Estrutura, fisiologia e bioquímica da pele aplicadas à ciência cosmética.

Alexandre Ferreira

Avaliação de eficácia

Desafios

• Necessidade de novos Apelos

• Busca por novos ativos

– Cosméticos x “Cosmecêuticos”

• Necessidade de pesquisa & desenvolvimento

• Estudos de EFICÁCIA & SEGURANÇA

• Investimento $$$$$

Considerações GeraisDiretriz Estratégica

(Marketing) OBJETIVO Mercado

Cliente Regulamentação

Benefício(valor)

Evidência(Comprovação)

Apelo

• Hidrata

• Reduz Ruga• Energiza• Despigmenta• etc...

Resposta

Biológica

Produto MENSURAR

SIM

NÃO

OBJETIVO

O QUE ESTÁ POR TRÁS DA MENSURAÇÃO!?!?!?!?

Senso Crítico

CONHECIMENTO

Método Sistemático

Impessoal

Apenas Operacional

Como é CRIADO o

conhecimento no Mundo

Moderno????

Melhoria de

Processos

Permeia as

Organizações

Não está restrito à

Pesquisa Básica

Princípio de operação

da Ciência Básica

MÉTODO CIENTÍFICO

Resposta:

Ler MUITO!!!

Método CientíficoObservação

Sistemática

Fenômeno Hipótese

Coerência

Testável

Bibliografia

Teoria

CientíficaPrevisões

Experimentação Resultados

SIM

NÃO

Nova

Hipótese

Validam

Hipótese?

CONHECIMENTOLaboratórios

Aplicação em Processos

Planejar PD(S/C)A

Fazer

Estudar

Agir

• Experimentação

• Teste de novos processos

Oportunidade

• Definição de Hipóteses

• Desenho experimental

• Analise dos Resultados

• Validação da Hipótese

CheckStudy

Implementação de melhorias

SIMNÃO

Nova

Hipótese

Construção do Conhecimento

Conhecimento

Conhecimento

Por Trás do Sim/Não

MENSURAR

SIM NÃO

Falso Negativo

ERROS ACONTECEM!!!!!

Falso Positivo

Impacto na

OrganizaçãoImpacto no Cliente

Não Deixe de

Acreditar

Seja

Desconfiado

A INCERTEZA É INERENTE

DA EXPERIMENTAÇÃO

Prejuízo

SENSO CRÍTICO NA

INTERPRETAÇÃO DO

RESULTADO

Experimentação

• Por natureza é uma atividade artesanal

• Objetivo:

– Mensurar uma resposta e gerar evidências para testar uma hipótese

• Muito dependente do pessoal (equipe)

• Mais diversas fontes de variação

• Como detectar falhas em uma única experimentação??

Não é

possível!!!

Desenvolvimento

mais suscetível

O QUE ESTÁ POR

TRÁS DA

MENSURAÇÃO?

Por trás da Mensuração

MENSURAÇÃO

DESENHO

EXPERIMENTAL

SIGNIFICADO

BIOLÓGICO DO

TESTE E

RESULTADOS METODOLOGIA

ANÁLISE

ESTATISTICA

INCERTEZA

FORMA DE

EXECUÇÃO

ASPECTOS

ÉTICOS

O QUE FOI

MEDIDO?

Escolhendo o Apelo

Mercado

APELODiretriz

Estratégica

FÁCIL

“Reduz Ruga”

“Induz Colágeno”

“Hidrata a pele”

“Revitaliza a pele”

“Induz a regeneração celular”

“Energiza a pele”

DIFÍCIL

Mecanismo

de Ação

Produto

É RELEVANTE???

Mecanismo

biológico

É COMPATÍVEL??

Base Científica

FENÔMENO

BIOLÓGICO

J KE

GI L

M

G

HN

A

B

C

D

E

F

PROCESSO FISIOLÓGICOMECANISMO DE AÇÃO

RESPOSTA

DESEJADA

O que será mensurado?

J KE

GI L

M

GH N

A

B

C

D

E

F PRODUTO

J KE

GI L

M

GH N

A

B

C

D

E

F

APELO

Resposta

Biológica

Medição direta

Redução de Rugas

↑ Colágeno Tipo I

↑ RNA Colágeno Tipo 1

↑ Glicosaminoglicanas

↓ ROS

Medição Indireta Suporta o Apelo???

