Andressa Andressa SpradaSprada

DIAGNDIAGNÓÓSTICO LABORATORIAL DE STICO LABORATORIAL DE MICOBACTMICOBACTÉÉRIAS RIAS

LacenLacen/PR/PR

29 DE MAIO DE 201429 DE MAIO DE 2014

POR QUE POR QUE MICObactMICObactéériasrias??*** Além de membrana citoplasmática, cromossomo, ribossomos, grânulos de

polifosfato, vacúolos lipídicos e mesossomos, as micobactérias tem uma

parede celular rica em lipídeos, entre eles os ácidos micólicos.

Ácidos micólicos + Fucsina = NÃO se descoram com o álcool-ácido e, por isso,

são chamados de BAAR!!!!

Parede celular de micobacteria: 1-lípidos externos, 2-ácido micólico, 3-polisacáridos(arabinogalactano), 4-peptidoglicano, 5-membrana plasmática, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-fosfatidilinositol manósido, 8-esqueleto da parede celular

BACILOSCOPIABACILOSCOPIA

• Realizada apenas para o Hospital Oswaldo Cruz!!!!

• BACILOSCOPIA (S = 40 – 60 %)

Coloração de Ziehl-Neelsen

Amostras – Escarro, Secreções, Biópsia,

LBA (???), Líquidos (???), Urina (???),

Líquor (???),......

- + de 5000 bacilos/mL de escarro

BACILOSCOPIABACILOSCOPIA

• Leitura da baciloscopia segundo Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras micobactérias:

NEGATIVO: Não são encontrados BAAR em 100 campos

QUANTIFICA: 1 a 9 BAAR em 100 campos

+ : 10 a 99 BAAR em 100 campos

++ : 1 a 10 BAAR por campo em 50 campos

+++ : mais de 10 BAAR em 20 campos

BACILOSCOPIABACILOSCOPIA

BACILOSCOPIABACILOSCOPIA

BACILOSCOPIABACILOSCOPIA

BACILOSCOPIABACILOSCOPIA

BACILOSCOPIABACILOSCOPIA

CULTURA DE BAARCULTURA DE BAAR- Amostras = Escarro, LBA, Líquidos,

LCR, Secreções, Biópsia, LG, Sangue

-Descontaminação pelo Petroff/

Semeadura em Lowenstein Jensen

(V= 2 mL)

- Ogawa-Kudoh (V= 1 mL) - Feita no Lacen/PR

- MGIT (V= 2mL)

* 10 a 100 bacilos/mL de escarro

(a) Sol. De sais minerais(a) Sol. De sais minerais LJLJ OKOK

Fosfato Fosfato monopotmonopotáássicossico 2,4 g2,4 g 12,0 g12,0 g

Sulfato de magnSulfato de magnéésiosio 0,24 g0,24 g --

CitratoCitrato de magnde magnéésiosio 0,6 g0,6 g 0,6 g 0,6 g

GlutamatoGlutamato de sde sóódiodio -- 3,0 g3,0 g

AsparaginaAsparagina 3,6 g3,6 g --

GlicerolGlicerol 12 mL12 mL 24 mL24 mL

ÁÁgua Destiladagua Destilada 600 mL600 mL 600 mL600 mL

DIFERENDIFERENÇÇAS NA COMPOSIAS NA COMPOSIÇÇÃO ÃO DODO LJLJ E DO E DO OKOK

MMéétodo de todo de PetroffPetroff -- LJLJ

Cultura pelo MCultura pelo Méétodo de todo de OgawaOgawa KudohKudoh** DESCENTRALIZA** DESCENTRALIZAÇÇÃO JÃO JÁÁ!!!! **!!!! **

VANTAGENS DO OGAWA KUDOHVANTAGENS DO OGAWA KUDOH

• Técnica rápida e simples;

• Não há necessidade de Cabine de Segurança Biológica;

• Importantíssimo o uso de EPI’s (Máscara N95/PFF2, jaleco mangas longas com punho, óculos de proteção, luvas);

• A sala do ambiente laboratorial deve ser bem ventilada e ter umbico de Bunsen;

• O laboratório deve ter acesso ao GAL para liberação dos resultados que já chegarão cadastrados!!!

