Modelos experimentais in vitro e in vivo empregados internacionalmente

para desenvolver produtos anticâncer

Raquel Carvalho Montenegro

Laboratório de Citogenética HumanaInstituto de Ciências BiológicasUniversidade Federal do Parárcm.montenegro@gmail.com

24/09/2013Simpósio sobre desenvolvimento de medicamentos oncológicos no Brasil

P&D DE MEDICAMENTOS

• 5.000 a 10.000 compostos estudados para cadamedicamento desenvolvido

• O processo pode durar de 10 a 15 anos!• O custo pode chegar a 800 milhões de dólares!

Alvo terapêutico DescobertaQuímica

MedicinalEstudos in

vitroEstudos in

vivoTestes

clínicos

POR QUE PESQUISAR DE NOVAS DROGAS ANTICÂNCER?

• Segunda causa de morte por doença;• 10 milhões de mortes a cada ano;• 75 milhões de pessoas vivas, anualmente, com câncer.• Responsável por 1 morte por minuto no mundo;

• Mais de 1.560 mortes por dia (EUA);

• No ano 2030:•Esperar 27 milhões de casos incidentes de câncer•17 milhões de mortes por câncer

American Cancer Society, 2012

METÁSTASE FALHA TERAPÊUTICA

CâncerCAUSAS

TOXICIDADE

RESISTÊNCIA TUMORAL

O que fazer?

Onde procurar?

ORIGEM DE NOVOS FÁRMACOS

• Modelagem Molecular

• Síntese Química

• Prospecção de Produtos Naturais

ND, 57 (28%)S, 44 (21%)

S/NM, 38 (9%)N, 27 (13%)

B, 26 (13%)V, 5 (2%)

NB, 1 (0%)

S*, 20 (10%)

S*/NM, 8 (4%)

Síntese Derivado Natural

Natural

Cragg & Newman, 2012. J. Nat. Prod. 75, 311-335

Natural

MiméticoNatural

Farmacóforo/Mimético NaturalFarmacóforo

Natural

BiológicosVacinas

64%

Mercado de Fármacos Antineoplásicos

PESQUISA DE FÁRMACOS ANTICÂNCER

Pré screen em 3 linhagens iniciou em1999. Em seguida em 60 linhagens- Elimina 80% dos

candidatos. Identificado o alvo molecular antes de proceder o teste

Hollow Fiber e Xenográfico (in vivo)- desde de 1998.

TRIAGEM IN VITRO – 3 LINHAGENS

60 LINHAGENSMECANISMO DE

AÇÃOHOLLOW

FIBERMODELOS

XENOGRÁFICOS

DESENHO EXPERIMENTAL

ExtratoFração

Substância Pura

Teste de 3 linhagens tumorais

Ensaio do MTT

MECANISMO DE AÇÃOAlvo molecular

Seletividade

EFICÁCIA:Modelos murinos

Hollow fiberModelos

xenográficos

TOXICIDADE

Fracionamento bioguiado

Identificação dos compostos ativos

PESQUISA DE FÁRMACOS ANTICÂNCER

TRIAGEM IN VITRO – 3 LINHAGENS

60 LINHAGENSMECANISMO DE

AÇÃOHOLLOW

FIBERMODELOS

XENOGRÁFICOS

Concentração única - Determinação do % de inibição em

3 linhagens

Extrato – 50 μg/mL

Fração/sub-fração 25 μg/mL

Substância pura - 5μg/mL ou 10μM

Novo teste para determinação da CI50 (concentração

que causa 50% de inibição)

Rápido

Sensível

Confiável

Seguro

Eficiente

Custo-benefício

EXIGÊNCIAS DE UM TESTE DE CITOXICIDADE IN VITRO:

Princípio: Análise colorimétrica que quantifica indiretamente as células viáveisbaseada na conversão do sal de MTT, um composto de cor amarela, a formazan, decoloração púrpura.