Método

RE

SP

OS

TA

MÉ

TO

DO

Pessoal Procedimentos

Equipamentos Estrutura física

Pessoal

• Qualificação

• Treinamento

– Validação do treinamento

• Costuma ser uma das maiores fontes de variação dentro de um método

Equipamentos

• $$$$$$$

• Precisão

• Grau de automação

• Qualidade da capacidade de mensuração

• Passível de calibração

• Disponibilidade manutenção

• GRANDE GARGALO PARA MUITOS LABORATÓRIOS

Estrutura Física

• Fluxo de circulação

• Facilidade de limpeza

• Qualidade da rede elétrica

• Qualidade da fonte de água

• Prática de segurança

Procedimento

• Origem

– Normas / Guias

– Artigos científicos

– Desenvolvimento interno

• Aceitação

– Aprovado pela comunidade científica

– De acordo com as teorias vingentes

– Regulamentado

Procedimento

MENSURAÇÃO

MODELO

INDUÇÃOUSO DOS

EQUIPAMENTOS

DOCUMENTAÇÃO

PREPARAÇÃO

DOS REAGENTES

DESENHO

EXPERIMENTAL

ANÁLISE DOS

RESULTADOS

RESULTADO

CONCLUSÃO

ou

????????

Modelo

Animal

In Vitro Humano

Pré-Clínicos Clínicos

Obtenção das Culturas

• Obtenção do explante

• Separação do tecido

• Digestão enzimática

• Cultura em meio seletivo

• Tripsinização diferencial

• Obtenção de culturas puras

Tipos de culturas

Queratinócitos FibroblastosMelanócitos

ATERAÇÃO FISIOLÓGICA

MORTE

MODELO

MULTIPLICAÇÃO

SECREÇÃO

ADIÇÃO DE

AGENTE

INDUTORPRODUTO

Indução & Resposta

RE

SP

OS

TA

Mensuração

J KE

GI L

M

G

HN

A

B

C

D

E

F

PROCESSO FISIOLÓGICO

RESPOSTA

DESEJADA

MENSURAR

SUBJETIVA

OBJETIVA

FORMA

NÃO

PARAMÉTRICA

PARAMÉTRICA

A, B, C, D, E

ESCALA

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

INFLUENCIA FORTEMENTE

O DESEMPENHO DO

MÉTODO

A escolha do Método

Qual método escolher????

RE

SP

OS

TA

MÉTODO a

PERGUNTA

HIPÓTESE

MÉTODO b

MÉTODO c

MÉTODO d

etc...

Relevância

Preço

Desempenho

Parâmetros de desemenho do Método

MÉTODORepetibilidade

Reprodutibilidade

VARIAÇÃO

Exatidão

Seletividade

Robustez

DESEMPENHO

Linearidade

Sensibilidade

Limite de Detecção

Limite de Quantificação

Faixa de Trabalho

CORRELAÇÃO

INCERTEZAPRECISÃO

Parâmetros

Parâmetros Interligados

Repetibilidade

Exatidão

Reprodutibilidade

Seletividade

Linearidade

Sensibilidade

Limite de Detecção

Limite de Quantificação

Faixa de Trabalho

Robustez

PERFORMANCE

Exatidão e PrecisãoExatidão

Precisão

EXATIDÃO:

• Capacidade de entregar o valor verdadeiro

• Desvios do método

• Fácil correção

PRECISÃO:

• Capacidade de repetir o resultado

• Inerente do método

• Difícil correção

Precisão

REPETITIVIDADE

Reprodução do resultado após repetitivos experimentos

REPRODUTIBILIDADE

Reprodução do resultado em laboratórios Distintos

Precisão Intermediária

Reprodução dos resultados dentro de diferentes variáveis

•Técnicos•Equipamentos

•Dias

Estudo de Proficiência

Provedores de ensaios de proficiência

Laboratório 1

Laboratório 2

Laboratório 3

Laboratório n

Validação Treinamento

Validação Equipamento • Coordena atividades

• Oferece amostras de referência• Analisa os dados

ExatidãoFre

quência

Resposta

Resposta Real

X R Y

A incerteza

Método 1 Método 2

Resposta obtida em 1 experimento

Universo de respostas possíveis

Fre

quência

Resposta

Fre

quência

Resposta

Respostas unidimensionais

Linearidade

CorrelaçãoResposta

Estímulo

Sensibilidade

LQ inf.

LD

LQ sup.

