Post on 01-Feb-2021
1 Métodos Instrumentais Capítulo 2
2 CROMATOGRAFIA
2.1 Princípios Gerais da Cromatografia
A cromatografia é uma técnica de separação química
Neste capítulo será objeto de tratamento/discussão apenas a separação
cromatográfica realizada em coluna.
Não serão abordados os processos cromatográficos realizados em meios de
separação em forma de lâmina, tais como a cromatografia de camada fina ou
de papel.
2.1.1 Perspetiva Histórica
Há evidências históricas que sugerem que a separação cromatográfica em
coluna é realizada desde a Idade Média.
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2 Métodos Instrumentais Capítulo 2
A sua explicação e desenvolvimento só surgiu no início do século XX.
Mikhail Tswett, um botânico Russo, foi quem pela
primeira vez usou e interpretou a técnica de separação
que veio a dar origem às técnicas modernas de
cromatografia em coluna.
Tswett, em 1906, usou éter de petróleo como fase
móvel e uma coluna de vidro empacotada com CaCO3para separar alguns pigmentos extraídos de plantas.
À técnica de separação usada atribuiu-lhe a designação
de cromatografia, que provém do termo Grego - chromatos – que significa cor.
A separação dos vários pigmentos foi interpretada como consequência das
diferentes mobilidades com que se movimentavam no interior da coluna.
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3 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Tswett concluiu que a fase estacionária comporta-se como uma resistência à
progressão dos pigmentos ao longo da coluna.
A resistência foi interpretada como o resultado da adsorção dos pigmentos à
fase estacionária, o que permitiu atribuir à fase estacionária as características
de um agente adsorvente.
Adsorvente é um material sólido capaz de reter espécies químicas à sua
superfície, em consequência de interacções físico/químicas estabelecidas
entre as espécies químicas e o adsorvente.
Apesar da adsorção ter tendência para imobilizar os pigmentos na fase
estacionária é, no entanto, contrariada pela passagem contínua de fase móvel,
que remove os pigmentos que eventualmente estejam adsorvidos.
Na figura a seguir ilustra-se a cromatografia em coluna usada por Tswett
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4 Métodos Instrumentais Capítulo 2
q
A + B
B
B
A
A + B
eluente
B
A
eluente
B
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5 Métodos Instrumentais Capítulo 2
B
A
eluente
B
A
eluente
A
eluente
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6 Métodos Instrumentais Capítulo 2
O equipamento simples usado por Tswett sofreu considerável evolução até
aos nossos dias.
Na figura abaixo encontra-se ilustrado o equipamento contemporâneo de
cromatografia líquida em coluna.
Controlo e
aquisição
de dados
UV
VIS
DetectorBomba
InjectorReservatório
de eluente
Coluna em compartimento
termostático
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7 Métodos Instrumentais Capítulo 2
2.1.2 Classificação dos Processos Cromatográficos
Os processos cromatográficos são sistematizados de acordo com diversos
critérios, o que leva ao aparecimento de várias classificações para as diferentes
formas de cromatografia.
Diferentes formas de cromatografia
Critério: Tipo de suporte Modo de separação Natureza da fase móvel
Classificação: Coluna Adsorção Cromatografia gasosa
Planar Partição Cromatografia líquida
Permuta iónica Cromatografia supercrítica
Exclusão de tamanho
Afinidade
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8 Métodos Instrumentais Capítulo 2
a) Cromatografia de adsorção (gasosa ou líquida )
i) É o tipo de cromatografia mais usado.
ii) Utiliza uma fase móvel líquida ou gasosa.
iii) A fase estacionária é sólida (sílica gel, alumina ou celulose).
iv) A separação é garantida pelo equilíbrio de adsorção do soluto, que se
encontra dissolvido na fase móvel e adsorvido na fase estacionária.
v) As forças envolvidas são de natureza física. Interações eletrostáticas e
forças de Van Der Waals
b) Cromatografia de partição (gasosa ou líquida )
i) Este tipo de cromatografia baseia-se na partição do soluto entre a fase
móvel e um filme fino líquido que se encontra estabilizado à
superfície de um sólido inerte, que serve apenas de suporte ao filme.
