UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
Desenvolvimento e validação de métodos analíticos para
pesquisa de 2-feniletilaminas em fluidos biológicos
Alexandra Filipa Pereira Gonçalves
Mestrado em Química
Lisboa
2011
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
Desenvolvimento e validação de métodos analíticos para
pesquisa de 2-feniletilaminas em fluidos biológicos
Alexandra Filipa Pereira Gonçalves
Mestrado em Química
Orientação: Prof. Doutor José Manuel Florêncio Nogueira
Mestre Maria Suzel Costa de Sousa e Escada
Lisboa
2011
PREFÁCIO
O consumo de drogas de abuso sintéticas é cada vez mais recorrente, sendo já considerada
uma das epidemias do século XXI. Têm surgido no mercado ilícito novas drogas de abuso
sintéticas, em particular derivados de 2-feniletilaminas. A pertinência do estudo destes
compostos prende-se com o elevado grau de incidência da sua utilização recreativa e dos
efeitos psicoactivos que provocam. Torna-se por isso essencial num contexto forense, a
existência de métodos rápidos para pesquisa deste tipo de substâncias em amostras biológicas,
e passíveis de poderem ser utilizados em rotina.
A presente dissertação resulta da colaboração entre a Faculdade de Ciências da Universidade
de Lisboa e o Serviço de Toxicologia Forense (STF) da Delegação do sul do Instituto
Nacional de Medicina Legal, I. P. Pretendia-se então desenvolver e validar metodologias
analíticas para a pesquisa de derivados de 2-feniletilaminas em fluidos biológicos, com
aplicabilidade em rotina no STF. Resultou igualmente da colaboração o desenvolvimento de
uma metodologia analítica alternativa e inovadora para a análise de diversos derivados de 2-
feniletilaminas designada por micro-extracção adsorptiva em barra (BAµE), cuja invenção se
encontra sob pedido provisório de patente nacional.
O trabalho apresentado foi alvo de divulgação na comunidade científica, através de
comunicações em painel (“poster”) em encontros internacionais, assim como de
comunicações orais em encontros nacionais e ibéricos.
Comunicações em painel:
Development and validation of a method for the analysis of amphetamine-type
stimulants in whole blood by SPE-GC-MS. 19th Triennial Meeting of the
International Association of Forensic Sciences (IAFS), 2011, Funchal, Portugal.
Comunicações orais:
Selectividade: um parâmetro de validação muitas vezes subvalorizado.
I Jornadas Ibéricas de Toxicologia, 2011, Covilhã, Portugal.
Desenvolvimento e validação de métodos para análise de estimulantes do tipo
anfetamina em amostras biológicas. XXII Encontro Nacional de Química, 2011,
Braga, Portugal.
Publicações em revistas científicas indexadas:
Development of a Powdered Activated Carbon in Bar Adsorptive
Micro-extraction for the Analysis of Morphine and Codeine in Human Urine. A.F.P.
Gonçalves, N.R. Neng, A.S. Mestre, A.P. CArvalho, J.M.F. Nogueira. Aceite para
publicação em Journal of Chromatographic Sciences (9 Out 2011).
iii
AGRADECIMENTOS
A concretização da presente dissertação deve-se ao contributo de diversas pessoas e
entidades, às quais quero manifestar o meu profundo agradecimento.
Agradeço às instituições que apoiaram o trabalho desenvolvido, nomeadamente, ao Serviço
de Toxicologia Forense da Delegação do Sul do Instituto Nacional de Medicina Legal I.P.,
por me ter proporcionado um estágio, em excelentes instalações e condições de trabalho.
Ao Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade de
Lisboa agradeço condições que permitiram levar a cabo a segunda fase do trabalho.
Aos orientadores, Professor Doutor José Manuel F. Nogueira e Mestre Suzel Costa,
agradeço a orientação do presente trabalho, sugestões e conselhos. Agradeço ainda ao
Professor Doutor José Manuel F. Nogueira ter aceitado a orientação desta dissertação, seu
interesse, prontidão e auxílio. À Mestre Suzel Costa agradeço o seu grande
profissionalismo, os conhecimentos científicos transmitidos, dedicação, incentivo,
disponibilidade e paciência.
Ao Prof. Doutor Jorge Costa Santos, Director da Delegação de Lisboa do Instituto
Nacional de Medicina Legal, agradeço a oportunidade de realizar o estágio na Instituição,
assim como a disponibilização dos meios necessários à concretização do mesmo.
Dirijo um agradecimento muito especial ao Director do Serviço de Toxicologia Forense,
Mestre Mário Dias, por manter sempre a porta aberta nas inúmeras visitas ao STF e, em
especial, pela proposta de estágio, compreensão, interesse demonstrado, apoio
incondicional e constante incentivo.
