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FERNANDA GINANI ANTUNES
EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE CÉLULAS-TRONCO DA
POLPA DE DENTES DECÍDUOS HUMANOS
NATAL, RN
2017
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DE DENTES
DECÍDUOS HUMANOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutora em Patologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
NATAL, RN
2017
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia
Antunes, Fernanda Ginani.
Efeito do laser de baixa intensidade na atividade biológica
de células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos / Fernanda Ginani Antunes. - 2017.
97 f.: il.
Tese (Doutorado em Patologia Oral) - Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de
Pós-graduação em Patologia Oral, Natal, 2017.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.
1. Terapia com luz de baixa intensidade - Tese. 2. Células-
tronco - Tese. 3. Polpa dentária - Tese. 4. Proliferação celular - Tese. 5. Biomateriais - Tese. I. Barboza, Prof. Dr. Carlos
Augusto Galvão. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D21
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“Sabemos como é a vida: num dia dá tudo certo e no outro as coisas já não
são tão perfeitas assim. Altos e baixos fazem parte da construção do nosso
caráter. Afinal, cada momento, cada situação que enfrentamos em nossas
trajetórias é um desafio, uma oportunidade única de aprender, de se tornar
uma pessoa melhor. Só depende de nós, das nossas escolhas...
Não sei se estou perto ou longe demais, se peguei o rumo certo ou errado. Sei
apenas que sigo em frente, vivendo dias iguais de forma diferente. Já não
caminho mais sozinho, levo comigo cada recordação, cada vivência, cada
lição. E, mesmo que tudo não ande da forma que eu gostaria, saber que já
não sou a mesma pessoa de ontem me faz perceber que valeu a pena. Procure
ser uma pessoa de valor, em vez de procurar ser uma pessoa de sucesso. O
sucesso é só consequência”.
Albert Einstein
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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À DEUS, por sempre me mostrar um caminho nos momentos
difíceis, não deixando o desânimo tomar conta, por me mostrar toda
a força, a fé e o potencial existentes em mim e por ter colocado
pessoas tão especiais ao meu lado, sem as quais certamente não
teria chegado tão longe.
À minha mãe Viviani Ginani e minha irmã Amanda
Ginani,por sempre acreditarem na minha capacidade e me
acharem a melhor de todas, mesmo não sendo. Agradeço o apoio,
o amor incondicional eaamizade eterna! #nós3sempre... Serei
eternamente grata por tudo. Amo vocês!!
Ao meu amigo e marido, André Cavalcanti, por estar sempre
ao meu lado, me incentivando e me fazendo acreditar que posso
mais do que imagino. Obrigada pela paciência, por todos os
momentos de alegria, dúvida e conquista compartilhados. Te amo!
Ao meu orientador, amigo para vida, chefe querido,Prof. Dr.
Carlos Augusto Galvão Barboza, palavras não conseguem
traduzir minha gratidão por esses 10 anos de orientação e amizade.
Agradeço por ter acreditado e confiado no meu trabalho desde o
início. Hoje, posso dizer, sem sombra de dúvida, que você foi
fundamental na minha vida, um dos maiores exemplos de
profissional... o grande responsável pelo meu encanto com a
pesquisa científica; obrigada por ter pego na minha mão e me
conduzido de forma segura neste caminho e ter se tornado um
amigo com quem eu posso contar.
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AGRADECIMENTOS
Às minhas amigas, presentes da pós-graduação para a vida, Luciana
Rabêlo, Ruth Medeiros, agradeço pela disposição em ajudar sempre que
precisei (mesmo que reclamassem algumas vezes), por terem aguentado meus
abusos e minhas chatices. Contem sempre com minha amizade... sou a chata
necessária na vida de vocês!
Ao amigo Diego Moura Soares, meu irmão de coração. Obrigada por
estar sempre disposto a me ajudar. Ainda que a distância nos separe, você
estará sempre no meu coração. Nossa amizade e sintonia é eterna.
Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, que abriu as portas
do seu laboratório (Biopol) como se eu fosse um dos seus alunos durante todos
esses anos. Agradeço a oportunidade de tê-lo ao meu lado, ajudando no meu
crescimento profissional e por ter se tornado um amigo.
A todos os colegas do BIOPOL - UFRN, que sempre me receberam de
forma tão gentil no laboratório. Agradeço especialmente a Jailma, Day, Karol,
Rony e Moacir que deixaram mais divertidos meus dias de experimento, e por
sempre estarem dispostos a me ajudar, seja emprestando reagente, a chave
do laboratório ou dividindo a sobremesa para aliviar o estresse.
Aos colegas do laboratório de Cultura de Células - UFRN,
especialmente a bruxa querida do meu coração, Ana Katarina Menezes, pela
disponibilidade em ajudar, pela troca de experiências e por todos os momentos
de descontração vivenciados no laboratório, mesmo quando tudo dava errado.
Chegou a hora da veterana dizer até logo...esse dia tinha que chegar né?!
Sentirei saudades...
Aos colegas da Patologia Oral por todo apoio e paciência com a
biomédica que nunca tinha visto uma lâmina de cistos e tumores
odontogênicos ou de patologias de glândulas salivares na vida. Nos momentos
que pensei em desistir, lembrava do esforço de vocês para que eu não me
sentisse excluída e tive forças para continuar.
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Às Profas. Dra. Lélia Batista de Souza e Dra. Márcia Costa Miguel,
pela participação na banca da qualificação, contribuindo para o aprimoramento
deste trabalho.
Aos Professores do Programa de Doutorado em Patologia Oral, por
todos os ensinamentos e incentivos, que contribuíram para o meu crescimento
acadêmico.
Aos meus amigos da graduação Juliana Alves, Hudson Bezerra,
Jannyce Guedes, Bruno Tardelli, Gabriela Diniz, Hermany Munguba,
Hylarina Diniz, que compartilharam comigo momentos especiais desde o início
da minha jornada pela vida científica.
Aos amigos do grupo de pesquisa em Biologia Crânio-Facial, em
especial Mardem Portela e Haroldo Gurgel, pelas boas energias transmitidas
em todos os momentos e por acreditarem no meu potencial. Aos novatos,
aproveitem todas as oportunidades que surgirem nessa vida meio louca de
cientista. Desejo um lattes com muitos artigos publicados!
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em especial ao
Departamento de Morfologia e ao Departamento de Bioquímica por ter
proporcionado as condições necessárias para a realização deste trabalho e por
serem a extensão da minha casa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pelo suporte financeiro na forma de bolsa de doutorado.
Ao CNPq que financiou a pesquisa através do edital universal.
À toda minha família e amigos, que torceram para o sucesso deste
trabalho e pela compreensão em todos os momentos de ausência.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho, meu sincero agradecimento!
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ALP do inglês alkaline phophatase – fosfatase alcalina
APC Aloficocianina
ASC do inglês adult stem cell– célula-tronco adulta
AsGa Arsênio e Gálio
ATP do inglês adenosine triphosphate – adenosina trifosfato
Ca2+ Cálcio
CD marcador de superfície celular
CFU-C do inglês Colony-forming unit in culture – Unidade de
formação de colônia em cultura
Cm Centímetro
cm2 centímetro ao quadrado
CNPase enzima 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase
CO2 gás carbônico
COL 1 colágeno tipo 1
CTM célula-tronco mesenquimal
DAPI corante fluorescente 4'-6-Diamidino-2-phenylindole
DMF Dimetilformamida
DNA do inglês, Deoxyribonucleic Acid – ácido
desoxirribonucléico
DP desvio-padrão
DPSC do inglês postnatal dental pulp stem cells - células-tronco da
polpa dental
DSSP do inglês dentin sialophosphoprotein – sialofosfoproteína
dentinária
ESC do inglês embrionic stem cell - célula-tronco embrionária
FDA do inglês Food and Drug Administration
FITC Fluorescina isoticianato
g/mol grama por mol
GFAP do inglês glial fibrillary acidic protein – proteína ácida fibrial
gliar
h Hora
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HA/TCP hidroxiapatita associada a fosfatotricálcio
HLA-DR do inglês human leukocyte antigen–DR – antígeno de
leucócitos humanos
IMA Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano
InGaAlP Índio, gálio, alumínio e fósforo
ISCT do inglês International Society for Cellular Therapy –
Sociedade Internacional de Terapia Celular
J/cm2 joule por centímetro ao quadrado
kV quilovolt, medida de tensão elétrica
LADISPO Laboratório de Dispositivos Poliméricos
LBI laser de baixa intensidade
MEC matriz extracelular
MEM do inglês minimum essential media– meio essencial mínimo
mg/mL miligrama por mililitro
mL Mililitro
mM Milimolar
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio
mW Miliwatt
NeuN do inglês neuronal nuclear antigen – antígeno nuclear
neuronal
NF-ĸB do inglês nuclear transcription factor kappa B - Factor
Nuclear Kappa β
NFM Neurofilamento M
NIR do inglês near infrared – próximo ao infravermelho
nm Nanômetro
NO do inglês nitric oxide – óxido nítrico
P1 primeiro subcultivo
P2 segundo subcultivo
P3 terceiro subcultivo
P4 quarto subcultivo
PBS do inglês Phosphate-Buffered saline – solução salina
tamponada com sais de fosfato
PDLSC do inglês periodontal ligament stem cells – células-tronco do
ligamento periodontal
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PE Ficoeritrina
PEO do inglês polyethylene oxide - óxido de polietileno
pH potencial de hidrogênio iônico
PI iodeto de propídeo
PLA do inglês Poly(lactic acid) – ácido polilático
PVA do inglês Poly(vinyl alcohol)- Poli(Álcool Vinílico)
RNA do inglês ribonucleic acid – ácido ribonucléico
ROS do inglês reactive oxigen species – espécies reativas de
oxigênio
s Segundos
SFB soro fetal bovino
SHED do inglês stem cells from human exfoliated teeth - células-
tronco da polpa de dentes decíduos humanos esfoliados
T0 momento imediato após a primeira irradiação
T24 intervalo de tempo de 24 horas após a primeira irradiação
T48 intervalo de tempo de 48 horas após a primeira irradiação
T72 intervalo de tempo de 72 horas após a primeira irradiação
UI/mL unidades internacionais por mililitro
µg/mL micrograma por mililitro
µL Microlitro
µm Micrometro
ºC grau Celsius
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RESUMO
O laser de baixa intensidade (LBI) tem apresentado resultados positivos na
proliferação de diversos tipos celulares in vitro. A primeira parte do trabalho
avaliou o efeito do LBI na proliferação e viabilidade de células-tronco da polpa
de dentes decíduos humanos esfoliados (SHED). As células foram irradiadas
ou não (controle) com um laser diodo InGaAlP (660 nm, 30 mW, modo de ação
contínuo) usando duas diferentes doses (0,5 J/cm2 por 16 segundos e 1,0
J/cm2 por 33 segundos) e os três grupos foram estudados nos intervalos de 0,
24, 48 e 72 h. Foi observado que a dose de 1,0 J/cm2 promoveu um aumento
na proliferação celular nos intervalos de 48 e 72 h quando comparada ao grupo
controle e à dose de 0,5 J/cm2 e a viabilidade celular não foi afetada pela
irradiação ao longo do experimento. Em conjunto, os dados mostraram que os
parâmetros do LBI utilizados (660 nm, 30 mW, 1,0 J/cm2) promoveram
proliferação das SHEDs e mantiveram a sua viabilidade. A partir destes
resultados favoráveis, a segunda parte do trabalho avaliou o efeito do LBI com
os mesmos parâmetros na proliferação de SHEDs cultivadas sobre arcabouços
nanofibrosos de PLA confeccionados pela técnica de eletrofiação. Este
procedimento permite a obtenção de arcabouços tridimensionais que simulam
a matriz extracelular a partir de um biomaterial com propriedades físicas
favoráveis e baixo custo. Três grupos experimentais (G1 – não irradiado; G2 –
irradiado com 0,5 J/cm2; G3 – irradiado com 1,0 J/cm2) foram analisados nos
intervalos de 24, 48 e 72 h. Os resultados indicaram que o PLA não é citotóxico
para as SHEDs e que os grupos submetidos à laserterapia tiveram maior
proliferação celular quando comparados com o grupo controle não irradiado.
Com base nos achados, evidenciou-se que as nanofibras de PLA são
arcabouços favoráveis para o cultivo de SHEDs e que a laserterapia estimulou
a proliferação quando aplicada nas células cultivadas sobre este arcabouço.
Com base nos dados gerais obtidos, conclui-se que a laserterapia nos
parâmetros avaliados apresenta efeitos bioestimulatórios nas SHEDs
cultivadas tanto na superfície padrão (plástico da placa de cultivo) quanto sobre
arcabouços nanoestruturados de PLA.
Palavras-chave: laserterapia; células-tronco; polpa dentária; proliferação
celular; biomateriais; polímeros; eletrofiação.
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ABSTRACT
The low-level laser therapy (LLLT) has been shown positive results in the in
vitro proliferation of several cell types. The first part of the study evaluated the
effect of LLLT on the proliferation and viability of stem cells from human
exfoliated deciduous teeth (SHED).Cells were irradiated or not (control) with an
InGaAlP diode laser (660 nm, 30 mW, continuous action mode) using two
different doses (0.5 J/cm2 for 16 seconds and 1.0 J/cm2 for 33 seconds) and the
three groups were analyzed at the intervals of 0, 24, 48 and 72 h.It was
observed that the dose of 1.0 J/cm2 promoted an increase in cell proliferation at
the 48 and 72 h intervals when compared to the control group and the dose of
0.5 J/cm2, and that cell viability was not affected by irradiation throughout the
experiment. Taken together, the data showed that the LLLT parameters (660
nm, 30 mW, 1.0 J/cm2) promoted proliferation of SHEDs and maintained their
viability. Based on these favorable results, the second part of the study
evaluated the effect of LLLT with the same parameters on the proliferation of
SHEDs cultured on PLA nanofibrous scaffolds obtained by electrospinning. This
procedure allows obtaining three-dimensional scaffolds that mimic the
extracellular matrix from a biomaterial with favorable physical properties and
low cost.Three experimental groups (G1 - non-irradiated; G2 - irradiated with
0.5 J/cm2; G3 - irradiated with 1.0 J/cm2) were analyzed at 24, 48 and 72 h. The
results indicated that PLA is not cytotoxic to SHEDs and that the groups
submitted to laser therapy had higher cell growth when compared to the non-
irradiated control group. Based on these findings, it was shown that PLA
nanofibers are favorable scaffolds for the cultivation of SHEDs and that laser
therapy stimulated the proliferation when applied to the cells cultured on this
scaffold. Based on the general data obtained, it is concluded that the laser
therapy in the evaluated parameters has biostimulatory effects on the
proliferation of SHEDs on both the standard surface (plastic of the culture plate)
and on nanostructured PLA scaffolds.