ii) O filme fino líquido é a fase estacionária.
iii) Utiliza uma fase móvel líquida ou gasosa.
iv) A partição é garantida por forças de natureza físico/química
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9 Métodos Instrumentais Capítulo 2
c) Cromatografia de Permuta Iónica (líquida)
i) Usa-se uma resina permutadora de iões como fase sólida estacionária.
ii) A separação cromatográfica é garantida pelo equilíbrio de permuta
iónica.
iii) Utiliza uma fase móvel líquida.
iv) As forças envolvidas são do tipo eletrostático.
d) Cromatografia de exclusão
i) A separação é conseguida pela passagem da fase móvel através de um
gel poroso, que tem por objetivo separar as espécies químicas por
tamanho molecular, eluindo primeiro as moléculas maiores
ii) A separação é alcançada pela exclusão diferencial ou inclusão de
componentes dentro das partículas do enchimento e,
além da separação de componentes discretos, a
técnica é utilizada para caracterizar a distribuição de
peso molecular de polímeros.
iii) Utiliza uma fase móvel líquida.
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10 Métodos Instrumentais Capítulo 2
e) Cromatografia de afinidade
i) É o tipo de cromatografia com maior grau de especificidade. Ocorre uma
ligação molecular específica e reversível entre o soluto e um ligante
imobilizado na fase estacionária
ii) Aproveita a existência de interações específicas entre a espécie química
a separar e uma outra que se encontra imobilizada na fase estacionária.
iii) As forças envolvidas na retenção são fundamentalmente de natureza
química, pelo que haverá necessidade de se alterar a composição da fase
móvel para extrair posteriormente a espécie química.
iv) Utiliza uma fase móvel líquida.
v) É usada para separar produtos biológicos: ligações enzimas e substratos,
anticorpos e substratos e recetores de hormonas.
f) Cromatografia gasosa
i) Permite a separação de substâncias voláteis arrastadas por um gás
através de uma fase estacionária.
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11 Métodos Instrumentais Capítulo 2
ii) A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido que propicia a
distribuição dos componentes da mistura entre as duas fases através de
processos físicos e químicos (adsorção, diferenças de solubilidades,
volatilidades).
iii) Como fase móvel é utilizado um gás, denominado gás de arraste, que
transporta a amostra através da coluna cromatográfica até ao detetor.
g) Cromatografia líquida
i) A cromatografia líquida é uma técnica adequada para a separação dos
componentes de soluções líquidas e utiliza-se quer para fins analíticos quer
para fins preparativos.
ii) A amostra é injetada na coluna usando uma microseringa na
cromatografia analítica.
iii) A fase móvel transportando a amostra é forçada a percolar através da
coluna por uma ação externa que pode ser a simples força da gravidade –
cromatografia de baixa pressão – ou uma força mais intensa gerada por uma
bomba – cromatografia de alta pressão.
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12 Métodos Instrumentais Capítulo 2
2.1.3 Parametrização da Cromatografia
A parametrização cromatográfica é definida por um conjunto de parâmetros
que permitem caracterizar o processo cromatográfico.
A posição, a forma e a resolução dos picos cromatográficos são exemplos de
parâmetros cromatográficos de elevada relevância para a caracterização da
cromatografia. Estes parâmetros encontram-se ilustrados na Figura abaixo.
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13 Métodos Instrumentais Capítulo 2
a) Parâmetros Individuais de um Pico Cromatográfico
tM
tR1tR2
tR3
t’R1
t’R2)
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14 Métodos Instrumentais Capítulo 2
h1
1
W1
W1/2h1/2
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15 Métodos Instrumentais Capítulo 2
(1) linha de base
(2) tempo morto (tM)
(3) tempo de retenção (tR)
(4) largura do pico (W)
(5) largura do pico a meia altura (W1/2)
(6) desvio padrão. Para picos com forma gaussiana ()
(95% do soluto)
Os parâmetros acima descritos são suficientes para caracterizar convenientemente
a separação cromatográfica. A quantificação destes parâmetros permite avaliar o
desempenho da separação cromatográfica.
