Purificacao de Produtos Biotecnologicos-1
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Purificação de Produtos Biotecnológicos
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP
Disciplina: Engenharia Bioquímica II APrograma de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia CarneiroProfº Arnaldo Márcio
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Etapas de um Processo de Purificação
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Etapa do processo Operações unitárias Princípio
Clarificação
Filtração convencional Tamanho de partículas Centrifugação Tamanho e densidade de partículas Filtração tangencial (membranas) Tamanho de partículas
Floculação Hidrofobicidade de partículas
Rompimento de células
H omegeneização Cisalhamento Ultra-som Cisalhamento Moagem em moinho de bolas Cisalhamento
Rompimento químico ou enzimático Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou a membrana celular
Purificação de baixa resolução
Precipitação Solubilidade
U Itrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas
Extração em sistemas de duas fases líquidas Solubilidade, massa molar
Purificação de alta resolução
Cromatografia de troca-iônica Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula
Cromatografia de afinidade (biológica ou química)
Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção)
Cromatografia de imunoafinidade Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção antígeno/anticorpo)
Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade
Cromatografia de exclusão molecular Massa molar
Membranas adsortivas Massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína
Tratamentos finais
Cristalização Solubilidade e características de equilíbrio líquido-sólido
Liofi I ização Características de equilíbrio líquido-sólido
Secagem Características de equilíbrio líquido-sólido
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Rompimento Celular
Suspensão Celular
Clarificação
Rompimento Celular
Produtos Intracelulares
Produtos intracelulares tornam o processo de purificação de biomoléculas mais difícil em comparação com produtos extracelulares devido à necessidade do rompimento
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Aplicados após a separação e lavagem das células;
Células animais (possuem apenas membrana), fácil rompimento com baixa força de cisalhamento;
Ex.: Células animais: rompidas por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade
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Forma mais adequada de Rompimento?Tipo de microrganismoTamanho da célula;Tolerância a tensões de cisalhamento;Necessidade de controle de
temperatura;Gasto de energia;
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Parede Celular
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Métodos de Rompimento Celular
• Homogeneizador de alta pressão• Moinho de bolas• Ultrassom
Mecânicos
• Choque osmótico• Congelamento-descongelamento• Aquecimento • Secagem
Não-mecânico
s • Álcalis• Solventes• Detergentes• Ácidos
Químicos
• Lize enzimáticaEnzimáticos
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Homogeneizador a alta pressão
CavitaçãoTurbulênciaCisalhamento
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Mecânico - Homogeneizador a alta pressãoEste tipo de rompimento provoca aumento da
temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigeração
Pressões utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s e concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa úmida).
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Mecânico - Homogeneizador a alta pressãoO desempenho pode ser afetado por:
Pressão de operação;Velocidade de alimentação;Temperatura;Estado fisiológico do microrganismo;Condições de cultivo;Tipo de célula e sua concentração.tamanho das células (maior => rompimento mais
fácil)pressão (maior => maior eficiência)número de passagens (múltiplas etapas aumenta o
ren-dimento)
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Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento, que neste caso é de 1a ordem em relação ao número de passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:
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log Rm = k . N . Pa (Rm – R)
onde:Rm é a concentração máxima de proteína disponível para ser liberada (g/L)R é a concentração de proteina liberada (g/L)k é a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de célulaN é o número de passagensP é a pressão
a é constante que depende do tipo de microrganismo e das condições de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)
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Mecânico – Moinho de BolasConsiste na passagem da suspensão celular
por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas de vidro.
O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células.
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Mecânico – Moinho de Bolas
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Mecânico – Ultra-som
O rompimento ocorre quando ondas sonoras (~20kHz), são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação.
Escala de laboratório.
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Mecânico - Ultrassom
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Rompimentos MecânicosDesvantagens:
As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas;
Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.