Palavras-chave: laser therapy; stem cells; dental pulp; cell proliferation;
biomaterials; polymers; electrospinning.
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SUMÁRIO
1 REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................... 14
1.1 Células-tronco......................................................................................... 14
1.1.1 Célula-tronco da polpa de dente decíduo humano ........................ 15
1.2 Laser e laserterapia ............................................................................... 18
1.2.1 Mecanismo de ação do laser de baixa intensidade ............................ 20
1.2.2 Ação do LBI nas células em cultivo ............................................... 24
1.3 Engenharia tecidual ............................................................................... 28
1.3.1 Ácido Polilático (PLA) ......................................................................... 30
1.3.2 Eletrofiação .................................................................................... 32
2 OBJETIVOS ............................................................................................. 34 3 ARTIGO I .................................................................................................. 35 4 ARTIGO II ................................................................................................. 56 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................... 75
6 REFERÊNCIAS ........................................................................................ 76
ANEXO ........................................................................................................ 93
14
1. REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 Células-tronco
A manutenção do número de células, da matriz extracelular, da
arquitetura e da função dos órgãos ocorre devido à renovação celular que
depende, basicamente, da existência de células com capacidade de auto-
renovação e de diferenciação que são denominadas células pluripotentes,
multipotentes, células de reserva ou células-tronco (PERES, CURI, 2005;
ZAGO, COVAS, 2006).
As células-tronco são definidas como células indiferenciadas que,
quando induzidas corretamente, apresentam grande capacidade de auto-
renovação e de diferenciação em tipos celulares especializados (BARRY, 2003;
HOFFMAN, CARPENTER, 2005; FRESHNEY, STACEY, AUREBACH, 2007).
Elas podem ser primariamente classificadas em dois tipos: células-tronco
embrionárias e células-tronco adultas. Outra forma de caracterização de tais
células baseia-se na capacidade de originar um ou mais tipo celular
especializado: totipotentes, pluripotentes, multipotentes e unipotentes
(KRABBE, ZIMMER, MEYER, 2005; SERAKINCI, KEITH, 2006).
As células-tronco embrionárias (Embryonic Stem Cell – ESC) são
encontradas na massa celular interna do blastocisto (embrioblasto) eoriginam
os mais de 250 tipos celulares diferentes do corpo humano. A capacidade
dessas células de se multiplicarem em cultura sem perder a pluripotência,
assim como a possibilidade de induzir sua diferenciação em diversos tipos
celulares, fez com que as células-tronco embrionárias se tornassem uma
poderosa ferramenta de pesquisa e uma promissora fonte de tecidos para
transplantes (ZAGO, COVAS, 2006). Todavia, o aspecto político, moral e
religioso acerca de sua obtenção, o alto custo de manutenção e manipulação
dos embriões são fatores que têm limitado os avanços nos estudos com
essafonte primária de células totipotentes e pluripotentes. Além do já exposto,
essas células apresentam como desvantagens a dificuldade de controlar o
potencial proliferativo e de diferenciação, o que pode resultar na formação de
teratomas justamente por descontrole dessas propriedades (THOMSON et al.,
15
1998; SHAMBLOTT et al., 1998; GRONTHOS et al., 2000; GOLDBERG,
SMITH, 2004; MURRAY et al., 2007).
As células-tronco adultas ou somáticas (Adult Stem Cell – ASC) são
células indiferenciadas, encontradas em tecidos especializados como a medula
óssea, tecido adiposo e tecido hematopoiético e vêm sendo pesquisadas nos
tecidos dentais de animais e de humanos, com evidência que as mesmas se
reprogramem geneticamente (HARADA et al., 1999; GRONTHOS et al., 2000;
BIANCO et al.,2001). Em geral, essas células são consideradas multipotentes,
tendo a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, porém
restritos ao tipo do folheto germinativo de origem (ectoderma, mesoderma ou
endoderma), e apresentam um melhor controle dos processos de diferenciação
e proliferação in vitro. As ASCs podem ser autogênicas, não incorrendo em
limitações morais, e responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao
hospedeiro. Apesar disso, o fato de não serem pluripotentes e da sua presença
em menor quantidade nos tecidos representam suas desvantagens quando
comparadas às ESCs (SONG et al., 2004).
Caracterizar uma célula como célula-tronco não é tão simples; as
células-tronco praticamente não expressam ou expressam poucos marcadores
de superfície específicos. Em 2006, a Sociedade Internacional de Terapia
Celular (ISCT) estabeleceu um painel de marcadores de superfície celular para
identificação de células-tronco mesenquimais (CTM). Pelo menos 95% da
população de CTMs devem ser positivas para CD73, CD90 e CD105; e
negativas para CD34, CD45, CD11b ou CD14, CD19 ou CD79α, e HLA-DR.
Outro aspecto importante que caracteriza as células-tronco é a capacidade de
diferenciação em osteoblastos, condroblastos e adipócitos em condições de
cultivo celular (DOMINICI et al., 2006).
1.1.1 Célula-tronco da polpa de dente decíduo humano
Células progenitoras odontogênicas foram isoladas e expandidas in vitro
pela primeira vez em 2000 a partir da polpa de dente permamente humano
(GRONTHOS et al., 2000). Os autores observaram que essas células eram
capazes de auto-renovação e diferenciação, in vitro e in vivo, denominando-as
de células-tronco da polpa dental (em inglês Dental Pulp Stem Cell – DPSC).
16
Em 2003, um outro grupo identificou uma população de células
clonogênicas com alta capacidade proliferativa na polpa de dentes decíduos,
capazes de formar uma variedade de tipos celulares, que foram denominadas
células-tronco da polpa do dente decíduo esfoliado (em inglês Stem cells from
Human Exfoliated Deciduous teeth - SHED) (MIURA et al., 2003).
Experimentos com esse tipo celular mostraram que há diferenças significativas
entre a biologia de dentes decíduos e de permanentes e que as SHEDs
apresentam uma taxa de proliferação maior (NAKAMURA et al., 2009), maior
número de divisões celulares – o que pode facilitar sua expansão in vitro –
formação de colônias, capacidade de osteoindução in vivo e a formação de
tecido diferente do complexo dentina-polpa (MIURA et al., 2003). Esses autores
acreditam que as SHEDs representam uma população de células multipotentes
que se encontra em um estágio de maturidade inferior do que o verificado nas
DPSCs.
A obtenção das SHEDs é um processo simples, conveniente e com
pouco ou nenhum trauma, tendo em vista que toda criança perde os dentes
decíduos, sendo essa uma oportunidade perfeita para recuperar e armazenar
células-tronco para futuras aplicações clínicas. Além disso, o uso autógeno
dessas células reduz o risco de reações imunológicas ou rejeição de
transplantes e também elimina a possibilidade de contrair doenças de outro
doador (ARORA, ARORA, MUNSHI, 2009).
O aparecimento dessas células se dá por volta da sexta semana do
desenvolvimento pré-natal humano. Os pesquisadores acreditam que essas
células-tronco se comportam diferentemente das células-tronco adultas (pós-
natal) por se multiplicarem rapidamente e se diferenciarem muito mais rápido
do que as células estaminais adultas, sugerindo que elas são menos maduras
(diferenciadas), e consequentemente, com potencial para se diferenciar em
uma ampla variedade de tipos teciduais (MIURA et al., 2003; SEO et al., 2008;
ARORA, ARORA, MUNSHI, 2009).
As células-tronco da polpa dental compartilham diversos marcadores
com células derivadas da medula óssea, como CD146, colágeno tipo I,
colágeno tipo III, α-actina de músculo liso, fosfatase alcalina, osteonectina,
osteopontina, osteocalcina e fator de crescimento de fibroblasto II. Marcadores
hematopoiéticos como CD14, CD45 e CD34 não foram identificados nessas
17
células (GRONTHOS et al., 2000). Há também a expressão de marcadores
neurais (Nestina, βIII-tubulina, NeuN, GFAP, NFM e CNPase) por ambas as
linhagens, DPSC e SHED, o que sugere a origem mesenquimal dessas células,
fortalecendo a hipótese de serem originadas das cristas neurais. Além da
expressão dos marcadores neurais, outro aspecto que aponta para uma origem
dessas células a partir das cristas neurais é a sua morfologia fibroblastóide
(GRONTHOS et al., 2002; MIURA et a., 2003).
Investigando a crista neural como possível origem das células-tronco da
polpa de dentes decíduos esfoliados (SHED), Volponi, Pang e Sharpe (2010)
verificaram que as SHEDs são uma população heterogênea e que apresentam
características moleculares in vitro semelhantes às demais células-tronco
adultas e às células da crista neural. As células da crista neural são células
multipotentes que apresentam potencial de auto-renovação e de diferenciação
em várias linhagens celulares além de desempenharem um importante papel
no desenvolvimento dentário, pois originam os componentes mesenquimais
dos dentes, incluindo odontoblastos, tecido pulpar, ligamento periodontal e
vascularização apical (VOLPONI, PANG, SHARPE, 2010).
Para induzir a formação de osso, cemento e dentina in vivo, os estudos
experimentais demonstram que as células-tronco da polpa requerem um meio
indutor apropriado e um arcabouço composto por hidroxiapatita e fosfato
tricálcico (HA/TCP) (GRONTHOS et al., 2000; BATOULI et al., 2003). As
células-tronco dos dentes decíduos demonstraram uma forte capacidade de
induzir formação óssea in vivo, apesar de não se diferenciarem diretamente em
osteoblastos nos transplantes, essas células foram capazes de induzir nova
formação óssea atraindo células osteogênicas hospedeiras (MIURA et al.,
2003).
Um estudo utilizando células-tronco da polpa de dentes permanentes,
polpa de dentes decíduos humanos esfoliados e do ligamento periodontal
demonstrou que as três linhagens celulares formaram uma variedade de
tecidos associados ao complexo dentina/polpa, osso, músculo liso, tecido
neural, e endotélio. Transplantes xenógenos com carreador HA/TCP com
DPSC ou SHED geraram, no leito receptor, tecidos com diferentes camadas
odontoblásticas e uma estrutura de matriz dentinária mineralizada. Os autores
concluíram que a presença de populações distintas de células-tronco dentárias
18
associada a carreadores têm o potencial para regenerar estruturas dentárias
(SHI et al., 2005).
Cordeiro et al. (2008) avaliaram as características morfológicas dos
tecidos que se formaram quando fragmentos de dente humano (arcabouços
biodegradáveis) semeados com SHEDs foram transplantados em ratos
imunossuprimidos. Os autores observaram que os tecidos resultantes
apresentaram arquitetura e celularidade bem semelhantesao de um tecido
pulpar. Assim, as SHEDs poderiam ser implantadas diretamente na câmara
pulpar de um dente severamente danificado para regenerar a polpa em seu
interior, evitando a necessidade de tratamento endodôntico (ARORA, ARORA,
MUNSHI, 2009).
Sakai et al. (2010), objetivando estabelecer se os vasos sanguíneos da
papila dental são recrutados a partir do mesênquima vizinho, ou se as
populações locais de células-tronco são capazes de formarem estruturas
vasculares (angiogênese), utilizaram SHEDs semeadas em fragmentos de
elementos dentários (arcabouço celular) e implantaram subcutaneamente em
camundongos imunocomprometidos. Os autores concluíram que as SHEDs se
diferenciam em células endoteliais, promovendo o processo de angiogênese, e
em odontoblastos capazes de gerarem dentina tubular.
1.2 Laser e laserterapia
Nos últimos anos, o aprimoramento da tecnologia nas áreas biomédicas
tem propiciado o advento de novos equipamentos. O laser de baixa intensidade
(LBI) pode ser um bom exemplo dessa tecnologia, tendo diversas
aplicabilidades clínicas. O laser é uma fonte de radiação eletromagnética,
possuindo características especiais que o difere de outras fontes convencionais
incandescentes, tornando seu uso viável em múltiplas aplicações médicas
(SULEWESKI, 2000).
A palavra LASER é um acrônimo do termo em inglês Light Amplification
by Stimulated Emission of Radiation, que significa amplificação da luz por
emissão estimulada de radiação, caracterizando bem a forma pela qual essa
luz é produzida (SULEWSKI, 2000; CATÃO, 2004). A luz do laser pode ser
definida como sendo um conjunto de fótons que seguem uma trajetória
19
ondulatória apresentando características especiais de unidirecionalidade,
coerência e monocromaticidade (CATÃO, 2004; PINHEIRO et al., 2010).
Apesar do interesse nos últimos anos pela laserterapia ter crescido
bastante, os primeiros relatos da utilização dessa técnica datam do início do
século XX. Em 1917, o físico alemão Albert Einstein propôs os princípios físicos
da emissão estimulada, postulando as bases teóricas sobre a manipulação
controlada de ondas de luz (CATÃO, 2004). Os primeiros relatos da utilização
do laser de baixa potência são de 1965, por Sinclair e Knoll, que adaptaram
essa radiação a pratica terapêutica. Nesse mesmo ano, o laser foi utilizado
pela primeira vez na Odontologia por Stern e Sognnaes e após a publicação de
alguns trabalhos a partir de 1968, a laserterapia despertou o interesse sobre os
seus efeitos em tecidos vivos (SULEWESKI, 2000).
De acordo com a sua potência e a capacidade de interação com os
tecidos biológicos, os lasers podem ser classificados em duas categorias: laser
de alta intensidade ou laser cirúrgico (Hight Intensity Laser Treatment) e laser
de baixa intensidade ou laser terapêutico (Low Intensity Level Treatment)
(CATÃO, 2004). O primeiro apresenta efeitos térmicos, propriedades de corte,
vaporização e hemostasia, atuando por meio do aumento da temperatura e
produção de calor; o segundo promove efeitos analgésicos, antiinflamatórios e
cicatrizantes, são absorvidos pelos tecidos e estimulam um efeito biomodulador
(PINHEIRO et al., 2010).