Por vezes caracteriza-se os picos cromatográficos através de outros parâmetros
que resultam dos anteriores por simples cálculo aritmético.
iiW 4
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16 Métodos Instrumentais Capítulo 2
(1) tempo ajustado (corrigido) de retenção (t’R).
(2) fator de capacidade, k
b) Eficiência
O êxito da separação cromatográfica depende:
(1) largura dos picos
(2) espaço em tempo entre dois picos consecutivos
A separação efetiva de um par de componentes pode ser conseguida quer os seus
picos sejam estreitos, quer sejam largos. O tempo de separação destes últimos
será invariavelmente mais longo.
MRiRi ttt ,
M
MRii
t
ttk
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17 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Os picos mais
estreitos são
separados mais
cedo
Os picos mais
largos são
separados mais
tarde
tempo
sinal
sinal
sinal
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18 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Se todos os outros parâmetros forem iguais, deve-se preferir separações
cromatográficas que apresentem picos estreitos.
Esta preferência é quantificada através do parâmetro designado por eficiência (N).
Esta razão compara a largura do pico com o tempo (ou volume) de retenção,
pelo que N é uma medida do alargamento do pico por unidade do tempo.
A eficiência é determinada por fatores relacionados com a construção da
coluna e seu empacotamento, bem como da velocidade da fase móvel.
222
16
i
Ri
i
Ri
i
Ri
W
ttVN
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19 Métodos Instrumentais Capítulo 2
C) Parâmetros Atribuídos a Pares de Picos Cromatográficos
O grau de mistura de dois solutos quando avaliado a partir dos
correspondentes picos é quantificado por dois parâmetros: fator de
separação, ai,j e resolução, Rs.
O fator de separação para dois picos adjacentes é caracterizado por:
No cálculo do fator de separação, o numerador identifica-se sempre com o pico
de maior tempo de retenção.
Mas em cromatografia o grau de mistura entre dois solutos não pode ser avaliado
apenas à custa do parâmetro de localização dos correspondentes picos.
1
2
1
22,1
k
k
tt
tt
MR
MR
a
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20 Métodos Instrumentais Capítulo 2
É necessário também atender à dispersão de cada um deles, uma vez que a largura
dos picos vai condicionar a separação dos dois solutos.
RESOLUÇÃO
Rs define a condição de separação aplicada a dois picos adjacentes.
1212
5,0 WW
ttR RRs
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21 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Condição de separação:
ou
W1 W2
t1
t2sinal
tempo
12122
1WWtt RR
5,1sR
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22 Métodos Instrumentais Capítulo 2
A resolução é determinada pela escolha da:
(1) fase estacionária
(2) fase móvel
(3) temperatura
(4) comprimento da coluna (fase estacionária)
d) Comparação das Eficiências Cromatográficas
A eficiência cromatográfica, N, é bastante útil quando se pretende comparar
separações cromatográficas realizadas sob diferentes condições
experimentais.
A eficiência cromatográfica é também designada por número de pratos teóricos.
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23 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Quando uma coluna cromatográfica tem um comprimento L, a altura equivalente
de cada um dos seus pratos teóricos é definida por:
Um processo de separação cromatográfico torna-se mais próximo do ideal à
medida que a altura equivalente do prato teórico, H, tende para zero.
2.1.4 Quantificação em Cromatografia
Para as mesmas condições experimentais, isto é, mantendo constante:
(1) a fase estacionária
(2) a fase móvel
(3) a velocidade da fase móvel
(4) a temperatura da separação
(5) o detetor
2
16
Ri
i
t
WL
N
LH
13:44:40
24 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Os parâmetros característicos dos picos individuais podem ser usados para
identificar a presença de uma espécie química na mistura inicial.
Como resultado, o cromatograma pode ser usado para efetuar a identificação
(análise qualitativa) dos vários constituintes de uma mistura.
