos, transmitindo ao produto acabado um aroma agradvel. Os corantes so

utilizados para melhorar o aspecto de apresentao do produto. Algumas vezes,

estes produtos so adicionados para mascarar alguma alterao que o produto sofre

com o passar do tempo como precipitao e alterao de cor (FERREIRA, 2002).

Alm das matrias-primas j citadas, muitos agentes podem ser adicionados

a formulaes de xampu por possurem ao especfica, destinados a casos

7/26/2019 000482329

49/224


particulares do cabelo e couro cabeludo. Existem xampus para combater a caspa,

dermatite seborrica, pitirase versicolor, infeces bacterianas causadas por

Staphylococcus aureus, psorase, entre outros. Segundo SHAPIRO e MADDIN

(1996), os frmacos antifngicos, dentre eles o cetoconazol, so amplamente

empregados em formulaes de xampu, pois esses frmacos possuem mecanismo de

ao especfico, sendo capazes de controlar alteraes no couro cabeludo.

3.5. Antifngicos

3.5.1. Histrico

At 1945, terapias no especficas como queratolticos (cido saliclico) e

anti-spticos (violeta de genciana) eram a base do tratamento tpico de infeces

causadas por fungos. Em 1945, surgiu o cido undecilnico, um composto

insaturado com 11 carbonos, com ao fungisttica. Entretanto, esse agente

apresentava odor ranoso desagradvel e necessidade do uso prolongado

(FREEDBERG et al., 2003).

Em 1950, a descoberta dos antibiticos polinicos (anfotericina B e nistatina)

representou um avano na micologia mdica. Apesar da anfotericina B ter

rapidamente se tornado o principal suporte na terapia de infeces sistmicas srias,

o seu uso foi associado a diversos efeitos colaterais como nefrotoxicidade, por

exemplo. Um terceiro agente antifngico, a griseofulvina, foi descoberto em 1958 e

desenvolvido a partir do Penicillium griseofulvum(ESPINEL-INGROF,1996).

A flucitosina, anlogo pirimidnico, foi sintetizada em 1957 e apresentou

limitada atividade contra determinados fungos. O tolnaftato (1964), pertencente

classe dos tiocarbamatos, utilizado topicamente, teve seu uso essencialmente restrito

a infeces causadas por dermatfitos (VANDEN-BOSSCHE et al., 2003).

A descoberta da atividade antifngica da naftidina, prottipo das alilaminas,

foi o ponto inicial para os estudos de relao estrutura-atividade resultando no

7/26/2019 000482329

50/224


desenvolvimento da terbinafina, uma alilamina com considervel melhora das

propriedades antimicticas (VANDEN-BOSSCHE et al., 2003).

A procura por novos antifngicos menos txicos conduziu descoberta dos

derivados imidazlicos. Em 1960, trs novos compostos de uso tpico foram

introduzidos: clotrimazol, desenvolvido pela Bayer (Alemanha), miconazol e

econazol, ambos desenvolvidos pela Janssen Pharmaceutica (Blgica)

(MAERTENS, 2004).

Em 1981, o FDA aprovou o cetoconazol, desenvolvido pela Janssen

Pharmaceutica, o primeiro composto imidazlico disponvel para tratamento oral de

infeces fngicas sistmicas. Por quase uma dcada, o cetoconazol foi considerado

o frmaco de escolha e nico disponvel para tratamento oral de infeces

sistmicas (ESPINEL-INGROF,1996).

A introduo da primeira gerao de triazis (fluconazol e itraconazol)

representou o segundo maior avano no tratamento de infeces fngicas. Apesar

do uso difundido, esses agentes tm importantes limitaes clnicas relatadas como

o surgimento de resistncia e toxicidade. A fim de superar essas limitaes,

diferentes anlogos tm sido desenvolvidos. Pode-se citar a segunda gerao de

triazis (voriconazol, pozaconazol e ravuconazol) que possuem grande potncia,

maior atividade contra resistncia e atividade contra Aspergillus spp.

(LAVERDIERE et al., 2002; MAERTENS, 2004).

Atualmente existem muitos agentes tpicos empregados no tratamento de

micoses superficiais. A terapia tpica apresenta grandes vantagens sobre a

sistmica, dentre elas pode-se destacar a falta de efeitos adversos severos e de

interaes medicamentosas, facilidade do uso e o no monitoramento do paciente

com exames laboratoriais. Na Tabela 3 esto apresentados alguns agentes tpicos

disponveis para o tratamento de infeces fngicas superficiais e o seu mecanismo

de ao.

7/26/2019 000482329

51/224

7/26/2019 000482329

52/224

7/26/2019 000482329

53/224

7/26/2019 000482329

54/224


colaboradores (1982) o frmaco apresentou grande potencial teraputico na

dermatomicose.

Alguns artigos relataram que o cetoconazol tem atividade sobre outras

doenas que no so causadas por fungos. Baixa dose de cetoconazol mostrou ser

efetiva no tratamento do hirsutismo, apresentando pequeno nmero de efeitos

colaterais, mas ainda ficando reservado como alternativa de escolha devido

hepatotoxicidade (GOKMEN et al., 1996). O frmaco tambm mostrou ser efetivo

no tratamento de cncer de prstata, pois em altas doses pode diminuir rapidamente

o nvel de testosterona (TRACHTENBERG et al., 1983).

Estudos que compararam a carga viral do VIH em pacientes tratados com

saquinavir isolado ou associado com cetoconazol mostraram que pacientes que

receberam o regime combinado apresentaram maior queda na carga viral. Os

resultados indicaram que a combinao cetoconazol mais saquinavir requer maiores

estudos (JORDAN, 1998).

A adio de baixas doses de cetoconazol ciclosporina no tratamento de

pacientes renais e cardacos transplantados produziu efeitos favorveis na funo do

rgo transplantado, diminuindo o nmero de infeces cutneas fngicas, as taxas

de rejeio e as necessidades de ciclosporina. O frmaco interage com ciclosporina

atravs do citocromo P450, conduzindo inibio do metabolismo de ciclosporina

aumentando o seu nvel no sangue (KEOGH et al., 1995; SOBH et al., 1995;

GERNTHOLTZ et al., 2004).

importante salientar que, em 1983, HENNING e colaboradores

descreveram um caso importante de efeito colateral do cetoconazol, quando o

frmaco induziu hepatite em um paciente. Atualmente, recomenda-se que o mdico

solicite exames clnicos da funo heptica durante o tratamento (2 semanas aps o

incio do tratamento e aps com intervalos mensais).

7/26/2019 000482329

55/224

7/26/2019 000482329

56/224

7/26/2019 000482329

57/224

7/26/2019 000482329

58/224


Segundo a USP 28 (2005), a determinao do teor de cetoconazol matria-

prima feita atravs de volumetria em meio no-aquoso com determinao

potenciomtrica do ponto final. Para comprimidos contendo cetoconazol a

determinao feita atravs de CLAE com fase mvel diisopropilamina-metanol

(1:500) / acetato de amnio (1:200) (7:3) e detector em 225 nm. A suspenso oral

de cetoconazol avaliada por CLAE com a seguinte fase mvel: 2,55g de sulfato de

tetrabutilamnio em 750 ml de gua e 250 ml de acetonitrila.

Diferentes mtodos analticos para quantificao do cetoconazol,

principalmente em fluidos biolgicos e comprimidos foram citados na literatura.