O laser de baixa intensidade (LBI) ou laserterapia refere-se ao uso do
laser em dois diferentes espectros que são estabelecidos a partir do
comprimento de onda utilizado. O espectro de ação vermelho ou visível
apresenta comprimento de onda que varia de 630 a 680 nm, enquanto o
infravermelho ou invisível compreende comprimentos de onda próximo a 700 -
904 nm (BENSADOUIN, NAIR, 2015). O comprimento de onda utilizado
durante a instituição da laserterapia parece influenciar o seu efeito nas células
em cultura. Estudos demonstraram que comprimentos de onda no espectro de
luz vermelha variando entre 600 a 700nm, contribuem com o aumento da
proliferação e diferenciação celular (WILDEN, KARTHEIN, 1998; STEIN et al.,
2005; TUBY, MALTZ, ORON, 2007). Em contrapartida, o espectro de luz
infravermelho com variação do comprimento de onda entre 810 a 830 nm tem
20
sido associado à inibição da taxa proliferativa de alguns tipos celulares
(MOORE et al., 2005; HAWKINS-EVANS, ABRAHAMSE, 2008).
Diversos parâmetros da laserterapia devem ser avaliados a fim de que o
efeito sobre o tecido irradiado seja efetivo. Além do comprimento de onda, são
parâmetros fundamentais para os resultados obtidos: a densidade de energia
ou dose (quantidade de energia por unidade de área transferida ao tecido), a
potência (valor informado pelo fabricante em watts), a densidade de potência
(potência de saída da luz por unidade de área medida em watts dividido por
centímetros quadrados) e o intervalo de aplicação (MOORE et al., 2005).
Outra característica relevante que os lasers apresentam é em relação ao
seu modo de funcionamento. Existem lasers de ondas contínuas, que quando
acionados permanecem ligados continuamente até serem desligados e os
lasers de ondas pulsadas, que mesmo após serem acionados, permanecem
parte do tempo ligados e outra parte desligados, fracionando a liberação da luz
durante o intervalo de aplicação (ALMEIDA-LOPES, 2003).
1.2.1 Mecanismo de ação do laser de baixa intensidade
O mecanismo de ação do laser de baixa intensidade no sistema
biológico envolve inicialmente a fotoativação de uma molécula fotorreceptora
da célula, seguida de absorção da luz e o desencadeamento de dois tipos de
reações (primárias e secundárias) (KARU, 1999). As reações primárias
ocorrem na presença da luz e resultam em alterações na configuração
molecular e função do fotoreceptor. Acredita-se que essas reações estejam
relacionadas à formação de oxigênio singlete, modificações das propriedades
do estado redox, presença de óxido nítrico, aumento da temperatura local por
tempo determinado ou superprodução de ânions superóxidos. Já as reações
secundárias ocorrem sem a presença da luz, podendo ser horas ou dias após a
irradiação, compreendendo alterações na sinalização e funções celulares (XU
et al., 2008) como a fotorresposta dos receptores localizados nas mitocôndrias
e a síntese de DNA e RNA no núcleo celular (KARU, 2008).
As pesquisas relacionadas ao mecanismo de ação do LBI envolvem
sempre o estudo das mitocôndrias. Essas organelas desempenham um papel
importante na geração de energia e no metabolismo celular (GAO, XING, 2009;
21
HUANG et al., 2009; SILVEIRA et al., 2009). A absorção de radiação
monocromática visível e próxima ao infravermelho (do inglês near infrared -
NIR) por componentes da cadeia respiratória celular tem sido considerada
como o principal mecanismo de LBI em nível celular (KARU, 1989). Estudos
evidenciam que o LBI age nas células através de um fotorreceptor principal:
citocromo c oxidase – enzima terminal da cadeia mitocondrial de transporte de
elétrons que desempenha papel bioenergético vital na célula (HUANG et al.,
2009; SRINIVASAN, AVADHANI, 2012).
A citocromo c oxidase é uma proteína de membrana mitocondrial de 200
KDa que apresenta duas metades heme (heme a e heme a3), dois sítios redox
ativos de cobre (CuA e CuB), um zinco e um magnésio. A absorção de fótons
pela citocromo c oxidase leva a estados eletronicamente excitados,
estimulando a cadeia respiratória por acelerar as reações de transferências de
elétrons na molécula (YU et al., 1997). Desse modo, ocorre aumento do
potencial elétrico da membrana, maior metabolismo oxidativo e
consequentemente resultando em maior síntese de ATP e espécies reativas de
oxigênio (do inglês reactive oxigen species - ROS) (HUANG et al., 2009;
SILVEIRA et al., 2009).
A atividade da citocromo c oxidase pode ser regulada pelo óxido nítrico
(do inglês nitric oxide - NO) (BELTRAN et al., 2000; BROWN, 2001; KARU,
PYATIBRAT, AFANASYEVA, 2005). O NO produzido na mitocôndria pode inibir
a respiração celular através de uma competição direta com o oxigênio para se
ligar a citocromo c oxidase (ANTUNES, BOVERIS, CADENAS, 2004; HUANG
et al., 2009). A laserterapia pode inverter essa inibição através da dissociação
do NO da citocromo c oxidase, permitindo o influxo de oxigênio e a geração de
espécies reativas de oxigênio que podem ativar fatores de transcrição
nucleares (KARU, PYATIBRAT, KALENDO, 2005; LANE, 2006; HUANG et al.,
2009, POYTON et al., 2011).
As espécies reativas de oxigênio (ROS) resultantes da ativação da
cadeia respiratória podem ter efeitos benéficos ou prejudiciais. De acordo com
Huang et al. (2009), baixos níveis de ROS estão associados a efeitos
bioestimulantes, enquanto altos níveis têm sido relacionados a efeitos
inibitórios e indutores de morte celular. Os estudos indicam que a laserterapia
em altas doses leva ao aumento das concentrações de ROS, que por sua vez
22
leva a uma diminuição do potencial da membrana mitocondrial, ocasionando
uma diminuição da permeabilidade membranar. A dimimuição da
permeabilidade celular leva a destruição da mitocôndria, ativando fatores pró-
apoptóticos que levam a ativação do citocromoc, que ativa caspases
ocasionando a apoptose (OSIPOV et al., 2006; WU et al., 2007).
O LBI produz uma mudança no potencial redox da célula, aumentando a
oxidação (KARU, 1999), a geração de ROS e a atividade redox da célula
(GROSSMAN et al., 1998; ALEXANDRATOU et al., 2002; LAVI et al., 2003;
ZHANG et al., 2008; CHEN et al., 2011). Alterações no estado redox induz a
ativação de numerosas vias de sinalização intracelular tais como a síntese de
acido nucléico, síntese de proteína e progressão no ciclo celular.
Alterações nos elementos da sinalização mitocondrial (potencial de
membrana, ATP, ROS, Ca2+ e óxido nítrico) medeiam a ativação ou a
supressão de moléculas no citoplasma e subseqüentemente promovem a
ativação de cascatas de sinalização. Essas vias de sinalização resultam na
síntese de DNA, RNA e proteínas ou em alterações no citoplasma e na
membrama plasmática que podem relacionar-se a atividade proliferativa
(HAWKINS, ABRAHAMSE, 2006; HU et al., 2007; KARU, 2008; GAO, XING,
2009)
Tentando explicar o efeito bioestimulatorio do LBI em nível molecular,
Karu (1999) propôs uma cadeia de eventos moleculares a partir da absorção
de luz por um fotorreceptor levando à fotoativação de enzimas na mitocôndria,
incluindo a transdução de sinal e eventos de amplificação, terminando com a
foto-resposta. Segundo o mesmo autor, a luz é absorvida pelos componentes
da cadeia respiratória, levando a mudanças nas mitocôndrias e no citoplasma.
Em baixas doses de laser, Ca²+ adicional é transportado para o citoplasma por
um processo que estimula síntese de DNA e RNA, mitose e proliferação
celular. Em altas doses, muito Ca2+ é liberado, resultando em hiperatividade da
ATPase, bombas de cálcio e consequentemente degradação do ATP presente
na célula e inibição do metabolismo celular (SCHINDL et al., 2000). Segundo
Friedmann et al. (1991), a liberação de Ca2+ ocorre a partir da força motriz
protónica e que além da liberação de Ca2+ verifica-se também um aumento de
curto prazo no pH intracelular.
23
Estudos moleculares mostram que após a absorção dos fótons pelas
células numerosas vias de sinalização são ativadas, levando à ativação de
fatores de transcrição. Estes fatores de transcrição podem promover o aumento
da expressão de genes relacionados com a síntese de proteínas, a migração e
proliferação celular, a sinalização anti-inflamatória, as vias anti-apoptóticas e
enzimas antioxidantes (DE FREITAS, HAMBLIN, 2016).
A laserterapia estimula o crescimento celular diretamente através da
regulação da expressão de genes relacionados com a proliferação celular e,
indiretamente, através da regulação de genes relacionados com a migração
celular e remodelação, síntese de DNA e reparo, canal iônico e potencial de
membrana, e metabolismo celular. O LBI também aumenta a proliferação
celular por suprimir a apoptose das células (ZHANG et al., 2003). Tem sido
demonstrado que a laserterapia pode estar relacionada à expressão alterada
de genes e proteínas relacionadas ao ciclo celular (GRECO et al., 2001;
PEPLOW et al., 2011) e parece aumentar a liberação de fatores de
crescimento e citocinas (GAVISH et al., 2004; BYRNES et al., 2005; SHIMIZU
et al., 2007; PEPLOW et al., 2011).
Os mecanismos moleculares e celulares do LBI sugerem que os fótons
são absorvidos pelas mitocôndrias, estimulando a produção de ATP. Baixos
níveis de ROS ativam os fatores de transcrição, tais como NF-ĸB (do inglês
nuclear transcription factor kappa B), para induzir alguns produtos de
transcrição gênica responsáveis pelos efeitos bioestimulatórios do LBI. Em
altas concentrações, as ROS inibem a proliferação celular, levando as células à
apoptose (FARIVAR, MALEKSHAHABI, SHIARI, 2014).
Em se tratando da ação do laser nos diferentes espectros de luz, seu
efeito molecular parece ocorrer de forma distinta quando se compara a luz
vermelha com a infravermelha. A luz visível (vermelha) induz uma reação foto-
química, ocasionando em uma direta ativação da síntese de enzimas, tendo
como principal alvo os lisossomos e as mitocôndrias. As organelas não
absorvem luz infravermelha (espectro invisível), apenas as membranas
celulares apresentam respostas a esse estímulo, logo a luz infravermelha
causa alterações no potencial de membrana induzindo efeitos foto físicos e
fotoelétricos, levando à excitação dos elétrons e a um aumento na síntese de
ATP (ALMEIDA-LOPES et al., 2001).
24
1.2.2 Ação do LBI nas células em cultivo
A ação do LBI na proliferação celular vem sendo estudada em diversos
tipos celulares como fibroblastos (MOORE et al., 2005; HAWKINS-EVANS,
ABRAHAMSE, 2008), células endoteliais (SCHINDL et al., 2003), células
neoplásicas (CASTRO et al., 2005; WERNECK et al., 2005) e osteoblastos
(FUJIHARA et al., 2006), contudo pouco se sabe a respeito da ação do LBI na
proliferação de células-tronco (KHALID et al., 2012).
Dentre as diversas fontes de células-tronco, poucas foram avaliadas na
literatura em relação a laserterapia (GINANI et al., 2015; MARQUES et al.,
2016; BORZABADI-FARAHANI, 2016), o que demonstra a necessidade de
realização de novos estudos com células-tronco obtidas de outras fontes, a fim
de compreender melhor a ação que a laserterapia exerce na proliferação
dessas células.
Com relação aos estudos sobre o efeito do laser em células-tronco, tem
sido observado que a laserterapia pode promover tanto um aumento da
proliferação celular (EDUARDO et al., 2008; GAO, XING, 2009; MVULA et al.,
2010), quanto contribuir com a diferenciação dessas células (HOU et al., 2008;
SOLEIMANI et al., 2012). Os estudos têm utilizado comprimentos de onda que
variam de 600 a 700 nm quando o objetivo é estimular a proliferação e
diferenciação celular (WILDEN, KATHEIN, 1998).
A laserterapia geralmente utiliza baixas densidades de energias e
comprimentos de onda, porém suficientes para desencadear na célula alvo o
processo de biomodulação. A energia é capaz de penetrar nos tecidos,
resultando em aumento da atividade, proliferação e regeneração celular,
síntese de fatores de crescimento, produção de colágeno, angiogênese, além
de analgesia e efeito antiinflamatório (LI, CHEN, WANG, 2006). Tem sido
relatado que a magnitude do efeito de bioestimulação do laser depende do
comprimento de onda utilizado, bem como do estado fisiológico das células no
momento da irradiação, sendo esse efeito mais evidenciado em células com
déficit nutricional, desordem funcional ou injúria (KARU, 1989; PINHEIRO et al.,
2002; TUNER, 2007;).
Em relação ao comprimento de onda, a literatura relata que o espectro
de luz visível (vermelho), variando de 600 a 700 nm, apresenta resultados mais
25
eficazes na bioestimulação celular (WILDEN, KARTHEIN, 1998). Porém,
mesmo em alguns experimentos que utilizaram o espetro de luz infravermelho
(TUBY et al., 2007; BOUVET-GERBETTAZ et al., 2009; SOLEIMANI et al.,
2012), observou-se uma influência positiva na taxa de proliferação celular, com
exceção do estudo de Bouvet-Gerbettaz et al. (2009). Nesse estudo foi
avaliada a influência do LBI (808 nm, 800 mW e 4 J/cm²) a partir do número de
CFU-F de células em suspensão. O grupo não irradiado apresentou um valor
médio de colônias maior que o irradiado.
