Utilização de plasmídeos vegetais derivados de vírus no melhoramento
genético e proteção de cultivos
Prof. Dr. Felipe dos Santos Maraschin
Laboratório de Fisiologia Vegetal – Instituto Biociências UFRGS
Porto Alegre, RS
Plasmídeos vegetais
• Sistema de expressão transiente de amplo espectro – Simples administração
– Não transgênico
– Sem necessidade de cultura in vitro ou agentes de seleção
– Superexpressão constitutiva ou induzível, estável e duradoura
– Não herdável e não transmissível
TYLCV
• Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)
• Geminivirus (ssDNA circular)
• Patógeno de diversas culturas pelo mundo
• Transmitido por Bemisia tabaci “whitefly”
Ciclo de um Geminivirus
TYLCV
• Genoma circular ssDNA 6 ORFs
• Região intergênica (IR) contém elementos para replicação pelo hospedeiro e funciona como um promotor bidirecional
• Proteínas do hospedeiro geram novas cópias dsDNA
• A proteína C1 é essencial para a produção de novos genomas ssDNA por replicação “rolling circle”
• A proteína V1 codifica o capsídeo (CP) e é essencial para transmissibilidade
• As proteínas V2, C2, C3 e C4 estão envolvidas na mobilidade viral, aparição de sintomas e na severidade da doença
• Em suma, cinco ORFs não estão envolvidas na replicação e expressão do vírus
Modificação do vírus
• As proteínas do capsídeo viral V1, V2 estão envolvidas no movimento do vírus dentro da planta
• TYLCV inoculados mecanicamente não causam infecção
• Um isolado israelense (GenBank X15656) é capaz de causar infecção com inoculação mecânica
• Remoção de 20 aa (60nt) N-terminais da proteína V1 (CP) tornou o vírus incapaz de gerar sintomas. Entretanto esta versão que é capaz de multiplicar-se e espalhar-se nos tecidos vegetais foi denominada IL-60
• TYLCV é funcional somente com pequenos insertos
O sistema de expressão • Uma célula expressando V1,V2 replica autonomamente dsDNA contendo a
IR.
• Um plasmídeo contendo IR é capaz de se auto-propagar em células vegetais como um plasmídeo
• ssDNA não é produzido e capsídeos virais não podem ser produzidos
• O vetor pode ser propagado em E coli
• O gene de interesse é colocado em um plasmídeo “satélite” que possui a região IR como promotor (p-IR).
• A administração plasmídeo helper p1470 “ativa” a propagação do plasmídeo satélite
helper
Satélite (expressão)
Ciclo do plasmídeo vegetal
X
X
X
X Outras células
Expressão de genes exógenos
• Inicialmente a expressão é limitada ao floema, e após alguns dias passa a espalhar-se para outros tecidos.
DNA
Silenciamento gênico
• Expressão de dsRNA formando hairpin para silenciamento do gênico.
• Expressão do operon prnABCD de Pseudomonas fluorescens em tomate.
• Formação de um único mRNA policistrônico e acúmulos do composto funcional pyrrolnitrina.
• O acúmulo de pyrrolnitrina confere resistência à infecção por R. solani.
Vantagens do sistema
• Facilidade: miniprep de 2 plasmídeos administrados mecanicamente na planta hospedeira. Somente uma clonagem é necessária
• Altos níveis de expressão: comparáveis a CaMV::35S
• Universalidade de hospedeiros
• Estratégia não transgênica e com reduzidos riscos de biossegurança. USDA – Non GMO!!!
• Limitação de fluxo gênico
• Aplicação em espécies de difícil transformação
• Expressão de operons sem a necessidade de transformação plastidial, rotas metabólicas co-expressas
Resultados preliminares - UFRGS
Tabaco Arroz Eucalipto
Macieira Videira
Projetos em colaboração
• Embrapa Uva e Vinho, Bento Gonçalves, RS
• Resistência à sarna da maçã (Apple scab)
MSc.Roberta Cusin
Sarna da maçã
• Causada pelo ascomiceto Venturia inaequalis
• Predominante em clima úmido temperado
• Causa perdas de até 100% nos pomares
• Quatro aplicações de fungicidas mais tratos culturais perfazem 20% do custo de produção
• Fuji, Gala e Golden delicious são muito sucetíveis.
Variedades resistentes à sarna
• Vários acessos de germoplasma de Malus são resistentes à sarna
• A resistência já foi mapeada e um gene, Vf2 oriundo de Malus floribunda, foi demonstrado como o responsável pelo fenótipo resistente
• A introgressão genética nas variedades cultivadas pode levar décadas (até 20 anos)
Mecanismo de resistência
• Interação gene-a-gene
• Proteínas R reconhecem efetores do patógeno (Avr genes)
• Reconhecimento por uma proteína LRR identificada como Vf2
Viabilizar a introgressão imediata do gene de resistência nas variedades suscetíveis Fuji e Gala
• Clonagem do gene Vf2 de Malus floribunda
• Tratamento plantas Fuji e Gala com o gene de resistência
• Genotipagem
• Análise da expressão
• Testes de patogenicidade
Resultados
Amostragens
15 e 30 dias – detecção DNA plamidial
240 dias – análise expressão gênica
Abril 2015
Expressão do gene de resistência nas plantas tratadas
Macierias Gala e Fuji resistentes à sarna
Modulação da expressão de gênica para obtenção de uvas apirênicas
• Jaiana Malabarba – Doutoranda PPGBCM-UFRGS
Orientação Giancarlo Pasquali e Luis Fernando Revers
Fator de transcrição MADS
• Presente em um QTL para apirenia em videira
• MADS Box, gene candidato
Modulação da expressão gênica
• Superexpressão: Variedades apirênicas
• Silenciamento:Variedades com sementes
Resultados
• A superexpressão restaurou parcialmente a formação de sementes em variedades apirênicas
100-200 fold increase!
Resultados
• O silenciamento por RNAi suprimiu a produção de sementes em variedades com sementes
Agradecimentos
• Roberta Cusin
• Jonata Ribeiro
• Jaiana Malabarba
• Vitor Falavigna
• Luis Fernando Revers, Embrapa
• Sílvio André Meirelles Alves, Embrapa
• Diogo Porto, Embrapa
• Márcia Margis, UFRGS
• Rogério Margis, UFRGS
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