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Bioquímica e Toxicologia
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA DE FASE REVERSA (CLAE-FR)
Docente: Professora Doutora Ângela Malcata
Gestão da Qualidade, Ambiente e Segurança – 2.º Ano Paulo Jorge Morais Pereira Martelo – n.º 21130 Sara Filipa Vieira Gomes – n.º 21356 07-12-2010
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Índice1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................4
2. METABOLISMOS DO BENZENO, TOLUENO E XILENO..............................................4
2.1. METABOLISMO DO BENZENO..................................................................................4
2.2. METABOLISMO DO TOLUENO..................................................................................5
2.3. METABOLISMO DO XILENO......................................................................................5
3. TÉCNICA INSTRUMENTAL DE ANÁLISE UTILIZADA...................................................6
3.1. DEFINIÇÃO....................................................................................................................6
3.2. SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS CONSTITUINTES DAS AMOSTRAS.............6
3.3. CARACTERÍSTICAS DA CLAE-FR............................................................................8
3.4. INSTRUMENTAÇÃO E EQUIPAMENTO AUXILIAR..............................................13
3.4.1. RESERVATÓRIO DE ELUENTE...........................................................................13
3.4.2. BOMBA......................................................................................................................13
3.4.3. INJECTOR.................................................................................................................13
3.4.4. COLUNA DE SEPARAÇÃO DE FASE REVERSA..............................................13
3.4.5. DETECTOR DE ABSORVÂNCIA NO ULTRAVIOLETA E NO VISÍVEL...........14
3.4.6. AUTO-SAMPLER.....................................................................................................18
4. CONCLUSÕES...................................................................................................................19
5. BIBLIOGRAFIA....................................................................................................................20
5.1. SÍTIOGRAFIA...............................................................................................................20
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Índice de figuras e tabelasFigura 1 - Metabolismo do Benzeno.............................................................................................5Figura 2 - Electronegatividade da molécula da água....................................................................7Figura 3 - Reservatório da fase móvel........................................................................................10Figura 4 - Bomba da alta pressão...............................................................................................11Figura 5 - Válvula de injecção.....................................................................................................11Figura 6 - Coluna cromatográfica de fase reversa......................................................................11Figura 7 - Detector de UV-VIS.....................................................................................................12Figura 8 - Esquematização da sequência das etapas na análise por CLAE-FR.............................12Figura 9 - Classificação das colunas de fase reversa...................................................................14Figura 10 - Célula do detector de UV de comprimento de onda fixo.........................................15Figura 11 - Detector espectrofotométrico de UV-VIS de comprimento de onda variável..........17Figura 12 - Equipamento de CLAE-FR compacto da actualidade................................................17Figura 13 - Pormenor de equipamento de CLAE-FR da actualidade...........................................18Figura 14 - Amostrador automático para CLAE-FR.....................................................................18
Tabela 1 - Características das colunas de fase reversa...............................................................14Tabela 2 - Vantagens/desvantagens da CLAE-FR........................................................................20
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1. INTRODUÇÃONo âmbito das matérias leccionadas na disciplina de Bioquímica e Toxicologia,
foi disponibilizado pela sua Docente um estudo científico, com o título: “Evaluation of
genotoxicity in a group of workers from a petroleum refinery aromatics plant”, e
solicitada a realização de um trabalho em grupo sobre a técnica laboratorial de análise
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa – CLAE-FR) utilizada nesta
investigação científica.
O objectivo do estudo científico em questão foi avaliar os efeitos tóxico-
genéticos resultantes da exposição ocupacional ao Benzeno, Tolueno e Xileno (BTX)
de um grupo de 48 trabalhadores de uma unidade de produtos aromáticos,
pertencente a uma refinaria do Norte de Portugal, tendo-se para o efeito procedido à
recolha de amostras de urinas no final de um dia de trabalho.
As amostras das urinas colhidas foram posteriormente submetidas a análises
quantitativas, pela técnica analítica da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de
Fase Reversa (CLAE-FR) com detector de ultra-violetas (UV), das concentrações dos
ácidos: t,t-mucônico (t,t-MA), hipúrico (HA), e metilhipúrico (MHA), considerados,
respectivamente, indicadores biológicos de exposição sensíveis a baixas
concentrações de Benzeno, Tolueno e Xileno para o organismo humano.