Moore et al. (2005), objetivando avaliar o efeito do laser em diferentes
comprimentos de onda (625, 635, 645, 655, 665, 675 e 810 nm) em dois tipos
celulares (fibroblastos e células endoteliais), avaliaram a taxa de proliferação
celular após um período de 72 h de cultivo. Eles verificaram um aumento no
crescimento tanto das células endoteliais, quanto para os fibroblastos em todos
os comprimentos de onda estudados, exceto para o de 810 nm.
Hawkins-Evans e Abrahamse (2008) obtiveram resultados semelhantes
aos verificados por Moore et al (2005) no que se refere a proliferação de
fibroblastos. Eles avaliaram comprimentos de onda de 632,8 e 830 nm e
verificaram um efeito estimulatório na proliferação desse tipo celular mais
efetivo quando tratados com laser de 632,8 nm, sugerindo que o comprimento
de onda interfere potencialmente na resposta celular.
Além do comprimento de onda, a bioestimulação in vitro é dependente
de outros fatores, tais como a potência (ALMEIDA-LOPES et al., 2001), a
densidade de energia (PEREIRA et al., 2002; KREISLER et al., 2003) e o tipo
de célula que está sendo irradiada (MOORE et al., 2005). Esses parâmetros
são úteis para aumentar a taxa de proliferação, porém eventualmente
promovem efeitos adversos sobre a síntese de proteínas (PEREIRA et al.,
2002). Portanto, é crucial identificar a combinação correta desses fatores para
atingir a taxa máxima de proliferação celular.
Dentre as doses mais utilizadas na laserterapia em células-tronco, há
uma preferência pela utilização de doses baixas, sendo 0,05 J/cm2 a menor
dose até o momento aplicada (PEREIRA et al., 2012), a dose de 0,5 J/cm2 a
mais utilizada (HOU et al., 2008; WU et al., 2012; SOARES et al., 2015) e 42
J/cm2 a maior dose utilizada (PEREIRA et al., 2012). Dentro do espectro de luz
visível a menor potência empregada nos experimentos foi de 0,02 mW
26
(PEREIRA et al., 2012) e a maior, 119 mW (MVULA et al., 2010), enquanto no
espectro de luz invisível a menor potência foi de 50 mW (SOLEIMANI et al.,
2012) e a maior, 800 mW (BOUVET-GERBETTAZ et al., 2009).
Tuby et al. (2007) demonstraram que a laserterapia promove a
proliferação de células-tronco mesenquimais e cardíacas in vitro quando essas
são irradiadas com um laser diodo (AsGa), no comprimento de onda de 804 nm
e com doses de 1,0 e 3,0 J/cm2. A proliferação de ambos os tipos celulares
aumentou significativamente após a aplicação do laser quando comparado ao
grupo controle não irradiado sem causar nenhum dano sobre essas células em
todos os intervalos de tempo analisados (1, 2, 3 e 4 semanas após a
irradiação).
Para aumentar a taxa de proliferação de células-tronco mesenquimais
da medula óssea, Hou et al. (2008) usaram o LBI a partir da utilização do laser
com comprimento de onda de 635 nm e doses de 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 J/cm2. Não
foram encontradas diferenças significativas entre os grupos não irradiados e
irradiados no que se refere à citotoxicidade. No entanto, a taxa de proliferação
das células estudadas foi significativamente maior no grupo irradiado quando
comparado com o grupo controle, sendo a dose de 0,5 J/cm2 a mais efetiva.
Villiers et al. (2011) avaliaram a ação do laser diodo, com 636 nm e 5,0
J/cm2 na proliferação de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo
humano, sendo uma linhagem extraída a partir de procedimento cirúrgico e
outra comercial, as quais mostraram resultados completamente distintos. Na
linhagem comercial não houve diferença significativa em nenhum dos tempos
avaliados (24, 48 e 72 h), por sua vez, as células oriundas de procedimento
cirúrgico mostraram diferenças estatisticamente significativas na proliferação
celular nos tempos de 24 e 72 h pós-irradiação quando comparadas com o
controle não irradiado. Esses resultados demonstram que a linhagem também
pode influenciar na ação do LBI.
Soleimani et al. (2012) analisaram a ação do LBI na taxa proliferativa de
células-tronco da medula óssea humana cultivadas em meio indutor de
diferenciação osteogênica e neurogênica. Sabe-se que a taxa proliferativa das
células-tronco é bastante reduzida quando as mesmas encontram-se em
processo de diferenciação. Mesmo em meios indutores, os referidos autores
27
observaram um aumento significativo na proliferação das células irradiadas
quando comparadas com o grupo não irradiado.
Quando se trata de laserterapia em células de origem dental, a literatura
ainda é bastante incipiente. A maioria dos artigos baseia-se em estudos in vitro
utilizando DPSC, enquanto que SHEDs e PDLSCs foram menos estudadas
(BORZABADI-FARAHANI, 2016). Os efeitos da laserterapia em células-tronco
de origem dental parecem seguir a lei Arndt-Schulz: pequenas doses
estimulam, doses moderadas inibem e grandes doses matam (MARQUES et
al., 2016).
Resultados positivos foram relatados na literatura quando as células-
tronco foram cultivadas sob condições de estresse (EDUARDO et al., 2008;
DINIZ et al., 2015), mostrando que as células irradiadas apresentaram um
potencial de proliferação e uma viabilidade superior quando comparadas ao
grupo controle que não foi submetido ao laser.
Diniz et al. (2015) submeteu DPSCs à estresse através do contato com
substânicas nocivas liberadas por adesivos dentais, e mostrou
que a viabilidade dessas células foi maior quando submetidos à laserterapia.
Já um estudo realizado com SHEDs demonstrou que a irradiação dessas
células com deficiência nutricional (10 e 5% de SFB), com um laser de
comprimento de onda de 660 nm e dose de 3,0 J/cm2, promoveu aumento na
proliferação celular. Porém quando se avaliou esse mesmo tipo celular em
condições nutricionais normais (15% de SFB), não houve diferença estatística
entre os grupos (EDUARDO et al., 2008).
No entanto, alguns estudos mostram que, em condições de cultivo ideal
(meio de cultura suplementado com 15% de SFB), células PDLSCs (SOARES
et al., 2015) e DPSCs (ZACCARA et al., 2015) submetidas à laserterapia
tiveram um aumento na proliferação celular quando comparadas com os
grupos controles não irradiados.
Em relação a influência da laserterapia na diferenciação de células-
tronco de origem dental, Turrioni et al. (2014) observaram um aumento da
atividade de fosfatase alcalina (ALP) e da síntese de colágeno, bem como a
expressão de sialofosfoproteína dentinária (DSSP) e colágeno tipo 1 (COL I)
avaliada 72 horas após a última irradiação. Já Pereira et al. (2012), analisando
28
a formação de nódulos mineralizados após 3 semanas, não foram capazes de
encontrar diferenças entre os grupos irradiados e não irradiados.
Os estudos encontrados na literatura, até o presente momento, relatam
ou efeitos benéficos ou nenhuma alteração nas células-tronco submetidas à
laserterapia. Sabendo-se que no cultivo das células-tronco comumente é
observado um baixo rendimento e uma taxa proliferativa reduzida, o uso de
uma ferramenta que venha aumentar essa taxa proliferativa e
consequentemente acelerar o processo de diferenciação celular, é de grande
interesse para a medicina regenerativa.
1.3 Engenharia tecidual
A engenharia tecidual é um campo multidisciplinar que envolve os
princípios de biologia, medicina, engenharia e ciência dos materiais para criar
substitutos biológicos para tecidos perdidos ou danificados, além de contribuir
em paralelo com os avanços nas áreas de biomateriais e biotecnologia (LIAO
et al., 2011). Esta ciência envolve três componentes básicos: um arcabouço
que proporciona estrutura e substrato para o crescimento e desenvolvimento
tecidual (scaffolds); uma fonte de células para facilitar a formação do tecido
desejado; e fatores de crescimento ou estímulos biofísicos que direcionem o
crescimento e diferenciação das células no arcabouço (MURPHY et al., 2013).
Os tecidos animais são compostos por células embebidas em uma
matriz extracelular (MEC), e do ponto de vista estrutural a MEC natural é uma
rede tridimensional de fibras composta por várias proteínas e polissacarídeos,
com diâmetro variando de dezenas a centenas de nanômetros (WANG et al.,
2013). Além disso, a MEC fornece às células uma ampla gama de sinais
químicos que regulam a função celular (LANNUTTI et al., 2007). Assim, na
engenharia tecidual o arcabouço desempenha um papel crítico, devendo
mimetizar as funções biológicas da estrutura e da matriz extracelular (MEC)
naturais do tecido, como a microarquitetura com um tamanho de poro suficiente
para promover a adesão, proliferação e migração celular, além da deposição
de matriz (QUARTO, GIANNONI, 2016).
Os biomateriais possuem um papel primordial no campo da engenharia
tecidual. Esforços consideráveis vêm sendo aplicados na criação de materiais
29
biomiméticos capazes de estabelecer funções celulares específicas e
direcionar interações célula-célula, atuarem como arcabouços para populações
celulares e agentes terapêuticos, funcionando como matrizes que vão guiar a
regeneração do tecido (HUBBEL, 1995; LEE, KASPER, MIKOS, 2015).
Com o desenvolvimento das técnicas de produção dos biomateriais, os
tipos de arcabouços e a qualidade do tecido formado se tornam cada vez mais
versáteis (LANGER, VACANTI, 2016). Dependendo das propriedades físicas e
químicas destes biomateriais, os mesmos podem gerar respostas positivas ou
negativas nos processos de adesão, proliferação, migração e diferenciação
celular (HUTMACHER, 2000; ALLEN et al., 2006; MENDONÇA et al., 2009).
Apesar da existência de um número bastante variado de materiais
potenciais, o arcabouço ideal deve ter algumas propriedades gerais que são
normalmente desejadas. Além de favorecer a adesão, proliferação,
diferenciação e migração celular, os arcabouços devem: 1) possuir poros
interconectáveis de tamanho apropriado para a integração e vascularização do
tecido; 2) ser composto de material com uma taxa de degradação que se
aproxima da taxa de regeneração do tecido natural desejado; 3) possuir
propriedades mecânicas compatíveis com o local de enxertia e com o
manuseio; 4) não provocar resposta inflamatória de toxicidade in vivo; 5) ser
facilmente fabricável em diferentes tamanhos e formas; 6) ser passível de
esterilização, evitando contaminações, mantendo as propriedades estruturais e
mecânicas (HUTMACHER, 2001; LANNUTTI et al., 2007; LANGER, 2008).
Com base no exposto, os biomateriais poliméricos são os preferidos,
podendo ser divididos em dois grupos: naturais, como o colágeno, a gelatina, o
fibrinogênio, o ácido hialurônico e a quitosana; e sintéticos, como os
polianidridos, o poliuretano e os poliésteres (CAO et al., 2004). As vantagens
dos polímeros naturais estão relacionadas à melhor biocompatibilidade e
menor imunogenicidade. No entanto, apresentam variações nas propriedades
mecânicas, na degradação e na reprodutibilidade como suas desvantagens. Já
os polímeros sintéticos podem ser modificados para melhorar suas
propriedades, representam uma fonte mais confiável de matéria-prima, além de
apresentarem baixo custo (VASITA, KATTI, 2006; BARNES et al., 2007;
LIANG, HSIAO, CHU, 2007).
30
1.3.1 Ácido Polilático (PLA)
O ácido polilático (PLA) é um dos polímeros sintéticos mais
amplamente utilizado em uma variedade de aplicações biomédicas devido à
sua elevada resistência, biocompatibilidade, biodegradabilidade, boa
solubilidade em alguns solventes orgânicos como o clorofórmio e a acetona, e
baixo custo (LANZA, LANGER, VACANTI, 2007; LU, MIKOS, 2009;
CASASOLA et al., 2014; SAINI, ARORA, KUMAR, 2016). Quando utilizado
como arcabouço celular, o PLA, sozinho ou combinado com outro material
biodegradável, proporciona um ambiente excelente para o crescimento celular
devido às suas propriedades físicas (ARMENTANO et al., 2013; SANTORO et
al., 2016).
Primeiro sintetizado por Carothers em 1932, o PLA é produzido a partir
de policondensação de ácido lático ou pela polimerização de abertura do anel
do dímero cíclico lactido (JAMSHIDIAN et al., 2010; LOPES, JARDINI, FILHO,
2012). Como outros poliésteres, o PLA degrada-se por hidrólise não enzimática
e os seus subprodutos são eliminados através do metabolismo celular normal
(LASPRILLA et al., 2012). A biocompatibilidade e a biodegradabilidade desse
biomaterial tornam-no um candidato ideal para dispositivos implantáveis
(LOVALD et al., 2009; LASPRILLA et al., 2012)
A regulação de dispositivos baseados em PLA pelo FDA aumentou o
interesse no uso de PLA no campo da engenharia de tecidos. O PLA tem sido
largamente empregado como arcabouço, não só pela sua biocompatibilidade
intrínseca e biodegradabilidade, mas também porque a quiralidade do ácido
láctico (ácido L- e D-láctico) pode ser utilizada para sintetizar PLA com
diferentes estereoregularidades. A esteroregularidade influencia as
propriedades físico-químicas do material, tais como propriedades mecânicas e
térmicas e características de degradação (BIGG, 2005). Consequentemente, o
PLA tem sido amplamente utilizado em aplicações de engenharia tecidual,
tanto como arcabouços, quanto como sistemas de administração de fármacos
(BIGG, 2005; LOPES, JARDINI, FILHO, 2012; RATNER, 2013).
Apesar de suas muitas propriedades desejáveis, a principal
preocupação com o uso de PLA está relacionada com seus produtos de
degradação. PLA degrada em ácido láctico, um ácido relativamente forte que
31
pode provocar uma resposta inflamatória (LANZA, LANGER, VACANTI, 2007).