• O Lacen/PR oferece o treinamento e fornece os meios mensalmente de acordo com a rotina de cada laboratório.

VANTAGENS DO OGAWA KUDOHVANTAGENS DO OGAWA KUDOH• Enviar ao Lacen/PR para fazer a tipificação e TST (realizar Ziehl- Neelsen das colônias para confirmar se é BAAR);

• Se for para realizar TST: Solicitar no GAL “Tuberculose, teste de sensibilidade”; SÓ É FEITO TST SE FOR Mycobacteriumtuberculosis;

•Se for para tipificar: Solicitar no GAL “Micobacteriose” (O Serviço de Micobactérias encaminhará à Seção de Biologia Molecular do Lacen/PR ou ao CRPHF, dependendo do aspecto das colônias). *** Lembrando de que se for MNT há a necessidade de 3 isolados com crescimento de mais de 10 colônias;

OBS.: Lembrar de que se for enviado “isolado” deve ser preenchido no campo do GAL que é IS (Isolado Bacteriano) e não IN (Amostra “In Natura”).

CULTURA DE BAAR CULTURA DE BAAR –– Em Em meio smeio sóólidolido* Leitura da cultura (Escala semiquantitativa) segundo Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras micobactérias:

- Quantifica: Menos de 20 colônias

-+ : 20 a 100 colônias

- ++ : Mais de 100 colônias separadas

- +++ : Colônias confluentes (tapete)

BACTECBACTECTMTM MGITMGITTMTM 960960

• Cultura : Meio líquido (MGIT 960 - BD®)

TST TST –– MMÉÉTODO DAS PROPORTODO DAS PROPORÇÇÕES ÕES –– 42 dias42 dias

* TESTE DE SENSIBILIDADE (RMP, INH, EMB, SM)- + DE 20 COLÔNIAS

TST TST –– MMÉÉTODO DAS PROPORTODO DAS PROPORÇÇÕES ÕES –– 42 dias42 dias

- Leitura do TST segundo Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras micobactérias:

Ex: Tubo controle = 50 colônias

LJ+RMP = 3 colônias

3 X 100/ 50 = 6 % de bacilos resistentes

TST TST –– MMÉÉTODO DAS PROPORTODO DAS PROPORÇÇÕESÕES

CONCENTRAÇÃO CRÍTICA DA DROGA E PROPORÇÃO CRÍTICA

-

DROGASDROGAS CONCENTRACONCENTRAÇÇÃO ÃO CRCRÍÍTICA (TICA (g/mL)g/mL)

PROPORPROPORÇÇÃO ÃO CRCRííTICATICA (%)(%)

IsoniazidaIsoniazida 0,20,2 11

RifampicinaRifampicina 4040 11

EtambutolEtambutol 22 11

EstreptomicinaEstreptomicina 44 11

TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM

MGITMGITTMTM 960 960 –– 10/14 dias10/14 dias

TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM

MGITMGITTMTM 960960

TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO QUIDO BACTECBACTECTMTM MGITMGITTMTM 960960

TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM

MGITMGITTMTM 960960

TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM

MGITMGITTMTM 960960

TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM

MGITMGITTMTM 960960

TST TST –– MEIO LMEIO LÍÍQUIDO BACTECQUIDO BACTECTMTM

MGITMGITTMTM 960960

TST TST –– Procedimento no Procedimento no LacenLacen/PR /PR apapóós leituras leitura

* Se for SENSÍVEL a todas as drogas: Liberar no GAL!!!

* Se apresentar MONORESISTÊNCIA: Liberar no GAL!!!

* Se apresentar POLIRESISTÊNCIA ouMULTIRESISTÊNCIA ou for um isolado XDR: Liberar no GAL e encaminhar ao CRPHF/RJ para confirmar a resistência e testar frente às drogas de segunda linha; Após liberação do resultado pela Referência, liberamosno GAL.