2. METABOLISMOS DO BENZENO, TOLUENO E XILENO
2.1. METABOLISMO DO BENZENOA taxa do metabolismo do Benzeno no corpo humano após a exposição
ocupacional é superior a 50%, sendo a primeira reacção metabólica que ocorre, a sua
transformação em Benzeno-epóxido (BE). Este é sucessivamente transformado em
metabolitos fenólicos que representam cerca de 30% da dose de Benzeno absorvida
(fenol – 15%; quinol – 12%; catecol – 2%; 1,2,4-benzenotriol – 2%). O BE também
reage com a glutationa formando o ácido fenil-premercaptúrico, que transformando-se
no ácido s-fenilmercaptúrico, é eliminado na urina. Apesar do anel aromático do trans-
di-hidro-di-hidroxibenzeno (formado a partir de reacção secundária) ser quimicamente
estável, cerca de 2% acaba por sofrer uma abertura para formar um metabolito de
estrutura linear – o t,t-muconaldeído, que por fim dá origem ao t,t-MA, que também é
eliminado na urina. O valor de referência da concentração do t,t-MA na urina de um
não-fumador é <0,3 mg/g creatinina.
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2.2. METABOLISMO DO TOLUENONo corpo humano o Tolueno é absorvido mais rapidamente através dos
pulmões e, mais lentamente pela pele, sendo detectado em primeiro lugar na corrente
sanguínea e depositando-se em seguida nos tecidos adiposos, ocorrendo que, 20% da
dose do Tolueno absorvida pelo organismo humano é expirada (eliminada) pelo
aparelho respiratório, sem sofrer qualquer alteração. Os restantes 80% da dose do
Tolueno absorvida são metabolizados pelo organismo humano, resultando como
principais metabolitos desse processo o ácido hipúrico, o o-cresol e o ácido benzóico.
2.3. METABOLISMO DO XILENOAs principais vias de absorção (entrada) do Xileno no organismo são em
primeiro lugar as vias respiratórias superiores e, em segundo, a pele. No corpo
humano o processo da metabolização do Xileno absorvido é semelhante ao
mecanismo do metabolismo do Tolueno e, o metabolismo do Xileno tem a sua origem
na oxidação de um grupo metílico, resultando como produto da reacção o ácido
metilbenzóico que por sua vez reage com a glicina dando lugar à formação do ácido
metilhipúrico. Este metabolito que corresponde a 95% da dose do Xileno absorvida é
posteriormente eliminado na urina, verificando-se que uma pequena fracção do Xileno
absorvido é eliminada pelo organismo humano como xilenol.
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Figura 1 - Metabolismo do Benzeno
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3. TÉCNICA INSTRUMENTAL DE ANÁLISE UTILIZADA
3.1. DEFINIÇÃOA cromatografia é uma técnica instrumental de análise química que é utilizada
para realizar a separação das substâncias contidas em misturas complexas,
baseando-se no princípio da adsorção selectiva (que não se deve confundir com
absorção). Esta técnica foi descoberta em 1906 pelo botânico italiano naturalizado
russo, Mikahail Tswett, mas não foi muito utilizada até aos anos 30. Tswett separou
pigmentos de plantas (clorofilas) adicionando um extracto de folhas verdes em éter de
petróleo a uma coluna vertical construída com um tubo de vidro preenchido com
carbonato de cálcio em pó. Enquanto a solução do extracto de folhas verdes percolou
através do interior da coluna as substâncias componentes migraram para baixo com
taxas de velocidades diferentes, e a coluna no final apresentou-se manchada com
gradientes horizontais de cores. A esse gradiente colorido deu-se o nome de
cromatograma.