Este efeito é ainda mais exacerbado pelo fato dos dispositivos feitos em PLA
sofrerem geralmente erosão em massa. Como resultado, a acumulação de
produtos ácidos dentro da massa do material acelera sua degradação,
eventualmente levando a uma perda súbita de sua integridade mecânica e uma
resposta inflamatória retardada (LANZA, LANGER, VACANTI, 2007; RATNER,
2013). No entanto, o PLA é ainda um material preferido para a fabricação de
arcabouços por causa da concentração reduzida de produtos de degradação
com porosidade aumentada. Consequentemente, várias abordagens para
amenizar as deficiências deste polímero sintético são propostas, incluindo a
preparação de copolímeros de ácido láctico e compósitos baseados em PLA
(ATHANASIOU, NIEDERAUER, AGRAWAL, 1996; HABRAKEN, WOLKE,
JANSEN, 2007; PUPPI et al., 2010; WEI et al., 2015).
Outra limitação para aplicação do PLA em um ambiente hidrofílico é a
sua superfície hidrofóbica. A hidrofobicidade do PLA também resulta em baixa
afinidade celular e pode desencadear uma resposta inflamatória do hospedeiro
após o contato direto com fluidos biológicos (GUO et al. , 2015; STANKEVICH
et al., 2015; MURARIU, DUBOIS, 2016). Para expandir a utilização de PLA,
foram utilizados polímeros hidrofílicos como óxido de polietileno (PEO) (ZHAO
et al., 2012), poli (álcool vinílico) (PVA) (ABDAL-HAY et al., 2016) nas
modificações de PLA para melhorar a sua hidrofilicidade. O futuro do PLA para
a engenharia de tecidos complexos provavelmente reside na sua combinação
com outros biomateriais, a fim de potencializar suas vantagens e minimizar
suas fraquezas (SANTORO et al., 2016).
O uso do PLA, seja puro ou em blendas/modificações, vem sendo
amplamente investigado com diversos focos (XIAO et al., 2012), seja para
sistema de liberação de fármacos (LI et al., 2013; LUO et al., 2015); analisar a
eficácia em fazer a interface no processo de cicatrização de tecidos (JAMSHIDI
et al., 1988); ou investigar a interação com diversos tipos celulares, como
condrócitos humanos e fibroblastos NIH/3T3 (LEE et al., 2002; FUKUHIRA et
al., 2006; PRIME et al., 2007), células percursoras osteogênicas (HAMAJIMA et
al., 2003; HU et al., 2003; ABDAL-HAY et al., 2013), células do sistema imune
(STANKEVICH et al., 2015), e linhagens de células neuronais (ÁLVAREZ et al.,
2013; XIE et al., 2013; MEI et al., 2014; MOBASSERI et al., 2014).
32
Arcabouços nanofibrosos de PLA produzidos pela técnica de eletrofiação
têm se mostrado uma ferramenta versátil para a engenharia tecidual em virtude
da sua superfície topográfica tridimensional que permite uma maior adesão das
células, além de funcionar como um dispositivo para entrega de drogas ou
moléculas bioativas (SANTORO et al., 2016).
1.3.2 Eletrofiação
A eletrofiação (eletrospinning) é uma das técnicas mais comumente
utilizadas na literatura para a fabricação de suportes fibrosos. É uma técnica
relativamente simples e de baixo custo, que utiliza forças eletrostáticas para
produzir arcabouços fibrosos, usando soluções poliméricas ou polímeros
fundidos, resultando em fibras contínuas de diâmetros variados (LU et al.,
2009).
Essa técnica produz malhas não tecidas contendo fibras de diâmetro
variando de dezenas de micrômetros até dezenas de nanômetros. Materiais
sintéticos ou naturais podem ser utilizados, mas os polímeros sintéticos
geralmente permitem uma maior capacidade de adaptar as propriedades
mecânicas e a taxa de degradação (LANNUTI et al., 2007). As características
desses arcabouços, tais como a porosidade, o tamanho de poro e o tamanho
da fibra, podem ser facilmente regulados (PHAM, SHARMA, MIKOS, 2006).
A técnica de eletrofiação baseia-se na aplicação de elevado potencial
elétrico a uma solução polimérica, inicialmente armazenada em um capilar
metálico que é bombeado a um fluxo controlado. O aparato típico para a
execução da técnica consiste em uma fonte elétrica, um sistema de
bombeamento da solução polimérica e um coletor. Quando o potencial elétrico
aplicado excede as forças de tensão superficial que agem em direção oposta,
um jato polimérico fino é ejetado da seringa e segue em direção ao coletor
onde as fibras são depositadas (PALGRAVE, PAYNE, EGDELL, 2009; LIEN et
al., 2011; LANDAU, ROTHSCHILD, 2012). O solvente da solução é evaporado,
durante o trajeto da seringa até o coletor, formando a fibra que se deposita
aleatoriamente, dando origem a uma malha não tecida caracterizada por uma
elevada área superficial (LANNUTI et al., 2007).
33
Apesar da facilidade de utilização da técnica de eletrofiação, um grande
número de parâmetros do processo pode influenciar a composição, a
morfologia e a estrutura das fibras geradas e podem ser agrupados em três
categorias: propriedades da solução (concentração e peso molecular do
polímero, viscosidade, condutividade elétrica, elasticidade, tensão superficial),
condições do processo (voltagem, fluxo de alimentação, distância entre a
seringa e o coletor, diâmetro da abertura da seringa) e condições ambientais
(temperatura, umidade, tipo de atmosfera e pressão atmosférica) (XIE, LI, XIA,
2008; SANTORO et al., 2016).
34
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral:
• O presente estudo tem como objetivo avaliar, através de
experimentos in vitro, a influência do laser de baixa intensidade
(LBI) na atividade biológica das células-tronco da polpa de dente
decíduo humano esfoliado (SHED).
2.2. Objetivos específicos:
• Avaliar a influência do LBI, aplicado nas doses de 0,5 e 1,0 J/cm2,
na capacidade de proliferação e na viabilidade in vitro das
SHEDs.
• Avaliar se o LBI promove melhor biointegração in vitro das SHEDs
cultivadas sobre um arcabouço polimérico (PLA) nanofibroso.
35
3. ARTIGO I
Para submissão à Lasers in Medical Science (ISSN 0268-8921) – IF 2.461
(JCR® 2015) – Qualis A2
LASER DE BAIXA INTENSIDADE INDUZ A PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE
CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS HUMANOS
ESFOLIADOS.
Low-level laser irradiation induces in vitro proliferation of stem cells from
human exfoliated deciduous teeth.
Fernanda Ginania, Carlos Augusto Galvão Barbozaa
a Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brasil
Autor para correspondência:
Carlos Augusto Galvão Barboza
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral
Av. Salgado Filho, 1787 – Lagoa Nova
CEP 59056-000 – Natal – RN – Brasil
e-mail: cbarboza@cb.ufrn.br
36
RESUMO
O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do laser de baixa intensidade (LBI) na
proliferação e viabilidade de células-tronco da polpa de dentes decíduos
humanos esfoliados (SHED). As células foram irradiadas ou não (controle) com
um laser diodo InGaAlP (660 nm, 30 mW, modo de ação contínuo) usando
duas diferentes doses (0,5 J/cm2 por 16 segundos e 1,0 J/cm2 por 33
segundos). As irradiações foram realizadas nos intervalos de 0 e 48 h, com a
ponta do laser fixada perpendicularmente a cada placa a uma distância de 0,5
cm das células. A proliferação e a viabilidade celular foram analisadas nos
intervalos de 0, 24, 48 e 72 h, através do método de exclusão do azul de Tripan
e do ensaio de MTT. O ciclo celular e a expressão de Ki67 foram analisados
por citometria de fluxo. Eventos relacionados à apoptose foram avaliados pela
expressão de Anexina V e PI e alterações morfológicas no núcleo foram
analisadas pela coloração com DAPI. Os resultados demonstraram que a dose
de 1,0 J/cm2 promoveu um aumento na proliferação celular nos intervalos de
48 e 72 h quando comparada ao grupo controle e à dose de 0,5 J/cm2. A
distribuição das células nas fases do ciclo cellular revelou que os grupos
irradiados exibiram a maioria das células nas fases S e G2/M, o que foi
confirmado pelo aumento da expressão de Ki67. Todos os grupos exibiram
baixa marcação para Anexina V e PI e nenhuma alteração nuclear foram
detectadas, o que indica que a viabilidade não foi afetada pelas doses
estudadas. Conclui-se que os parâmetros do LBI utilizados (660 nm, 30 mW,
1,0 J/cm2) promovem proliferação das SHEDs e mantêm a sua viabilidade.
Palavras-chave: Polpa dentária; célula-tronco; terapia a laser; proliferação de
células.
37
INTRODUÇÃO
Células-tronco da polpa de dente decíduo humano esfoliado (sigla em
inglês SHED – Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth) foram
isoladas por Miura et al. [1] como uma população de células clonogênicas com
alta capacidade proliferativa, capaz de formar uma variedade de tipos
celulares. Experimentos com este tipo celular mostraram que há diferenças
significativas na biologia de células-tronco obtidas de dentes decíduos e de
dentes permanentes. Quando comparadas às células-tronco provenientes da
polpa de dentes permanentes, notou-se que as SHEDs apresentaram uma
maior taxa de proliferação [2], maior número de divisões celulares – o que pode
facilitar sua expansão in vitro –, além de maior formação de colônias,
capacidade de osteoinduçãoin vivo e formação de tecidos diferentes do
complexo dentina-polpa [1].
A obtenção dessas células é um processo simples, conveniente e com
pouco ou nenhum trauma, tendo em vista que toda criança perde os dentes
decíduos, sendo essa uma oportunidade perfeita para recuperar e armazenar
células-tronco para tratar doenças ou lesões futuras [3]. No entanto, estas
células precisam ser armazenadas para permitir seu uso clínico posterior; e o
rendimento em cultivo normalmente é baixo, tornando-se fundamental a
estimulação da proliferação in vitro, para que se obtenha um número adequado
de células [4].
A irradiação com laser de baixa intensidade (LBI) pode ser uma
estratégia eficaz para promover uma ampliação significativa do número de
células in vitro e sua posterior diferenciação, contribuindo com os processos
regenerativos in vivo e nos protocolos de engenharia tecidual. A capacidade
que o LBI apresenta de estimular a proliferação dos mais diferentes tipos
celulares tem sido relatado como o seu mais importante efeito fisiológico [5]. A
literatura mostra que o estimulo do LBI provoca um aumento na taxa
proliferativa em diversos tipos celulares como fibroblastos [6,7], células
endoteliais [8] e osteoblastos [9].
Dentre as diversas fontes de células-tronco, poucas foram avaliadas
quando submetidas à laserterapia [10-12], o que demonstra a necessidade de
38
realização de novos estudos para melhor compreender a ação que a
laserterapia exerce na proliferação dessas células. Quando se trata de
laserterapia em células-tronco de origem dental, a maioria dos artigos utiliza
células-tronco derivadas da polpa de dentes permanentes (DPSCs), enquanto
que estudos com células de outras fontes dentais ou periodontais são escassos
na literatura [12,13]. Por essa razão, o objetivo desse trabalho foi avaliar,
através de experimentos in vitro, a influência do LBI na atividade biológica de
células-tronco da polpa de dente decíduo humano esfoliado (SHED).
MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi aprovado pelo do comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Parecer CAAE:
34913314.4.0000.5537). Para isolamento das SHEDs foram utilizados três (03)
dentes decíduos humanos com pelo menos 1/3 de rizólise fisiológica.
Cultura de células
Após a exodontia, cada dente foi imediatamente mantido em tubo tipo
Falcon contendo 5 mL de meio alfa-MEM em condição hipotérmica (4ºC).
Posteriormente, em câmara de fluxo laminar, os dentes foram submetidos ao
protocolo descrito por Vasconcelos et al. [14], para evitar possível
contaminação por microorganismos: três lavagens de 10 minutos cada, com
uma solução contendo meio alfa-MEM enriquecido com 10.000 U.I./mL de
Penicilina, 10.000 µg/mL de Estreptomicina, 100 mg/mL de Gentamicina e 250
µg/mL de Anfotericina B (todos reagentes da Gibco, USA).
As SHEDs foram obtidas de acordo com o protocolo descrito por Ginani
et al. [15]. O tecido pulpar foi cuidadosamente retirado por curetagem e, em
seguida, o extrato foi submetido à digestão enzimática com 3 mg/mL de
colagenase I (Gibco,USA) e 4mg/mL de dispase (Gibco, USA), por 1 hora a
37°C. As culturas foram mantidas em meio alfa-MEM suplementado com 15%
de soro fetal bovino (Gibco, USA) a 37ºC em 5% de CO2 até atingirem 70 –
90% de confluência, com troca de meio a cada três dias.
39
Na primeira passagem (P1), as células foram analisadas para confirmar
sua natureza de célula-tronco, de acordo com os critérios estabelecidos por
Dominici et al. [16]. Em resumo, uma alíquota de células foi avaliada em
citometria de fluxo usando Human MSC Analysis Kit (BD Stemflow™, USA) que
permite avaliar os marcadores de superfície celular que, em conjunto,
identificam as células-tronco mesenquimais através de anticorpos para detectar
expressões positivas (CD105 PerCP-Cy5.5, CD73APC, CD90 FITC) e
negativas (CD45, CD34, CD11b, CD19, HLA-DR PE). Adicionalmente, as
células foram cultivadas em meios de diferenciação osteogênico e adipogênico
(StemPro® Differentiation Kits, InvitrogenCorp., Carlsbad, CA, USA) por até 21
dias e a natureza multipotencial das SHEDs foi confirmada através das
colorações de Von Kossa e Oil Red.
Desenho experimental
A Figura 1 mostra as etapas realizadas neste estudo. Após a
caracterização, as SHEDs foram expandidas e divididas em três grupos de
acordo com o tratamento utilizado: (I) Controle: sem irradiação; (II) Laser 0,5:
células irradiadas com uma dose de 0,5 J/cm2; (III) Laser 1,0: células irradiadas
com uma dose de 1,0 J/cm2. Em seguida, as células de todos os grupos foram
submetidas a ensaios para avaliar a viabilidade e a capacidade proliferativa e
identificar eventos relacionados à apoptose e ao ciclo celular.
Figura 1–Desenho experimental do estudo. P: passagem (subcultivo celular).