Também do mesmo serviço, agradeço ao Dr. Antonio Castañera, director de qualidade,
pela formação e apoio em validação de métodos analíticos, acreditação de laboratórios e
gestão da qualidade.
Ao Doutor Mário Barroso uma palavra de gratidão. O interesse demonstrado no trabalho
desenvolvido, as suas sugestões, disponibilidade para discutir os problemas que iam
surgindo e a sua “irritante” boa disposição foram essenciais; um belo colega. À Dra. Suzana
Fonseca agradeço a excelente companhia nas longas manhãs e tardes de tratamento de
resultados, as conversas esclarecedoras, a eterna paciência para responder às minhas
questões e as amostras de urina. À Dra. Susana Simões agradeço a sua disponibilidade,
excelente companhia, conversas e esclarecimentos. Agradeço ainda o apoio prestado nos
ensaios realizados por LC-MS/MS, sem o qual estes não seriam possíveis.
iv
Aos restantes profissionais do serviço, Dr. Nuno Gonçalves, Dr. Francisco Vale,
Eng. Cláudia Maueza, Elsa Rodrigues, Luísa Almeida e Paula Rodrigues, agradeço o
companheirismo, a forma como me integraram na equipa e a paciência demonstrada para
com a entropia por mim causada na rotina do laboratório. Uma palavra de agradecimento
ao doutorando José Restolho pelo companheirismo, apoio e momentos de descontracção
passados no STF e congressos.
Aos colegas do Grupo de Ciência & Tecnologia de Separação da Faculdade de Ciências da
Universidade de Lisboa agradeço a companhia e as longas conversas.
Não posso também deixar de agradecer aos meus amigos, e a todas as pessoas que me
deram uma palavra de amizade e incentivo. Uma palavra muito especial à amiga Maria
Costa, pelo apoio incondicional, paciência, partilha de experiências e, acima de tudo, pelo
privilégio de me deixar entrar no seu mundo.
À minha família, em especial aos meus pais e irmã. Aos meus primos, ao Fábio, por me
fazer rir nos momentos de desespero. Aos meus queridos avós, pelo imenso carinho.
Ao Daniel, pelo amor e amizade. Obrigada pelo apoio e compreensão nos imensos fins-de-
semana e férias em que estive ausente.
v
ÍNDICE
PREFÁCIO ................................................................................................................................... i
AGRADECIMENTOS ................................................................................................................... iii
ÍNDICE GERAL ........................................................................................................................... v
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ xix
ÍNDICE DE TABELAS .................................................................................................................. xi
ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS E SÍMBOLOS .............................................................................. xiii
RESUMO .................................................................................................................................. xvii
PALAVRAS-CHAVE .................................................................................................................. xvii
ABSTRACT ................................................................................................................................ xix
KEYWORDS .............................................................................................................................. xix
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1
2. DROGAS DE ABUSO .............................................................................................................. 3
2.1. Definição ............................................................................................................................................... 3
2.2. Considerações sobre drogas sintéticas e drogas de design .............................................................. 4
2.3. Derivados de 2-feniletilaminas........................................................................................................... 4
2.3.1. Série 2C: 2C-T-2 e 2C-T-7 ............................................................................................................... 7
2.3.2. p-metoxianfetaminas: PMA e PMMA ............................................................................................ 9
2.3.3. Catinonas: Metcatinona .................................................................................................................. 11
2.3.4. Efedrinas: Efedrina e Norefedrina ............................................................................................... 12
2.4. Enquadramento: Novas drogas e tendências emergentes ........................................................... 13
3. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE DE DROGAS DE ABUSO .......................................................... 15
3.1. Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS).................................... 15
3.2. Técnicas de preparação de amostras ............................................................................................... 18
3.2.1. Extracção em Fase Sólida (SPE) ................................................................................................... 19
3.2.2. Extracção Sorptiva em Barra de Agitação (SBSE) ..................................................................... 21
3.2.3. Novos materiais e metodologias inovadoras ............................................................................... 23
3.2.3.1. Poliuretano vs. carvão activado .................................................................................................. 24
