Cromatografia–Noções gerais e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: Vitória Berg Cattani...

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Cromatografia–Noções gerais e Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência:

Vitória Berg Cattani

Universidade Federal de Santa MariaCentro de Educação Superior Norte - RS

CROMATOGRAFIA

Michael Tswett - 1906

éter depetróleo

CaCO3

mistura depigmentos

pigmentosseparados

CROMATOGRAFIA

Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou

sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

Princípio Básico

TIPOS DE MECANISMOS Depende do tipo de fase estacionária.

Transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária.

ADSORÇÃO

Na superfície das partículas sólidas.

PARTIÇÃO

Entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionária que fica nos poros de um suporte sólido inerte.

BIOAFINIDADE

TIPOS DE MECANISMOS

TROCA IÔNICA

Com componentes iônicos da fase estacionária;

Inclui resinas trocadoras de cátions e de ânions.

EXCLUSÃO

Processo mecânico

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA

Planar Em coluna

Gasosa Fluidosupercrítico

LíquidaLíquido

Centrífuga (chromatotrom)

CCD CP CG ClássicaCGAR CLAE

ou HPLC

Técnica

Fase Móvel

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR

padrões amostras

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR

Aplicações:

•separação de substâncias;

•identificação de substâncias.Rf = ds/dmdm

ds1

ds2

CHROMATOTRON®

Aplicações:

•separação de substâncias.

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR

Eluente

CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA

Aplicações:

•separação de substâncias.

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA

Solvente

Fase estacionária

Algodão

CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA

CROMATOGRAFIA GASOSA

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

Usada para separar compostos orgânicos voláteis;Separação ocorre devido a partição entre:

fase móvel (gás inerte);fase estacionária (sílica da coluna).

Aplicações:

Separação de substâncias;

Identificação de substâncias:

tempo de retenção;

espectro de massas (CG-MS);

Quantificação de substâncias (padrão).

AU

ME

NT

O D

A

TE

MP

ER

AT

UR

A D

A C

OL

UN

A

CROMATOGRAFIA GASOSA

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) OU

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

COLUNA CROMATOGRÁFICA

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

COLUNA CROMATOGRÁFICA

Solvente (fase móvel)

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

FASE ESTACIONÁRIA

FASE NORMAL

Superfície da sílica com característica POLAR.

FASE REVERSA

Superfície da sílica com revestimento APOLAR.

Ex.: C18 (ODS), C8 – fase ligada;

Ex.: poliestireno, poliacrilato – polímeros adsorvidos.

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

FASE ESTACIONÁRIA

CH3O

CHCH3

COOH

Si O Si O

Si O Si O

OH OHPontes de hidrogênio

Si O O

Si O Si O

Fase normal (sílica gel) Fase reversa (sílica ODS)

COOH

CHCH3

CH3OInteração Van der Waals

OC18H37 OC18H37

Si

Figura 1- Interação do naproxeno com a superfície da sílica gel e sílica gel ODS

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

mistura

degasser

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

mistura

degasser

ELUIÇÃO ISOCRTÁTICAOU ELUIÇÃO EM GRADIENTE

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

Degas-ser

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

Degas-ser

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

Degas-ser

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

Degas-ser

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

Degas-ser

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

ESTRUTURA DO HPLC

fase móvel

descarte

bomba injetor

detector

Degas-ser

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

DETECTORES:

UV/vis – baseado na absorção de luz pelo analito. Boa sensibilidade (0,01-100µg)

DAD (diode array detector) – tipo avançado de UV

Fluorescência

Eletroquímico

Massa

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

APLICAÇÕES:

Separação de substâncias;

Identificação de substâncias:

tempo de retenção;

espectro de absorção no UV-VIS( HPLC-UV/VIS);

Quantificação de substâncias (padrão).

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

VANTAGENS:

Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores;

Seletividade;

Menor risco de degradação da amostra (CG);

Boa sensibilidade (nanogramas).

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA

LIMITAÇÕES:

Alto custo do equipamento;

Alto custo da operação (colunas e solventes);

Experiência do analista no manuseio do equipamento;

Necessidade de extração antes do uso;

Grande quantidade de resíduo formado.

CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

•Retenção ou Fator de Capacidade (k’)•Mede o tempo de permanência do composto na fase estacionária comparado com o tempo de permanência na fase móvel durante a corrida.

•Indica o grau de afinidade que a fase estacionária e a fase móvel possuem pelo composto.

0

01

0

01'V

VV

T

TTK

T0: tempo de retenção de um composto não retido pela coluna

•Seletividade ()•Compara a retenção de um componente com a retenção de outro componente, indicando até que ponto o sistema químico (coluna e fase móvel) os diferencia.

01

02

1'

2'

VV

VV

K

K

CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

•Resolução (R)•Avalia a qualidade da separação entre dois componentes de acordo com uma determinada condição cromatográfica.

)( 122

12

WW

TTR

•Eficiência (N)•Indica o quanto o sistema de CLAE permite que a banda de um componente se dilua durante a corrida cromatográfica.

•Avalia o alargamento da banda de um pico de um componente causados por fatores ligados ao injetor, coluna, fase móvel, detector.

2

1

116

W

TN

CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

•Influência da geometria da coluna na separação Influência da geometria da coluna na separação cromatográficacromatográfica

•Comprimento (maior)

•Maior eficiência (no de pratos teóricos);

•Maior tempo de análise e consumo de solventes;

•Maior resolução;

•Maior capacidade;

•Maior pressão de trabalho.

•Diâmetro interno (menor)

•Maior seletividade (picos mais finos);

•Maior eficiência (menor diluição do pico);

•Menor capacidade;

•Análise mais rápida, menor consumo de solventes e menor pressão.

SPE NH2

SPE C18

Benomyl

Tebuthiuron

Simazine

Atrazine

Diuroion

Ametryn

Coluna C18, FM: ACN:0,01% NH4OH (35:65, v/v), fluxo 0,7 mL/min.

Triazine

Simazine

Atrazine

FM: ACN:H2O: CH3COOH (50:50:0,01, v/v)

Coluna C18; fluxo: 0,3 mL/mi); detecção: 220nm

Folpet

Chlorothalonil

Quinomethionat

Tetradifon

Trifluralin

FM (gradiente côncavo): ACN:H2O (40:60 a 90:10 em 20 min; permaneceu 90:10 por 5 min; retornou a 40:60 em 5 min).

Coluna C18; fluxo: 1,0 mL/min; detecção: 220 e 260 nm