40
Irradiação laser
Na terceira e quarta passagens (P3 e P4), os grupos experimentais II e
III foram irradiados com um aparelho de Laser diodo InGaAlP (Kondortech –
Modelo BioWave LLLT Dual, São Carlos, Brasil), com os seguintes parâmetros:
potência de 30 mW; comprimento de onda de 660 nm; doses de 0,5 e 1,0
J/cm2; tempos de irradiação de 16 s (0,5 J/cm²) e 33 s (1,0 J/cm²); diâmetro da
ponta de 0,01 cm2; modo de ação contínuo; e aplicação com sonda de
irradiação perpendicular à placa, a 0,5 cm das células. A potência do laser foi
medida com o dispositivo Laser Check Power Meter (Coherent Inc., Santa
Clara, CA, USA) antes de cada aplicação.
As irradiações foram efetuadas nos intervalos 0 e 48 h e as análises
foram efetuadas nos intervalos de 0, 24, 48 e 72 h após a primeira aplicação do
laser. Para o teste de exclusão do Azul de Tripan e ensaio de MTT, as células
foram cultivadas em placas de 24 e 96 poços, respectivamente, com a
irradiação sendo realizada no ponto central de cada poço. Nos ensaios para
avaliação do ciclo celular, expressão de Ki67 e apoptose, as células foram
cultivadas em placas de 6 poços e a aplicação do laser ocorreu em cinco
pontos fixos e distintos em cada poço. O plaqueamento celular foi realizado de
forma que entre os poços semeados havia um poço vazio, impedindo a
dispersão de luz não intencional entre os poços durante aplicação da
laserterapia.
Análise da proliferação celular
A proliferação celular foi analisada pelo método de exclusão do Azul de
Tripan e pelo ensaio de MTT, nos intervalos de 0, 24, 48 e 72 h após a primeira
irradiação, com todos os experimentos realizados em quadruplicata (n=4). Para
a coloração com Azul de Tripan, as células foram cultivadas em placas de 24
poços, na densidade de 2x104 células/poço. O número de células coradas pelo
Azul de Tripan em cada poço foi obtido através da contagem em câmara de
Neubauer, em cada intervalo de tempo analisado. Para o ensaio de MTT, as
células foram cultivadas em placas de 96 poços na densidade de 5x103
células/poço e a absorbância das amostras foi medida em um leitor de
microplacas (Epoch-Biotech Instruments, USA) no comprimento de onda de
570 nm.
41
Análise do Ciclo Celular
A fim de avaliar os efeitos da laserterapia sobre o ciclo celular, as células
de cada grupo foram cultivadas em triplicata (n=3) em placas de seis poços na
densidade de 2 x 105 células/poço. Após os intervalos estudados (0, 24, 48 e
72h), as células foram processadas e foram adicionados 5 µL de Iodeto de
Propídeo (25 mg/mL, Invitrogen, USA), juntamente com 200 µL de PBS gelado,
seguindo-se a análise das células em citômetro de fluxo FACS Canto II (BD
Biosciences, USA).
Análise da expressão de Ki67
A análise da expressão da proteína nuclear Ki67 foi realizada em
citometria de fluxo. Para isso, as células foram cultivadas em triplicata (n=3),
em placas de seis poços na densidade de 2 x 105 células/poço. No intervalo
T72, as células foram processadas e incubadas com 10 µL do anticorpo
monoclonal anti-Ki67 conjugado com FITC (Clone 7B11, Invitrogen, USA) por
20 minutos com proteção contra a luz e, em seguida, as células foram
analisadas em citômetro de fluxo.
Análise da Apoptose
Para avaliar os efeitos da laserterapia sobre a apoptose, foi utilizado o kit
FITC/Annexin V Dead Cell Apoptosis Kit with FITC Annexin and PI, for Flow
Cytometry (Invitrogen, USA). As células foram cultivadas em triplicata em
placas de seis poços na densidade de 2 x 105 células/poço. No último intervalo
de tempo analisado (T72), as células foram processadas e incubadas com 3 µL
de Annexin V – FITC e 1 µL da solução de PI a 100 µg/mL, por 15 minutos em
temperatura ambiente e mantidas sob proteção de luz. Após o período de
incubação, as células foram analisadas em citômetro de fluxo, medindo a
emissão de fluorescência a 530 nm e 575 nm.
Análise morfológica do núcleo
Para avaliar a existência de danos nucleares nas células submetidas à
laserterapia, as células foram cultivadas em placas de 24 poços, na densidade
de 2x104 células/poço. No intervalo de 72 horas, as células foram incubadas
42
com DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindole, Molecular Probes, USA), na diluição
1:1000, por 20 minutos em câmara escura. As células foram avaliadas em
microscópio de fluorescência (NIKON Eclipse Ti-U, USA), a fim de identificar a
eventual presença de núcleos picnóticos e fragmentação nuclear nas células
dos três grupos.
Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise não paramétrica. A diferença entre
os grupos para cada um dos intervalos de tempo estudados (0, 24, 48 e 72h)
foi analisada pelos testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney,
considerando-se um nível de significância de 5% (p<0,05).
RESULTADOS
As células pulpares apresentaram positividade para os marcadores de
superfície CD90 (98,8%), CD73 (99,9%) e CD105 (97,4%). Já para os
marcadores CD45, CD34, CD11b, CD19 e HLA-DR, menos de 1% das células
foram positivas. A microscopia de luz mostrou a deposição de matriz
mineralizada corada por Von Kossa e a presença de vesículas lipídicas
coradas por Oil Red O, o que representa, respectivamente, a diferenciação de
células osteoblásticas e adiposas (Figura 2).
43
Figura 2–(A-D) Análise da expressão dos marcadores de superfície para células-tronco
mesenquimais nas SHEDs: (A) CD90; (B) CD73; (C) CD105; (D) Coquetel negativo.(E-F)
Fotomicrografias das SHEDs submetidas a diferenciação osteogênica (E; Coloração por Von
Kossa, amplificação original x40) e adipogênica (F; Coloração por Oil Red, amplificação original
x100).
A análise do número de células obtidas pelo método de exclusão do Azul
de Tripan revelou que a dose de 1,0 J/cm2 promoveu um aumento da
proliferação celular nos intervalos de 48 e 72 horas, quando comparado com os
grupos controle e Laser 0,5 (p<0,05). Observa-se que o grupo controle teve
uma menor proliferação celular quando comparado com os grupos irradiados
(Laser 0,5 e Laser 1,0), com diferença estatisticamente significativa (p<0,05) no
intervalo de 72 h entre os grupos irradiados (Figura 3).
44
Figura 3 - Número de SHEDs nos intervalos de tempos estudados. Letras iguais correspondem
a diferença estatisticamente significativa (p<0,05; Teste de Mann-Whitney).
A atividade mitocondrial, medida pelo ensaio de MTT, apresentou
resultados semelhantes aos achados através das contagens com azul de
Tripan, uma vez que o grupo irradiado com a dose de 1,0 J/cm2 mostrou uma
redução significativamente maior do MTT nos intervalos de 24, 48 e 72 h,
quando comparado com o grupo não irradiado. Apenas no intervalo de 48 h foi
observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos irradiados
(Tabela 1).
Tabela 1. Análise dos valores de absorbância das SHEDs em cada intervalo de tempo após a
lasertarpia nos diferentes grupos estudados.
DP: desvio padrão. *Teste de Mann-Whitney; os números em negrito indicam diferença
estatisticamente significativa (p<0,05)
Controle Laser 0,5 Laser 1,0 p*
Média ± DP Média ± DP Média ± DP C vs. 0,5 C vs. 1,0 0,5 vs. 1,0
T0 0,306 ± 0,080 0,334 ± 0,061 0,358 ± 0,070 0,3624 0,0524 0,2152
T24 0,387 ± 0,077 0,469 ± 0,060 0,454 ± 0,055 0,0038 0,0077 0,6619
T48 0,593 ± 0,095 0,608 ± 0,088 0,695 ± 0,088 0,9430 0,0127 0,0184
T72 0,696 ± 0,095 0,773 ± 0,095 0,813 ± 0,076 0,1067 0,0183 0,4965
45
A distribuição das células nas fases do ciclo celular foi coerente com
células em proliferação ao longo do experimento, sendo o grupo irradiado com
1,0 J/cm2 o que apresenta mais células proliferativas, com sua grande maioria
nas fases S e G2/M nos intervalos T48 e T72 (Figura 4).
Figura 4 - Distribuição das SHEDs nas fases do ciclo celular para os diferentes grupos
estudados, nos intervalos de tempo analisados. Os valores da porcentagem de cada fase do
ciclo representam a média da triplicata.
No intervalo de 72 horas após a primeira irradiação, a expressão da
proteína nuclear Ki67 foi maior nas células dos grupos irradiados do que nas
células que não foram irradiadas (controle), sendo que a dose de 1,0 J/cm2 foi
a que promoveu uma expressão maior de Ki67 (Figura 5). Esse resultado
corrobora com a análise do ciclo celular, uma vez que confirma que as células
do grupo Laser 1,0 concentravam-se nas fases proliferativas.
46
Figura 5 – Imunoexpressão de Ki67 nos grupos estudados. FlowJo (USA)
Em relação à avaliação de apoptose, as células exibiram níveis baixos
de fluorescência tanto para a anexina V quanto para o PI na citometria de fluxo
– o que é compatível com células viáveis – no intervalo de 72 horas,
demonstrando que não houve alterações consideráveis ao longo do
experimento (Figura 6). Este fato representa um indicativo de que as doses
estudadas não estão causando danos celulares às SHEDs.
Figura 6 - Imunomarcação das SHEDs com Anexina V/PI no intervalo de 72 horas. Q1: Anexina
V negativo/PI positivo; Q2: Anexina V/PI positivos; Q3: Anexina V positivo/PI negativo; Q4:
Anexina V/PI negativos. (A) Grupo controle não irradiado; (B) Grupo Laser 0,5; (C) Grupo Laser
1,0.
Não foram observados danos morfológicos ao DNA das SHEDs
submetidas a laserterapia durante o intervalo do estudo. As células não
apresentaram alterações significativas, tais como fragmentações nucleares e
núcleos picnóticos (Figura 7).
47
Figura 7 – Fotomicrografia das SHEDs após 72 horas de cultivo, coradas por DAPI. A -
Controle; B - Laser 0,5; C - Laser 1,0. (Coloração DAPI, 40x)
DISCUSSÃO
As células-tronco de origem dental são isoladas dos tecidos dento-
alveolares [17,18] e apresentam alta capacidade proliferativa e plasticidade,
podendo ser utilizadas para a regeneração das estruturas dento-faciais (como
osso alveolar, complexo dentina-polpa) ou outros tecidos como o tecido neural
[19]. Dentes decíduos humanos têm sido relatados na literatura como uma
fonte promissora para obtenção de células-tronco mesenquimais, que poderão
ser usadas em diversas aplicações clínicas, incluindo a engenharia de tecido
dentário [1], reparo de defeitos ósseos [20] e até mesmo no tratamento de
lesões do tecido neural e doenças degenerativas [21,22].
O isolamento simples e conveniente e a imunogenicidade insignificante –
permitindo, assim, seu uso em transplantes alogênicos sem a utilização de
imunossupressores [21,23,24] – conferem às células-tronco da polpa de dente
decíduo humano esfoliado (SHED) uma importante utilidade clínica, inclusive
na criação de bancos de células. Todavia, a proliferação dessas células é um
processo demorado e a identificação de métodos que aumentem o número de
células disponíveis em um menor intervalo de tempo tornam-se fundamentais.
Nesse contexto, uma das possibilidades sugeridas na literatura é o uso do laser
de baixa intensidade (LBI) [25-27].
O efeito bioestimulatório do LBI tem sido relatado há pelo menos quatro
décadas. Desde que esse efeito foi relatado pela primeira vez, os
pesquisadores neste campo têm buscado o melhor protocolo de laserterapia
48
para promover os efeitos bioestimulatórios positivos atribuídos ao laser de
baixa intensidade [28]. Na literatura, dentre as diversas fontes de células-
tronco, poucas foram avaliadas em relação a laserterapia, especialmente em
relação a células-tronco de origem dental [11,12,13], demonstrando assim a
necessidade de novos estudos com células-tronco obtidas de outras fontes, a
fim de compreender melhor a ação que o LBI exerce na proliferação dessas
células. O presente estudo avaliou o efeito da LBI em SHEDs, uma fonte de
célula-tronco dental pouco estudada, com apenas três estudos publicados
anteriormente [28-30].
Com relação a avaliação da ação do LBI nas células-tronco pulpares, a
literatura apresenta efeitos positivos da associação das células da polpa de
dentes permanentes com a laserterapia [27,31,32]. Quando se trata de SHEDs
associada ao laser de baixa intensidade, estudos prévios mostraram efeitos
positivos na sobrevida de SHEDs submetidas à condição de estresse [30] e na
diferenciação odonto-osteogênica [29], todavia este é o primeiro estudo a
avaliar, além da viabilidade e da proliferação, os efeitos da laserterapia no ciclo
celular, apoptose e morfologia nuclear, exibindo seus resultados favoráveis
nestes eventos biológicos.
Alguns aspectos do laser podem influenciar os resultados de proliferação
desejados, como o comprimento de onda, a potência e a densidade de energia
[26]. A literatura relata que tanto o espectro de luz visível (vermelho), quanto o
de luz infravermelho causam efeitos biológicos nas células irradiadas, sendo o
comprimento de onda variando de 600 a 700 nm o que apresenta melhores
resultados na bioestimulação celular [33-35]. Assim, optou-se por usar o
comprimento de onda de 660 nm nesse estudo, o que promoveu efeitos
bioestimulatórios positivos semelhantes aos relatados por Soares et al. [26],
Zaccara et al. [27], Eduardo et al. [31], confirmando a ação bioestimulátoria do
espectro de luz vermelha.
Além do comprimento de onda, a dose (densidade de energia) é outro
parâmetro que deve ser considerado quando se deseja a bioestimulação
celular. Doses variando de 0,5 a 10 J/cm2 são utilizadas para induzir a
proliferação celular, enquanto doses superiores a 10 J/cm2 podem promover
efeitos antiproliferativos [35]. Densidades de energia variando de 0,5 a 4 J/cm2
têm sido mais efetivas na estimulação do crescimento em células-tronco [25-
49
27,36,37] porém o efeito da variação da densidade de energia com
manutenção da potência ainda é desconhecido em SHEDs.