3.3. Revisão bibliográfica sobre análise de ATS em amostras biológicas ........................................ 25
3.4. Validação de métodos analíticos ...................................................................................................... 27
4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 31
4.1. Padrões e Reagentes .......................................................................................................................... 31
4.2. Soluções ............................................................................................................................................... 31
vi
4.3. Equipamento ...................................................................................................................................... 33
4.4. Materiais .............................................................................................................................................. 34
4.5. Condições Instrumentais .................................................................................................................. 35
4.5.1. GC-MS .............................................................................................................................................. 35
4.5.2. LC-MS/MS ....................................................................................................................................... 35
4.6. Amostras Biológicas .......................................................................................................................... 37
4.7. Identificação dos compostos ........................................................................................................... 38
4.8. Extracção em Fase Sólida (SPE) ..................................................................................................... 39
4.8.1. Pré-tratamento das amostras biológicas ....................................................................................... 39
4.8.2. Metodologia de extracção em fase sólida .................................................................................... 39
4.8.2.1.Metodologia de extração com as colunas Oasis® HLB ................................................... 39
4.8.2.2.Metodologia de extração com as colunas Oasis® MCX .................................................. 39
4.8.3. Derivatização química ..................................................................................................................... 40
4.8.3.1. MBTFA, MSTFA:TMS (95:5; v/v), MBDSTFA ou MSHFBA. .................................... 40
4.8.3.2. MSTFA/MBTFA ................................................................................................................... 40
4.8.3.3. PFPA/PFOH. ........................................................................................................................ 41
4.8.3.4. Py/Cloroformato de benzoílo ............................................................................................. 41
4.9. Quantificação ...................................................................................................................................... 41
4.10. Validação do método de ensaio para análise de ATS por SPE/GC-MS .................................. 42
4.10.1. Avaliação da selectividade ............................................................................................................ 43
4.10.2. Limites analíticos do método: limites de detecção e de quantificação ................................. 43
4.10.3. Linearidade ..................................................................................................................................... 44
4.10.4. Gama de trabalho ......................................................................................................................... 45
4.10.4.1. Regressão linear ponderada. ............................................................................................... 45
4.10.5. Precisão: repetibilidade e precisão intermédia ......................................................................... 46
4.10.6. Exactidão, veracidade e tendência ............................................................................................. 47
4.10.7. Recuperação da fase de extracção (eficiência de extracção) .................................................. 48
4.10.8. Presença de arrastamento (carry over) ......................................................................................... 49
4.10.9. Robustez ........................................................................................................................................ 49
4.11. Metodologia alternativa para análise de ATS em fluidos biológicos: Estudos preliminares .. 49
4.11.1. Preparação do micro-dispositivo de extracção ......................................................................... 50
4.11.2. Escolha do material adsorvente .................................................................................................. 50
4.11.3. Estudo do efeito de evaporação nos ATS ................................................................................. 51
4.11.4. Recuperação da fase de extracção (eficiência de extracção) ................................................... 52
4.11.4. Limite de detecção......................................................................................................................... 52
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 53