IdentificaIdentificaçção/Tipificaão/Tipificaçção: ão: RECOMENDADO PELA RECOMENDADO PELA REFERÊNCIAREFERÊNCIA

- Se for MNT : Solicitar mais 2 amostras para confirmar a infecção.

Exceto: Líquor e sangue

Ex.: Crescimento de MNT na amostra de escarro: Liberamos no GAL “MNT” e solicitamos mais 2 amostras para confirmar a infecção.

*** Só enviamos ao CRPHF quando tivermos as 3 amostras com crescimento de mais de 10 colônias em cada meio.

Complexo MTB ou MNT???Complexo MTB ou MNT???

* Cultura de BAAR * Cultura de BAAR →→ CMTB ou MNT??? AnCMTB ou MNT??? Anáálise macrosclise macroscóópica da cultura, anpica da cultura, anáálise lise microscmicroscóópica das colônias, niacina, crescimento em PNB:pica das colônias, niacina, crescimento em PNB:

1. Colônia 1. Colônia acromacromóógenagena, rugosa, forma, rugosa, formaçção de corda positiva, PNB negativo, niacina ão de corda positiva, PNB negativo, niacina positiva positiva →→ CMTB (CMTB (M. M. tuberculosistuberculosis, M. , M. bovisbovis, M. , M. africanumafricanum, M. , M. microtimicroti, M. , M. canetticanetti, M. , M. capraecaprae, M. , M. pinnipediipinnipedii))→→ Testes fenotTestes fenotíípicos e/ou molecularespicos e/ou moleculares

2. Colônia 2. Colônia acromacromóógenagena ou ou fotocromfotocromóógenasgenas ou ou escotocromescotocromóógenasgenas, pigmentada, lisa ou , pigmentada, lisa ou rugosa, formarugosa, formaçção de corda negativa, PNB positivo, niacina geralmente negativa ão de corda negativa, PNB positivo, niacina geralmente negativa →→ MNT MNT →→ Testes fenotTestes fenotíípicos e/ou molecularespicos e/ou moleculares

OBS.: * FOTOCROMOBS.: * FOTOCROMÓÓGENAS (GENAS (M. M. kansasiikansasii), ESCOTOCROM), ESCOTOCROMÓÓGENAS (GENAS (M. M. gordonaegordonae) OU ) OU ACROMACROMÓÓGENAS (GENAS (M. M. aviumavium).).

* As MNT podem ser de crescimento r* As MNT podem ser de crescimento ráápido (pido (M. M. fortuitumfortuitum, M. , M. chelonaechelonae) ou lento.) ou lento.

Complexo MTB ou MNT???Complexo MTB ou MNT???

Quando mandamos para biologia Quando mandamos para biologia molecular / PCR???molecular / PCR???

*** A biologia molecular do Lacen/PR faz a identificação do Mycobacterium tuberculosis e do Mycobacteriumavium.

*** Nós, do Serviço de diagnóstico de micobactérias, mandamos tipificar quando as colônias são acromógenas, mas não parecem de TB...Aguardamos a tipificação para realizar o TST.

*** Há a possibilidade de solicitação pelo GAL de “Tuberculose, Biologia Molecular” e “Mycobacteriumavium, Biologia Molecular” nas seguintes amostras: Líquidos, biópsia, secreções, LBA, LCR, urina.

Quando mandamos para biologia Quando mandamos para biologia molecular / PCR???molecular / PCR???

*** Só NÃO é possível fazer PCR direto da amostra de ESCARRO!!!!

Quando é solicitado, apenas realiza-se o exame, se houver crescimento no meio de cultura!!!!

*** Enviamos o isolado para ser tipificado!!!

O FUTURO DA TIPIFICAO FUTURO DA TIPIFICAÇÇÃO NO ÃO NO LACEN/PRLACEN/PR

*** O próprio Serviço de diagnóstico de Micobactériasrealizará as tipificações!!!

*** Será possível identificar um número maior de espécies.....

*** Desejamos realizar as tipificações no próprio Lacen/PR!!!!

OBRIGADA!!!