Post on 26-Oct-2015
Bioquímica Experimental I
Departamento de Química e Bioquímica
Licenciatura em Bioquímica
26 e 27 de Setembro de 2011
Ano Lectivo 2011/2012
Purificação do
Lisozima da
clara do ovo por
cromatografia de
troca iónica
Docente: Carla Real Afonso
Trabalho realizado por:
Alexandra Salvado, nº 40267
Andreia Sousa, nº 40261
Telmo Paiva, nº 40243
PL 3
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por
Cromatografia de Troca Iónica
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Índice
Resumo …………………………………………………………………………... 3
Material é Métodos………………………………………………………………. 4
Material …………………………………………………………………. 4
Métodos ………………………………………………………………….. 5
Resultados e Discussão ………………………………………………………….. 12
Conclusão ………………………………………………………………………... 33
Bibliografia ………………………………………………………………………. 35
Anexos …………………………………………………………………………… I
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por
Cromatografia de Troca Iónica
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Resumo
Este trabalho laboratorial teve como principal objectivo exemplificar um
processo de purificação enzimática através da realização da purificação parcial do
lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica. Posteriormente à
purificação realizaram-se outros objectivos, tais como: a determinação do grau de
purificação do enzima (através de uma electroforese SDS-PAGE), a determinação da
actividade enzimática de algumas fracções recolhidas durante a cromatografia e, por
último, o cálculo do rendimento deste processo.
Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca
catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Nesta
cromatografia usou-se como fase estacionária um permutador catiónico fraco, o CM-
Sephadex G-25 e como fase móvel utilizaram-se dois tipos de tampão com diferentes
valores de pH. O primeiro tampão utilizado, o tampão Tris (pH 8,2) foi usado para a
lavagem da coluna e para as proteínas de pI inferior a 10 serem eluídas. O segundo
tampão, o tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5), foi usado para a eluição das proteínas
com pI superior a 10. A lisozima apresenta um pI de 10,7 pelo que foi eluída com o
segundo tampão, assim como a avidina, que apresenta um pI de 10.
Como também já foi referido, neste trabalho realizou-se também uma
electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com o propósito de
determinar a pureza do lisozima recolhido, por comparação com um padrão do enzima
puro. Como será possível ver mais à frente, nota-se umas marcas de arrastamento no
poço do lisozima recolhido, pelo que é sinal da existência de impurezas (nomeadamente
outras proteínas).
Por fim, é de notar que nas fracções onde as actividades enzimáticas foram
superiores é de suspeitar a existência do enzima. O rendimento associado à
cromatografia de troca iónica foi de 112,2% e o grau de purificação obtido foi de 2002,7
vezes, os quais são incomportáveis com o esperado, pois foi usada uma absorvância de
PCO de outro grupo, visto terem sido os únicos a medi-la.
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Material e Métodos
Material
Cromatografia de troca iónica
Coluna Cromatográfica 40 x 2,6 cm
Bomba peristáltica
Cronómetro
Espectrofotómetro UV-Vis
Cuvettes de quartzo
Aparelho medidor de pH
Gaze
Material corrente de laboratório
Doseamento da actividade enzimática
Homogeneizador de Potter-Elvejam
Cuvettes de plástico
Pipeta automática
Pipeta graduada de 5mL
SDS-PAGE
Sistema de polimerização de géis
Placas de vidro para electroforese (mini)
Tina de electroforese vertical (mini)
Espaçadores (0,75mm) e pentes (0,75mm)
Fonte de alimentação (500V/150mA)
Pipetas automáticas
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Métodos
Cromatografia de troca iónica
Montagem da Coluna
Num Kitasato, deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na coluna
• Guardar num recipiente com rolha a 4oC
Decantar a maior parte do tampão (75% gel sedimentado e 25% tampão sobrenadante)
Montar a coluna na vertical e ver se está bem fechada
Encher a coluna com Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M
• Manter a sua saída fechada
Abrir a válvula para a entrada do tampão e introduzir cerca de 5-10 mL do tampão anterior.
Verter a mistura do gel em tampão na coluna, com a ajuda de um funil e de uma vareta de vidro, até encher completamente
Abrir a válvula de saída da coluna, mantendo um caudal de tampão Tris constante (1,6 - 1,8 mL/min
• ATENÇÃO: Nunca deixar secar o topo da coluna
Medir o fluxo de tampão através da coluna, medindo o volume eluído em 2 min.
Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura
Equilibrar a coluna através da passagem de um volume de tampão inicial de eluição aproximadamente igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada
Medir a altura do gel, assim como o diâmetro da mesma
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Preparação da Amostra
Aplicação da Amostra
Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL
Comprimir a gaze suavemente e o material que passar é o filtrado
Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL
Diluir com 35 mL de Tampão Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (diluição 1/8)
• O nome do filtrado será Preparado da Claro do Ovo (PCO)
Passar a mistura através de uma camada de lá de vidro colocada no interior duma seringa de 10 mL.
