PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIONO CARCINOMA MAMÁRIO

INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE GENE TP53TP53 NO CÂNCER DE MAMA E NAS NO CÂNCER DE MAMA E NAS LESÕES MAMÁRIAS PRÉ-NEOPLÁSICASLESÕES MAMÁRIAS PRÉ-NEOPLÁSICAS

Câncer de MamaCâncer de Mama

Câncer de MamaCâncer de Mama

No mundo: segunda neoplasia maligna

USA: 180 mil novos casos por ano

uma em cada oito mulheres

• Parkin et al, Eur J Cancer 2001.

• National Center for Health Statistics, 1998.

Câncer de Mama no BrasilCâncer de Mama no Brasil

Principal causa de morte por câncer em mulheres

Previsão para o ano de 2003:

– casos novos: 41.610 (46,35/100.000 mulheres)

– óbitos: 9.335 (10,40/100.000 mulheres)• INCA, 2003

Mortalidade por Câncer no Brasil de 1979-Mortalidade por Câncer no Brasil de 1979-20032003

Câncer de Mama no BrasilCâncer de Mama no Brasil

RS: terceiro do país em incidência– 52,2 casos novos/ 100.000 mulheres

RJ: 103,89 /100.000

SP: 78,69/100.000

• INCA, 2003

EtiologiaEtiologia

Etiologia desconhecida

Fatores hereditários = 5%

Vários fatores de risco

Patogênese complexa

Estudos para definição etiológica

Lesões Mamárias Pré-neoplásicasLesões Mamárias Pré-neoplásicas

Precursoras do carcinoma mamário

Modelo de evolução ainda indefinido

alterações genéticas favoráveis

• Syngletary, J Am Coll Surg 2002

Lesões Mamárias Pré-NeoplásicasLesões Mamárias Pré-Neoplásicas

Hiperplasia epitelial típica (risco 2 vezes maior)

Hiperplasia epitelial atípica (risco 5 vezes maior)

Carcinoma in situ (risco 10 vezes maior)

– Page et al, J Natl Cancer Inst 1978; London, JAMA 1992; Dupont, Cancer 1993

PAPILOMAVÍRUS HUMANOPAPILOMAVÍRUS HUMANO

Vírus DNA

Mais de 100 tipos identificados

Tipos são classificados conforme homologia na

seqüência de DNA e associação com lesões

clínicas

• Sisk & Robertson, Front Biosci 2002

PAPILOMAVÍRUS HUMANOPAPILOMAVÍRUS HUMANO

Mucosos: 11, 6, 16, 18, 31, 33, 52

Epidermodisplasia verruciforme: 14, 19, 29, 46

Cutâneos: 1, 63, 60, 65, 41

• zur Hausen & Villiers. Annu Rev Microbiol 1994

Vias de infecçãoVias de infecção

Contato/ Sexual

Transplacentária

Hematogênica

Strauss et al. Sex Trans Infect 2002; Syrjanen &Puranen. Crit Rev Oral Biol Med 2000

Formas de infecçãoFormas de infecção

Latente

Proliferativa

Oncogênica

Ação do HPV na célulaAção do HPV na célula

Lesões benignas - epissomal

Lesões malignas- freqüentemente integrado ao genoma do hospedeiro

Aumento da expressão dos genes E6 e E7

• Wolf & Ramirez, Cancer Invest 2001

Mecanismo oncogênico do HPVMecanismo oncogênico do HPV

E6 - degrada a proteína p53 pela via da ubiquitina

p53: parada do ciclo celular e/ou apoptose sempre que há um dano no DNA

• Farthing & Vousden, Trends in Microbiol 1994

Mecanismo oncogênico do HPVMecanismo oncogênico do HPV

E7 - modifica a estrutura da proteína Rb

pRb = responsável pela manutenção do ciclo celular quiescente.

Acúmulo de mutações genéticas e imortalização celular

Sisk & Robertson, Front Biosci 2002

Papel oncogênico do HPVPapel oncogênico do HPV

Fator causal essencial para o desenvolvimento de neoplasia do colo uterino

Detecção de DNA viral em 99,7% dos casos

• International Agency for Research on Cancer, 2000

Papel oncogênico do HPVPapel oncogênico do HPV

Importante fator de risco para outras neoplasias da região anogenital: 50 %

Câncer anal: incidência de 88 %

• Sturgeon et al. Am J Obstet Gynecol 1996; Frisch et al. N Engl J Med, 1997

HPV e carcinoma mamárioHPV e carcinoma mamário

Presença de DNA do HPV16 em 46% das 38 pacientes com carcinoma mamário e história prévia de NIC III

Possível disseminação hematogênica viral

• Hennig et al. Breast Cancer Res and Treat, 1999

PCRPCR

Processo que inclui três etapas:– Desnaturação

– Anelamento

– Extensão

Amplificação exponencial do fragmento alvo

PCRPCR

Iniciadores ou primers: seqüência conhecida de oligonucleotídeos com 20-25 pares de bases

Primer consenso: MY09/MY11, amplifica L1– amplifica mais de 25 tipos de HPVs– menor sensibilidade do que os primers específicos

Primer específico: amplifica região específica de um determinado HPV (E6)