Mtodos espectrofotomtricos na regio do visvel foram descritos para o

doseamento do cetoconazol. SADEGHI e SHAMSIPUR (1998) desenvolveram um

mtodo para determinao do cetoconazol em comprimidos, creme e amostras de

soro. O mtodo consiste na extrao do frmaco com cido pcrico pH 2,5 e

clorofrmio, seguido de deteco a 410 nm. Segundo KELANI e colaboradores

(1997), a quantificao de derivados piperaznicos, entre eles o cetoconazol naforma de comprimidos, foi aplicada com sucesso. Fez-se reao do frmaco com

2,3-dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona e determinao da absorvncia do produto

colorido formado em 588 nm. Os resultados foram comparados com a metodologia

oficial.

O doseamento do cetoconazol, atravs de espectrofotometria na regio do

ultravioleta, tambm foi descrito. Os autores desenvolveram, para a determinaodo frmaco em comprimidos e cremes, um mtodo onde a amostra foi dissolvida em

cido clordrico 0,01Me detectada em comprimentos de onda de 222 nm e 269 nm

(KEDOR-HACKMANN et al., 1994). Mtodo baseado na formao de um

complexo do frmaco com iodo foi desenvolvido. O produto formado apresentou

duas absores mximas a 290 e a 377 nm. As leituras foram feitas a 290 nm. O

mtodo mostrou-se rpido, simples e sensvel (EL-SHABOURI et al., 1998).

7/26/2019 000482329

59/224

7/26/2019 000482329

60/224

7/26/2019 000482329

61/224


Aps a preparao do xampu de cetoconazol, observa-se que o produto sofre

algum tipo de alterao, pois o mesmo adquire colorao avermelhada muito

rapidamente (STAUB et al., 2002). Essa alterao sugere que o produto no

estvel e que o mesmo forma produtos de degradao. Um grande problema da

instabilidade de uma formulao a diminuio no teor da substncia ativa e a

possvel formao de produtos txicos de degradao.

Aps reviso de literatura sobre a estabilidade do frmaco, foi possvel

encontrar alguns artigos sugerindo a instabilidade do produto frente luz.

Segundo KUMMER e colaboradores (1991), solues etanlicas de

cetoconazol (2,5 e 5,0 g/ml) mostraram-se estveis por um perodo de 28 dias.

Foram analisadas solues armazenadas em presena da luz ou ao abrigo da luz

assim como a ao da temperatura sobre as solues (temperatura ambiente e

refrigerao a 8 C). Os resultados apresentados no demonstraram diferena

significativa, indicando estabilidade do cetoconazol em soluo etanlica.

Entretanto, THOMA e KBLER (1996c) compararam a fotoestabilidade de

antimicticos azlicos. Apesar de suas estruturas serem semelhantes, os

pesquisadores relataram que existem diferenas na estabilidade fotoqumica. Em

particular, cetoconazol e terconazol mostraram-se fotolbeis. A instabilidade

fotoqumica foi considerada em soluo metanlica e tambm com o frmaco no

estado slido. Por outro lado, clotrimazol, nitrato de econazol e miconazol

resistiram degradao fotoltica.

ALLEN e ERICKSON (1996) avaliaram a estabilidade do cetoconazol em

lquidos orais (20 mg/ml). Seis frascos foram preparados, sendo que trs foram

armazenados a 5 C e trs a 25 C, todos no escuro. As amostras foram analisadas

por um perodo de 60 dias, utilizando cromatografia lquida de alta eficincia. O

frmaco mostrou ser estvel por 60 dias, armazenado ao abrigo da luz, a 5 C e a

25 C nos lquidos orais analisados.

7/26/2019 000482329

62/224

7/26/2019 000482329

63/224

MATERIAL E MTODOS

7/26/2019 000482329

64/224

Material e mtodos 35

4.1. DESCRIO GERAL

Nome genrico: cetoconazol (Figura 1)

Nome qumico: 1-acetil-4-{4-[2-(2,4-diclorofenil)-2-(1H-imidazolil-1-metil)-

1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina

CAS: 65277-42-1

Frmula qumica: C26H28Cl2N4O4

Massa molecular: 531,43

Faixa de fuso: 148 152 C (USP 28, 2005)

Propriedades fsico-qumicas: p branco ou quase branco. Praticamente

insolvel em gua, parcialmente solvel em lcool, solvel em lcool metlico,

bastante solvel em diclorometano ( REYNOLDS, 1996).

Categoria: antifngico

Classe: imidazol

pKa: 2,9 e 6,5 (FOYE et al., 2002)

4.2. SUBSTNCIA QUMICA DE REFERNCIA (SQR)

Foi utilizado cetoconazol, substncia qumica de referncia, com teor

estimado em 98,8 % e identificado pelo nmero de lote 0100005564, cedido pelo

laboratrio Stiefel (So Paulo, Brasil).

7/26/2019 000482329

65/224

7/26/2019 000482329

66/224

7/26/2019 000482329

67/224


4.3.1.5. Espectrofotometria de absoro na regio do infravermelho

Os espectros foram obtidos, com auxlio de espectrofotmetro de

infravermelho SHIMADZU FTIR, modelo 8001, pesando 1,5 mg de cetoconazol

SQR e cetoconazol matriaprima (Ceto1 e Ceto2), em pastilhas de 150 mg de

brometo de potssio dessecado.

4.3.1.6. Espectrofotometria na regio do ultravioleta

Foram traados espectros de absoro na regio de 200-400 nm, utilizando-se

equipamento SHIMADZU UV-1601 PC, empregando cubetas de quartzo de 1 cm

de percurso ptico. As amostras e o padro foram solubilizados em metanol com

concentrao final de 10 g/ml.

4.3.1.7. Perda por dessecao

Foi dessecado 1 g de cada matria-prima (Ceto1 e Ceto2), em pesa-filtro, em

estufa vcuo, por um perodo de 4 h e com temperatura de 80 C (USP 28, 2005).

4.3.2. Anlise quantitativa da matria-prima

4.3.2.1. Volumetria em meio no-aquoso

Ceto1 e Ceto2 foram quantificadas por volumetria em meio no-aquoso,

segundo USP 28 (2005). Dissolveram-se exatamente cerca de 200 mg de

cetoconazol previamente dessecado, em 40 ml de cido actico glacial. Titulou-se

com cido perclrico 0,1 M SV e o ponto de equivalncia foi determinado

potenciometricamente. Cada ml de cido perclrico 0,1 MSV equivale a 26,57 mg

de C26H28Cl2N4O4. Procedeu-se ensaio em branco.

7/26/2019 000482329

68/224

7/26/2019 000482329

69/224


Dietanolamida de cido graxo de coco 2%

Metilparabeno 0,2 %

Cloreto de sdio 2%

gua qsp

Adicionou-se, mediante agitao, lauril ter sulfato de sdio, dietanolamida

de cido graxo de coco e metilparabeno (solubilizado em lcool etlico) at

obteno de um produto homogneo. Dissolveu-se o cloreto de sdio na gua e

adicionou-se mistura anteriormente obtida. A formulao foi feita com agitao

at obter um produto final homogneo.

4.4.1.2. Preparo do xampu de cetoconazol 2 % (Xb-Ceto)

Pesaram-se 2 g de cetoconazol, seguindo-se a solubilizao do frmaco em

HCl M e adio de 100 ml de xampu base (item 4.4.1.1.). Aps, fez-se a

homogeneizao da formulao, com auxlio de um basto. O pH final do xampu

foi ajustado com NaOHMat 5,5, medido em potencimetro DIGIMED DMPH-2.

A formulao foi preparada ao abrigo da luz.

A formulao utilizada para desenvolvimento e validao dos mtodos, foi

armazenada em frasco plstico opaco, e mantida ao abrigo da luz.