Os cromatogramas são representações gráficas do registo de um sinal analítico
proveniente de um detetor, colocado imediatamente a seguir à coluna, em função
do tempo a partir do qual se fez a injeção da amostra.
Quando o sinal analítico é linear com a concentração do soluto, isto é
a quantidade total de soluto é proporcional à área do pico registado no
cromatograma.
O cálculo das áreas dos picos é feito pelos Integradores.
Solutokalsin
áreakq ssoluto
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25 Métodos Instrumentais Capítulo 2
2.1.5 Separação Cromatográfica
A interpretação da separação cromatográfica tem vindo a sofrer evolução ao
longo dos anos.
Dada a sua complexidade para o nível desta disciplina , abordar-se-á apenas
3 modelos interpretativos, que se complementam mutuamente.
a) Teoria de eluição
É intuitivo afirmar-se que um soluto quando se encontra distribuído pela fase
móvel desloca-se à velocidade com que a fase móvel se encontra animada.
Deste modo, poder-se-á afirmar que:
A velocidade média de um soluto num processo de separação cromatográfico
depende do tempo que permanece na fase estacionária comparativamente
com o tempo em que se move conjuntamente com a fase móvel.
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26 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Esta lei é traduzida pela equação:
Dado que:
Então
ou
uma vez que
móvelfmóvelfsoluto tempofracçãoVelocidadeVelocidade ..
iaestacionárfiaestacionárf tempofracçãoVelocidade ..
0. iaestacionárfVelocidade
móvelfmóvelfsoluto tempofracçãoVelocidadeVelocidade ..
móvelfsoluto tempofracçãouVelocidade .
móvelfVelocidadeu .13:44:40
27 Métodos Instrumentais Capítulo 2
A fracção de tempo que um soluto passa na fase móvel identifica-se com
fracção da sua quantidade de substância que se distribui pela fase móvel.
A fracção do soluto A na fase móvel é dado por:
fasesasambasemAdemolesdetotaln
móvelfasenaAdemolesnAfracção móvelf
º
º.
SSMM
MMmóvelf
VCVC
VCAfracção
.
MM
SSmóvelf
VC
VCAfracção
1
1.
13:44:40
28 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Se a partição do soluto A pelas duas fases é descrita por um coeficiente de
distribuição KDA, a expressão anterior toma a forma:
A velocidade com que o soluto A percorre a coluna é, então, dada por:
A relação entre o tempo de retenção e a velocidade com que o soluto se
desloca ao longo da coluna permite conhecer o comprimento da trajectória
percorrida pelo soluto ao longo da coluna, que não é necessariamente igual a
L.
M
SDA
móvelf
V
VK
Afracção
1
1.
M
SDA
A
V
VK
uu
1
1
13:44:40
29 Métodos Instrumentais Capítulo 2
ou
o que mostra que um aumento da velocidade de fluxo da fase móvel, , leva
à diminuição do tempo de retenção, tRA.
Simultaneamente, é possível constatar que para a mesma separação
cromatográfica, isto é para condições em que a razão VS/VM permanece
constante, a separação de dois ou mais solutos fica-se a dever à diferença de
valores da constante de distribuição de cada um dos solutos.
A equação anterior, conjuntamente com a equação de Van´t Hoff, permite
ainda prever a influência da temperatura no tempo de retenção
M
SDA
RAef
V
VK
utL
1
1
M
SDA
efRA
V
VK
u
Lt 1
u
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30 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Uma vez que
Então, o fator de capacidade pode ser expresso em termos da constante de
distribuição e da razão de volumes entre as fases móvel e estacionária.
A equação de Van´t Hoff é expressa por:
ou
M
MRAA
t
ttk
M
SDAA
V
VKk
2
ln
RT
H
T
KD
M
SDA
RAef
M
V
VK
tu
Lt
1
1
R
S
RT
HKD
ln
13:44:40
31 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Admitindo que a razão de volumes VS/VM é independente da temperatura,
então:
pelo que
ou
De onde se conclui que o logaritmo do fator de capacidade (tempo de
retenção) é inversamente proporcional à temperatura.