3.2. SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS CONSTITUINTES DAS AMOSTRASNa técnica instrumental de análise do t,t-MA por CLAE-FR (cromatografia
líquida de alta eficiência de fase reversa) utilizada, uma das maiores dificuldades na
análise de amostras biológicas, é a presença de substâncias que possam ser
confundidas com a própria substância objecto da análise. Para evitar que tal possa
acontecer, é necessário proceder, ou ao isolamento da substância a analisar, ou à
remoção/separação da(s) substância(s) interferente(s) antes de se prosseguir com a
análise, porque até a presença na amostra de outras substâncias bastante diferentes
daquela que se pretende analisar pode afectar negativamente a qualidade dos
resultados analíticos obtidos.
Por esse motivo, muitos métodos analíticos incluem nos seus procedimentos
uma etapa preliminar de separação das substâncias presentes nas amostras a
analisar. Por exemplo, as proteínas são substâncias interferentes presentes
frequentemente em amostras biológicas, que têm de ser separadas (removidas),
utilizando-se para o efeito técnicas como á diálise, ultra filtração e a cromatografia de
permeação em gel. A separação, ou remoção, de substâncias interferentes das
amostras a analisar é na realidade uma importante aplicação dos métodos de
separação nesta técnica instrumental de análise por CLAE-FR e, a título
exemplificativo, a necessidade da realização da quantificação de um determinado
aminoácido numa amostra com a presença de um grupo de outros aminoácidos muito
similares é demonstrativa da complexidade do problema que é necessário ultrapassar.
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Todos os processos de separação dependem primordialmente de algumas
propriedades físicas das substâncias constituintes das amostras, sendo facilmente
reconhecível a facilidade de separar substâncias com propriedades físicas muito
diferentes aplicando-se técnicas simples como a extracção de solvente. No entanto, se
algumas substâncias têm propriedades físicas similares a outras, torna-se essencial
explorar qualquer pequena diferença que possa existir nessas propriedades para se
poder obter a desejada separação entre elas.
Também é verdade que se pode maximizar o efeito de uma pequena diferença
entre as propriedades físicas de substâncias repetindo-se várias vezes a manipulação
no processo de separação, nomeadamente, em extracções de solvente sequenciais,
mas é a polaridade da molécula de uma substância a característica que afecta mais
significativamente as suas propriedades, e em particular, a sua solubilidade e
volatilidade. As moléculas dizem-se polares quando possuem um dipolo, cuja definição
é uma distribuição desigual, ou assimétrica, de electrões numa molécula originada
pelas diferenças das electronegatividades dos átomos que a constituem. Por exemplo,
a água é uma substância polar porque o oxigénio tem uma electronegatividade maior
do que o hidrogénio. Na molécula da água o átomo do oxigénio apodera-se dos dois
electrões dos átomos dos hidrogénios ficando com uma carga eléctrica negativa, e
deixa os átomos dos hidrogénios com uma carga eléctrica positiva (ver figura n.º 2,
seguinte).
Figura 2 - Electronegatividade da molécula da água
Devido à sua natureza iónica, ou polar, a molécula da água tende a ligar-se a
outra formando uma estrutura de treliça estabilizada pelas interacções mútuas destas
forças iónicas. As moléculas de outras substâncias de natureza parcialmente iónica,
ou polar, encaixam-se mais facilmente nessa estrutura de treliça do que as de
natureza apolar, e dissolvem-se na água, mas a força de atracção entre duas
moléculas polares produz outros efeitos além de afectar a solubilidade da substância.
Se uma das substâncias for um sólido a sua ligação a outras substâncias polares é
conhecida como adsorção, sendo a força desta ligação o reflexo directo das
interacções das forças iónicas entre as duas moléculas envolvidas. Nas técnicas
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analíticas envolvendo separação, tais como, cromatografia de gás-líquido,
cromatografia de líquidos e cromatografia de adsorção depende-se em larga escala
das interacções de natureza polar entre moléculas, podendo aproveitar-se ligeiras
diferenças de polaridades existentes entre as moléculas das substâncias para facilitar
a sua separação.