Absorbância em 595nm

3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida

Redutase

mitocondrial

MTT

FORMAZAN

MÉTODO DO MTT

Célula Viável

Célula Morta

DETERMINAÇÃO DA CI50

CI50

Mama (5)HS-578T (Carcinoma)

MCF-7 (Adenocarcinoma)

MDA-MB-231 (Adenocarcinoma)

MDA-MB-435 (Adenocarcinoma)

•MX-1 (Carcinoma)

Pulmão (9)A549 (Adenocarcinoma)

•HOP92 (Cél. Gr&e Indiferenciada)

NCI-H226 (Células esquamosa)

NCI-H23 (Adenocarcinma)

•NCI-H358M (Carcinoma brônquio-alveolar

•SW 1573 (Carcinoma)

•SW 1573-S1 (Modificado)

•SW 1573-2R50 (Modificado)

•SW1573-2R160 (Modificado)Leucemia (4)

HL60 (Promielocítica)

•K-562 (Eritroleucemia-mielóide crônica)

•CCRF-CEM (Linfoblástica aguda)

•MOLT-4 (Linfoblástica aguda)

Próstata (3)PC-3 (Carcinoma)

•DU-145 (Carcinoma)

PC-3/M (Carcinoma)

Cervix (1) HELA (Carcinoma)

Linhagens Celulares

Cólon (8)COLO 205 (Adenocarcinoma)

•HCC 2998 (Adenocarcinoma)

HCT-116 (Carcinoma)

HCT-15 (Adenocarcinoma)

•LOVO (Adenocarinoma)

•WIRD (Adenocarcinoma)

•HCT-8 (Adenocarcinoma)

•SW-620 (Adenocarcinoma)

Melanoma (3)M14 (Melanoma melanótico)

•UACC-257 (Melanoma maligno)

•UACC-62 (Melanoma maligno)

Renal (7)SN12S1 (Carcinoma)

•SN12A1 (Carcinoma)

A704 (Adenocarcinoma)

UO-31 (Carcinoma)

•TK-10 (Carcinoma)

•SN12C (Carcinoma)

•A498 (Carcinoma)

SNC (4)SNB-78 (Astrocytoma)

•SF-295 (Gliobastoma)

SNB-19 (Gliobastoma)

U373 (Glioblastoma)

Linhagens Celulares

Linhagens Celulares

Cólon HCT-116 p53wt

HCT-29 p53mt

Melanoma SK-MEL-19 p53wt BRAFmt RASwt

SK-MEL-28 p53mt BRAFmt RASwt

SK-MEL-103 p53wt BRAFwt RASmt

Gástrico ACP-03 (Adenocarcinoma tipo Intestinal) CMYC amplificado

ACP-02 (Adenocarcinoma tipo Difuso) CMYC amplificado

AGP-01 (Carcinomatose Peritoneal) CMYC amplificado

LINHAGENS CELULARES

Melanoma Mama

PulmãoLeucemia

COSTA-LOTUFO et al. ,2002.

Sangue +

Solução

salina

centrifugação

1500 rpm /

3min

Incubação sob

agitação1 h

centrifugação

1500 rpm /

10min

leitura em

espectrofotômetro

a 450 nm

Adição das

substâncias

Salina

Salina

+

DMSO

Substâncias teste

Triton

X-100

SE 2%

ATIVIDADE HEMOLÍTICAERITRÓCITO DE CAMUNDONGO

VIABILIDADE CELULAR EXCLUSÃO DO AZUL DE TRIPAN

Azul de Tripan

Princípio: O corante azul de tripan permite a distinção individual das células viáveis, queexpulsam o corante de seu espaço interno e das não-viáveis, onde o corante penetratornando-as azuis.

ENSAIO ANTIPROLIFERATIVOINCORPORAÇÃO DO BrdU

Ab 1ºAb

biotinilado

Estreptav-peroxidase

Imunocitoquímica

Células → BrdU → síntese de DNA → desnaturação → revelação

Princípio: A bromodeoxiuridina (BrdU) é uma base nitrogenada análoga à timidina que éincorporada ao DNA das células em proliferação. Este ensaio permite avaliar o efeito dadroga-teste sobre a síntese de DNA . A detecção é feita por imunocitoquímica.

ENSAIO ANTIPROLIFERATIVOINCORPORAÇÃO DO BrdU

COLORAÇÃO DIFERENCIALMAY GRUNWALD GIEMSA

Princípio: O corante May Grünwald Giemsa utilizado para coloração de células é umamistura de corantes (eosina e azul de metileno) com características neutras, que coramos componentes nucleares e citoplasmáticos das células.

May Grunwald Giemsa

COLORAÇÃO DIFERENCIALMAY GRUNWALD GIEMSA

CONTROLES

COMPOSTO 1

COMPOSTO 2

COLORAÇÃO DIFERENCIALLARANJA DE ACRIDINA/BROMETO DE ETÍDIO

Princípio: Este ensaio permite diferenciar células viáveis daquelas em processo demorte por apoptose ou necrose pela marcação diferencial com brometo de etídio eacridina laranja.