Faixa de Trabalho

Seletividade

• Capacidade de discriminar a resposta verdadeira de respostas falsas

• Suscetibilidade a interferentes

• Falso positivo

Método Pouco Seletivo

Método Muito Seletivo

Robustez

• Capacidade de tolerar variações em parâmetros aos quais o método é sujeito

Umidade

Lote Reagentes

pHReagentes

Temperatura

Parâmetros comuns

Alterações na

Rede elétrica

Desenho Experimental

• Garantir obtenção da resposta real

– Definição dos controles

– Necessidade de brancos / Placebo

• Garantir que resultado represente o que seria obtido em uma população

– Número de réplicas

– Aleatorização

• Evitar tendencia

– Estudo mono ou duplo cego

Análise de Resultados

CONCLUSÃO

RESULTADO

NÃO

SIM

TALVEZ

ANÁLISE CRÍTICAGESTÃO

DE RISCOS

Tipos de Distribuição de Dados

Fre

quência

Resposta Resposta

Fre

quência

Normal Não Normal

• Resultados paramétricos

• Médias

• Métodos analíticos

• Resultados não

paramétricos

• Análises sensoriais

Distribuição NormalFre

quência

Resposta

População de nrespostas obtidas

Resposta média

99% 0,5%0,5% 0,01

95% 2,5%2,5% 0,05

p-valor

Intervalo de Confiança

A VariaçãoFre

quência

Resposta

Método 1

Método 2

Resposta Esperada

X R Y

Comparando Dois Resultados

Fre

quência

Resposta

Dado 1Análise Estatística

X R

X = R ou X ≠ R

Teste T de Student

X < R

X > R

Bilateral

Unilateral

X

Dado 2

Dado 2

R2

Analisando Vários Resultados

Fre

quência

Resposta

Dado 1 ANOVA(Análise de Variância)

R1

Dado 2

R2

Apresentação dos resultados

*

Resultado = X ± Y

Valo

r

Resposta

Grupo 1

Grupo 2

Valo

r

Resposta

Amostra 1

Grupo 2

Grupo 3

a

a,b

b

Amostra Resultado

1 5 ± 1 a,b

2 8 ± 2 c

3 6 ± 1 c

4 4 ± 2 a,c

Nível de Significância:5; 1; 0,1%

Melhor se Incerteza

Conclusões

• Não terceirize a responsabilidade

• ANALISE OS RESULTADOS CRITICAMENTE

• Exija apresentação clara dos resultados através de relatório detalhado (caso se trate de uma pesquisa)

• Ensaios – sempre que disponível apenas acreditados

• Fundamental uma análise estatística

Classes de Experimentação

Ensaio Pesquisa

• Controle de qualidade • Desenvolvimento

• POPs • Protocolo + POPs

• Experimentação Única • Múltiplos experimentos

• Sujeito a validação • Não validável

• Rigidez • Flexibilidade

• Sem margem a interpretação

• Com margem a interpretação

• Pessoal treinado na execução

• Pessoal com conhecimento no tema

Garantia da qualidade

Controle de

Qualidade

Pesquisa

Inovadoras

NÃO

Estudo com

Animais

Estudo in vitro

Estudo Clínico

Boas Práticas

Laboratoriais

(BPL)

(Guia)

Boas Práticas

Clínicas

(BPC)

(Guia)

Certificação

Pesq

uis

as

En

saio

s

Acreditação

ISO 17.025SIM

(Norma)

Características Gerais

• Foco na operação (laboratório)

• Estratégia (comercial / Administrativa) não é abordada

– Exceto o que impacta no laboratório

• Estrutura da documentação

• Organização da Equipe

• Fluxo geral de trabalho

• Adequação de parte física laboratorial

ISO 17.025

Laboratório

Equipe

Coordenador

Técnicos

Boas Práticas Laboratoriais

Laboratório Patrocinador

Equipe

Pesquisador Principal

Demais Membros

Boas Práticas Clinicas

Laboratório

CEP

Patrocinador

Sujeito de Pesquisa

Equipe

Pesquisador Principal

Demais Membros

Responsabilidade

Laboratório

Agência Reguladora

Fabricante

ExigênciasDocumentação

Necessidades

Resultados

Órgão de Acreditação

Consumidor

Conflito de Interesse

Laboratório

Fabricante

OBJETIVO Cliente

OBJETIVO Cliente

Pressão

Escolha de um laboratório

• Visite o laboratório

• Quando disponível preferência para contratar laboratórios certificados/acreditados