O movimento do analito é um recurso essencial das técnicas de análise que
englobam separação de substâncias, sendo possível definir, em termos gerais, as
intensidades das forças que originam esse deslocamento. Se se aplicar uma força
sobre uma molécula o seu deslocamento será condicionado por uma força contrária de
algum tipo, podendo ser simplesmente o efeito da fricção ao passar por moléculas de
solvente, ou poderá ser o efeito da adsorção numa fase sólida. Nos métodos de
análise com separação de substâncias não é a intensidade inicial da força utilizada
que é importante, mas sim as variações resultantes na força total aplicada nas
diferentes moléculas presentes que proporciona a base para a sua separação
eficiente.
3.3. CARACTERÍSTICAS DA CLAE-FREsta técnica analítica laboratorial requer somente que a amostra a analisar seja
solúvel na fase móvel (líquida). Assim, a CLAE-FR é um método ideal para a
separação e análise de substâncias iónicas ou macro moléculas de interesse biológico
e produtos naturais lábeis, bem como uma imensa variedade de outros compostos de
elevada massa molecular e/ou baixa estabilidade térmica.
A técnica da cromatografia líquida em coluna utiliza uma grande variedade de
materiais adsorventes sólidos aplicados na fase estacionária, nos quais se incluem a
sílica, a alumina e a sílica-gel. Os líquidos utilizados na fase móvel são adsorvidos
selectivamente por estes sólidos adsorventes – num processo designado por
cromatografia de separação – que permite o fabrico de colunas com propriedades
muito diferentes para cada aplicação particular. A Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE, ou HPLC do inglês High Performance Liquid Chromatography), é
uma variante desta técnica que efectua a adsorção selectiva dos líquidos em
partículas sólidas adsorventes extremamente pequenas e uniformes para proporcionar
uma elevada sensibilidade analítica, necessitando de recorrer à utilização de um
reservatório de eluente, uma bomba para transportar o líquido, passando pelo injector
onde é introduzida a amostra também líquida, até à coluna sujeita ou não a controlo da
temperatura, um detector de UV-VIS (ultravioleta-visível) e um integrador (onde é feito
o controlo, aquisição e tratamento dos dados).
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A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de
cromatografia na qual a fase móvel é líquida. Esta fase móvel encontra-se sob pressão
e é forçada a passar através do interior de uma coluna (de vidro com parede espessa
ou metálica) que contém a fase estacionária (sólida). É um processo bastante eficiente
e rápido, podendo a eluição da amostra ser feita, ou com um único solvente, ou com
uma mistura destes. Se durante o processo de eluição a composição do eluente se
mantém constante está-se perante um processo de eluição isocrático, e se a
composição do eluente muda com o decorrer do tempo de eluição está-se perante um
processo de eluição de gradiente em que a composição da fase móvel varia de acordo
com a polaridade dos analitos, sendo necessário recorrer à utilização específica de
uma bomba binária ou quaternária, e de um sistema de programação de gradiente
para se poder obter uma variação contínua da composição do eluente.
A “Força” do solvente é uma designação da capacidade de um determinado
solvente eluir uma amostra, pelo que quanto maior for a força do solvente menor será
o tempo de retenção, ou de chegada, ao detector/quantificador do equipamento. A
introdução da amostra na fase móvel no topo da coluna é sempre uma operação
crítica devido à alta pressão a que o sistema funciona, recorrendo-se para o efeito à
utilização de uma válvula de injecção. Existem numerosas fases estacionárias
disponíveis para CLAE, podendo utilizar-se todas as diversas fases sólidas de
cromatografia de fase líquida em CLAE: adsorção, partição, permuta iónica, exclusão
molecular, incluindo permeação e filtração em gel. No âmbito da cromatografia de
partição há ainda a considerar dois tipos: CLAE de fase normal, e CLAE de fase
reversa. Na Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa (CLAE-FR) a
fase estacionária sólida é apolar. Esta característica é pouco utilizada em