Células viáveis Células apoptóticas Células necróticas

MORTE CELULAR

Padrão de Fragmentação do DNA

DNA Ladder

A invasividade das células tumorais representauma das várias propriedade necessárias para aformação de metástase

INVASÃO

CITOMETRIA DE FLUXO

MICROSCOPIA CONFOCAL

INIBIÇÃO DE TOPOISOMERASE

SC-DNATopoisomerase

Inibidor

Análise

• 30 min a 37ºC;

• Parar a reação com SDS 10%;

• Digestão com PK;

• Extração de impureza com

clorofórmio:álcool isoamílico (24:1)

Eletroforese em gel de agarose 1%

Detectar formas ativas e latentes das MMPs e quantificar aatividade enzimática

INIBIÇÃO DE METALOPROTEINASEZIMOGRAFIA

ANÁLISE MOLECULAR

PCR

qPCR:mRNA

MicroRNA

WesternBlot

FISH

TOXICOGENÉTICA:

TESTE DO COMETAMICRONÚCLEO

D0 D3

D6 D9

ESTUDOS IN VIVO: ANGIOGÊNESE

D12 D15

D18 D21

Inibição da angiogênese por uma substância teste administrada por via oral.

(A) Controle: bFGF ( 0.1 g/pelet ) + PMMA

(B) Substância teste: bFGF( 0.1 g/pelet ) + FH (100 g/pelet)

Melanoma B16F10Subcutâneo

Camundongos black (C57Bl6)

Peso

corpóreoSobrevida

ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VIVO

MODELO MURINO

Massa

tumoral

Administração do

fármaco

– Carcinossarcoma 256 de Walker

– Sarcoma 180

– Melanoma B16

– Leucemia L1210

– Carcinoma de Ehrlich

– Carcinoma de Lewis

– Fibro-histiocitoma TEGS

ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VIVO

Implantadas no animal

(SC ou IP)

Legenda:

Hollow Fiber

Células Tumorais

Retirado

cirurgicamente

MTT

595nm

Tratamento com a

substância teste

MODELO HOLLOW FIBER

Células inoculadas

(SC)

Tratamento com a

substância teste

( IP ou VO)

Sobrevida (PS)

calculada

MODELO XENOGRÁFICO

CITOTOXICIDADE

Linhagens Tumorais Humanas:3 linhagens

Célula Normal

SUBSTÂNCIAS

SUBSTÂNCIAS

TRIADAS

Hemólise

Eritrócito de

camundongo

1ª Etapa Dano ao DNA

Viabilidade celular

Análise Morfológica

2ª Etapa

Morte Celular

Proliferação

Diferenciação

Migração /Invasão celular

3ª Etapa

4ª Etapa SUBSTÂNCIA (S) MAIS

PROMSSORA (S)

Via de sinalização

celular

FISH

Western Blot

RT-PCR

Linhagens Tumorais Humanas:60 linhagens

Platymiscium floribundum

O

O

R1

R2O

R3

R4OCH3

H

H

R1 R2 R3 R4

1 H H H OH

2 H CH3 H H

3 H CH3 OCH3 H

4 OH H H H

5 H H H H

Gardênia MilitãoTese de doutorado

Estudos com Platymiscium floribundum

PTEROCARPANOS

2,3,9-TRIMETOXIPTEROCARPANO

Indução de apopotose

4

3

2

O

O

10 9

H3CO

OCH3

H3CO

M1

M2M1

M2

M1

M2M1

M2

Control DMSO

5g/mL2.5g/mL

• Atraso no ciclo celular em G2/M

A B C

D E F

control 2,3,9-trimethoxypterocarpan 3,9-dimethoxypterocarpan

3-hydroxy-9-methoxypterocarpan 3,4-dihydroxy-9-methoxypterocarpan 3,10-dihydroxy-9-methoxypterocarpan

LAMIN B

Figure 6. Confocal laser scanning microscopy (LSM) images of MCF-7 cells. The nuclei inred are evidenced by Propidium Iodate and lamina B in green evidenced by anti-laminaB-FITC. (A) Control cells and (B) cells from the first treatment with compound 1.22/07/2013 65a. Reunião Anual da SBPC

MECANISMO DE AÇÃOMONASTROL

Mayer et al., 1999, Science 286, 971.22/07/2013 65a. Reunião Anual da SBPC

A B

A) Capraria biflora L.;

Capraria biflora L.