4.4.2. Xampu comercial de cetoconazol 2% (Form1 e Form2)

Foram adquiridas duas formulaes de diferentes indstrias farmacuticas

que foram denominadas Form1 e Form2. As amostras foram escolhidas, pois a

Form1 o medicamento de referncia e a Form2 medicamento genrico. Os

constituintes das formulaes esto descritos abaixo:

7/26/2019 000482329

70/224


Form1

Concentrao: cetoconazol 20 mg/g

Quantidade de xampu no frasco: 100 ml

Frasco de comercializao: branco opaco

Fabricao: abril/03

Validade: abril/05

Obs: conservar protegido da luz

Composio: sulfato sdico de lauril-poliglicol-ter, lauril-poliglicol-ter

sulfosuccinato sdico, dietanolamida de cido lurico, mirstico, palmtico,

esterico e olico, laurdimnio de colgeno hidrolisado, dioleato de macrogol-120

metil glicose, perfume buqu, imiduria, cido clordrico, eritrosina sdica e gua

purificada.

Form2

Concentrao: cetoconazol 20 mg/g

Quantidade de xampu no frasco: 110 ml

Frasco de comercializao: branco opaco

Fabricao: agosto/03

Validade: agosto/05

Obs: conservar protegido da luz

Composio: lauril ter sulfato de sdio, lauril ter sulfosuccinato de

sdio, dietanolamida do cido graxo de coco, trioleato de metil glicose, hidroxi-

propillaurildiamnio de colgeno hidrolisado, cloreto de sdio, imidazolinidil uria,

7/26/2019 000482329

71/224

7/26/2019 000482329

72/224

7/26/2019 000482329

73/224

7/26/2019 000482329

74/224

7/26/2019 000482329

75/224

7/26/2019 000482329

76/224


A. Preparo da soluo de cetoconazol SQR

Foram pesados, analiticamente, 15,0 mg de SQR em balo volumtrico

mbar de 50 ml; adicionaram-se 2 ml de HCl M e completou-se o volume com a

fase mvel.

B. Preparo das solues amostra

Para as trs formulaes avaliadas (Xb-ceto, Form1 e Form2) foram pesados

exatamente cerca de 400 mg de xampu (equivalentes a 8,0 mg de cetoconazol) em

balo volumtrico mbar de 25 ml. Aps, completou-se o volume com a fase mvel,

obtendo-se concentrao de 320 g/ml.

Para a formulao desenvolvida no laboratrio (Xb-ceto), foi necessrio

fazer a correo da densidade, para os clculos de teor, pois a concentrao da

mesma era expressa em mg/ml. Para as formulaes comerciais, a correo no foi

necessria (concentrao mg/g).

C. Clculos

Foram calculadas as reas mdias correspondentes a trs injees, para as

amostras Xb-ceto, Form1, Form2 e para a soluo de SQR. Aps, procedeu-se a

quantificao de cetoconazol em cada formulao, utilizando-se a equao 3:

7/26/2019 000482329

77/224

7/26/2019 000482329

78/224


a 2,2 mg/ml. A essas alquotas foram acrescentados 1,0; 2,0 e 3,0 ml de soluo

estoque de cetoconazol SQR (1,1 mg/ml); aps completou-se o volume com a fase

mvel. As concentraes obtidas foram de 264,0; 308,0; 352,0 g/ml, sendo estas

denominadas R1, R2 e R3, respectivamente.

Para quantificar o teor recuperado de cetoconazol SQR, adicionado nas

solues, procedeu-se o clculo de percentagem recuperada atravs da equao 4

descrita pelo AOAC (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL

CHEMISTS, 1990).

onde: Cf = concentrao encontrada na amostra adicionada da SQR (g/ml)

Ca = concentrao encontrada na amostra no adicionada da SQR (g/ml)

CSQR

= concentrao da SQR adicionada amostra (g/ml)

4.5.2.1.5.5. Robustez

Para a determinao da robustez do mtodo foi avaliada a estabilidade da

soluo e realizados testes com alteraes na fase mvel conforme descrito a seguir.

A.Estabilidade da soluo

Avaliou-se durante trs dias a estabilidade de uma soluo SQR. Para tanto,

preparou-se a soluo, em balo volumtrico mbar, no diluente contendo

300 g/ml de cetoconazol. A soluo foi armazenada temperatura ambiente e foi

analisada no momento do preparo, no segundo e terceiro dias. Calculou-se o desvio

R % = (Cf Ca) .100CSQR Equao 4

7/26/2019 000482329

79/224

7/26/2019 000482329

80/224

7/26/2019 000482329

81/224


Microrganismo: Candida albicans ATCC 10231

Concentrao do inculo: 0,5 %

Soluo diluente inicial: lcool metlico

Soluo diluente final: Soluo tampo fosfato potssio 1 % pH 6,0

Concentrao das solues: 20,0; 100,0; 500 g/ml

Mtodo: Cilindros em placa

Meio de cultura: gar Sabouraud-dextrose 2 %

Tempo de incubao: 18 horas

Temperatura de incubao: 35 2 C

4.5.2.2.1. Material

Foram empregadas placas de Petri (20 mm x 100 mm) e cilindros de ao

inoxidvel (8 mm x 6 mm x 10 mm). Esses materiais, assim como vidraria no

volumtrica, utilizados no ensaio microbiolgico, foram esterilizados em estufa

temperatura de 180 C, durante duas horas.

Aps a execuo do ensaio, a medida dos halos de inibio formados foi feitaem leitor de placas BIOMATIC com auxlio de paqumetro digital STARRET, com

graduao de 0,01 mm.

4.5.2.2.2. Preparo do meio de cultura

No doseamento microbiolgico foi utilizado gar Sabouraud-dextrose 2 %(Merck), para manuteno e repique do microrganismo, assim como para o preparo

7/26/2019 000482329

82/224


da camada base e inculo. O meio de cultura, Sabouraud-dextrose 2 %, foi

preparado atravs de reconstituio do meio dessecado em gua. Fez-se o

aquecimento do meio at total dissoluo e aps esterilizou-se em autoclave a

121 C, durante 15 minutos.

4.5.2.2.3. Preparo da soluo tampo fosfato de potssio 1 % pH 6,0

Dissolveram-se 2 g de fosfato de potssio dibsico e 8 g de fosfato de

potssio monobsico em 1000 ml de gua. Aps procedeu-se a determinao do pH,

com auxlio de potencimetro, e esterilizao em autoclave a 121 C, durante 15

minutos (USP 28, 2005).

4.5.2.2.4. Preparo da soluo salina

Pesou-se 0,9 g de cloreto de sdio e diluiu-se em 100 ml de gua. Aps, fez-

se a esterilizao em autoclave a 121 C, durante 15 minutos.

4.5.2.2.5. Preparo do inculo

O microrganismo foi mantido em refrigerador, em tubo contendo gar

Sabouraud-dextrose 2 % inclinado, e repicado para outro tubo, 48 horas antes do

ensaio, permanecendo temperatura de 25 C. No momento do ensaio, o

microrganismo foi transferido para soluo salina, at obter-se uma suspenso a

25 % 2 % de transmitncia, a 580 nm. A partir desta suspenso, preparou-se o

inculo a 0,5 % em gar Sabouraud-dextrose 2 %, mantido em banho-maria a 47 C

1 C at ser distribudo nas placas.

7/26/2019 000482329

83/224


4.5.2.2.6. Validao

Para a validao do mtodo alguns parmetros foram avaliados:

Linearidade: foram desenvolvidas duas curvas padro, em dias diferentes,

com trs concentraes cada uma. A equao da reta e o coeficiente de correlao

(r) foram calculados.