cromatografia “normal”, mas, no entanto, representa mais de 90% das aplicações em
CLAE. Nestas condições da CLAE-FR, as substâncias polares permanecem na fase
móvel líquida (também polar), sendo eluídas antes das substâncias apolares que têm
maior afinidade para a fase estacionária sólida (também apolar). A estrutura da fase
estacionária não polar, ou apolar, é constituída por uma substância ligada a uma
matriz de partículas de sílica, e um bom exemplo de coluna de fase reversa é a
habitual coluna C. Neste tipo de coluna, a uma matriz de suporte está ligado um n-
alcano com 18 átomos de carbono. Este tipo de cromatografia é extremamente
sensível à composição da fase móvel, mas o efeito da variação de fase estacionária
(relativamente ao número de átomos de carbono) na separação das substâncias
constituintes de uma dada mistura é também, assinalável. As fases móveis mais
utilizadas na CLAE-FR são compostas pela água, etanol, isopropanol, acetonitrilo e
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tetrahidrofurano. As pressões das fases móveis utilizadas na CLAE-FR são as mais
elevadas da técnica de CLAE, podendo atingir o valor de 400 bar. Após a separação
efectuada na coluna de fase reversa, as várias substâncias constituintes da amostra
vão passar por um detector/quantificador com tempos de chegada (ou retenção) que
lhes são característicos, uma vez que estes dependem dos seus tipos de interacção
com a fase estacionária. Existem vários tipos de detectores que podem ser utilizados
na CLAE-FR, tais como: Adsorção UV, “Diode Array”, Fluorescência, Índice de
Refracção, Condutividade e Amperometria. No que respeita ao manuseamento de um
equipamento de CLAE-FR existem vários cuidados a observar, nomeadamente: não
exceder a pressão máxima de trabalho que depende das colunas de separação a
utilizar nas análises, utilizar reagentes de pureza elevada (supra-puros), evitar a
formação de bolhas de ar e o surgimento de corrosão.
Genericamente, um equipamento de CLAE-FR é composto pelos seguintes
elementos, pela ordem a seguir apresentada: reservatório de solvente (eluente) da
fase móvel, ligado através de tubagem própria a uma bomba de alta pressão (duplo
pistão) de caudal constante. A bomba encontra-se ligada a uma válvula injectora, que
por sua vez está conectada ao topo da coluna vertical de separação de fase reversa,
com ou sem controlo de temperatura. A base da coluna está ligada ao
detector/quantificador de radiações ultra-violetas (UV), e no fim este dispositivo
comunica com o computador (integrador) do cromatógrafo (ver figuras 3, 4, 5, 6 e 7,
seguintes):
Figura 3 - Reservatório da fase móvel
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Integrador
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Figura 4 - Bomba da alta pressão
Figura 5 - Válvula de injecção
Figura 6 - Coluna cromatográfica de fase reversa
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Integrador
Integrador
Integrador
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Figura 7 - Detector de UV-VIS
A execução da análise quantitativa ou qualitativa de uma amostra na CLAE-FR
compreende as etapas esquematizadas na figura 8, seguinte. Após a injecção do analito, a
separação e a eluição têm lugar no interior da coluna de separação de fase reversa.
Figura 8 - Esquematização da sequência das etapas na análise por CLAE-FR
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Integrador
Espectro da substância analisada
A área dos picos é medida pelo integrador/quantificador e é proporcional
à concentração da amostra
Movimento Interior da coluna de fase reversa
CLAE-FR
Integrador/quantificador dos picos das substâncias
Amostra
Geração de sinais
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3.4. INSTRUMENTAÇÃO E EQUIPAMENTO AUXILIAR
3.4.1. RESERVATÓRIO DE ELUENTEÉ a fonte de eluente (fase móvel). Habitualmente é constituído por 1 até 4
frascos de vidro, conforme a bomba de aspiração é isocrática, binária ou quaternária,
de capacidade compreendida entre 1 a 2 litros. O eluente antes de ser introduzido no
reservatório deve ser desgaseificado e a utilização de uma bomba binária ou
quaternária permite variar a composição do eluente em função da polaridade dos
analitos ao longo da separação cromatográfica.