Manter o PCO a 4ºC, bem identificado até ao final do trabalho
Calibrar um aparelho medidor de pH
Ligar a bomba peristáltica e controlar o fluxo de entrada do tampão para 1,6 - 1,8 mL/min
Parar a eluição da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua saída
Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume total
• Cuidado para não secar o gel!
Depois da amostra penetrar toda no gel, abrir a saída da coluna e iniciar a sua eluição.
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• Controlar o fluxo!
Recolher fracções de 15 mL em diferentes provetas até passar na coluna um volume total de tampão aproximadamente igual ao volume da coluna preparada.
Medir o volume de pH de cada fracção recolhida. Colocá-las, só depois, em gelo!
Proceder à eluição da coluna com tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M
Recolher fracções de 10 mL até registar um aumento brusco no seu valor de pH para 8,5
Reduzir, depois, o volume de cada fracção para 5 mL
Parar a eluição da coluna quando o valor de pH das fracções estabilizar perto de 10,5
• Ler também as absorvências do tampão Tris e de carbonatos de sódio
Realizar as leituras de absorvências das fracções a 280 nm (acertar o zero com água destilada).
Conservar as fracções bem identificadas
Lavar a coluna com um volume de tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M igual a , pelo menos, 2 vezes o volume da coluna
Regenerar as condições iniciais passando 2 volumes de solução tampão de eluição Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e NaN3 0,02 % (m/v) através da coluna
Indicar na coluna qual o último tampão utilizado
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Doseamento da actividade enzimática
SDS-PAGE
Lavar muito bem as placas de vidro, os espaçadores e os pentes com etanol e secar
Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de vidro maior com os espaçadores colocar a placa de vidro mais pequena
Introduzir a "sandwich" na peça de suporte para a mesma
Apertar os parafusos e confirmar se não há fugas
Introduzir um pente na "sandwich" até ficarem totalmente inseridos entre as duas placas
Marcar com uma cante um traço 1,0 cm abaixo do nível inferior dos dentes do pente. Este será o nível até ao qual se introduzirá a solução de gel resolvente ou de separação
Ajustar o zero do espectrofotómetro a 450 nm com tampãio de fosfatos (pH 7,0) 0,1 M
Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma célula de absorção
Adicionar 0,1 mL da fracção em estudo e misturar rapidamente por inversão, tapando o topo da célula com parafilm
Medir o decréscimo da absorvância a 450 nm da amostra durante um minuto
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Preparação dos géis
Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) à solução de gel resolvente
Adicionar a solução do gel resolvente à "sandwich" com o auxílio de uma pipeta de Pasteur
• Evita a formação de uma superfície de polimerização irregular, que ocorreria se esta estivesse directamente exposta ao ar
Introduzir um pouco de água destilada
Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel polimerize
Depois de polimerizado, inverter a caixa de polimerização de modo a escorrer toda a água da superfície do gel
Introduzir o pente na "sandwich" de modo a não criar bolhas de ar
Deixar a repousar para polimerizar
Marcar a posição dos poços do pente no gel
Quando o gel de concentração polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado
Lavar os poços do gel com água destilada
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Montagem da câmara electroforética
Electroforese
Retirar a peça auxiliar de montagem da caixa de polimerização
Deitar na bancada a peça central da câmara de electroforese
Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na peça central da câmara de electroforese
Introduzir a peça central no reservatório de tampão inferior da câmara de electroforese
Colocar a tampa da câmara electroforética
Ligar os eléctrodos à fonte de tensão (atenção à polaridade!)
Colocar a voltagem nos 100 V
Registar a intensidade de corrente no início e no fim da electroforese
Deixar correr a electroforese até o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente (1h - 1h30)
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Remoção do gel
Desligar a fonte de alimentação e despejar a solução de electroforese
Deitar a peça central da câmara de electroforese na bancada e remover a peça auxiliar de montagem
Remover a "sandwich"
Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente
Levantar o espaçador de modo a que a placa de vidro superior se separe do gel
Remover a placa
O gel ficará agarrado a uma das placas
Cortar um dos cantos do gel
Medir o comprimento do gel e a distância migrada pelo azul de bromofenol
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Resultados e Discussão
Gráfico de eluição da cromatografia realizada apresentando a absorvância a 280
nm e valor de pH de cada fracção em função do volume eluído. Discussão do
gráfico obtido face às propriedades da técnica cromatográfica
Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca
catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Como a
composição em resíduos de aminoácidos varia de proteína para proteína, a carga global
destas apresenta valores diferentes para diferentes valores de pH. Assim:
as proteínas que apresentam carga global positiva, ou seja, o valor de pH é inferior
ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina catiónica.
as proteínas que apresentam carga global negativa, ou seja, o valor de pH é superior
ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina aniónica.