5.1. Identificação dos compostos ........................................................................................................... 53
vii
5.2. Extracção em Fase Sólida (SPE) ..................................................................................................... 56
5.2.1. Pré-tratamento das amostras biológicas ....................................................................................... 56
5.2.2. Metodologia de extracção .............................................................................................................. 56
5.2.3. Estudo do efeito de evaporação nos ATS ................................................................................... 57
5.2.4. Derivatização química ..................................................................................................................... 58
5.3. Validação do método de ensaio para análise de ATS por SPE/GC-MS .................................. 60
5.3.1. Avaliação da selectividade .............................................................................................................. 60
5.3.2. Limites analíticos do método: limites de detecção e de quantificação ................................... 63
5.3.3. Linearidade ....................................................................................................................................... 66
5.3.4. Gama de trabalho ........................................................................................................................... 68
5.3.4.1. Regressão linear ponderada. ................................................................................................. 69
5.3.5. Precisão e exactidão ....................................................................................................................... 71
5.3.6. Recuperação da fase de extracção (eficiência de extracção) .................................................... 72
5.3.7. Presença de arrastamento (carry over) ........................................................................................... 74
5.3.8. Robustez .......................................................................................................................................... 75
5.4. Metodologia alternativa para análise de ATS em fluidos biológicos: Estudos preliminares .. 75
5.4.1. Escolha do material adsorvente .................................................................................................... 76
5.4.2. Optimização dos parâmetros de LC-MS/MS ............................................................................. 78
5.4.3. Estudo do efeito de evaporação nos ATS ................................................................................... 78
5.4.4. Recuperação da fase de extracção (eficiência de extracção) ..................................................... 79
5.4.5. Limite de detecção ........................................................................................................................... 80
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................................... 81
7. PERSPECTIVAS FUTURAS.................................................................................................... 85
8. REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 87
9. ANEXOS ................................................................................................................................... I
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1 – Estruturas químicas da 2-feniletilamina (a) e da anfetamina (b). .......................................... 4
Figura 2.2 – Estruturas químicas de alguns compostos da série 2C.. ......................................................... 7
Figura 2.3 – Estruturas químicas das moléculas 2C-B (a) e DOB (b). ....................................................... 8
Figura 2.4 – Síntese da metcatinona: reacção de oxidação da efedrina .................................................... 11
Figura 3.1 – Representação esquemática das etapas do método de SPE ................................................. 20
Figura 3.2 – Representação do mecanismo de extracção por SPE de modo misto (MCX) de uma
droga básica (propranolol). ....................................................................................................................... 21
Figura 3.3 – Imagem e representação esquemática de BAµE. .................................................................. 24
Figura 3.4 – Estrutura molecular do grupo uretano ................................................................................... 24
Figura 4.1 – Representação esquemática da barra de micro-extracção .................................................... 50
Figura 4.2 – Ilustração genérica do processo de pré-concentração dos analitos por BAµE-LD......... 51
Figura 5.1 – Identificação do 2C-T-2-N-TFA numa amostra de sangue total fortificada com 200
ng/mL dos ATS em estudo e à qual se adicionou o PI na mesma concentração: Confirmação
da presença dos três fragmentos iónicos de diagnóstico no cromatograma (a); Fragmentograma
de massa do 2C-T-2-N-TFA (b); Aplicação dos critérios de aceitação para a identificação do
2C-T-2-N-TFA (c).. ................................................................................................................................... 55
Figura 5.2 – Cromatogramas obtidos por SPE/GC-SIM-MS: alíquota de pool de sangue branco
fortificada com o PI (200 ng/mL) e os ATS (200 ng/mL) (a); alíquota da mesma pool de sangue