Preciso: foi avaliada atravs do desvio padro relativo (DPR) obtido na

repetibilidade (mesmo dia) e na preciso intermediria (diferentes dias) das

amostras com a mesma concentrao.

Exatido: avaliada atravs do percentual de recuperao de uma

quantidade conhecida de SQR adicionada amostra.

4.5.2.2.6.1. Preparo das solues de cetoconazol SQR

Foram transferidos 25,0 mg de cetoconazol substncia qumica de referncia,

exatamente pesados, para balo volumtrico mbar de 25 ml. Solubilizou-se em

2 ml de HCl M, e aps adicionaram-se 1,25 g de xampu base (descrito no item

4.4.1.1.), 0,25 ml de polissorbato 80 e 10 ml de lcool metlico. O balo

volumtrico foi agitado durante 20 minutos em agitador mecnico e aps

completou-se o volume com lcool metlico. Aps filtrao com papel de filtro

comum, foram transferidos, analiticamente, 1,0; 1,0 e 5,0 ml da soluo comconcentrao de 1000 g/ml, para bales volumtricos mbar de 50, 10 e 10 ml e

adicionados de soluo tampo fosfato de potssio 1 % pH 6,0, obtendo

concentraes finais de 20,0; 100,0 e 500,0 g/ml (P1, P2 e P3).

7/26/2019 000482329

84/224

7/26/2019 000482329

85/224


4.5.2.2.6.4. Clculos

Os ensaios foram realizados em dois dias, sendo que, em cada dia utilizaram-

se 24 placas, finalizando 48 placas avaliadas. Para efeito de clculo, foram

realizadas mdias de cada 8 placas, totalizando seis resultados mdios que foram

submetidos anlise estatstica.

A reta foi construda plotando no grfico os valores mdios dos halos de

inibio versus o logaritmo da concentrao. A equao da reta foi determinada

atravs do estudo de regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. O ensaio

foi avaliado atravs de anlise de varincia (ANOVA), conforme preconizado pela

F. Bras. IV (1988). A determinao da potncia do cetoconazol na amostra foi

calculada pela equao de HEWITT (1977).

4.5.2.2.6.5. Exatido

A exatido do mtodo foi verificada pela adio de quantidades conhecidas

da SQR na soluo amostra.

Para realizao do ensaio preparou-se uma soluo estoque da SQR,

denominada Soluo estoque 1. Para tanto, foram transferidos 100 mg de

cetoconazol SQR, exatamente pesados, para balo volumtrico mbar de 50 ml.

Solubilizou-se em HCl M, e aps adicionaram-se 5 g de xampu base (descrito no

item 4.4.1.1.), 0,5 ml de polissorbato 80 e 10 ml de lcool metlico. O balo

volumtrico foi agitado durante 20 minutos em agitador mecnico e aps

completou-se o volume com metanol. Procedeu-se filtrao com papel de filtro

comum.A concentrao final obtida foi de 2000 g/ml.

A partir da Soluo estoque 1 fez-se uma nova diluio em metanol,

denominada Soluo estoque 2,obtendo concentrao final de 500 g/ml.

7/26/2019 000482329

86/224


Preparou-se, da mesma forma, uma soluo estoque da amostra. Foram

transferidos 5,0 g de xampu de cetoconazol (descrito no item 4.4.1.2.), exatamente

pesados, para balo volumtrico mbar de 50 ml. Adicionaram-se 0,5 ml de

polissorbato 80 e 10 ml de lcool metlico. O balo volumtrico foi agitado durante

20 minutos em agitador mecnico e aps completou-se o volume com metanol.

Procedeu-se filtrao com papel de filtro comum. A concentrao final obtida foi de

2000 g/ml.

A. Preparo das solues de cetoconazol SQR

Transferiram-se, analiticamente, 1,0; 1,5 e 1,8 ml da Soluo estoque 1

(2000 g/ml), para bales volumtricos mbar de 50, 25 e 10 ml e adicionou-se

soluo tampo fosfato de potssio 1 % pH 6,0, obtendo concentraes finais de

40,0; 120,0 e 360,0 g/ml (P1, P2 e P3).

B. Preparo das solues amostra

Transferiram-se, analiticamente, 1,0; 1,5 e 1,8 ml da soluo estoque amostra

(2000 g/ml), para bales volumtricos mbar de 50, 25 e 10 ml e adicionou-se


40,0; 120,0 e 360,0 g/ml (A1, A2 e A3).

C. Preparo das solues R1, R2 e R3

Transferiram-se, analiticamente, 1,0; 1,5 e 1,8 ml da soluo estoque da

amostra (2000 g/ml) e adicionaram-se 1,0; 1,5 e 1,8 ml da Soluo estoque 2

(500 g/ml), para bales volumtricos mbar de 50, 25 e 10 ml. Aps adicionou-se

7/26/2019 000482329

87/224



50,0; 150,0 e 450,0 g/ml (R1, R2 e R3).

Para quantificar o teor recuperado de cetoconazol SQR adicionado na

soluo amostra, procedeu-se execuo do mtodo sendo utilizadas 15 placas de

Petri, adicionadas, aleatoriamente com 200 l das solues de cetoconazol SQR,

solues amostra e solues R1, R2 e R3.

Com a mdia dos valores de halos de inibio obtidos e com a equao da

reta foi possvel calcular a percentagem recuperada atravs da equao 4 descrita noitem 4.5.2.1.5.4 pela AOAC (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL

CHEMISTS, 1990).

4.6. ESTUDOS DE FOTOESTABILIDADE

4.6.1. Avaliao do cetoconazol frente luz UV-C e luz UV-A

Para avaliao da fotoestabilidade do cetoconazol, amostras contendo o

frmaco foram expostas lmpadaLight express LEUV (254 nm), 30 W (UV-C) e

lmpada Blacklight blue lamp Orion (352 nm) 30 W, 130 V (UV-A). As

lmpadas foram colocadas em cmara, espelhada internamente, com 100 x 16 x 16

cm.

4.6.1.1. Amostras expostas luz UV

A. Matria-prima

Alquotas de 1,0 ml de uma soluo metanlica de cetoconazol 2 % foram

transferidas para vidro de relgio. Aguardou-se at a evaporao total do solvente

orgnico, obtendo a formao de um filme no vidro. As amostras foram colocadas

7/26/2019 000482329

88/224

7/26/2019 000482329

89/224

7/26/2019 000482329

90/224

7/26/2019 000482329

91/224


4.6.2.2. Deteco dos produtos de degradao

As pastilhas de brometo de potssio foram submetidas diretamente anlise

por espectroscopia na regio do infravermelho. A soluo metanlica e as

formulaes de xampu foram avaliadas por cromatografia em camada delgada (item

4.5.1.4.) e cromatografia lquida de alta eficincia (item 4.5.2.1.).

4.6.2.3. Determinao do teor de cetoconazol

Para a determinao do teor do frmaco as amostras (Sol-ceto, Xb-ceto,

Form1 e Form2) foram avaliadas atravs de CLAE (item 4.5.2.1.). As formulaes

de Xb-ceto, expostas luz visvel, por um perodo de 17 meses, foram avaliadas

atravs de ensaio microbiolgico (item 4.5.2.2.) para avaliao da atividade

antifngica do frmaco.

4.6.2.4. Determinao da densidade

Durante os estudos de estabilidade das formulaes fez-se a determinao da

densidade do Xb-ceto, Form1 e Form2, atravs de picnmetro, para observar

possvel modificao na massa do produto. Para tanto, utilizou-se metodologia

descrita no item 4.5.1.2.

