Pacientes portadores de feridas neoplásicas em Serviços de ...
PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIO INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE TP53...
Transcript of PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIO INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE TP53...
PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIONO CARCINOMA MAMÁRIO
INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE GENE TP53TP53 NO CÂNCER DE MAMA E NAS NO CÂNCER DE MAMA E NAS LESÕES MAMÁRIAS PRÉ-NEOPLÁSICASLESÕES MAMÁRIAS PRÉ-NEOPLÁSICAS
Câncer de MamaCâncer de Mama
Câncer de MamaCâncer de Mama
No mundo: segunda neoplasia maligna
USA: 180 mil novos casos por ano
uma em cada oito mulheres
• Parkin et al, Eur J Cancer 2001.
• National Center for Health Statistics, 1998.
Câncer de Mama no BrasilCâncer de Mama no Brasil
Principal causa de morte por câncer em mulheres
Previsão para o ano de 2003:
– casos novos: 41.610 (46,35/100.000 mulheres)
– óbitos: 9.335 (10,40/100.000 mulheres)• INCA, 2003
Mortalidade por Câncer no Brasil de 1979-Mortalidade por Câncer no Brasil de 1979-20032003
Câncer de Mama no BrasilCâncer de Mama no Brasil
RS: terceiro do país em incidência– 52,2 casos novos/ 100.000 mulheres
RJ: 103,89 /100.000
SP: 78,69/100.000
• INCA, 2003
EtiologiaEtiologia
Etiologia desconhecida
Fatores hereditários = 5%
Vários fatores de risco
Patogênese complexa
Estudos para definição etiológica
Lesões Mamárias Pré-neoplásicasLesões Mamárias Pré-neoplásicas
Precursoras do carcinoma mamário
Modelo de evolução ainda indefinido
alterações genéticas favoráveis
• Syngletary, J Am Coll Surg 2002
Lesões Mamárias Pré-NeoplásicasLesões Mamárias Pré-Neoplásicas
Hiperplasia epitelial típica (risco 2 vezes maior)
Hiperplasia epitelial atípica (risco 5 vezes maior)
Carcinoma in situ (risco 10 vezes maior)
– Page et al, J Natl Cancer Inst 1978; London, JAMA 1992; Dupont, Cancer 1993
PAPILOMAVÍRUS HUMANOPAPILOMAVÍRUS HUMANO
Vírus DNA
Mais de 100 tipos identificados
Tipos são classificados conforme homologia na
seqüência de DNA e associação com lesões
clínicas
• Sisk & Robertson, Front Biosci 2002
PAPILOMAVÍRUS HUMANOPAPILOMAVÍRUS HUMANO
Mucosos: 11, 6, 16, 18, 31, 33, 52
Epidermodisplasia verruciforme: 14, 19, 29, 46
Cutâneos: 1, 63, 60, 65, 41
• zur Hausen & Villiers. Annu Rev Microbiol 1994
Vias de infecçãoVias de infecção
Contato/ Sexual
Transplacentária
Hematogênica
Strauss et al. Sex Trans Infect 2002; Syrjanen &Puranen. Crit Rev Oral Biol Med 2000
Formas de infecçãoFormas de infecção
Latente
Proliferativa
Oncogênica
Ação do HPV na célulaAção do HPV na célula
Lesões benignas - epissomal
Lesões malignas- freqüentemente integrado ao genoma do hospedeiro
Aumento da expressão dos genes E6 e E7
• Wolf & Ramirez, Cancer Invest 2001
Mecanismo oncogênico do HPVMecanismo oncogênico do HPV
E6 - degrada a proteína p53 pela via da ubiquitina
p53: parada do ciclo celular e/ou apoptose sempre que há um dano no DNA
• Farthing & Vousden, Trends in Microbiol 1994
Mecanismo oncogênico do HPVMecanismo oncogênico do HPV
E7 - modifica a estrutura da proteína Rb
pRb = responsável pela manutenção do ciclo celular quiescente.
Acúmulo de mutações genéticas e imortalização celular
Sisk & Robertson, Front Biosci 2002
Papel oncogênico do HPVPapel oncogênico do HPV
Fator causal essencial para o desenvolvimento de neoplasia do colo uterino
Detecção de DNA viral em 99,7% dos casos
• International Agency for Research on Cancer, 2000
Papel oncogênico do HPVPapel oncogênico do HPV
Importante fator de risco para outras neoplasias da região anogenital: 50 %
Câncer anal: incidência de 88 %
• Sturgeon et al. Am J Obstet Gynecol 1996; Frisch et al. N Engl J Med, 1997
HPV e carcinoma mamárioHPV e carcinoma mamário
Presença de DNA do HPV16 em 46% das 38 pacientes com carcinoma mamário e história prévia de NIC III
Possível disseminação hematogênica viral
• Hennig et al. Breast Cancer Res and Treat, 1999
PCRPCR
Processo que inclui três etapas:– Desnaturação
– Anelamento
– Extensão
Amplificação exponencial do fragmento alvo
PCRPCR
Iniciadores ou primers: seqüência conhecida de oligonucleotídeos com 20-25 pares de bases
Primer consenso: MY09/MY11, amplifica L1– amplifica mais de 25 tipos de HPVs– menor sensibilidade do que os primers específicos
Primer específico: amplifica região específica de um determinado HPV (E6)
MetodologiaMetodologia
Análise dos resultados: gel de agarose a 1,5 %
Visualização com luz ultravioleta a partir da incorporação de brometo de etídio
– primers consenso: 450 pares de base (pb)
– primers específicos: 380 pb para HPV16 e 440 bp para HPV 18
– primers ß-globina: 280 bp
ResultadosResultados
101 pacientes com câncer de mama
41 pacientes controles – 21 pacientes com fibroadenoma – 20 pacientes com hiperplasia gordurosa
ResultadosResultados
25 casos de carcinoma positivos (24,75%)– 15 casos (60%): positivos para HPV16– 11 casos (40%): positivos para HPV18
Um dos casos foi positivo para os dois tipos virais
Nenhum caso do grupo controle foi positivo para HPV
Gene Gene TP53TP53
Cromossoma 17p13
Li-Fraumeni
proteína p53: apoptose e/ou parada do ciclo celular
alteração: instabilidade genômica
• Malkin et al, Science 1990; Dickson & Lippman, Diseases of the
Breast 2000.