3.4.2. BOMBAA bomba tem por objectivo movimentar o eluente (fase móvel) e pode-se
apresentar em três versões: isocrática, binária e quaternária. É constituída por dois
pistões com movimentos recíprocos, cuja movimentação alternada permite obter um
fluxo de eluente constante e estável. Apesar do fluxo usado habitualmente ser da
ordem de 0,5 – 4 ml/minuto, as bombas têm capacidade para produzirem fluxos
estáveis no intervalo compreendido entre 0,001 e 10 ml/minuto. Dado o eluente ter de
se movimentar através de uma coluna empacotada com uma fase estacionária sólida,
a bomba tem de trabalhar a pressões elevadas durante períodos prolongados de
tempo. As bombas mais comuns podem atingir pressões máximas de 250 a 300 bar,
estando a pressão de trabalho normalmente compreendida entre 60 – 150 bar.
3.4.3. INJECTORA elevada pressão a que a separação cromatográfica tem lugar faz com que a
injecção da amostra não possa ser efectuada directamente sobre a cabeça da coluna,
tal como acontece na cromatografia em fase gasosa. Para ultrapassar esta dificuldade
criou-se a chamada válvula de injecção, sendo a injecção da amostra feita à
temperatura ambiente e o volume injectado compreendido geralmente entre 1 a 500
µl.
3.4.4. COLUNA DE SEPARAÇÃO DE FASE REVERSANeste tipo de coluna de fase reversa (ou inversa) a fase estacionária é apolar,
pelo que se usa uma fase móvel de elevada polaridade (por exemplo: água, metanol,
acetonitrilo ou tetrahidrofurano). No que respeita ao material utilizado no
empacotamento do seu interior são usados grupos apolares funcionalizados à
superfície da sílica, como por exemplo: octadecil (C18), octil (C8), etil (C2), ciclo-hexil
(CH) e fenil (PH). Quanto à sua dimensão, agrupam-se, em:
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Figura 9 - Classificação das colunas de fase reversa
Tipo de coluna Comprimento Diâmetro interno Fluxo fase móvel
Coluna convencional 10 - 25 cm 4,6 mm 0,5 – 3 ml/minuto
Coluna empacotada de pequeno diâmetro 1 – 10 cm 0,2 – 1 mm 1 – 2 µl/minuto
Coluna capilar empacotada
1 – 100 cm 40 – 80 µm 0,5 – 2 µl/minuto
Coluna tubular aberta 1 – 100 cm 15 – 50 µm <1 µl/minuto
Tabela 1 - Características das colunas de fase reversa
É necessário observar o cuidado de efectuar o condicionamento correcto da
coluna para garantir um equilíbrio perfeito entre a fase estacionária e a fase móvel.
Para colunas novas o período de condicionamento recomendado é de 4 – 8 horas,
para colunas não utilizadas há alguns dias o tempo é de 2 horas e para colunas
utilizadas diariamente, 15 minutos. Quando não são utilizadas, as colunas devem ser
guardadas em solvente orgânico, ou em alternativa, fase móvel.
3.4.5. DETECTOR DE ABSORVÂNCIA NO ULTRAVIOLETA E NO VISÍVEL O princípio do funcionamento de um detector de absorvância no ultravioleta e
no visível baseia-se no fenómeno da absorção de luz por parte da amostra orgânica
quando esta é atravessada por radiação electromagnética, e na medição subsequente
da perda de intensidade da luz transmitida (absorvância) que é proporcional à
concentração da amostra. Normalmente, a absorção ocorre nas regiões dos
ultravioletas e infravermelhos do espectro electromagnético, num dado intervalo de
comprimentos de onda (210-380 nm – UV, e 380-800 nm – VIS), sabendo-se de
antemão, que aproximadamente 90% dos compostos orgânicos absorvem luz nas
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Colunas de fase reversa
Colunas convencionais
Micro colunas
Coluna capilar empacotada
Coluna tubular aberta
Coluna empacotada de pequeno Ø
diâmetro
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regiões dos UV-VIS do espectro electromagnético. Existem dois tipos de detectores de
luz ultravioleta, a distinguir: o detector de comprimento de onda variável
(espectrofotómetro), de aplicação mais vasta e sensível, mas também mais caro, e o
detector fotométrico que mede a intensidade de um ou dois comprimentos de onda