4.6.2.5. Determinao do pH

Durante os estudos de estabilidade das formulaes, fez-se a determinao do

pH das formulaes comerciais (Form1 e Form2) e da Xb-ceto, com auxlio de

potencimetro DIGIMED DMPH-2, para verificar possvel alterao no pH das

mesmas.

7/26/2019 000482329

92/224


4.7. ESTABILIDADE QUMICA

4.7.1. Degradao cida

A. Matria-prima

Adicionaram-se a 15,0 mg de cetoconazol (matria-prima) 4 ml de HCl M

em balo volumtrico mbar de 50 ml, aguardouse por 4 horas e aps a soluo foi

neutralizada com 4 ml de NaOHM. Completou-se o volume com a fase mvel. As

amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item 4.5.2.1.).

B. Formas farmacuticas

Para as trs formulaes avaliadas (Xb-ceto, Form1 e Form2) foram pesados,

analiticamente, 400 mg de xampu (equivalentes a 8,0 mg de cetoconazol) em balo

volumtrico mbar de 25 ml. Adicionaram-se 4 ml de HCl M, aguardouse por

4 horas, e aps a soluo foi neutralizada com 4 ml de NaOH M. Completou-se ovolume com a fase mvel. As amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item

4.5.2.1.).

4.7.2. Degradao alcalina

A. Matria-prima

Pesaram-se 15,0 mg de cetoconazol (matria-prima) em balo volumtrico

mbar de 50 ml, solubilizou-se em lcool metlico e a esta soluo foram

adicionados 4 ml de NaOH M. Aguardouse por 4 horas e aps a soluo foi

neutralizada com 4 ml de HCl M. Completou-se o volume com a fase mvel. As

amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item 4.5.2.1.).

7/26/2019 000482329

93/224




analiticamente, 400 mg de xampu (equivalentes a 8,0 mg de cetoconazol) em balo

volumtrico mbar de 25 ml. Adicionaram-se 4 ml de NaOH M, aguardouse por

4 horas, e aps a soluo foi neutralizada com 4 ml de HCl M. Completou-se o

volume com a fase mvel. As amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item

4.5.2.1.).

4.7.3. Degradao com perxido de hidrognio

A. Matria-prima

Pesaram-se 200,0 mg de cetoconazol (matria-prima) em balo volumtrico

mbar de 50 ml, solubilizou-se em lcool metlico e a estes foram adicionados

30 ml de perxido de hidrognio 30 %. Agitou-se durante 30 minutos, e aps

completou-se o volume com perxido de hidrognio. Alquota de 2,0 ml foi

transferida para balo volumtrico mbar de 25 ml e completou-se o volume com a

fase mvel. Fez-se um branco. As amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item

4.5.2.1.), logo aps a preparao e aps 4 horas sob repouso.



analiticamente, 5 g de xampu (equivalentes a 200 mg de cetoconazol) em balo

volumtrico mbar de 50 ml e a estes foram adicionados 30 ml de perxido de

hidrognio 30 %. Agitou-se durante 30 minutos, e aps completou-se o volume com

perxido de hidrognio. Alquotas de 2,0 ml foram transferidas para balo

volumtrico mbar de 25 ml e completou-se o volume com a fase mvel. Fez-se um

7/26/2019 000482329

94/224

7/26/2019 000482329

95/224

7/26/2019 000482329

96/224


de arranjo de diodos SPD-M10A VP, central de controle SCL-10A, desgaseificador

DGU-14A. A fase mvel e as condies cromatogrficas utilizadas na determinao

da pureza das amostras foram as mesmas descritas nos itens 4.5.2.1.3. e 4.5.2.1.4.,

respectivamente.

4.8.1.4. Concentrao das fraes

As fraes foram levadas secura em evaporador rotatrio com temperatura

inferior a 50 C sob presso reduzida. Primeiramente, aguardou-se a evaporao do

metanol e aps fez-se extrao do produto de degradao, em funil de separao,

com auxlio de clorofrmio. O produto de degradao, em maior concentrao na

fase orgnica, foi novamente colocado em evaporador rotatrio para evaporao do

solvente.

Aps, as amostras foram colocadas em dessecador sob vcuo, protegidas da

luz.

4.8.1.5. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear de 1H e 13C

O espectro de RMN de 1H do cetoconazol SQR foi obtido em espectrmetro

BRUKER (200 MHz), utilizando clorofrmio deuterado como solvente. A anlise

foi feita no laboratrio de Ressonncia Magntica Nuclear, Departamento deQumica, Universidade Federal de Santa Maria. O espectro de 13C do cetoconazol

SQR foi obtido em espectrmetro VARIAN (300 MHz), utilizando clorofrmio

deuterado como solvente e tetrametilsilano (TMS) como referncia interna. A

anlise foi feita no laboratrio de Ressonncia Magntica Nuclear, Instituto de

Qumica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Os dois produtos de degradao isolados foram enviados para Facult dePharmacie, Universit Picardie Jules Verne(Amiens - Frana) onde foi realizada a

7/26/2019 000482329

97/224


espectroscopia de RMN de 1H e 13C. Os espectros dos produtos isolados (Fr1 e Fr2)

foram obtidos em espectrmetro BRUKER AMX 500 (500 MHz), utilizando

clorofrmio deuterado como solvente e TMS como referncia interna.

4.8.2. Espectrometria de massas (MS)

Para obteno dos espectros de massas de Fr1, Fr2 e cetoconazol foi utilizada

a cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrometria de massas (LC-

MS).

4.8.2.1. Degradao das amostras

Alquotas de 1,0 ml da soluo metanlica de cetoconazol 2 % foram

acondicionadas em cubetas de plstico descartveis Plastibrand. Fecharam-se as

cubetas, com auxlio de Parafilme colocaram-se as amostras na cmara. O tempo

de exposio lmpada UV-C foi de 30 horas.

4.8.2.2. Equipamento e condies cromatogrficas

As anlises foram realizadas em cromatgrafo a lquido de alta eficincia

SHIMADZU LC-10AD VP, detector de UV SPD-10AV VP e desgaseificador

DGU-14A. A fase mvel foi constituda de metanol-gua-acetato de amnio

(7:3:0,0025, V/V/p). Aps a mistura foi desgaseificada durante 12 minutos, em

banho de ultra-som sob vcuo.

Os parmetros utilizados foram os seguintes: fluxo: 2 ml/min, coluna: Waters

SpherisorbS5 C8 (10 x 250 mm) e comprimento de onda: 225 nm.

7/26/2019 000482329

98/224

7/26/2019 000482329

99/224


Os ensaios foram realizados em So Paulo, em laboratrio conveniado com a

Fundao Instituto de Pesquisas Farmacuticas da Universidade de So Paulo

(USP), sendo o laboratrio habilitado para trabalhar com animais.

O procedimento, a seguir descrito, foi baseado no trabalho desenvolvido por

DRAIZE e colaboradores (1944).

4.9.1.1. Teste de irritao ocular

Este mtodo foi utilizado para avaliar as amostras de xampu (Xb-ceto)

contendo os produtos de degradao. Para tanto avaliaram-se uma formulao com

teor de 103,3 % (amostra no degradada) e uma formulao com teor de 41,4 %

(amostra degradada aps exposio lmpada UV-C).

Utilizaram-se cinco coelhos albinos para cada amostra e as amostras de

xampu foram utilizadas sem diluio.