• Qualifique o laboratório através de uma auditoria

– Sistema de documentação

– Acompanhamento do teste

Medidas Biofísicas

• Medidas da elasticidade da pele

• Medidas da hidratação da pele

• Medidas da oleosidade da pele

• Avaliação clínica do estado da pele

• Diminuição da irregularidade de rugas

Medidas Biofísicas

• Vantagem:

– utiliza como modelo experimental sistema in vivo

• Desvantagem:

– não permite compreender ao nível molecular a ação do produto

Ensaios Moleculares

• Estimulo produção de proteínas de MEC

• Inibição da produção e atividade das MMPs

• Inibição da produção de RL

• Estímulo a proliferação celular

• Entre outros...

Ensaios Moleculares

• Vantagens

– Possível medir parâmetros que não podem ser medidos in vivo

– Podem ser feitos em larga escala

– No geral são altamente reprodutíveis com baixa variabilidade

• Desvantagens

– Geralmente é sistema longe do in vivo

– Necessário, desenvolvimento e domínio de técnicas envolvendo alta tecnologia

Quando usar

• Como teste pré-clínicos de eficácia

• Para a substituição de modelos animais

• Quando o parâmetro não pode ser medido in vivo

• Para prospecção de ativos

Desenvolvimento

• Conhecimento do processo biológico a ser medido.

– Anti-envelhecimento – envelhecimento

– Clareamento cutâneo – melanogêneses

– Proteção Solar – produção de ROS por incidência de UV, danos ao DNA e reposta imunológica associada.

• Identificação do ponto no processo que é o alicerce da resposta biológica de interesse.

• Validação da técnica a ser usada.

Eficácia via tópica

• Não prevê se ele permeia até o local de ação

• Necessário avaliar a entrega do ativo via tópica

• A eficácia de um ativo: in vitro x in vivo

• Determinação de permeação percutânea in vitro

Testes in vitro

• Simular in vitro processos biológicos do envelhecimento

• Medir esses processos

• Avaliar resposta induzida por ativo

• Inferir a eficácia

Uso de Culturas de células e pele

• Usadas para:

– Teste eficácia

– Teste de segurança

• Permitem medir:

– Alterações da fisiologia intra e extra celular

– Indução de morte

Estresse oxidativo

• Determinação da inibição do efeito biológicos de ROS

– Indução de MMPs; morte celular; fatores de transcrição AP1.

• Quantificação do ROS

– Indireto: usando moléculas específica

– Direto: EPR (Electron paramagnetic resonance)

Determinação de No. Células

• Aplicado a culturas

• Indicativo de proliferação, inibição de crescimento e morte

– Contagem de células

– Incorporação de DNA (Timina marcada)

– Exclusão de corantes – Trypan Blue;

– Metabolismo celular – MTT

• Redução de corante pelo metabolismo celular

Danos ao DNA

• Danos oxidativos ou por UV

• Ensaio do cometa

Matriz Extracelular

• Indução ou inibição da produção:

– Proteínas de matriz

– MMPs

– TIMPs

ADIÇÃO DE

AGENTE

INDUTOR

Componentes Matriz Extracelular

• MMPs – atividade enzimática

• Dosagem bioquímicas específicas

• Técnicas imunológicas

– Western Blots

– Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

• Quantificação de mRNA

– Northern blots

– RTPCR

Vias de Sinalização Intracelular

• Fosforilação

• Expressão de proteínas da via

• Translocação citoplasma/núcleo

Determinação Enzimáticas

• Detecção do produto

– Absorção

– Fluorescência

– Luminescência

+

ENZIMA SUBSTRATO PRODUTOS

Determinação Bioquímicas

• Detecção do produto

– Espectroscopia

– Fluorescência

+

COLÁGENO LIGANTE

Western Blot

+ELETROFORESE

-

TRANSFERÊNCIA HIBRIDIZAÇÃO

ANTICORPO

LAVAGEM REVELAÇÃO

ELISALAVAGEM

ANTICORPOREVELAÇÃO

ADIÇÃO DA

AMOSTRA

PLACA

CONTENDO

ANTICORPO

• Leitura

– Absorção

– Fluorescência

– Luminescência

Northern Blot

+ELETROFORESE

-

TRANSFERÊNCIA HIBRIDIZAÇÃO LAVAGEM REVELAÇÃO

SONDA

Imunofluorescência

AGENTE

INDUTOR

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