Polimorfismo do gene Polimorfismo do gene TP53TP53
Aumento de risco para o desenvolvimento de carcinomas
Polimorfismo: ocorrência de múltiplos alelos num lócus, onde pelo menos dois alelos aparecem com freqüências superiores a 1% em determinada população
Polimorfismo do códon 72 do exon 4
Translação de uma Arginina (Arg) ou uma Prolina (Pro) - CGC/ CCC
• Maltlasheweski et al, Mol Cell Biol 1987; Wang et al Int J Mol Med 1999
Alteração estrutural
Mudanças funcionais
Variante Arg mais efetiva na promoção da apoptose
Aumento de susceptibilidade à degradação pela proteína E6 do papilomavírus humano (HPV)
• Maltlasheweski et al, Mol Cell Biol 1987; Dumont et al, Nat Genetics 2003; Thomas et al, Mol Cell Biol 1999.
Variações étnicas e climáticas
Alelo Pro: variações de freqüência de 17 a 63%
Mantido por seleção natural
• Beckman et al, Hum Hered 1994.
Carcinomas associados ao polimorfismo do Carcinomas associados ao polimorfismo do TP53TP53 Aumento de risco para portadores do alelo Pro:
- cabeça e pescoço
- pulmão
Aumento de risco para portadores do alelo Arg:
- bexiga
- pele não-melanoma
• Weston et al, Cancer Epidemiol Biomark Prev 1992; Shen et al Cancer Lett 2002; Soulitzis et al Cancer Lett 2002
Associação mais significativa
HPV: carcinoma de colo de útero
Risco 7 vezes maior de desenvolver carcinoma
Alelo Arg
• Storey et al, Nature 1998
Estudos posteriores com resultados controversos
No Brasil apenas um estudo
Associação de risco importante - Arg– OR: 8,0 (95% CI: 2,3-28,5)– OR: 21,5 (95% CI: 3,4-137, 8)
Variação inter-laboratorial
• Makni et al, Int J Cancer 2000.
Câncer de MamaCâncer de Mama
Sete trabalhos na literatura indexada
Resultados controversos
Tendência de aumento de risco com alelo Pro
• Kawajiri et al, Carcinogenesis 1993; Sjalander et al, Carcinogenesis 1996; Weston et al, Cancer Epidemiol Biomark Prev 1999; Papadakis et al, Mol Cell Biol Res Commun 2000; Keshava et al Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; Langerod et al Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; Suspitsin Int J Cancer 2003; Buyru Oncol Rep 2003.
JustificativasJustificativasAusência de trabalhos que determinem o tipo de polimorfismo da
população brasileira
Primeiro a ser realizado em lesões pré-neoplásicas
Alta incidência de infecção pelo HPV e de carcinoma mamário na nossa região
Estudo prévio: prevalência da infecção pelo HPV de 25% no câncer de mama em nosso meio
OBJETIVOSOBJETIVOS
Objetivo principal
– avaliar a presença do polimorfismo do códon 72 no exon 4 do gene TP53 nas pacientes portadoras de carcinoma mamário e nas pacientes portadoras de lesões mamárias pré-neoplásicas
Objetivos secundários– correlacionar o polimorfismo do gene TP53 com as seguintes variáveis clínico-
patológicas: idade raça antecedentes ginecológicos tipo histológico grau histológico estadiamento tumoral presença de HPV no carcinoma mamário
– comparar o polimorfismo do gene TP53 nas pacientes com câncer com os achados em pacientes com lesões mamárias pré-neoplásicas e controles saudáveis.
Grupo controle
indivíduos doadores do Banco de Sangue da ISCMPA
sexo feminino
randomização pela idade
Amostras Amostras
Veno-punção: pacientes
doação: controles
2 ml sangue total
vacutainer com citrato de sódio
extração do DNA das amostras
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO DE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO DE FRAGMENTOS POLIMÓRFICOSFRAGMENTOS POLIMÓRFICOS
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
SEPARAÇÃO POR ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
LEITURA EM LUZ U-V
Enzimas de restriçãoEnzimas de restrição
Enzima BstUIProlina não clivada
199 pb
Arginina clivada em 2 fragmentos 113 pb 86 pb