Para aplicao da amostra a plpebra inferior do olho direito foi

cuidadosamente tracionada, formando o saco conjuntival, onde, com auxlio de uma

seringa, foi aplicado 0,1 ml do xampu. Em seguida as plpebras foram mantidas

unidas por 30 segundos, massageando-se o olho do animal para permitir o contato

uniforme com o produto. O olho esquerdo serviu de controle.

Os efeitos causados conjuntiva, crnea e ris foram observados depois dedecorridas 24, 48, 72 horas e no final do stimo dia, aps aplicao do produto. As

avaliaes das reaes oculares foram baseadas na escala de Draize, onde esto

descriminadas as graduaes atribudas s reaes oculares, como: hiperemia

(superabundncia de sangue), quemose (edema), secreo, irite e opacidade (Tabela

6) (DRAIZE et al., 1944).

Aps as leituras, o valor total de cada animal foi obtido e a mdia dos cincocoelhos, por perodo de leitura, foi calculada, resultando no ndice de irritao

7/26/2019 000482329

100/224

7/26/2019 000482329

101/224

7/26/2019 000482329

102/224


sistema de filtro absoluto e presso positiva. Todo trabalho foi desenvolvido

empregando material esterilizado e tcnicas asspticas.

4.9.2.1.1. Culturas celulares

Foi utilizada a seguinte linhagem celular: NCTC Clone 929, clula de tecido

conjuntivo de camundongo (ATCC CCL-1). A linhagem foi cultivada em meio

mnimo de Eagle, suplementado com 0,1 mMde aminocidos no essenciais, 1 mM

de piruvato de sdio e 10 % de soro fetal bovino, sem antibitico (MEM com 10 %

SFB).

A manuteno da linhagem foi feita a 36 C, em garrafa de 250 ml e repiques

com intervalos mdios de 72 horas. A disperso da monocamada celular foi

efetuada utilizando uma associao de tripsina 0,2 % e versene 0,02 % (ATV).

Aps a disperso, as clulas foram novamente suspensas no meio de cultura e

distribudas, na garrafa destinada manuteno e nas placas de Petri que foramutilizadas para a realizao dos ensaios.

4.9.2.1.2. Mtodo de difuso em gar

As clulas foram semeadas em volumes de 5 ml em placas de Petri (60 x

15 mm), na concentrao de 3 x 105cls/ml. A incubao foi realizada por 48 horas

a 37 C em atmosfera mida contendo 5 % de CO2. Aps este perodo, com a

monocamada de clulas j formada, o meio de cultura foi desprezado e adicionado

volume de 5 ml de overlay, em cada placa de Petri. Este meio composto de partes

iguais de MEM duas vezes concentrado e gar (BBL-Becton Dickinson) a 1,8 %

contendo 0,01 % de vermelho neutro (Merck), como corante vital. No momento do

uso o gar foi fundido e misturado com o MEM, ambos temperatura de 44 1 C.

Discos de 0,5 cm de dimetro, de papel de filtro atxico, foram embebidos na

7/26/2019 000482329

103/224


amostra e posicionados sobre a camada de gar, antes da solidificao completa. As

placas foram incubadas novamente em estufa a 37 C com 5 % de CO2 por 24

horas.

Foram utilizados fragmentos de ltex como controle positivo e discos de

papel atxico como controle negativo. Para a determinao de cada amostra

utilizaram-se quatro placas.

As placas foram observadas macroscpica e microscopicamente e a

citotoxicidade foi constatada pela presena de halo claro ao redor da amostra

testada. Fez-se a determinao do tamanho do halo formado, com auxlio de

paqumetro. A mdia das leituras das quatro placas foi calculada.

A partir das medidas dos halos formados, os ndices de zona (IZ) foram

graduados segundo a USP 28 (2005) (Tabela 8).

Tabela 8 ndice de zona e descrio da reatividade para a avaliao do potencial decitotoxicidade in vitro mtodo de difuso em gar.

ndice de zona (IZ) Descrio da reatividade Classificao

0 ausncia de efeito sob a amostra nenhuma

1 alterao ou degenerao celular sob a amostra fraca

2 halo claro somente sob a amostra leve

3 halo entre 0,5 e 1,0 cm ao redor da amostra moderada

4 halo claro maior que 1,0 cm severaFonte: USP 28, (2005).

7/26/2019 000482329

104/224

RESULTADOS E DISCUSSO

7/26/2019 000482329

105/224

Resultados e discusso 77

5.1. MATRIA-PRIMA

As matrias-primas e a SQR utilizadas no desenvolvimento deste trabalho,

foram armazenadas em recipientes ao abrigo da luz. A manipulao das mesmas

sempre foi realizada em ambiente escuro.

5.1.1. Anlise qualitativa da matria-prima

5.1.1.1. Caractersticas organolpticas

As duas amostras de cetoconazol foram comparadas com a substncia

qumica de referncia. Ambas apresentaram-se como p branco.

5.1.1.2. Determinao do ponto de fuso

Determinou-se o ponto de fuso de Ceto1 e Ceto2, e aps fez-se a

comparao com os dados da literatura.

Para a determinao do ponto de fuso, o equipamento, METTLER

TOLEDO modelo FP90, utiliza trs capilares contendo as amostras. Estes so

aquecidos com faixa de aquecimento definida enquanto os capilares so iluminados,

por uma lmpada, via um tubo de luz. Trs fotossensores medem continuamente a

intensidade da luz transmitida atravs das amostras. Os sensores ficam situados na

parede exterior e transformam a luz transmitida em um sinal eltrico proporcional.

Os valores encontrados para as matrias-primas e a especificao

farmacopica encontram-se na Tabela 9.

7/26/2019 000482329

106/224

7/26/2019 000482329

107/224


5.1.1.4. Cromatografia em camada delgada (CCD)

A cromatografia em camada delgada consiste na separao dos componentes

de uma mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de

adsorvente retido sobre uma superfcie plana (COLLINS et al., 1997). Para o

cetoconazol, o eluente escolhido, preconizado na USP 28 (2005), foi constitudo de

n-hexano, acetato de etila, metanol, gua e cido actico glacial (42:40:15:2:1

V/V/V/V/V).

Aps o desenvolvimento do cromatograma, as placas foram secas e

reveladas. As manchas nas placas (extino de fluorescncia) foram visualizadas

atravs de luz ultravioleta (254 nm), pois o adsorvente da placa estava impregnado

com reagentes fluorescentes. Alm disso, as placas foram expostas a vapores de

iodo em recipiente fechado, onde os compostos orgnicos se tornaram visveis

(manchas marrons).

O resultado obtido demonstrou similaridade das manchas entre amostra e

SQR. O valor de Rf encontrado para Soluo teste 1 e 2, Soluo padroe Soluo

padro diludafoi de 0,33. Nenhuma mancha secundria foi observada.

5.1.1.5. Espectrofotometria de absoro na regio do infravermelho

A radiao no infravermelho corresponde parte do espectro

eletromagntico situada entre as regies do visvel e das microondas. Embora o

espectro no infravermelho seja caracterstico da molcula como um todo, certos

grupos de tomos do origem a bandas que ocorrem mais ou menos na mesma

freqncia, independentemente da estrutura da molcula. justamente a presena

destas bandas caractersticas de grupos que permite, atravs de simples exame do

espectro e consulta a tabelas, a identificao de estruturas (SILVERSTEIN e

WEBSTER, 2000).

7/26/2019 000482329

108/224


As matrias-primas e a SQR apresentaram as mesmas bandas de absoro na

regio do infravermelho, como pode ser observado na Tabela 10, com suas devidas

atribuies. O espectro na regio do infravermelho para o cetoconazol SQR, Ceto1

e Ceto2 encontram-se representados nas Figuras 2, 3 e 4, respectivamente.