após fortificação a 200 ng/mL com o PI e os ATS, e os cinquenta e dois compostos
mencionados na tabela em anexo (b). ..................................................................................................... 62
Figura 5.3 – Cromatogramas obtidos na segunda fase do estudo da selectividade do método
analítico por SPE/GC-MS: alíquota de pool de sangue branco fortificada com o PI (200
ng/mL) e os ATS (200 ng/mL) (a); alíquota da mesma pool de sangue após fortificação com o
PI (200ng/mL) e os cinquenta e dois compostos mencionados na tabela em anexo (b)... ............ 63
Figura 5.4 – Distribuição do erro relativo percentual (ER%) em função das concentrações de 2C-
T-2-N-TFA obtida para o Modelo 1 (wi=1), Modelo 2 (wi=1/√x), Modelo 3 (wi=1/x),
Modelo 4 (wi=1/x2), Modelo 5 (wi= 1/√y), Modelo 6 (wi=1/y) e Modelo 7 (wi=1/y2). ............. 70
Figura 5.5 – Áreas cromatográficas obtidas por injecção em GC-MS dos extractos derivatizados
obtidos por SBSE(PDMS e PU) e BAµE(AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, MCX, StrataTM-X)
(n=1)............................................................................................................................................................. 77
Figura 5.6 – Áreas cromatográficas obtidas por BAµE (CA3)LD/LC-MS/MS no estudo da
evaporação dos extractos. ......................................................................................................................... 79
Figura 5.7 – Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos
compostos em estudo, calculada para um nível de concentração (n=3). .................................................. 79
xi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 2.1 – Características físico-químicas dos ATS em estudo. .............................................................. 6
Tabela 3.1 – Detectores geralmente utilizados em GC. .............................................................................. 16
Tabela 4.1 – Gradiente de eluição utilizada para análise cromatográfica dos ATS em estudo.. ........... 36
Tabela 4.2 – Transições MRM, voltagem do cone, energia de colisão (Ecolisão) e tempo de retenção
(tR) dos analitos e PI.. ................................................................................................................................ 37
Tabela 4.3 – Intervalos máximos de tolerância permitidos para as abundâncias relativas dos
fragmentos de diagnóstico, monitorizados em modo SIM.. ............................................................... 38
Tabela 4.4 – Parâmetros de validação do método analítico de SPE/GC-MS para identificação e
quantificação de ATS em amostras de sangue total ............................................................................. 42
Tabela 5.1 – Razão massa/carga (m/z) dos fragmentos iónicos diagnóstico monitorizados em
modo SIM e tempo de retenção (tR) usados na identificação dos compostos derivatizados com
MBTFA........................................................................................................................................................ 53
Tabela 5.2 – Resultados obtidos no estudo do LOD e LOQ em três gamas de trabalho.. .................. 65
Tabela 5.3 – Resumo dos resultados obtidos referentes ao modelo de regressão linear simples para
os ATS em estudo.. .................................................................................................................................... 67
Tabela 5.4 – Resumo dos resultados obtidos no teste de Mandel para os ATS em estudo. ................ 68
Tabela 5.5 – Resumo dos resultados obtidos no teste de homogeneidade de variâncias. .................... 69
Tabela 5.6 – Erros relativos (ER%) por recurso à regressão linear simples e ponderada para cada
factor de ponderação empírico, referente ao 2C-T-2-N-TFA... ......................................................... 71
Tabela 5.7 – Resumo dos resultados obtidos no estudo da precisão e exactidão do método,
determinado para três níveis de concentração (concentrações de ATS expressas em ng/mL e
n=15)... ......................................................................................................................................................... 72
Tabela 5.8 – Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos
compostos em estudo, calculada para três níveis de concentração... ................................................. 74
xiii
ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS E SÍMBOLOS
2C-B 4-bromo-2,5-dimetoxifeniletilamina 2C-D 2,5-dimetoxi-4-metil-feniletilamina 2C-E 2,5-dimetoxi-4-etilfeniletilamina 2C-I 2,5-dimetoxi-4-iodofeniletilamina 2C-T-2 2-[4-(etiltio)-2,5-dimetoxifenil]etanamina 2C-T-7 2-[2,5-dimetoxi-4-(propiltio)fenil]etanamina AC Carvão activado (do inglês, Activated Carbon) ACN Acetonitrilo ANOVA Análise de Variância ATS Estimulantes do tipo anfetamina (do inglês, amphetamine-type stimulants)
BAµE Micro-Extração Adsorptiva em barra (do inglês bar adsorptive micro-extraction)
BAµE Micro-extracção adsortiva em barra (do inglês, Bar Adsorptive Micro-Extraction)
BSTFA N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamida CAS Chemical Abstracts Service
CE Electroforese Capilar (do inglês, Capillary Electrophoresis)
CE-MS Electroforese Capilar acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry)
CE-NPD Electroforese Capilar com Detector por Azoto e Fósforo (do inglês, Capillary Electrophoresis-Nitrogen-Phosphorous Detector)
CE-UV Electroforese Capilar com Detector de Ultravioleta (do inglês,Capillary Electrophoresis-Ultraviole Detector)