O

O

O

Biflorina

CI50:

Células tumorais –

0,43 a 10,11 μg/mL

Linfócitos periféricos –

5,12 μg/mLB) raízes da C. biflora.

BIFLORINA

ANTIOXIDANTE

PROPERTIES

CELL

DIFFERENTIATIO

N

0 10 20 30 40 50 60 700

25

50

75

100

125

Controle Dacarbazina Biflorina Associado

Dias

Sob

revid

a (

%)

0 5 10 15 20 25 300.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

*

***

*

Dias após o implante do tumor

Volu

me

Tu

mora

l (c

c3)

TUMOR GROWTH

SURVIVAL CURVE

APOPTOSIS

INTERACTS

WITH DNA

BLOCKS MYC

AMPLIFICATION

CITOTOXIC TO

CANCER CELLS

BIFLORINA

NATURAL PRODUCTS

DISPLAY SEVERAL ACTIVITIES

Vasconcellos et al. 2005;2007; 2010; 2011; Montenegro et al., 2013

0 10 20 30 40 50 60 700

25

50

75

100

125

Controle Dacarbazina Biflorina Associado

Dias

Sob

revid

a (

%)

BIFLORINA

INCREASE SURVIVAL IN MICE BEARING MELANOMA

BIFLORIN

Su

rva

vil

(%)

Days

Combinatio

n

Dacarbazin

e

Contr

ol

NATURAL PRODUCTS

INVASION ASSAY

BIFLORINA

INHIBITION OF MDA-MB-435 CELLS INVASION IN

VITRO

DMSO 1μM

2.5μM 5μM

1 2.5 5

NATURAL PRODUCTS

C

C

Compound 7

BIFLORINA

DISRUPT CYTOSQUELETON IN VITRO

Compound 7

Compound 7

Compound 7

NATURAL PRODUCTS

N-Cad

β-actina

DMSO B1 B2.5 B5.0

N-cadherin :

increase migration, invasion, and secretion of extracellular proteases in breast tumor cells

N-cadherin, is upregulated in invasive cancer;

N-cadherin expressing cells migrated more efficiently and showed increased invasion of Matrigel;

Gravdal et al., 2007.Christofori, G. NATURE, 2006.

BIFLORINA

DOWN-REGULATES N-CADHERIN

NATURAL PRODUCTS

Gravdal et al., 2007.Christofori, G. NATURE, 2006.

PROPOSED MECHANISM

Primary tumor

E E

EE

E- Cadherin

EEE

N

NN

N-Cadherin

NN

N

X

X

X

BIFLORINA

NATURAL PRODUCTS

Toxicologia de Nanocarreadores em Primatas não-humanos

Cebus apella mantidos em cativeiro no Centro Nacional de Primatas;

- Cinética e Biodistribuição do Nanocarreador

- Toxicologia: Quimioterapia com Paclitaxel e Paclitaxel nanocarreado

• FIGURA 4. 1 Biodistribuição tecidual da nanoemulsão em Cebus apella, através da captação tecidual de [3H]-colesterol livre injetado pela via endovenosa após 24 horas.

719,28

33,23

50,14

177,66 190,27

49,8634,09

15,69

49,85 70,21

9,310,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

Fígado Testículo Rins Baço Suprarenal

Pâncreas Coração Musculo Pulmão Medulaóssea

Cérebro

BIODISTRIBUIÇÃO DA NANOPARTÍCULA

Universidade Federal do Ceará

Letícia V. Costa-Lotufo

Manoel Odorico de Moraes

Cláudia Pessoa

Ana Paula N.N.Alves

Paula Jimenez

Diego Veras

Danilo Rocha

Otília Pessoa

Edilberto Rocha Silveira

Maria Conceição F. Oliveira

Mary Anne Silva Lima

Universidade Federal do Pará

Raquel Carvalho Montenegro

Rommel Mário Rodrigues Burbano

Bruno Soares

Leilane Barreto

Laine Celestino

Gilmara Bastos

Milton Nascimento Silva

Alberto Arruda

Mara Arruda

MUITO OBRIGADA!!!

UNIVERSIDADE

FEDERAL DO PARÁ