%T

90.00 90.00

80.00 80.00

60.00 60.00

40.00 40.00

20.00 20.00

10.00 10.00

4000.0 2000.0 1500.0 1000.0 600.0

Figura 2- Espectro na regio do infravermelho do cetoconazol SQR.

%T

90.00 90.00

80.00 80.00

60.00 60.00

40.00 40.00

20.00 20.00

10.00 10.00

4000.0 2000.0 1500.0 1000.0 600.0

Figura 3- Espectro na regio do infravermelho da matria-prima denominada Ceto1.

7/26/2019 000482329

109/224

7/26/2019 000482329

110/224


5.1.1.6. Espectrofotometria na regio do ultravioleta

Aps a obteno dos espectros de absoro na regio do ultravioleta para

SQR (Figura 5), Ceto1 (Figura 6) e Ceto2 (Figura 7), pde-se observar que as

matrias-primas apresentaram os mximos de absoro nos mesmos comprimentos

de onda que a SQR. Alm disso os espectros obtidos apresentaram o mesmo perfil

de absoro.

Figura 5 Espectro de absoro na regio do ultravioleta para SQR, utilizando equipamentoSHIMADZU UV-1601 PC e cubetas de quartzo de 1 cm de percurso ptico.

Figura 6 Espectro de absoro na regio do ultravioleta para Ceto1, utilizando equipamentoSHIMADZU UV-1601 PC e cubetas de quartzo de 1 cm de percurso ptico.

7/26/2019 000482329

111/224


Figura 7 Espectro de absoro na regio do ultravioleta para Ceto2, utilizando equipamentoSHIMADZU UV-1601 PC e cubetas de quartzo de 1 cm de percurso ptico.

5.1.1.7. Perda por dessecao

Os valores de umidade encontrados foram de 0,008 % para Ceto1 e 0 % paraCeto2. Os valores encontram-se dentro da faixa especificada pela USP 28 (2005)

que deve ser inferior a 0,5 % de umidade.

5.1.2. Anlise quantitativa

5.1.2.1. Volumetria em meio no-aquoso (VMNA)

Ceto1 e Ceto2 foram quantificados por volumetria em meio no-aquoso,

segundo USP 28 (2005). Foram feitas trs determinaes de cada matria-prima. Na

Tabela 11 encontram-se os teores e a especificao farmacopica.

7/26/2019 000482329

112/224


Tabela 11 Valores obtidos na determinao do teor de Ceto1 e Ceto2 atravs de mtodo deVMNA descrito no item 4.3.2.1.

Especificao Farmacopica(%) (USP 28)

Teor (%)Ceto1

Teor (%)Ceto2

99,9 101,1

98,0-102,0 99,9 99,0

100,1 99,7

Mdia 100,0 99,9

DPR 0,1 1,1

Aps as anlises qualitativas e quantitativas das matrias-primas (Ceto1 e 2)

concluiu-se que as mesmas encontravam-se de acordo com as especificaes

farmacopicas (USP 28, 2005).

A matria-prima denominada Ceto1 foi utilizada para o preparo da

formulao (Xb-ceto) que foi utilizada para o desenvolvimento e validao dos dois

mtodos de anlise quantitativa: cromatografia lquida de alta eficincia e ensaio

microbiolgico. A matria-prima Ceto2 foi empregada nos estudos de estabilidade

do frmaco e avaliao da segurana biolgica do xampu de cetoconazol.

5.2. FORMAS FARMACUTICAS

5.2.1. Xampu de cetoconazol 2 % preparado no laboratrio (Xb-Ceto)

Segundo THOMA e KBLER (1997), os excipientes podem influenciar

fortemente a fotoestabilidade de substncias, portanto a escolha da formulao de

Xb-ceto foi feita tentando utilizar o menor nmero de excipientes possveis, para

diminuir a possvel interferncia dos mesmos. Adicionou-se formulao os

excipientes necessrios para o desenvolvimento do xampu.

7/26/2019 000482329

113/224


Como tensoativo para o Xb-ceto, optou-se pelo lauril ter sulfato de sdio

(Figura 8) que um tensoativo aninico. Os mecanismos fsico-qumicos que

caracterizam a detergncia so (WOLF et al., 2001):

diminuio da fora de ligao entre a queratina e as sujidades atravs da

diminuio da tenso superficial, de modo a facilitar a remoo das

partculas,

transferncia da oleosidade para o veculo aquoso,

disperso/suspenso do leo e das partculas de sujidades na espuma.

Figura 8 - Estrutura qumica do lauril ter sulfato de sdio

Como agente estabilizador de espuma foi empregada a dietanolamida de

cido graxo de coco. Algumas vezes estes compostos tambm contribuem para

aumentar a viscosidade do produto final. Para a preparao de xampus comum a

adio de estabilizadores de espuma, pois freqente a associao da detergncia

ao poder de espuma, entretanto estas propriedades nem sempre so concomitantes,

j que existem tensoativos eficazes na detergncia e que possuem fraco poder de

espuma (BOUILLON, 1996).

A viscosidade do Xb-ceto 2 % foi aumentada atravs da adio de cloreto de

sdio, que teve como conseqncia um aumento na resistncia ao movimento.

Adicionou-se, tambm, formulao, metilparabeno que um conservante da

classe dos hidroxibenzoatos. Sua estrutura qumica est representada na Figura 9.

R uma mistura de grupos alquila C12-14 e n = 1 a 4

R-O(CH2CH2O)nCH2CH2-O-SO3-Na+

7/26/2019 000482329

114/224

7/26/2019 000482329

115/224

7/26/2019 000482329

116/224

7/26/2019 000482329

117/224

7/26/2019 000482329

118/224


diclorometano e agitao ocorreu a formao de duas fases, sendo que a substncia

passou em maior parte da fase aquosa para o solvente.

Optou-se pela extrao com trs pores de solvente, apesar de K

(coeficiente de partio) ser grande, uma poro significativa do soluto ficaria

presente em ambas as fases aps uma extrao simples. Sendo assim, fez-se a

extrao do soluto com trs pores de diclorometano; desta forma a extrao foi

praticamente total.

Para as amostras de cetoconazol extradas do xampu, optou-se pelo mesmo

eluente escolhido para a matria-prima (item 4.3.1.4.), pois, aps vrias tentativas, o

melhor resultado foi encontrado com o mesmo.

Aps o desenvolvimento do cromatograma, as placas foram secas e

reveladas. Da mesma forma que para a matria-prima, as manchas nas placas foram

visualizadas atravs de luz ultravioleta (254 nm) e expostas a vapores de iodo em

recipiente fechado.

O resultado obtido (Figura 10) demonstra a similaridade das manchas entre

amostras e padro. O valor de Rf encontrado foi de 0,33. Observou-se uma mancha

secundria na amostra Xb-ceto com Rf de 0,75, sendo a mancha atribuda ao

conservante -metilparabeno- constituinte da formulao, uma vez que foi feito um

branco (formulao sem o cetoconazol) e observou-se a presena da mancha. Para

as outras amostras no foram observadas manchas secundrias.

7/26/2019 000482329

119/224


Figura 10 Representao do cromatograma em camada delgada, utilizando n-hexano, acetato deetila, metanol, gua e cido actico (42:40:15:2:1 V/V/V/V/V) como eluente. Valor de Rf docetoconazol de 0,33. Soluo padro(1), Soluo padro diluda(2), Form1(3), Form2(4),Xb-ceto(5) e Sol-ceto(6)

5.3.2. Anlise quantitativa

No existem metodologias oficiais para o doseamento de cetoconazol em

xampu. Para o desenvolvimento deste trabalho, foi necessrio o desenvolvimento e

a validao de mtodos que tornassem possvel a determinao do teor do frmaconas formulaes, para posterior estudo da estabilidade do mesmo. Para tanto, dois

mtodos foram desenvolvidos e validados: a cromatografia lquida de alta eficincia

e o ensaio microbiolgico.