CI Ionização Química (do inglês, Chemical Ionization) cm Centímetro CRM Material de referência certificado (do ingês, certified reference material) CV% Coeficiente de variação percentual
CVSI Coeficiente de variação da precisão intermédia
DBD-F 4-(N,N-dimetilaminosulfonil)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole DBD-F 4-(N,N-dimetilaminosulfonil)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole DOB 2,5-dimetoxi-4-bromoanfetamina DOM 4-metil-2,5-dimetoxianfetamina e- Feixe de electrões
ECD Detector de Captura Electrónica (do inglês, Electron Capture Detector)
Ecolisão Energia de colisão EI Ionização Electrónica (do inglês, Electronic Ionization) EMR Erro médio relativo eV electrão volt
Fcrit Valor tabelado da distribuição F de Snedecor para (N-1;N-1;α)
FDA Food and Drug Admistration
FID Detector de Ionização de Chama (do inglês, Flame Ionization Detector)
xiv
FLD Detector de Fluorescência (do inglês, Fluorescence Detector) GC Cromatografia Gasosa (do inglês, Gas Chromatography)
GC-MS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, Gas Chromatography-Mass Spectrometry)
HCl Ácido clorídrico HFBA Anidrido heptafluorbutírico
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (do inglês, High-Performance Liquid Chromatography)
HPLC-MS Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, High-Performance Liquid Chromatography-Mass Sprectrometry)
ISO International Organization for Standardization
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
KH2PO4 di-hidrogenosfosfato de potássio
Ko/w Logaritmo do coeficiente de partição do composto entre o octanol e a água
KOH Hidróxido de potássio KPDMS/W Coeficiente de distribuição dos analitos entre o PDMS e a fase aquosa kV kilovolt LC Cromatografia Líquida (do inglês, Liquid Chromatography)
LC-MS/MS Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massa em Tandem (do inglês, Liquid Chromatography coupled with Tandem Mass Spectrometry
LD Dessorção líquida (do inglês, liquid desorption) LLE Extracção Líquido-Líquido (do inglês, Liquid-Liquid Extraction) LOD Limite de detecção (do inglês, Limit of Detection) LOQ Limite de quantificação (do inglês, Limit of Quantification) LSD Dietilamida do ácido lisérgico M Molaridade m/z Razão massa/carga mbar Milibar MBDB N-metil-1-(benzodioxol-5-il)-2-butanamina MBDSTFA N-metil-N-terc-butildimetilsilil-trifluoroacetamida MBTFA N-metil-bis-trifluoroacetamida mCPP 1-(3-clorofenil)piperazina MDA 3,4-metilenodioxianfetamina MDE N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina MDMA 3,4-metilenodioximetanfetamina MeOH Metanol
MEPS Microextracção em Seringa Empacotada (do inglês, Micro Extraction by Packed Sorbent)
mg Miligramas min Minuto MIP Impressão molecular em polímeros (do inglês, Molecular Imprinted Polymers) mL Mililitro mm Milímetro MRM Multiple Reaction Monitoring
MS Espetrometria de Massa (do inglês, Mass Spectrometry) MSAµE Micro-Extracção Adsortiva em Multi-Esferas
xv
(do inglês, Multi-Spheres Adsorptive Microextraction) MSHFBA N-metil-N-(trimetilsilil)heptafluorobutiramida MSTFA N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida N Normalidade N-1 Graus de liberdade
NPD Detector de Azoto e Fósforo (do inglês, Nitrogen-Phosphorus Detector)
N-TFA Derivados N-trifluoroacilados ºC Graus Celsius ONU Organização das Nações Unidas p.a para analysis
PDMS Polidimetilsiloxano (do inglês, Polydimethylsiloxane) PFPA Anidrido pentafluoropropiónico PFPOH Pentafluoropropanol pH Logaritmo negativo da concentração hidrogeniónica PI Padrão interno pka Constante de ionização PMA p-metoxianfetamina PMAs p-metoxianfetaminas PMMA p-metoximetanfetamina
PTV Vaporização com temperatura programada (do inglês, programmable temperature vaporization)
PU Poliuretano py Piridina r Coeficiente de correlação -R Grupo substituinte
R2 Coeficiente de determinação
ER% Erro relativo percentual Relacre Associação de Laboratórios Acreditados de Portugal rpm Rotações por minuto S/N Razão sinal/ruído (do inglês, signal-to-noise)
SBSE Extracção Sorptiva em Barra de Agitação (do inglês, Stir Bar Sorptive Extraction)
SI Precisão intermédia
SIM Monitorização selectiva de iões (do inglês, Selective Ion Monitoring, Single Ion Monitoring)
SNC Sistema nervoso central SPE Extracção em Fase Sólida (do inglês, Solid Phase Extraction) SPE/GC-MS Extracção em Fase Sólida/Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massa SPME Microextracção em Fase Sólida (do inglês, Solid Phase Microextraction) STF Serviço de Toxicologia Forense
Sy/x Desvio-padrão residual, erro-padrão
TCD Detector de Condutividade Térmica (do inglês, Thermal-Conductivity Detector)
tcrit Valor tabelado da distribuição t Student para (N-1;N-1;α/2)
TD Dessorção térmica (do inglês, thermal desorption)
xvi
TFAA Anidrido trifluoroacético TMCS Trimetilclorosilano TMS Trimetilsilil
tR Tempo de retenção
tRr Tempo de retenção relativo
u.m.a. Unidades de massa atómica
UPLC-FLD Cromatografia Líquida Ultra-Eficiente com detector de Fluorescência (do inglês, Ultra Performance Liquid Chromatrography-Fluorescence Detector)
UPLC-MS Cromatografia Líquida Ultra-Eficiente acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, Ultra Performance Liquid Chromatrography-Mass Spectrometry)
UV Ultravioleta v/v Volume/volume WADA World Anti-Doping Agency
WHO Organização Mundial de Saúde (do inglês, World Health Organization) Wi Factor de ponderação, peso WLQLR Regressão linear ponderada (do inglês, weighted least squares linear regression) α Nível de significância µg Micrograma µL Microlitros µm Micrómetros ΣRE% Somatório do erro relativo percentual