De acordo com Karu [38] o aumento da dose pode provocar danos aos
fotorreceptores e como resultado, o efeito biomodulatório do laser é reduzido. É
provável que doses menores diminuam o risco de dano celular e, no caso das
células-tronco, contribuam para o aumento de sua população, mantendo suas
características inicias íntegras [26]. Utilizando doses menores (0,5 e 1,0 J/cm2),
o presente estudo conseguiu promover a bioestimulação sem causar danos a
morfologia do núcleo celular nem perda de viabilidade. Fato este confirmado
pela marcação dos núcleos das células irradiadas com DAPI, que demonstrou
núcleos íntegros, sem a presença de fragmentação nuclear ou núcleos
picnoticos. Além disso, a análise dos marcadores relacionados à apotose
(anexina V/PI) mostraram que a maioria das células que foram submetidas à
laserterapia permaneceu viável, reforçando que o LBI não afeta a viabilidade
das células estudadas.
Nossos resultados corroboram os de Fernandes et al., [28] quanto ao
êxito na proliferação de células-tronco da polpa de dentes decíduos utilizando
comprimento de onda de 660 nm e com doses baixas (1,2 J/cm2). Todavia, os
autores avaliaram variações de dose e também da potência (1,2 J/cm2 – 0,5
mW; 2,5 J/cm2 – 10 mW; 3,7 J/cm2 – 15 mW; 5,0 J/cm2 – 20 mW; e 6,2 J/cm2 –
25 mW) e ainda utilizaram intervalos muito curtos para avaliação da
proliferação celular (6 e 24 horas). De fato, variações de parâmetros na
laserterapia têm sido um dos principais complicadores na comparação de
estudos em fotobiomodulação [39].
Doses de 0,5 e 1,0 J/cm2 foram testadas anteriormente em células-
tronco do ligamento periodontal humano [26] e em células-tronco da polpa de
dentes permanentes [27], com os demais parâmetros do laser iguais ao
utilizados no presente estudo. As células da polpa de dentes permanentes
apresentaram uma maior proliferação nos últimos tempos estudados (72 e 96h
após a irradiação) quando irradiadas com a dose de 1,0 J/cm2 comparadas
com o grupo controle não irradiado [27]. Comportamento semelhante foi
demonstrado com as células-tronco do ligamento periodontal humana que,
quando irradiadas com uma dose de 1,0 J/cm2, apresentaram uma taxa
proliferativa significativa maior quando comparado com o grupo não irradiado,
50
nos últimos tempos avaliados (48 e 72 horas após a irradiação) [26]. Com base
nestes resultados e nos encontrados no presente estudo, acredita-se que a
dose de 1,0 J/cm2 possa ser efetiva no aumento da proliferação de outras
fontes de células-tronco. Além disso, pode-se observar que esta dose permitiu
uma resposta proliferativa mais acentuada das SHEDs em comparação com a
dose 0,5 J/cm2, o que foi demonstrado pela expressão de Ki67 e a distribuição
das células no ciclo celular.
A análise do ciclo celular demonstrou a distribuição das células em fases
consistentes com a proliferação celular (S e G2/M), corroborando os achados
anteriores em células-tronco da polpa dental [27]. Embora o mecanismo
molecular exato pelo qual o LBI exerce seus efeitos sobre a proliferação celular
não esteja completamente compreendido, os dados experimentais mostraram
que a irradiação é seguida pelo aumento da síntese de fatores de crescimento,
óxido nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio (ROS), ATP, RNA, e DNA
[40]. No teste de MTT, o grupo irradiado com a dose de 1,0 J/cm2 exibiu os
melhores resultados nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após a primeira
irradiação em comparação com o grupo controle (não irradiado) e este foi
significativamente melhor quando comparado ao grupo irradiado na dose de
0,5 J/cm2, no intervalo de 48 horas. Os resultados estão de acordo com os
estudos de Barboza et al. [25], que irradiaram células-tronco da medula óssea
e derivadas do tecido adiposo e de Stein, et al. [41], que irradiaram
osteoblastos humanos. Ambos os trabalhos apresentaram maior proliferação
celular usando um comprimento de onda de 660 nm e uma dose de 1,0 J/cm2.
Os resultados deste estudo mostraram que o LBI nos parâmetros
utilizados (potência de 30 mW, comprimento de onda de 660 nm e densidade
de energia de 1,0 J/cm2) estimularam a proliferação de SHEDs, sem afetar a
viabilidade ao longo do experimento. Estes dados têm relevância clínica
potencial, uma vez que o uso do LBI representa uma oportunidade terapêutica,
especialmente no campo da terapia celular e da engenharia tecidual.
Considerando o número limitado de experimentos e a heterogeneidade das
metodologias empregadas, mais pesquisas são necessárias para identificar os
parâmetros ideais para estimular proliferação e especialmente a diferenciação
deste tipo celular induzidos pela laserterapia.
51
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56
4. ARTIGO II
Para submissão ao Journal of Biomedical Materials Research – Part
B:Applied Biomaterials (ISSN 1552-4981) – IF 2.881 (JCR® 2015) – Qualis
A2
INFLUÊNCIA DA FOTOBIOMODULAÇÃO NA PROLIFERAÇÃO DE
CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DENTÁRIA CULTIVADAS SOBRE
ARCABOUÇOS POLIMÉRICOS NANOFIBROSOS.
Influence of photobiomodulation on the proliferation of dental pulp stem
cells cultivated on polymeric nanofibrous scaffolds.
Fernanda Ginania, Talita Nascimento da Silvab, Paulo Henrique de Souza
Piccianib, Carlos Augusto Galvão Barbozaa
aPrograma de Pós-Graduação em Patologia Oral, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brasil
bPrograma de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Polímeros,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Autor para correspondência:
Carlos Augusto Galvão Barboza
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral
Av. Salgado Filho, 1787 – Lagoa Nova
CEP 59056-000 – Natal – RN – Brasil
e-mail: cbarboza@cb.ufrn.br
57
RESUMO
A eletrofiação tem sido estudada para produção de nanofibras de polímeros,
sendo o ácido polilático (PLA) um biomaterial promissor pelas suas
propriedades físicas e baixo custo. O laser de baixa intensidade (LBI) tem
apresentado resultados positivos na proliferação de diversos tipos celulares in
vitro. Este estudo avaliou o efeito do LBI (comprimento de onda 660 nm;
potência 30 mW; doses de 0,5 e 1 J/cm2) na proliferação de células-tronco da
polpa de dentes decíduos humanos cultivadas sobre arcabouços nanofibrosos
de PLA confeccionados pela técnica de eletrofiação. Três grupos experimentais
(G1 – não irradiado; G2 – irradiado com 0,5 J/cm2; G3 – irradiado com 1,0
J/cm2) foram analisados nos intervalos de 24, 48 e 72 h. Os resultados
demonstraram que o PLA não é citotóxico para as SHEDs, que apresentaram
tendência proliferativa em todos os grupos no decorrer do experimento. Os
grupos submetidos à laserterapia (G2 e G3) tiveram maior crescimento celular
do que o grupo controle não irradiado (G1), com melhores resultados para o G3
no intervalo inicial (T24) e para G2 nos demais intervalos (T48 e T72). Conclui-
se que as nanofibras de PLA são arcabouços favoráveis para o cultivo de
SHEDs e que a laserterapia nos parâmetros estudados promoveu efeitos
bioestimulatórios quando aplicada nas células cultivadas sobre este arcabouço.
Palavras-chaves: Materiais biocompatíveis; polímeros; eletrofiação; células-
tronco; laserterapia.
58
INTRODUÇÃO
A engenharia de tecidos tem sido bastante utilizada para proporcionar a
reparação funcional, com o desenvolvimento de substitutos biológicos que
possam restaurar, manter ou substituir tecidos e órgãos danificados. Esta
ciência envolve três componentes básicos: um arcabouço que proporciona
estrutura e substrato para o crescimento e desenvolvimento tecidual; uma fonte
de células para facilitar a formação do tecido desejado; e fatores de
crescimento ou estímulos biofísicos que direcionem o crescimento e
diferenciação das células no arcabouço [1].
Os tecidos animais são compostos por células embebidas em uma
matriz extracelular (MEC); estruturalmente a MEC natural é uma rede
tridimensional de fibras composta por várias proteínas e polissacarídeos, com
diâmetro variando de dezenas a centenas de nanômetros [2]. Assim, na
engenharia tecidual o arcabouço desempenha um papel crítico, devendo
mimetizar as características estruturais e as funções biológicas da MEC natural
do tecido, como a microarquitetura com um tamanho de poro suficiente para
promover a adesão, proliferação e migração celular, além da deposição de
matriz [3].
Com o desenvolvimento das técnicas de produção dos biomateriais, os
tipos de arcabouços e a qualidade do tecido formado se tornam cada vez mais
versáteis [4]. A eletrofiação (eletrospinning) é uma das técnicas mais
comumente utilizadas na literatura para a fabricação de suportes fibrosos. É
uma técnica bem estabelecida, usada para fabricar arcabouços fibrosos cujas
propriedades (tais como a porosidade, o tamanho de poro e o tamanho da
fibra) podem ser facilmente regulados [5]. A eletrofiação produz malhas não
tecidas contendo fibras que variam em diâmetro de dezenas de nanômetros até
dezenas de micrômetros. Materiais sintéticos ou naturais podem ser utilizados,
mas os polímeros sintéticos geralmente permitem uma maior capacidade de
adaptar as propriedades mecânicas e a taxa de degradação [6]. Os parâmetros
de fabricação, tais como o solvente de polímero, a concentração de polímero, a
tensão e a distância do coletor, podem ser variados para modificar as
propriedades da fibra e da estrutura [7].
59
O ácido polilático (PLA) é um biopolímero comercial que pertence à
família do ácido α-hidroxil e que pode ser usado puro ou associado a outros
polímeros naturais ou sintéticos, possuindo uma variedade de aplicações
biomédicas devidas a sua elevada resistência, biodegradabilidade,
biocompatibilidade e baixo custo [8-10]. Quando utilizado como arcabouço, o
PLA promove um excelente ambiente para o crescimento celular especialmente
por suas propriedades físicas [11]. Arcabouços nanofibrosos de PLA
produzidos pela técnica de eletrofiação têm se mostrado uma ferramenta
versátil para a engenharia de tecidos, como uma superfície topográfica
tridimensional para a fixação das células, além de funcionar como um
dispositivo para entrega de drogas ou moléculas bioativas e um substrato para
bio-funcionalização [7].
O laser de baixa intensidade (LBI) tem sido considerado um grande
avanço tecnológico em virtude de suas diversas propriedades, tais como
monocromaticidade, direcionalidade, coerência e brilho, sendo utilizado como
adjuvante na área biomédica em virtude dos seus efeitos terapêuticos,
sobretudo para a bioestimulação tecidual e reparo ósseo. Estudos mostram
que a energia da luz também aumenta a quantidade de ATP; acelera a mitose;
melhora a reparação tecidual e óssea; equilibra a produção de fibroblasto,
normalizando as fibras colágenas e elásticas, que são depositadas na
reparação tecidual; e aumenta a circulação sanguínea periférica, promovendo
ação anti-inflamatória e cicatrização tecidual [12].
Estudos moleculares mostram que, após a absorção dos fótons pelas
células, numerosas vias de sinalização são ativadas, levando à ativação de
fatores de transcrição. Estes fatores de transcrição podem promover o aumento
da expressão de genes relacionados com a síntese de proteínas, a migração e
proliferação celular, a sinalização anti-inflamatória, as vias anti-apoptóticas e
enzimas antioxidantes. As células-tronco e células progenitoras parecem ser
particularmente suscetíveis ao LBI [13].
O efeito do LBI tem sido intensamente estudado nos últimos anos com o
objetivo de acelerar a proliferação de vários tipos celulares, representando uma
ferramenta útil para futuros avanços em engenharia tecidual [14]. Um efeito
bioestimulatório positivo in vitro do LBI foi demonstrado em osteoblastos sob
condições convencionais de cultivo [15-17] e em diversos tipos celulares
60
cultivados sob a superfície de biomateriais, incluindo policarbonato uretano
[18], biosilicato [19,20], matriz dérmica acelular [21] e estrutura porosa de
hidroxiapatita [22].
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da fotobioestimulação com
laser diodo no espectro de luz visível (660 nm) na proliferação de células-
tronco da polpa de dentes decíduos humanos (SHEDs) cultivadas sobre
arcabouços nanofibrosos de PLA confeccionados pela técnica de eletrofiação.
MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Parecer CAAE:
34913314.4.0000.5537). As células-tronco foram isoladas de três (03) dentes
decíduos em estágio final de esfoliação ou com exodontia indicada.
Após a exodontia, os dentes foram mantidos em condição hipotérmica
(4ºC) e submetidos ao protocolo de lavagem com antibióticos e antimicóticos
descrito por Vasconcelos et al. [23], com o objetivo de eliminar possível
contaminação das células por micro-organismos orais. Para obtenção das
SHEDs, o tecido pulpar foi cuidadosamente retirado por curetagem e, em
seguida, o extrato foi submetido à digestão enzimática com 3 mg/mL de
colagenase I (Gibco,USA) e 4mg/mL de dispase (Gibco, USA), por 1 hora a
37°C. As culturas foram mantidas em meio alfa-MEM suplementado com 15%
de soro fetal bovino (SFB) a 37ºC em 5% de CO2 até atingirem 70 – 90% de
confluência, com troca de meio a cada três dias.
Na primeira passagem (P1), a natureza das células-tronco
mesenquimais foi determinada de acordo com os critérios estabelecidos por
Dominici et al. [24]: adesão das células ao plástico de cultivo; imunomarcação
positiva de anticorpos de superfície (CD105, CD73 e CD90) em citometria de
fluxo usando o Human MSC Analysis Kit (BD Stemflow™, USA); e capacidade
de diferenciação osteogênica e adipogênica após cultivo com meios de indução
(StemPro® Differentiation Kits, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) por até 21
dias.