fixos. O detector fotométrico é sensível, económico, e mais do que suficiente para se
conseguirem bons resultados analíticos com todas as substâncias e compostos que
absorvam luz no comprimento de onda cuja intensidade o fotomultiplicador medir. Este
tipo de detector é normalmente insensível a variações de fluxo ou caudal e de
temperatura. A maioria dos detectores de comprimentos de onda fixos disponíveis no
mercado mede dois comprimentos de onda, um de 254 nm e outro de 280 nm,
consequências da absorvância de luz nos 254 nm e da emissão de luz nos 280 nm por
uma substância fosforescente. Em condições óptimas, podem-se atingir sensibilidades
de 0,001 unidades de absorvância e, se o composto ou substância absorver
intensamente na gama dos comprimentos de onda dos UV, é possível detectar
quantidades de substâncias e compostos na ordem dos nanogramas (10-9 g). Quando
se utiliza gradiente na fase móvel da CLAE-FR e esta apresenta variação significativa
de absorvância para os UV, é necessário utilizar a célula como referência para
compensar esta flutuação. Se a fase móvel não absorver ou se a absorvância dos UV
for constante, pode-se deixar a célula, ou vazia, ou cheia com um dos componentes
da fase móvel. A Figura 10, seguinte, mostra a concepção de uma célula para CLAE.
Figura 10 - Célula do detector de UV de comprimento de onda fixo
O detector de comprimento de onda variável de UV-VIS (espectrofotómetro),
capaz de abranger a gama dos 190 aos 800 nm através de um monocromador que
isola o comprimento de onda pretendido do feixe de luz policromático emitido pelas
lâmpadas de deutério (UV) ou tungsténio (VIS), permitindo a sua incidência nas
amostras e a recepção, após a absorvância, pelo fotomultiplicador do dispositivo (ver
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figura 11), apresenta várias vantagens relativamente ao outro detector de comprimento
de onda fixo, tais como:
a) Mede absorvâncias elevadas em várias substâncias ou compostos devido à
selectividade de comprimento de onda e, consequentemente, tem mais
sensibilidade;
b) Permite maior selectividade analítica a partir do momento em que um
determinado comprimento de onda pode ser escolhido, por exemplo, para o
qual o soluto de interesse absorve significativamente e os outros não;
c) Promove a eficiência da eluição por gradiente através da possibilidade de se
seleccionar um comprimento de onda para o qual os componentes da fase
móvel não tenham variação de absorvância para concentrações diferentes;
d) Permite a obtenção do espectro da absorvância de cada substância ou
componente em separado depois de terminar o escoamento da fase móvel.
As execuções de análises em diferentes comprimentos de onda também são
possíveis recorrendo ao uso de detectores espectrofotométricos de UV-VIS providos
de um conjunto de fotodíodos. Estes fotodíodos, selectivos a determinados
comprimentos de onda, e em grande número, cerca de 250, permitem construir o
espectro da substância ou composto durante a eluição. Este detector é denominado,
detector de rede de díodos (díode array detector). Os detectores de rede de díodos
eram, até há alguns anos, pouco sensíveis, mas na actualidade, com a evolução dos
computadores e softwares dedicados a este fim, com o aumento da sensibilidade dos
próprios díodos e, com as correcções das aberrações das redes de difracção,
aumentou-se significativamente a sensibilidade e a aplicabilidade das redes de díodos
nos detectores espectrofotométricos de UV-VIS utilizados nos equipamentos de CLAE-
FR. A figura 11, seguinte, ilustra o princípio do funcionamento de um detector
espectrofotométrico de UV-VIS de comprimento de onda variável.
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Figura 11 - Detector espectrofotométrico de UV-VIS de comprimento de onda variável
Nas figuras 12 e 13, seguintes, apresentam-se imagens de equipamentos
analíticos de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa, da actualidade.