xvii
RESUMO
Têm surgido no mercado ilícito novas drogas de abuso sintéticas, em particular os
denominados estimulantes do tipo anfetamina (ATS), dentro dos quais se incluem os
compostos 2-[4-(etiltio)-2,5-dimetoxifenil]etanamina (2C-T-2), 2-[2,5-dimetoxi-4-
(propiltio)fenil]etanamina (2C-T-7), p-metoxianfetamina (PMA), p-metoximetanfetamina
(PMMA), efedrina, norefedrina e metcatinona. O consumo excessivo deste tipo de drogas
deve-se, em grande parte, à falsa ideia de inocuidade e ainda aos efeitos psicoactivos
estimulantes que apresentam, embora alguns ATS tenham sido associados a mortes na
Europa. A identificação e quantificação destas drogas em fluidos biológicos é imperativa,
particularmente em contexto forense, sendo esse o principal objectivo da presente
dissertação. Foi então desenvolvido e validado um método de identificação e quantificação
simultânea de ATS em amostras de sangue total, com análise por GC-MS em modo SIM
após extracção por SPE e derivatização. O método analítico revelou-se linear de 5 (limite
de quantificação) a 500 ng/mL, com coeficientes de determinação (R2) superiores a 0,99
para todos os analitos, excepto para a metcatinona (0,96). Os limites de detecção (LOD)
foram 1 ng/mL para todos os analitos e o método foi considerado selectivo e robusto. A
precisão variou de 7 a 14%, enquanto a exactidão se situou dentro de um intervalo de
± 15% para todos os analitos, com excepção da efedrina na concentração mais elevada
(17%) e metcatinona, cumprindo em geral os critérios aceites para a validação de métodos
bioanalíticos. A eficiência da extracção foi superior a 80% para todos os analitos em
estudo. O método desenvolvido e validado foi considerado adequado para confirmação
dos ATS e quantificação de 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, PMMA, efedrina e norefedrina em
amostras de sangue. Posteriormente, procedeu-se à aplicação de uma metodologia
alternativa para a análise dos ATS, a microextracção adsorptiva em barra (BAµE). Assim,
os analitos alvo foram extraídos de amostras de urina por BAµE(AC) e analisados por
LC-MS/MS. Considerando que a metodologia foi aplicada em condições padrão, os
resultados preliminares obtidos foram considerados satisfatórios, com a eficiência de
extracção a situar-se entre os 19% e os 48% e LOD de 2 ng/mL.
Palavras-chave: Estimulantes do tipo anfetamina; Sangue total; Urina; SPE ; BAµE;
GC-MS; LC-MS/MS; Validação
xix
ABSTRACT
New synthetic drugs of abuse have recently appeared in the illicit market, particularly the
so-called amphetamine-type stimulants (ATS), such as 2-[4-(ethylthio)-2,5-
dimethoxyphenyl]ethanamine (2C-T-2), 2-[2,5-dimethoxy-4-(propylthio)phenyl]ethanamine
(2C-T-7), p-methoxyamphetamine (PMA), p-methoxymethamphetamine (PMMA),
ephedrine, norephedrine and methcathinone. A remarkable increase has been observed in
the abuse of those drugs due in large part to the erroneous idea of safety and their
psychoactive effects, although some ATS have been associated to deaths in Europe. In this
sense, it’s justified the need of development of an analytical methodology for the
identification and quantification of these drugs in biological fluids, which was the main goal
of this work. Thus, a method for the simultaneous identification and quantification of ATS
in whole blood samples was developed and fully validated. These were analyzed by GC-MS
in SIM mode after SPE and derivatization. The method was linear from 5 (limit of
quantification) to 500 ng/mL, with determination coefficients (R2) higher than 0.99 for all
analytes, except for methcathinone (0.96). The limits of detection (LOD) were 1 ng/mL
for all analytes and the method was considered selective and robust. The precision ranged
from 7 to 14%, while accuracy was within a ± 15% interval for all analytes, except for
ephedrine at the highest concentration level (17%) and methcathinone, fulfilling the criteria
usually accepted for bioanalytical method validation. Extraction efficiency was higher than
80% for all analytes. Therefore, the method developed and validated was considered
adequate for screening and confirmation of all ATS and quantification of 2C-T-2, 2C-T-7,
PMA, PMMA, ephedrine and norephedrine in blood samples. An alternative procedure
was tested, the bar adsorptive micro-extraction (BAµE). Thus, the target analytes were
extracted from urine samples by BAµE(AC) and analyzed by LC-MS/MS. Considering that
the methodology was applied in standard conditions, the preliminary results were
satisfactory, presenting extraction efficiencies between 19% and 48% and LOD of 2
ng/mL.
Keywords: Amphetamine-type stimulants; Whole blood; Urine; SPE; BAµE; GC-MS;
LC-MS/MS; Validation
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
Os derivados anfetamínicos constituem a maior classe de estimulantes do sistema nervoso
central (SNC), tendo por base a molécula de 2-feniletilamina (ou β-feniletilamina),
distinguindo-se entre si pelos vários substituintes no anel e cadeia lateral [1-5]. Na sua
generalidade, estes derivados apresentam acção estimulante ao nível do SNC, mais evidenciada
na anfetamina, ou acção alucinogénica, típica da mescalina. Alguns destes compostos
apresentam características únicas, nomeadamente, capacidade para aumentar o poder de
introspecção, sentimentos de empatia, comunicação e indução de sentimentos de intimidade e
tranquilidade. Estas características levaram a que algumas destas drogas de abuso fossem
denominadas entactogénicas [6-8].