Os arcabouços foram confeccionados no Laboratório de Dispositivos
Poliméricos (LADISPO) do Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa
61
Mano (IMA) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). O PLA (peso
molecular 200.000 g/mol; Natureworks, Minnetonka, MN, USA) foi dissolvido
em clorofórmio e dimetilformamida (DMF), em uma proporção de 4:1. A
eletrofiação da solução polimérica de PLA a 16% foi realizada por meio de uma
fonte de alimentação de alta tensão (Modelo PS / FC60P02.0-11, Glassman
High Voltage Inc., NJ, EUA) e uma bomba de seringa controlada digitalmente
(Modelo 100, KD Scientific Inc., Holliston, MA) nas seguintes condições: vazão
da solução polimérica na seringa de 0,5 mL/hora, tensão aplicada de 20 kV,
umidade relativa de 71% a 22ºC. A distância entre o coletor e a seringa foi de
13 cm. A morfologia das nanofibras de PLA foi avaliada no IMA/UFRJ em um
microscópio eletrônico de varredura com emissão de campomodelo Hitachi S-
4700 (NewYork, USA).
Após a obtenção das fibras nas dimensões adequadas (6 mm de
diâmetro), estas foram submetidas ao processo de esterilização adaptado do
protocolo descrito por Mansourizadeh et al. [25]: exposição por três horas na
luz ultravioleta em câmara de fluxo laminar; lavagem com etanol 70% durante
30 minutos; e três lavagens com tampão fosfato (PBS) por 15 minutos cada.Em
seguida, as fibras de PLA foram dispostas em placas de 96 poços e imersas
em meio alfa-MEM suplementado com 15% de SFBovernight a 37ºC em 5% de
CO2, com o objetivo de aumentar a hidrofilia do biomaterial.
Após esse período, os arcabouços foram divididos em três grupos
experimentais para o cultivo celular: (G1) PLA: células cultivadas no PLA sem
irradiação; (G2) PLA + Laser 0,5: células cultivadas no PLA e irradiadas com
uma dose de 0,5 J/cm2; (G3) PLA + Laser 1,0: células cultivadas no PLA e
irradiadas com uma dose de 1,0 J/cm2. As células foram cultivadas na
densidade de 5x103 células/poço. Nos grupos G2 e G3 as células foram
irradiadas nos intervalos T0 e T48 (48 h após a primeira irradiação) com um
aparelho de Laser diodo (Kondortech – modelo Bio Wave LLLT Dual, São
Carlos, Brasil), com as características apresentadas na Tabela 1. O
plaqueamento celular foi realizado de forma que entre os poços semeados
havia um poço vazio, impedindo a dispersão de luz não intencional entre os
poços durante aplicação da laserterapia.
62
Tabela 1 - Parâmetros do Laser utilizado
Composição InGaAlP
Potência 30 mW
Comprimento de onda 660 nm
Modo de ação Contínuo
Diâmetro da ponta 0,01 cm2
Doses utilizadas 0,5 e 1,0 J/cm²
Tempo de irradiação 16 s (0,5 J/cm²) e 33 s (1,0 J/cm²)
Modo de aplicação sonda de irradiação perpendicular à placa, a 0,5 cm das células
A proliferação e viabilidade celular foram avaliadas através do ensaio de
MTT e através do Live-Dead Assay Cytotoxicity Kit for mammalian cells
(Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Para o ensaio de MTT, a leitura da
absorbância das amostras foirealizada em um leitor de ELISA em um
comprimento de onda de 570nm, nos intervalos de 24, 48 e 72 h após a
primeira aplicação do laser.
No intervalo de 72 horas foi realizado o ensaio Live/Dead. Para tanto, os
poços dos grupos foram incubados com 2 µM de calceína AM (que cora em
verde o citoplasma de células vivas) e 4 µM de homodímero de etídio (que cora
em vermelho o núcleo de células mortas), por 20 minutos, em ambiente
protegido da luz. As amostras foram avaliadas em microscópio de fluorescência
(Zeiss Imager A2, Oberkochen, Alemanha) e foram obtidas fotomicrografias do
campo central de cada amostra (n=4) para análise do número de células
mortas.
Os dados foram submetidos à análise não paramétrica. A diferença entre
os grupos para cada um dos intervalos de tempo estudados foi analisada pelos
testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, considerando-se um
nível de significância de 5% (p<0,05).
RESULTADOS
63
A microscopia eletrônica de varredura revelou que as fibras de PLA
produzidas pela técnica de eletrofiação, nos parâmetros utilizados,
apresentaram tamanho médio de 616 ± 177 nm (Figura 1).
Figura 1 – Micrografia eletrônica das fibras de PLA produzidas por eletrofiação. (A) Aumento de
1.500x; (B) Aumento de 30.000x.
Através do ensaio de MTT foi possível observar que o PLA não é
citotóxico para as SHEDs, uma vez que as mesmas apresentaram uma
tendência proliferativa no decorrer do experimento (Figura 2). Quando
comparamos a associação do biomaterial com a laserterapia, observa-se que,
no primeiro intervalo analisado (T24), o laser na dose 1,0 J/cm2 (G3) promoveu
um maior crescimento celular, sendo significativamente melhor do que o laser
na dose de 0,5 J/cm2 (G2). Já após a segunda irradiação (T48), essa situação
se inverte, passando o grupo irradiado com o laser na dose de 0,5 J/cm2 a
apresentar melhores resultados em relação a proliferação celular, quando
comparado com o grupo G3 (PLA + Laser 1,0) (p<0,05) (Tabela 1). Todavia, no
intervalo de 72 h, o ensaio do MTT mostra uma queda considerável nas leituras
do G2, enquanto os dados do G3 seguem em ascendência.
64
Figura 2 – Curva de proliferação das SHEDs associadas ao PLA nos intervalos de tempos
estudados, através do MTT.
Tabela 1. Análise dos valores de absorbância das SHEDs associadas ao PLA em cada
intervalo de tempo após a lasertarpia nos diferentes grupos estudados.
*Teste de Mann-Whitney; os números em negrito indicam diferença estatística (p<0,05)
Os dados do MTT foram confirmados pelo ensaio de viabilidade celular
(Live/Dead), que mostrou que o G2 exibiu médias de células mortas (marcadas
em vermelho pelo homodímero de etídeo) significativamente maior do que os
grupos G1 e G3 no intervalo de 72 h (Figura 3).
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
T24 T48 T72
De
nsi
da
de
óp
tica
(5
70
nm
)G1
G2
G3
G1 G2 G3 p*
Média ± DP Média ± DP Média ± DP G1 vs. G2 G1 vs. G3 G2 vs. G3
T24 0,490 ± 0,065 0,509 ± 0,056 0,620 ± 0,061 0,8182 0,0082 0,0140
T48 0,785 ± 0,045 0,949 ± 0,088 0,683 ± 0,083 0,0025 0,0732 0,0012
T72 0,792 ± 0,078 0,872 ± 0,056 0,792 ± 0,071 0,1320 0,9452 0,0245
65
Figura 3 – (A-C) Imunofluorescência das células marcadas com Live/Dead nos grupos G1 (A),
G2 (B) e G3 (C). Marcação em vermelho representa células mortas. Barra de escala = 100 µm.
(D) Média do número de células mortas por campo nos grupos estudados, no intervalo de 72 h.
*p<0,05; Teste de Mann-Whitney.
DISCUSSÃO
O PLA é amplamente utilizado em uma variedade de aplicações
biomédicas pelas suas características de biocompatibilidade,
biodegradabilidadee baixo custo [8,10] e por proporcionar um ambiente
favorável para o crescimento celular [7,11,26]. Sua interação tem sido estudada
com diversos tipos celulares, como condrócitos, fibroblastos [27-29], células
percursoras osteogênicas [30-32], células do sistema imune [33], e linhagens
de células neuronais [34-37].
Uma importante perspectiva para o uso do PLA é sua associação com
células-tronco, especialmente na forma de arcabouços tridimensionais
nanofibrosos produzidos pela técnica de eletrofiação. Este processo promove
um microambiente adequado para a manutenção do fenótipo celular e do
crescimento das células com base na orientação das fibras, favorecendo a
66
adesão e a proliferação celular [38]. Marei et al. [26] cultivaram células
mesenquimais derivadas da medula óssea e do tecido adiposo
sobrearcabouços de PLA eletrofiados e observaram que o biomaterial
favoreceu a adesão e a proliferação celular. Russo et al. [39] também
observaram um aumento da adesão e proliferação celular quando cultivaram
células-tronco epiteliais aminióticas em arcabouços de PLA produzidos pela
mesma técnica. O presente estudo representa o primeiro relato do uso de
SHEDs associadas a nanofibras de PLA e os resultados favoráveis obtidos
podem representar uma perspectiva promissora na reconstrução de tecidos
dentários e ósseos perdidos.
Um requisito na engenharia tecidual é a obtenção de um número
adequado de células-tronco, visto que o seu rendimentoin vitro normalmente é
baixo [40]. Neste sentido, o laser de baixa intensidade (LBI) destaca-se como
uma ferramenta importante para aumentar o número de células-tronco
disponíveis em um menor intervalo de tempo [14]. Todavia, a literatura é
escassa quanto ao número de estudos investigando o efeito do LBI na adesão
e proliferação de células cultivadas em diferentes biomateriais e não há
estudos quanto à sua aplicação associada ao PLA. Quando submetidas à
laserterapia, as SHEDs cultivadas sobre o PLA exibiram uma curva crescente
de proliferação ao longo do experimento, demonstrando que o biomaterial não
é citotóxico para este tipo celular e que o LBI exerceu efeitos bioestimulatórios.
Os efeitos positivos da irradiação em células-tronco mesenquimais em
condições de cultivo regulares foram previamente descritos [41-44] e têm sido
associados ao aumento do potencial da membrana mitocondrial e, portanto, à
produção de ATP [45,46] e à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS)
[47,48]. Estes eventos bioquímicos têm sido apontados como sendo
responsáveis pelo controle da proliferação, viabilidade, diferenciação celular e
apoptose [17,49,50]. Como o efeito da laserterapia é dose dependente [51], as
SHEDs, na presença do PLA, podem necessitar de um estímulo inicial maior
para proliferação, o que explicaria o melhor resultado para a maior dose
avaliada (1 J/cm2) no intervalo inicial do experimento (T24).
Choi et al. [21], estudando o efeito da irradiação com 1 J/cm2 na
viabilidade e proliferação de células mesenquimais cultivadas em uma matriz
dérmica acelular, observaram resultados positivos, semelhantes aos
67
encontrados nesse trabalho, o que sugere o uso da laserterapia como uma
abordagem interessante para a engenharia de tecidos. Efeitos bioestimulatórios
associados a terapia a laser também foram encontrados por Hsu et al. [18], que
irradiaram células endoteliais cultivadas em um suporte de poliuretano poroso
com uma dose de 1,18 J/cm2. Estes últimos autores optaram por irradiar as
células antes do cultivo no arcabouço por se tratar de uma biomaterial poroso,
enquanto no presente trabalho a irradiação ocorreu diretamente sobre as
células previamente cultivadas no arcabouço de PLA, apresentando resultados
semelhantes.
Avaliando doses maiores do LBI, Renno et al. [19] observaram que
células pré-osteoblásticas (MC3T3-E1) cultivadas em biosilicato e irradiadas
comuma dose de 10 J/cm2 apresentaram uma diminuição da proliferação
celularquando comparada ao grupo não irradiado. Resultados semelhantes
foram encontrados no estudo de Pinto et al. [20], que também utilizou um
suporte de biosilicato e uma dose de 120 J/cm2 para o reparo de defeitos
ósseos em ratos, e não identificou um efeito extra da laserterapia no processo
de regeneração. Esses resultados podem ser um efeito da interferência do
biomaterial no momento da aplicação do laser, onde a luz pode sofrer refração
ou absorção [19]. Além disso, as doses muito altas do laser podem causar
efeitos antiproliferativos como já relatado na literatura [52,53]. No caso do
arcabouço de PLA usado no presente trabalho, a possível refração ou
absorção de luz pelo biomaterial não parece ocorrer, já que obtivemos uma
curva proliferativa mais ascendente nos grupos irradiados quando comparados
com o grupo não irradiado durante o experimento.
Um resultado inesperado foi a queda na proliferação celular no G2 no
intervalo de 72 h, demonstrado pelo MTT e visto no ensaio Live/Dead como
uma quantidade significativamente maior de células mortas. Esta observação
requer futuras investigações e uma das hipóteses para este fenômeno é o fato
deste grupo ter exibido uma expressiva proliferação celular no intervalo de 48
h, o que pode ter comprometido o transporte de nutrientes e promovido uma
sobrecarga de metabólitos celulares no microambiente de cultivo.
Conclui-se que as nanofibras de PLA são arcabouços favoráveis para o
cultivo de SHEDs e que a laserterapia nos parâmetros estudados promoveu
efeitos bioestimulatórios quando aplicada nas células cultivadas sobre este
68
arcabouço. Estudos futuros são necessários para a melhor compreensão dos
processos envolvidos na proliferação e especialmente na diferenciação celular
induzidos pela laserterapia na superfície do biomaterial. Isto deve incluir
experimentos aplicando esta metodologia in vivo e o uso do PLA em forma de
blendas e/ou com modificações estruturais, visando proporcionar uma melhor
resposta celular.
69
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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em resumo, o presente estudo mostrou que o LBI nos parâmetros
utilizados (potência de 30 mW, comprimento de onda de 660 nm e densidades
de energia de 0,5 e 1,0 J/cm2) estimularam a proliferação de SHEDs cultivadas
tanto na superfície padrão (plástico da placa de cultivo celular) quanto em
arcabouços tridimensionais de PLA produzidos por eletrofiação.
O uso do LBI apresenta um importante potencial terapêutico,
especialmente com aplicação no campo da engenharia tecidual. Considerando
o número limitado de experimentos e a heterogeneidade das metodologias
empregadas, mais estudos são necessários para a melhor compreensão dos
processos envolvidos na proliferação e especialmente na diferenciação celular
induzidos pela laserterapia. Isto deve incluir experimentos in vivo e o uso do
PLA em forma de blendas e/ou com modificações estruturais, visando
proporcionar uma melhor resposta celular para utilização na medicina
regenerativa e na engenharia tecidual.
76
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