Como a resina é de troca catiónica, ligou as proteínas que apresentavam carga
global positiva. As outras proteínas, como não se ligam à coluna foram eluídas com o
tampão.
A proteína que se pretendeu purificar tem pI igual a 10,7, como a resina é de
troca catiónica, para que esta adira à coluna, é necessário que tenha carga global
positiva, logo, o pH da solução utilizada na preparação da PCO teve de ser inferior ao
valor de pI da proteína, bem como o pH da solução com que se fez a lavagem da coluna.
Assim, ao aplicar a PCO na coluna, a lisozima liga-se à coluna enquanto as restantes
proteínas, por terem pI inferior ao pH, apresentam a carga global igual à da coluna e
como tal não se ligam, sendo eluídas com a solução inicial. Ao aumentar o pH do
tampão de eluição proteínas ligadas ficam com carga global diferente (negativa) e como
tal são também eluídas com o tampão. Desta forma, obtêm-se as diferentes proteínas
contidas na PCO variando o pH das soluções.
Se a variação do pH não for suficiente para eluir as proteínas da coluna, pode-se
aumentar a força iónica do tampão, adicionando cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de
potássio (KCl). Assim, a competição entre as partículas do sal e a proteína aumenta e o
sal começa a ligar-se à coluna obrigando as proteínas a ser eluídas com o tampão.
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Quadro 1. Valores das absorvâncias (a 280 nm) e de pH das fracções recolhidas na eluição da coluna.
Volume
de cada
fracção
Volume
de
eluição
total
Fracções Absorvância
a 280 nm pH Diluição
15 mL
15 1 0,080 8,21 -
30 2 0,872 8,21 1:2
45 3 0,936 8,23 1:3
20 mL 65 4 0,098 8,18 -
10 mL
75 5 0,049 8,16 -
85 6 0,033 8,14 -
95 7 0,032 8,15 -
105 8 0,044 8,17 -
115 9 0,037 8,36 -
125 10 0,032 8,58 -
5 mL
130 11 0,031 8,63 -
135 12 0,040 8,65 -
140 13 0,032 8,67 -
145 14 0,042 8,69 -
150 15 0,041 8,69 -
155 16 0,189 8,89 -
160 17 0,291 9,52 -
165 18 0,270 9,95 -
170 19 0,275 10,16 -
175 20 0,108 10,35 -
180 21 0,078 10,45 -
185 22 0,056 10,5 -
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Figura 1. Gráfico de eluição da cromatografia realizada, sendo a absorvância (a 280 nm) e o valor de pH de cada
fracção em função do volume de eluição.
Como é visível no gráfico anterior (Figura 1), da fracção 1 à 4, ou seja, dos 15
aos 65 mL eluídos, é quando se observa maior absorvância; havendo um pico de
absorvância quando o volume eluído é 45 mL, ou seja, na fracção 3. Como o pH do
tampão inicial é de 8,2, todas as proteínas, à excepção da Lisozima e da Avidina, são
eluídas juntamente com o tampão, pois não se ligam à coluna por terem carga negativa
(como é visível no quadro abaixo – quadro 2). Ao alterar a solução tampão de eluição
para uma com pH superior (pH 10,5), alterou-se a carga global das proteínas e como tal
a sua ligação com a coluna. As fracções recolhidas começaram a ter valores de pH mais
altos. A avidina que tem pI 10 ficou com carga negativa, sendo eluída com o tampão de
eluição, seguindo-se o lisozima, o enzima que se pretendia separar, que ficou com carga
nula.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1,2 1
5
30
45
65
75
85
95
10
5
11
5
12
5
13
0
13
5
14
0
14
5
15
0
15
5
16
0
16
5
17
0
17
5
18
0
18
5
pH
Ab
sorv
ân
cia
a 2
80
nm
Volume eluído /mL
Absorvância e valor de pH VS volume de
eluição
Absorvância
pH
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Quadro 2. Ponto isoeléctrico (pI) das principais proteínas presentes na clara do ovo.
Proteínas pI
Ovalbumina 4,5
Ovotransferrina 6,05
Ovomucoide 4,1
Lisozima 10,7
Ovoinibidor 5,1
Ovomacroglobulina 4,5
Ovoglicoproteína 3,9
Avidina 10
Explicação da variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções
colectadas na cromatografia de troca iónica e a compactação reversível sofrida
pelo gel na coluna durante este processo cromatográfico. Cálculo da força iónica
das soluções tampão utilizadas.
A variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na
cromatografia de troca iónica deve-se a terem sido utilizados dois tampões diferentes:
Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (utilizado nas primeiras 4
fracções – volume equivalente ao volume da coluna - ver anexos – I)
Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M (restantes fracções)
Se o tampão de eluição utilizado não tivesse sido trocado, aumentando-se o seu
pH gradualmente, a variação que se veria nas fracções seria contínua, e não descontínua
como foi o caso.
A utilização de dois tampões de eluição diferentes influenciou a altura da coluna
inicial (11 cm) devido às diferentes forças iónicas dos dois tampões.
A força iónica (I) é a medida do campo eléctrico devido aos iões presentes em
solução. Assim, está relacionada com a concentração de electrólitos, catiões e aniões. A
forção iónica das soluções tampão utilizadas podem ser calculadas através da seguinte
expressão:
Onde é a concentração da espécie com carga e é a carga da respectiva
espécie.
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Força Iónica do Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M
As equações que representam o equilíbrio do tampão são:
1. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga
Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:
2. Cálculo da força iónica
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Força Iónica do Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M
As equações que representam o equilíbrio do tampão são:
1. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga
Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:
2. Cálculo da força iónica
Visto que a força iónica do segundo tampão é maior que a do primeiro, o
segundo tampão causa o compactamento da coluna. As partículas de gel carregadas
negativamente, unem-se mais aos iões Na+ do tampão de carbonatos de sódio por a
concentração destes catiões ser superior neste tampão, o que em conjunto com outros
iões presentes em solução aumenta a força iónica causando a compactação da coluna.
Este processo de compactação é reversível – basta adicionar um tampão com menor
força iónica para que a coluna descompacte.
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Cálculo da concentração proteica de cada fracção e do PCO usando as leituras de
Absorvância a 280 nm
Para o cálculo da concentração das fracções foram utilizados dois valores de
coeficiente de absorção molar.
(mistura de proteínas)
(lisozima)
Nas fracções em que se suspeita que exista lisozima (fracções 17 – 19) utilizou-
se o segundo valor apresentado anteriormente, nas restantes, em que existe uma mistura
de proteínas (fracções 1 – 16 e 20 – 22), utilizou-se o primeiro valor. Exemplificando:
Fracção 1 (mistura de proteínas)
(mistura de proteínas)
Fracção 17 (lisozima)
(lisozima)
No caso em que existiu diluição das soluções para a obtenção de uma
absorvância mais rigorosa, deve multiplicar-se a concentração obtida pelo factor da
diluição. Por exemplo, a fracção 2:
(mistura de proteínas)
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Como a solução foi diluída com factor 2, a concentração real da fracção é:
Quadro 3. Resumo dos valores obtidos durante o processo de doseamento proteico.
Doseamento Proteico
Amostra
Volume
da
Fracção
(mL)
Volume
de
eluição
Total
(mL)
pH Abs280nm
Diluição
do
ensaio
[Prot] (mg/mL)
PCO - - 8,3 1,487 1:12 17,844
1 15 15 8,21 0,080 - 0,080
2 15 30 8,21 0,872 1:2 1,744
3 15 45 8,23 0,936 1:3 2,808
4 20 65 8,18 0,093 - 0,093
5 10 75 8,16 0,049 - 0,049
6 10 85 8,14 0,033 - 0,033
7 10 95 8,15 0,032 - 0,032
8 10 105 8,17 0,044 - 0,044
9 10 115 8,36 0,037 - 0,037
10 10 125 8,58 0,032 - 0,032
11 5 130 8,63 0,031 - 0,031
12 5 135 8,65 0,040 - 0,040
13 5 140 8,67 0,032 - 0,032
14 5 145 8,69 0,042 - 0,042
15 5 150 8,69 0,041 - 0,041
16 5 155 8,89 0,189 - 0,189
17 5 160 9,52 0,291 - 0,012
18 5 165 9,95 0,270 - 0,017
19 5 170 10,16 0,275 - 0,014
20 5 175 10,35 0,108 - 0,108
21 5 180 10,45 0,078 - 0,078
22 5 185 10,5 0,056 - 0,056
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Discussão das aproximações realizadas nos cálculos anteriores. Sugestão de um
método mais rigoroso para a determinação proteica de cada amostra.
Para a determinação da concentração proteica de cada fracção obtida na
cromatografia de troca iónica, foi medida a absorvância de cada uma delas e
seguidamente calculou-se a concentração utilizando a lei de Lambert-Beer ( ).
O método utilizado pode induzir em erro, visto que a concentração medida não foi
apenas das proteínas mas sim de todo o conteúdo existente nas fracções.