Figura 12 - Equipamento de CLAE-FR compacto da actualidade
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FotomultiplicadorLâmpada de D2 (UV) ou W (VIS)
Isolamento do comprimento
de onda pretendido
Absorvância da luz
Absorvância da luz
Feixe de luz policromático
Linhas de luz monocromática
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Figura 13 - Pormenor de equipamento de CLAE-FR da actualidade
3.4.6. AUTO-SAMPLERNa figura 13, seguinte, apresenta-se uma imagem de um amostrador
automático (auto-sampler) que é um acessório dos cromatógrafos de CLAE-FR actuais
que faz automaticamente as injecções dos analitos das amostras (soluções) nas
válvulas dos injectores dos equipamentos.
Figura 14 - Amostrador automático para CLAE-FR
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4. CONCLUSÕESA técnica laboratorial analítica da CLAE-FR apresenta um elevado potencial de
aplicações, bastante diversificadas, proporcionando bons resultados, quer em análise
qualitativa, quer em análise quantitativa, com desvios na repetibilidade e
reprodutibilidade inferiores a 5%.
A CLAE-FR tem aplicações correntes na análise de substâncias químicas, de
natureza orgânica, nomeadamente: proteínas, ácidos nucleicos, aminoácidos,
corantes, polissacarídeos, pigmentos e metabolitos de plantas, e produtos de origem
farmacêutica.
Relativamente a áreas de aplicação a CLAE-FR é utilizada em diversas
actividades, tais como:
a) Pesquisa química/bioquímica em análises de misturas complexas, purificação
de compostos químicos, desenvolvimento de processos de síntese de produtos
químicos, e isolamento/separação de produtos biológicos naturais com
características benéficas;
b) Controlo de qualidade em análises da pureza de materiais brutos, análises
quantitativas de produtos finais (garantia do cumprimento de especificações), e
análises de avaliação de estabilidade e degradação de produtos;
c) Controlo ambiental em análises dos poluentes do ar e da água, monitorização
de produtos e substâncias perigosas no âmbito da saúde ocupacional, e
monitorização dos níveis agrotóxicos dos solos;
d) Entidades Reguladoras e Fiscalizadoras do Estado em análises de controlo de
medicamentos e alimentos, identificação de narcóticos apreendidos, e de
controlo da conformidade (reclamações de etiquetas).
Na tabela 2, seguinte, apresenta-se um quadro comparativo das vantagens e
desvantagens da CLAE-FR:
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VANTAGENS DA CLAE-FR DESVANTAGENS DA CLAE-FR
A fase estacionária pode utilizar-se várias vezes;Versatilidade: o único requisito é a solubilidade do analito da amostra na fase móvel;Possui alta resolução;Boa aptidão para análise quantitativa e qualitativa;Boa detecção (sensibilidade);Boa aptidão para automatização;Tempos de análise rápidos (1 – 60 minutos).
Custo de aquisição do equipamento elevado;Custos de manutenção do equipamento elevados;Não existir um detector universal com boa detecção (sensibilidade);Complexidade de operação exigindo operadores com formação específica e experiência.
Tabela 2 - Vantagens/desvantagens da CLAE-FR
5. BIBLIOGRAFIATORRES, Joana Roma; TEIXEIRA, João P.; SILVA, Susana; LAFFON, Blanca; CUNHA, Luís M.; MÉNDEZ, Josefina; MAYAN, Olga (2005/2006). “Evaluation of genotoxicity in a group of workers from a petroleum refinery aromatics plant” in ELSEVIER – Available online at www.sciencedirect.com
CORRADINI, Danilo. (2010) Handbook of HPLC, Second edition. Roma: CRC Press
HAZEL, Peck; HOLME, David J. (1998) Analytical biochemistry, Third edition. Harlow: Pearson Education Limited
5.1. SÍTIOGRAFIAhttp://profesionseg.blospot.com/2009/01/tolueno-y-sus-derivados-metabolismo.html acedido em 7 de Novembro, 2010;
http://www.mednet.cl/link.cgi/Medwave/Enfermeria/mar2003/2771 acedido em 6 de Novembro, 2010;
http://www.farmabio.k6.com.br acedido em 16 de Outubro, 2010;
Imagens da CLAE-FR retiradas da internet utilizando-se o motor de busca “Google”.
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