7/26/2019 000482329

120/224


5.3.2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

A cromatografia lquida de alta eficincia uma tcnica freqentemente

empregada na quantificao de frmacos em formulaes farmacuticas

(WATSON, 1999).

As condies cromatogrficas utilizadas no desenvolvimento e validao do

mtodo por CLAE foram adaptadas de trabalhos descritos na literatura. Algumas

modificaes foram realizadas com o objetivo de otimizar a quantificao do

frmaco na forma farmacutica xampu. A proposta foi desenvolver um mtodo

rpido e sensvel, validando os parmetros que do confiabilidade ao mesmo.

Para a anlise de muitos frmacos empregam-se detectores UV/Vis,

fornecendo assim um mtodo de anlise exato, preciso e robusto. A cromatografia

juntamente com a deteco UV/Vis capaz de monitorar a estabilidade de frmacos

e formulaes, detectando produtos de degradao. Portanto, o mtodo foi escolhido

para determinar o teor do cetoconazol durante o estudo de estabilidade, assim como

a deteco de produtos de degradao formados.

Segundo a USP 28 (2005) para a quantificao do frmaco em suspenso

oral e comprimidos, os comprimentos de onda empregados so 223 e 225 nm,

respectivamente. Optou-se em desenvolver o mtodo em de 225 nm, onde o

frmaco apresenta uma boa absoro.

A partir dos dados relatados na literatura, foram experimentalmente testadasdiferentes composies de fases mveis, variando-se, basicamente, a proporo da

fase orgnica. Sendo assim, optou-se pela seguinte fase mvel:

monoisopropilamina-metanol 2:500 / acetato de amnio-gua 1:200 (7:3).

O acetato de amnio foi utilizado, pois melhorou os parmetros

cromatogrficos do pico relativo ao cetoconazol. O on amnio comporta-se como

cido fraco e a dissoluo de seus sais resulta em solues cidas ou neutras(DISCHER, 1966).

7/26/2019 000482329

121/224

7/26/2019 000482329

122/224

7/26/2019 000482329

123/224

7/26/2019 000482329

124/224


Minutes

0 2 4 6 8

mAU

0

200

400

600

Figura 14- Cromatograma da amostra Form1 (320 g/ml), obtido por CLAE com comprimento deonda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol(2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel.

Minutes

0 2 4 6 8

mAU

0

200

400

600

Figura 15- Cromatograma da amostra Form2 (320 g/ml), obtido por CLAE com comprimento deonda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol(2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel.

7/26/2019 000482329

125/224


5.3.2.1.1. Linearidade

A linearidade de um procedimento analtico a capacidade de obter

resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em anlise. A

linearidade pode ser determinada atravs da elaborao de curvas padro com no

mnimo cinco nveis de concentrao (ICH, 1996b).

Na Tabela 13 esto apresentados os valores das reas obtidas na elaborao

da curva padro, atravs de cromatografia lquida de alta eficincia.

Tabela 13 -Valores das reas obtidas na elaborao da curva padro do cetoconazol por CLAEcom comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 emonoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5como fase mvel.

ConcentraoSQR (g/ml) Dia 1* Dia 2* Dia 3* Mdia DPR

60,0 3605365 3490946 3566009 3554107 1,6

120,0 7095180 6914808 6936409 6982132 1,4

240,0 13754679 13729973 13816348 13767000 0,3

360,0 20659315 20930560 20603896 20731257 0,8

480,0 27409143 27319381 27139266 27289263 0,5*cada valor representa a mdia de trs injees

A Figura 16 indica a representao grfica da curva padro com a sua

respectiva equao da reta, obtida por regresso linear atravs do mtodo dos

mnimos quadrados.

A Tabela 39 (Anexo 1) apresenta os resultados dos tratamentos estatsticos

sobre os valores das reas encontradas na obteno da curva padro por

cromatografia lquida de alta eficincia.

7/26/2019 000482329

126/224


y = 56671x + 183697

r = 0,9999

0,00E+00

5,00E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+072,50E+07

3,00E+07

0 100 200 300 400 500

Concentrao (g/ml)

rea

Figura 16 -Representao grfica da mdia das trs curvas padro de cetoconazol e sua respectiva

equao da reta, obtidas por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fasereversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V)(7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel.

5.3.2.1.2. Preciso

A preciso do mtodo analtico representa o grau de concordncia entre os

resultados de anlises individuais quando o procedimento aplicado repetidamente

a mltiplas alquotas de uma amostra homognea (ICH, 1996b).

Os valores experimentais encontrados na determinao das amostras Xb-

ceto, Form1 e Form2 pelo mtodo de cromatografia lquida de alta eficincia esto

apresentados nas Tabelas 14, 15 e 16, respectivamente.

7/26/2019 000482329

127/224


Tabela 14 Valores experimentais obtidos na determinao de cetoconazol em xampu (Xb-Ceto)por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 emonoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5

como fase mvel.

Dias Teor (mg/ml)* Teor (%)* Mdia (%) DPR

120,1; 19,920,3; 20,020,3; 20,1

100,4; 99,3101,5; 100,1101,3; 100,7

100,6 0,8

220,5; 20,620,6; 20,720,1; 20,7

102,6; 102,8102,9; 103,3100,6; 103,3

102,6 1,0

3

20,6; 20,9

20,9; 21,121,1; 21,1

103,0; 104,6

104,5; 105,3105,3; 105,4

104,7 0,9

Mdia entre dias

102,6

DPR entre dias 0,4*cada valor representa a mdia de trs injees

Tabela 15 Valores experimentais obtidos na determinao de cetoconazol em xampu (Form1)por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 emonoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5como fase mvel.


119,8; 20,120,1; 20,120,0; 20,0

99,1; 100,3100,7; 100,5100,1; 100,0

100,1 0,5

219,3; 19,619,5; 19,519,6; 19,6

96,3; 97,997,7; 97,697,9; 97,8

97,5 0,6

320,0; 20,119,9; 19,920,0; 19,9

100,2; 100,599,3; 99,6

100,2; 99,599,9 0,5

Mdia entre dias

99,2

DPR entre dias 0,3* cada valor representa a mdia de trs injees

7/26/2019 000482329

128/224


Tabela 16 Valores experimentais obtidos na determinao de cetoconazol em xampu (Form2)por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 emonoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5

como fase mvel.


120,4; 20,420,0; 20,320,1; 20,5

101,8; 102,099,8; 101,7

100,6; 102,5101,4 1,0

220,0; 20,120,1; 20,020,3; 20,1

100,2; 100,6100,5; 99,8

101,4; 100,4100,5 0,5

3

20,3; 20,5

20,2; 20,120,2; 20,2

101,7; 102,5

100,8; 100,6101,0; 101,2 101,3 0,7

Mdia entre dias

101,1

DPR entre dias 0,5* cada valor representa a mdia de trs injees

5.3.2.1.3. Especificidade

A especificidade de um mtodo definida como a habilidade de avaliar de

forma inequvoca a substncia de interesse na presena de componentes que

poderiam interferir com a sua determinao numa mistura complexa. Aps a anlise

do cromatograma do Xb (item 4.4.1.1.) verificou-se que os excipientes no

interferem no pico relativo a

000482329

Documents

Transcript of 000482329