Assim, para a determinação mais correcta da concentração proteica deveria ter
sido utilizado um método específico de doseamento de proteínas, por exemplo o método
de Lowry. O princípio do método de Lowry baseia-se numa mistura contendo o
reagente de Folin-Ciocalteau que sofre uma redução quando reage com proteínas, na
presença do catalisador cobre (II). A sua principal vantagem é a de apresentar uma alta
sensibilidade na determinação das concentrações das mesmas. No entanto, apesar do
método de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para as proteínas, o mesmo
possui algumas desvantagens, como por exemplo estar sujeito a muitos tipos de
interferentes. Estes interferentes causam, normalmente, o aumento da absorvância do
branco, diminuição da absortividade específica ou formação de precipitados.
Outro método que poderia ser utilizado na determinação proteica é o método do
Biureto (ver anexos – II). No entanto, para além deste método ser muito menos sensível
que o método apresentado anteriormente, seria afectado pelo tampão Tris-HCl, já que
este é um dos poucos interferentes para este método (porque reage com o Cu2+
presente
na mistura).
Representação da actividade enzimática em função da concentração de proteína
para as diferentes diluições da PCO e ainda para a fracção que apresentava maior
actividade enzimática. Resumir os cálculos num quadro.
Em condições adequadas, a velocidade da reacção medida é proporcional à
quantidade de enzima presente no extracto (neste caso, PCO). No entanto, como muitas
enzimas não são encontradas puras, não é possível quantificá-las, pelo que os resultados
são expressos em termos de unidades de actividade (UA), que são definidas
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arbitrariamente como a quantidade de enzima capaz de variar 0,001 unidades de
absorvância por minuto.
Relativamente à lisozima, a unidade enzimática é dada pela quantidade de
centros catalíticos que conduz a uma variação de absorvância a 450nm de 0,001
unidades por minuto.
Para se fazer o cálculo das unidades enzimáticas é utilizada uma fórmula que
relaciona a variação de absorvância (∆Abs) e a variação do tempo (∆t). Para calcular
, fez-se uma regressão linear das rectas obtidas na realização dos ensaios
enzimáticos, onde
representa o declive dessas rectas. Nesta fórmula o tempo vem
em minutos, mas como o espectrofotómetro apresentou o tempo medido em segundos
(60 segundos), foi necessário converter-se esse valor para variação de absorvância por
minuto. Estes valores foram também divididos por 0,001, de modo a obter-se o número
de unidades enzimáticas.
Assim, a fórmula para calcular o número de unidades enzimáticas é:
, em que a unidade é U, sendo este U = µmol.min
-1
Nos ensaios enzimáticos realizados, só a PCO e a fracção 17 foram diluídas, pois
são as que se espera registar maior actividade enzimática. Ainda assim mediu-se a
actividade enzimática para outros picos de absorvância (Figura 1) para concluir se
tinham a lisozima ou não. Para exemplificar os cálculos efectuados tome-se como
modelo os seguintes cálculos:
PCO diluição 1:5
O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver
Anexos – III, Figura III). Neste caso,
.
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O número de unidades enzimáticas é:
Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:
Fracção 17 diluição 3:5
O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver
Anexos – III, Figura IX). Neste caso,
.
O número de unidades enzimáticas é:
Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:
Fracção 2
O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver
Anexos – III, Figura XII). Neste caso,
.
O número de unidades enzimáticas é:
Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:
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Quadro 4. Resumo dos ensaios da actividade do lisozima da clara do ovo na PCO e nas fracções correspondes aos
picos do gráfico 1.
Amostra Diluição
realizada
[Prot]
(mg/mL)
|∆Abs450nm/∆t|
(UA/min)
Actividade
(U/mL)
PCO
1:1 17,844 0,0007 420
1:2 8,922 0,0006 360
1:5 3,5688 0,0004 240
1:10 1,7844 0,0002 120
1:20 0,8922 0,0002 120
1:40 0,4461 0,0002 120
Fracção 17
1:1 0,012 0,0008 480
4:5 0,0096 0,0008 480
3:5 0,0072 0,0007 420
2:5 0,0048 0,0006 360
1:5 0,0024 0,0004 240
Fracção 2 1:1 1,744 1,8
Fracção 3 1:1 2,808 0,36
Fracção 8 1:1 0,044 48
Fracção 18 1:1 0,017 0,0002 120
Fracção 19 1:1 0,014 0,0001 60
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Figura 2. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO.