T
K
T
k D
lnln
2
ln
RT
H
T
k
R
S
RT
Hk
ln
13:44:40
32 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Principal desvantagem da teoria de eluição: não prevê a ocorrência de
dispersão nos picos cromatográficos.
tempo
limites
imaginários
Fase
estacionária
Fase
móvel
CM
CM
C
S
CS
pico 1
pico 2sinal
KD
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33 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Conclusão:
(1) A teoria de eluição baseia-se apenas nos valores de tRi para explicar a
separação cromatográfica.
(2) tRi é inversamente proporcional à velocidade da fase móvel.
(3) tRi é directamente proporcional a Kdi quando Kdi é elevado
(4) ln ki é inversamente proporcional à temperatura.
(5) A teoria de eluição não prevê a ocorrência de dispersão (largura do pico).
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34 Métodos Instrumentais Capítulo 2
b) Teoria de pratos
A incapacidade da teoria de eluição prever a dispersão dos picos
cromatográficos levou ao aparecimento de teorias mais complexas.
A teoria de pratos foi proposta em 1941 por Martin e Synge. Foi
desenvolvida por analogia com a destilação e a extração em contracorrente.
Esta teoria admite que, do ponto de vista teórico, a coluna cromatográfica é
constituída por uma sequência contínua de pequenos fragmentos, designados
por pratos.
pratos13:44:40
34 Métodos Instrumentais Capítulo 2
A teoria de pratos prevê que o soluto se distribui por um número restrito de
pratos ao longo do seu avanço através da coluna.
Nestas condições, a concentração de soluto à saída da coluna é dada por uma
distribuição gaussiana do tipo:
Em que
n é o nº de moles de soluto N é o nº de pratos teóricos
V é o volume eluido de fase móvel VR é o volume de retenção
Da expressão anterior conclui-se que:
2
12
2
RV
VN
R
eN
V
nc
N
VR
2
2
1
22
1
x
ey
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35 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Quando VR é substituído por tR, toma a forma:
A partir da expressão anterior é possível encontrar a expressão para a
eficiência de uma coluna cromatográfica:
ou
dado que
Apesar da teoria de pratos prever a dispersão dos picos, não consegue,
contudo, explicar o desvio da dispersão ao comportamento gaussiano. Este
desvio é explicado pela teoria cinética.
N
tR
2
RtN
4W
2
16
W
tN R
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36 Métodos Instrumentais Capítulo 2
c) Teoria Cinética
A teoria cinética descreve o alargamento dos picos cromatográfico através da
equação de Van Deemter.
ou
Esta equação estabelece que a altura do prato teórico, um dos parâmetros que
caracteriza a eficiência e depende do alargamento do pico, é influenciada
por três termos: A, B e C
Os parâmetros A, B e C são constantes determinadas por algumas propriedades
físicas das fases estacionária e móvel. Os seus valores são sempre positivos.
O parâmetro C é frequentemente desdobrado em duas contribuições: uma da fase
estacionária, CS, e outra da fase móvel, CM.
uCu
BAH uCC
u
BAH MS
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37 Métodos Instrumentais Capítulo 2
O parâmetro A está diretamente relacionado com:
(1) a heterogeneidade microscópica dos poros que resultam do empacotamento
da coluna
(2) a tortuosidade do percurso da fase móvel ao longo do seu trajeto.
Estas duas características proporcionam atrasos e avanços na velocidade da fase
móvel.
Quando se considera o fluxo no interior de um poro
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38 Métodos Instrumentais Capítulo 2
A velocidade do fluído varia desde um valor máximo atribuído à zona
central do poro até à velocidade nula junto das paredes do poro.
Ampliando um pouco mais a escala microscópica, de modo a reunir um conjunto
de poros, prevê-se também que a fase móvel siga trajetórias tortuosas através
das pequenas partículas do enchimento da coluna, o que obriga a velocidade
da fase móvel a mudar frequentemente de direção, percorrendo, assim,
diferentes trajetórias.