MetodologiaMetodologia

Análise dos resultados: gel de agarose a 1,5 %

Visualização com luz ultravioleta a partir da incorporação de brometo de etídio

– primers consenso: 450 pares de base (pb)

– primers específicos: 380 pb para HPV16 e 440 bp para HPV 18

– primers ß-globina: 280 bp

ResultadosResultados

101 pacientes com câncer de mama

41 pacientes controles – 21 pacientes com fibroadenoma – 20 pacientes com hiperplasia gordurosa

ResultadosResultados

25 casos de carcinoma positivos (24,75%)– 15 casos (60%): positivos para HPV16– 11 casos (40%): positivos para HPV18

Um dos casos foi positivo para os dois tipos virais

Nenhum caso do grupo controle foi positivo para HPV

Gene Gene TP53TP53

Cromossoma 17p13

Li-Fraumeni

proteína p53: apoptose e/ou parada do ciclo celular

alteração: instabilidade genômica

• Malkin et al, Science 1990; Dickson & Lippman, Diseases of the

Breast 2000.

Polimorfismo do gene Polimorfismo do gene TP53TP53

Aumento de risco para o desenvolvimento de carcinomas

Polimorfismo: ocorrência de múltiplos alelos num lócus, onde pelo menos dois alelos aparecem com freqüências superiores a 1% em determinada população

Polimorfismo do códon 72 do exon 4

Translação de uma Arginina (Arg) ou uma Prolina (Pro) - CGC/ CCC

• Maltlasheweski et al, Mol Cell Biol 1987; Wang et al Int J Mol Med 1999

Alteração estrutural

Mudanças funcionais

Variante Arg mais efetiva na promoção da apoptose

Aumento de susceptibilidade à degradação pela proteína E6 do papilomavírus humano (HPV)

• Maltlasheweski et al, Mol Cell Biol 1987; Dumont et al, Nat Genetics 2003; Thomas et al, Mol Cell Biol 1999.

Variações étnicas e climáticas

Alelo Pro: variações de freqüência de 17 a 63%

Mantido por seleção natural

• Beckman et al, Hum Hered 1994.

Carcinomas associados ao polimorfismo do Carcinomas associados ao polimorfismo do TP53TP53 Aumento de risco para portadores do alelo Pro:

- cabeça e pescoço

- pulmão

Aumento de risco para portadores do alelo Arg:

- bexiga

- pele não-melanoma

• Weston et al, Cancer Epidemiol Biomark Prev 1992; Shen et al Cancer Lett 2002; Soulitzis et al Cancer Lett 2002

Associação mais significativa

HPV: carcinoma de colo de útero

Risco 7 vezes maior de desenvolver carcinoma

Alelo Arg

• Storey et al, Nature 1998

Estudos posteriores com resultados controversos

No Brasil apenas um estudo

Associação de risco importante - Arg– OR: 8,0 (95% CI: 2,3-28,5)– OR: 21,5 (95% CI: 3,4-137, 8)

Variação inter-laboratorial

• Makni et al, Int J Cancer 2000.

Câncer de MamaCâncer de Mama

Sete trabalhos na literatura indexada

Resultados controversos

Tendência de aumento de risco com alelo Pro

• Kawajiri et al, Carcinogenesis 1993; Sjalander et al, Carcinogenesis 1996; Weston et al, Cancer Epidemiol Biomark Prev 1999; Papadakis et al, Mol Cell Biol Res Commun 2000; Keshava et al Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; Langerod et al Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; Suspitsin Int J Cancer 2003; Buyru Oncol Rep 2003.

JustificativasJustificativasAusência de trabalhos que determinem o tipo de polimorfismo da

população brasileira

Primeiro a ser realizado em lesões pré-neoplásicas

Alta incidência de infecção pelo HPV e de carcinoma mamário na nossa região

Estudo prévio: prevalência da infecção pelo HPV de 25% no câncer de mama em nosso meio

OBJETIVOSOBJETIVOS

Objetivo principal

– avaliar a presença do polimorfismo do códon 72 no exon 4 do gene TP53 nas pacientes portadoras de carcinoma mamário e nas pacientes portadoras de lesões mamárias pré-neoplásicas

Objetivos secundários– correlacionar o polimorfismo do gene TP53 com as seguintes variáveis clínico-

patológicas: idade raça antecedentes ginecológicos tipo histológico grau histológico estadiamento tumoral presença de HPV no carcinoma mamário

– comparar o polimorfismo do gene TP53 nas pacientes com câncer com os achados em pacientes com lesões mamárias pré-neoplásicas e controles saudáveis.

Grupo controle

indivíduos doadores do Banco de Sangue da ISCMPA

sexo feminino

randomização pela idade

Amostras Amostras

Veno-punção: pacientes

doação: controles

2 ml sangue total

vacutainer com citrato de sódio

extração do DNA das amostras

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO DE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO DE FRAGMENTOS POLIMÓRFICOSFRAGMENTOS POLIMÓRFICOS

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO

SEPARAÇÃO POR ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

LEITURA EM LUZ U-V

Enzimas de restriçãoEnzimas de restrição

Enzima BstUIProlina não clivada

199 pb

Arginina clivada em 2 fragmentos 113 pb 86 pb