Figura 3. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da
fracção 17.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0,4461 0,8922 1,7844 3,5688 8,922 17,844
Act
ivid
ad
e E
nzi
má
tica
(U
/mL
)
Concentração de Proteína (mg/mL)
Actividade Enzimática em função da
concentração de proteína para as
diferentes diluições de PCO
Actividade Enzimática
0
100
200
300
400
500
600
0,0024 0,0048 0,0072 0,0096 0,012
Act
ivid
ad
e E
nzi
má
tica
(U
/mL
)
Concentração de Proteína (mg/mL)
Actividade Enzimática em função da
concentração de proteína para as
diferentes diluições da fracção 17
Actividade Enzimática
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Determinação da actividade específica (SA) da PCO e de cada fracção eluída da
coluna
A actividade específica de um enzima (SA) corresponde ao nº de moles de
substrato ou produto convertidos por unidade de tempo e por unidade de massa de
enzima. Por outras palavras podemos dizer que é igual à actividade enzimática por
unidade de massa de enzima usada no ensaio.
Assim, para a actividade específica da PCO e de cada fracção eluída, tem-se que:
, onde as unidades enzimáticas são dadas por U.mg
-1.
Durante a actividade experimental apenas se mediu a absorvância a 450
manómetros durante 1 minuto para as fracções que apresentavam maior concentração
proteica. Desta forma, apenas foi possível calcular a actividade enzimática e a
actividade específica para estas fracções. Em seguida demonstra-se um exemplo do
cálculo da actividade específica para uma das fracções:
Fracção 8
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Quadro 5. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica
Doseamento
Proteico
Doseamento da actividade
enzimática
Am
ost
ra
Volu
me
da
Fra
cção
(mL
)
Volu
me
de
elu
ição
Tota
l
(mL
)
pH
Ab
s 28
0n
m
Dil
uiç
ão d
o
ensa
io
[Pro
t]
(mg/m
L)
(UA
/min
)
Act
ivid
ad
e
(U/m
L)
SA
(U/m
g)
PCO - - 8,30 1,487 1:12 17,844 0,0007 420 23,54
1 15 15 8,21 0,080 - 0,080
2 15 30 8,21 0,872 1:2 1,744 1,8 1,03
3 15 45 8,23 0,936 1:3 2,808 0,36 0,13
4 20 65 8,18 0,093 - 0,093
5 10 75 8,16 0,049 - 0,049
6 10 85 8,14 0,033 - 0,033
7 10 95 8,15 0,032 - 0,032
8 10 105 8,17 0,044 - 0,044 12 272,73
9 10 115 8,36 0,037 - 0,037
10 10 125 8,58 0,032 - 0,032
11 5 130 8,63 0,031 - 0,031
12 5 135 8,65 0,040 - 0,040
13 5 140 8,67 0,032 - 0,032
14 5 145 8,69 0,042 - 0,042
15 5 150 8,69 0,041 - 0,041
16 5 155 8,89 0,189 - 0,189
17 5 160 9,52 0,291 - 0,012 0,0008 480 40000
18 5 165 9,95 0,270 - 0,017 0,0002 120 7058,82
19 5 170 10,16 0,275 - 0,014 0,0001 60 4285,71
20 5 175 10,35 0,108 - 0,108
21 5 180 10,45 0,078 - 0,078
22 5 185 10,50 0,056 - 0,056
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Gráfico de eluição da cromatografia realizada representando a concentração de
proteína e SA de cada fracção em função do volume de eluição. Discussão dos
resultados obtidos.
Figura 4. Gráfico representativo da concentração de proteína e SA em função do volume de eluição.
Como é visível no gráfico anterior (Figura 4), a actividade específica é maior
onde a concentração proteica é menor. Apesar de haver uma maior concentração
proteica na primeira parte do gráfico (volume de eluição de 20 a 105), a enzima não está
presente, ou está presente em muito pouca quantidade, pois estas foram as primeiras
fracções a serem recolhidas e só as proteínas com carga negativa foram eluídas, ou seja,
todas as que tem pI inferior a 8,2, que não é o caso do lisozima, enzima do qual se está a
calcular a actividade específica.
Este gráfico mostra então que a separação da lisozima da clara do ovo por
cromatografia de troca iónica foi eficiente, já que nas fracções em que se esperava obter
o enzima, existe actividade enzimática.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
30 45 105 160 165 170
Act
ivid
ad
e E
spec
ífic
a (
SA
) (U
/mg
)
Co
nce
ntr
açã
o d
a P
rote
ína
(m
g/m
L)
Volume de Eluição (mL)
Concentração de Proteína e SA em função
do volume de eluição
[Prot] (mg/mL)
SA (U/mg)
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Estudo do electroforama obtido e identificação das principais proteínas em cada
pista. Relação do electroforama com os cromatogramas anteriores.
A electroforese realizada neste trabalho experimental foi uma electroforese
unidimensional em gel de SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE).
Foi utilizado o gel de poliacrilamida, pois este apresenta uma grande resolução
originando, portanto, uma boa separação dos diferentes componentes de uma mistura.