λ é uma constante que depende do
empacotamento da coluna
dp é o diâmetro da partícula de empacotamento.
pdA 2
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39 Métodos Instrumentais Capítulo 2
O termo está diretamente relacionado com o transporte de massa por
difusão do soluto na fase móvel devido à existência de um gradiente de
concentração.
Quando um soluto se encontra concentrado numa zona específica da fase móvel, o
soluto tem tendência a espalhar-se, diluindo-se, por todo o volume que o
rodeia por ação da sua difusão para as regiões de menor concentração.
Como habitualmente as colunas cromatográficas são estreitas e compridas é de
esperar que este efeito se faça sentir com maior intensidade na direção
longitudinal.
γ é uma constante que depende do empacotamento da coluna.
DM é o coeficiente de difusão do soluto na fase móvel
u/B
MDB 2
13:44:40
40 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Como a difusão é um processo de transporte de massa lento, o seu efeito só se
vai fazer sentir para velocidades baixas da fase móvel.
após difusão longitudinal
do soluto
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41 Métodos Instrumentais Capítulo 2
O termo ou ou
está diretamente relacionado com a cinética do processo de interação do soluto com
a fase estacionária.
Tal como o parâmetro anterior, também a influência do termo depende da
velocidade com que a fase móvel se desloca.
Fase móvel lenta
interação rápida
Cs e CM são descritos apenas por KD
uC
uC
uCC MS
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42 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Fase móvel rápida
interação lenta
Atrasa a mobilidade do soluto
ao longo da coluna
Cs é superior ao que seria de
esperar atendendo apenas a KD
DS e DM são os coeficientes de difusão do soluto nas fases estacionária e móvel, respetivamente.
df é a espessura da fase estacionária. dp é o diâmetro da partícula de empacotamento da coluna.
fS(k) e fM(k) são duas funções de k.
CsCs CM
S
fSS
D
dkfC
2
M
pMM
D
dkfC
2
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43 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Influência da velocidade da fase móvel na eficiência da separação cromatográfica
13:44:40
44 Métodos Instrumentais Capítulo 2
2.1.6 Otimização da Separação Cromatográfica
Otimizar uma separação cromatográfica é otimizar a resolução dos picos
cromatográficos e/ou diminuir o tempo despendido na realização da
separação cromatográfica.
Para que a otimização da separação cromatográfica aconteça é necessário atender a
algumas expressões anteriormente referidas:
1212
50 WW,
VVR RRs
1
2
1
221
k
k
VV
VV
MR
MR,
a
M
MRii
V
VVk
222
16
i
Ri
i
Ri
i
Ri
W
ttVN
13:44:40
45 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Quando se admite que:
As expressões anteriores permitem avaliar a dependência da resolução como a
eficiência e os factores de capacidade e de separação
Em que k2 é o factor de capacidade relativo ao pico com maior tempo de retenção
dos dois usados para definir Rs.
A equação anterior estabelece que a resolução de dois picos adjacentes pode ser
ajustada fundamentalmente por 3 factores.
(1) Eficiência da coluna, que é uma função de L e H.
(2) Factor de separação. É uma medida da diferença entre KD1 e KD2.
(3) Factor de capacidade, k2.
2
2
1
1
4 k
kNRs
a
a
2
2
1
1
4
1
k
k
H
LRs
a
a
WWW 12
13:44:40
46 Métodos Instrumentais Capítulo 2
Para Rs = 1,5 a sobreposição dos picos adjacentes é inferior a 0,1%.
Por vezes é necessário calcular o nº de pratos teóricos que uma coluna deveria
possuir para se alcançar uma dada resolução.
A expressão que permite efetuar esse cálculo é definida por:
Por sua vez, o efeito da resolução sobre o tempo de retenção é expresso por:
2
2
22
2 1
116
k
kRN s
a
a
22
32
22
2
1
1
16
k
k
u
HRt sr
a
a
13:44:40
47 Métodos Instrumentais Capítulo 2
0 3 6 9 120
1
2
3
4
5
N = 20 000
a = 1,02
a = 1,05
a = 1,1
a = 1,2
a = 1,3
Rs
k2
13:44:40