Estes géis também têm a vantagem de serem fáceis de preparar e corar, permitindo
revelar e identificar facilmente os compostos separados.
Esta electroforese foi realizada sob condições desnaturantes (devido ao SDS, que
é um detergente), que dissocia as cadeias e as ligações persulfureto, permitindo a
identificação aproximada, por comparação, do tamanho da proteína
Figura 5. Electroforama obtido no SDS-PAGE.
Na realização do gel para a electroforese, foram preparados dois tipos de gel. O
gel resolvente (a 12%) e o gel concentrador (a 5%). A camada superior, o gel
concentrador, tem poros maiores, enquanto o gel resolvente, a camada inferior, tem
poros mais pequenos. Desta forma, as proteínas maiores, com maior massa molecular
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ficam retidas na camada superior, enquanto as proteínas de menores dimensões passam
para a camada inferior.
Em cada poço seria suposto colocar de proteína, podendo ter no máximo
da solução proteica. Como algumas fracções possuem concentrações muito
baixas, o volume a colocar nos poços era muito maior que 10 logo, na
impossibilidade de colocar o volume calculado (ver Anexos - IV), colocou-se .
No electroforama obtido, a ordem de colocação das amostras nos poços é a
seguinte:
1- Amostra de PCO; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;
2- Amostra do pico 1 (Fracção 3); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5
minutos;
3- Amostra do pico 2 (Fracção 8); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5
minutos;
4- Amostra do pico 3 (Fracção 17); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5
minutos;
5- Amostra do lisozima; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;
6- Marcador; tampão e β-mercaptoetanol;
7- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol;
8- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos:
9- Amostra de β-globulina; tampão de aplicação; aquecidos durante 5 minutos.
Através da comparação das bandas obtidas com as bandas do marcador (Quadro
6), cujas massas moleculares são conhecidas, é possível verificar se a fracção que se
suspeita ter lisozima está pura.
Quadro 6. Proteínas que constituem o marcador.
Proteína Mr (KDa) Rf Erro
Fosforilase b 94 0,36 0,32-0,40
BSA 67 0,44 0,39-0,47
Ovalbumina 43 0,52 0,46-0,56
Anidrase carbonica 30 0,65 0,58-0,70
Inibidor de tripsina 20 0,75 0,66-0,80
α-lactalbumina 14,4 0,84 0,75-0,91
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Sabendo que a lisozima tem massa molecular 14,3 KDa, é de esperar que as
amostras que contenham lisozima apresentem uma banda situada onde, em comparação
com o marcador, a massa molecular é 14,4 KDa. Assim, é possível concluir que as
amostras colocadas no poço 1, 2, 3, 4 e 5 contem uma percentagem notável de lisozima.
Nas restantes amostras, foi estudado o efeito do aumento de temperatura (9), o
efeito do β-mercaptoetanol (7) e o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura
conjugados (8) na β-globulina. A β-globulina é construída por 2 subunidades, quando
fica sujeita à acção de agentes desnaturantes, as duas subunidades separam-se,
mostrando no electroforama três bandas distintas. Uma banda para a proteína não
desnaturada, e duas para cada uma das subunidades.
No caso em que foi estudado o efeito do β-mercaptoetanol (7), é possível
observar várias bandas a diferentes massas moleculares, o que significa que o β-
mercaptoetanol desnaturou a proteína de tal forma que para além das subunidades se
separarem uma da outra, ainda se dividiram em fracções com tamanhos variáveis (desde
94 a 14,4 KDa). Na amostra aplicada ao poço 8, a proteína também desnaturou dando
origem a 4 bandas distintas, ou seja, fracções com tamanhos variáveis. No caso em que
se estudou o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8), obteve-se
aproximadamente o mesmo resultado que no caso anterior, mas obteve-se menos
bandas. No caso em que apenas se estudou o aumento da temperatura aconteceu o
descrito anteriormente, o electroforama apresenta 3 bandas, uma banda para a proteína
não desnaturada (a primeira banda), e duas para cada uma das subunidades (a
subunidade de menor tamanho apresenta-se numa banda na parte inferior do
electroforama).
Quadro de purificação final do lisozima da clara do ovo
Para determinar o rendimento e a purificação do enzima seleccionaram-se as
fracções com maior actividade específica, pois é nestas fracções que se encontra a maior
parte do enzima que se pretendia purificar, o lisozima. As fracções seleccionadas foram
a 17, 18 e 19, já que apresentam actividade específica 40 000, 7058,82 e 4285,71,
respectivamente.
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Para exemplificar o cálculo do rendimento e da purificação do enzima,
procedeu-se a este cálculo para a fracção 17, sendo o cálculo para as outras fracções e
para a PCO semelhante.
Fracção 17
Sendo a actividade total o somatório de todas as actividades totais de todas as
fracções.
Sendo a actividade específica total o quociente entre a actividade total e a soma
das massas totais de enzima purificado.
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Quadro 7. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica.
Pa
sso
de
Pu
rifi
caçã
o
Vo
lum
e T
ota
l
(mL
)
[Pro
t]
(mg/m
L)
Ma
ssa
Pro
teic
a t
ota
l
(mg)
Act
ivid
ad
e
(U/m
L)
Act
ivid
ad
e
To
tal
(U)
SA
(U
/mg)
Ren
dim
ento
(%)
Pu
rifi
caçã
o
(x)
PCO 7*1
17,844 124,91 420 2 940 23,54
112,2 2002,7
Fra
cções
17 5 0,012 0,06 480 2 400 40 000
18 5 0,017 0,085 120 600 7 058,8
19 5 0,014 0,07 60 300 4 285,7
Total 15 0,014*2
0,215 660 3 300 47 142,86*3
*1 O volume da PCO deveria ser 8 % do volume total da coluna. No entanto, colocou-se 7 mL.
*2 O valor de concentração total é a média dos valores de concentração obtidos em cada fracção.
*3
Como é visível no quadro anterior (Quadro 7) tanto o rendimento como a
purificação dão valores bastante mais altos que o esperado. Durante a realização deste
trabalho experimental não se mediu a absorvância da solução da PCO utilizada e como
tal, para se obter um valor aproximado ao obtido se tivesse sido medido, foi utilizado o
valor de absorvância registado por outro grupo. Desta forma o valor da concentração e
consequente absorvância da PCO para a solução utilizada durante o trabalho, deveria ser
maior que aquele que obtemos do outro grupo.
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por
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Conclusão
Globalmente, este trabalho laboratorial foi constituído por quatro etapas
principais:
Cromatografia de troca iónica;
Doseamento da concentração de proteína;
Doseamento da actividade enzimática;
Electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
A cromatografia de troca iónica permitiu-nos separar diferentes fracções da
amostra da clara de ovo (PCO) e, como tal, diferentes soluções constituídas por
diferentes conjuntos de proteínas. Após a sua análise, ao serem medidas as absorvâncias
das fracções, foi possível identificar aquelas que teriam o enzima pretendido (lisozima)
na sua constituição. A partir daí foi possível analisá-las mais detalhadamente e avaliar
diversos parâmetros que nos permitiram estimar a presença e o comportamento do
lisozima.
Através da determinação da actividade enzimática de cada fracção, às quais se
adicionou substrato de parede celular de células de M. luteus, foi possível medir o
decréscimo da absorvência a 450 nm e, desta forma, verificar experimentalmente a
actividade do lisozima sobre as paredes celulares da bactéria em questão. Calculou-se
também a actividade enzimática e actividade específica das diferentes diluições da
amostra da PCO e das fracções correspondentes a picos de absorvância.
Por fim, pela realização da electroforese unidimensional em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) conseguiu-se identificar as principais proteínas presentes
em cada poço, nomeadamente, na amostra da PCO e nas amostras correspondentes aos
três picos. Tendo-se utilizado um marcador de massa molecular conseguiu-se concluir
que, de facto, o pico 3 (fracção 17) continha lisozima na sua constituição, enquanto que
os restantes (eluídos inicialmente) continham outras proteínas que fazem parte da
constituição da clara de ovo. Este método permitiu, assim, concluir que foi possível
purificar o lisozima, tal como se esperava.
Através das fracções com maior actividade específica determinou-se o grau de
purificação do lisozima bem como o rendimento de toda a actividade. Os valores
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obtidos para estes parâmetros não podem ser aceites como verdadeiros nem discutidos,
uma vez que para efectuar os cálculos foi necessário recorrer ao valor de absorvância da
PCO de outro grupo, não correspondendo à realidade daquilo que foi observado.
Em suma, apesar de não ter sido possível quantificar o rendimento nem o grau
de pureza do lisozima obtido, foi possível verificar qualitativamente a sua presença e
observar a sua actividade catalítica. Desta forma, pode fazer-se um balanço positivo
relativamente a todo trabalho que teve como principal objectivo a purificação do
lisozima da clara do ovo.
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Bibliografia
Boyer, RF (1993) Modern Experimental Biochemistry, 2ª ed., The Benjamin/Cummings
Publishing Co., Redwood City.
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York.
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Biotechnology, Fitzgerald Science Press: Bethesda, MA, pp. 199-206.
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Fundamental Methods, 3rd. ed., W.H. Freeman: New York, pp. 95-104.
Wilson, K (1994) Principles and Techniques of Practical Biochemistry, (Wilson, K e Walker, J,
eds.) 4ª ed., Cambridge University Press, Cambridge.