Neste sentido torna-se então conveniente estudar estas drogas de síntese, devido à elevada
incidência da sua utilização recreativa e aos efeitos tóxicos que provocam. Assim, e com o
crescente aumento do número de exames em cenário forense, torna-se essencial dispor de
métodos analíticos rápidos e suficientemente sensíveis, que permitam a monitorização destas
substâncias em amostras biológicas, passíveis de utilização na rotina laboratorial [9]. Por outro
lado, os resultados fornecidos pelo método analítico devem ser rigorosos, já que deles
dependem decisões e sentenças judiciais, com consequências económicas, sociais e jurídicas
sobre o indivíduo e/ou sobre a sociedade. Assim, e antes que possa ser utilizado em análises
de rotina, o método analítico desenvolvido deve ser validado, sendo necessário demonstrar
que este se adequa ao propósito a que se destina [10], ou seja, à detecção e quantificação de
substâncias estimulantes em amostras biológicas.
Nos últimos anos, diversas metodologias analíticas têm sido propostas para a determinação de
estimulantes do tipo anfetamina (de agora em diante ATS, do inglês amphetamine-type stimulant)
em matrizes biológicas (ex. urina, sangue, soro, cabelo) [11-16]. Para além do facto destes
compostos se encontrarem normalmente em concentrações reduzidas, a complexidade das
matrizes biológicas requer técnicas elaboradas de extracção e concentração, com vista à
obtenção de selectividade e sensibilidade adequadas.
A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) é, sem margem para
dúvidas, a técnica de excelência para identificação e quantificação de ATS, em particular
quando comparada com outras alternativas (ex. cromatografia líquida acoplada à
espectrometria de massa, LC-MS), cujos custos associados são mais elevados [13,17-19].
Comparativamente a outro tipo de detectores (ex. FID, NPD), a GC-MS permite a
identificação inequívoca de um determinado composto, condição obrigatória no Serviço de
Introdução o
2
Toxicologia Forense da Delegação do Sul do Instituto Nacional de Medicina Legal (STF),
principalmente se tivermos em consideração que se está a lidar com substâncias cujo consumo
é punível por lei [20].
Os métodos cromatográficos implicam normalmente um passo prévio de preparação das
amostras, processo este que é em geral moroso, podendo em muitos casos corresponder a
cerca de 80% do tempo de análise. O processo de preparação das amostras consiste não só na
extracção (ou enriquecimento) propriamente dita dos analitos da matriz, como também na
limpeza, concentração ou até mesmo a derivatização, dependendo das características das
substâncias em estudo [21]. Inúmeras publicações referentes à análise de ATS reportam a
extracção em fase sólida (SPE) [3,11, 22-27], pelas inúmeras vantagens que lhe estão
associadas, sendo também das técnicas mais utilizadas em análises forenses para a extracção e
pré-concentração de compostos orgânicos presentes em amostras de sangue total.
Neste contexto, o desenvolvimento e validação de métodos analíticos para pesquisa de 2-
feniletilaminas em fluidos biológicos está associado fundamentalmente a dois factores. O mais
relevante prende-se com a importância toxicológica que apresenta actualmente a determinação
deste grupo de substâncias em diferentes tipos de matrizes biológicas. Por um lado, algumas
das substâncias em análise (ex. 2-[4-(etiltio)-2,5-dimetoxifenil]etanamina, 2C-T-2, e
2-[2,5-dimetoxi-4 (propiltio)fenil]etanamina, 2C-T-7) são ainda pouco estudadas, não existindo
metodologias analíticas para a sua determinação em sangue total, pelo que a necessidade de
desenvolver métodos analíticos para a sua identificação e quantificação é claramente
justificada. Por outro lado, outros compostos, como a efedrina, norefedrina,
p-metoxianfetamina (PMA), p-metoximetanfetamina (PMMA) e metcatinona são de interesse
toxicológico, uma vez que são ATS com expressão no panorama de consumo de drogas,
sendo inclusivamente utilizados na produção de outras drogas sintéticas. O segundo factor
prende-se com a escassez de métodos validados na literatura para a triagem/confirmação e
quantificação simultânea dos compostos acima citados em amostras de sangue total e urina, o
que motivou este desenvolvimento.
Adicionalmente, e tendo em consideração as vantagens amplamente descritas na literatura
científica no que respeita à miniaturização, ao uso de novas tecnologias e materiais
adsorventes para a preparação de amostras biológicas, é relevante encarar outras alternativas
para a análise de ATS em amostras biológicas. Acresce que estas alternativas consomem
quantidades desprezíveis de solventes orgânicos, contribuindo deste modo para a utilização de
métodos “verdes” e mais amigos do ambiente [21].
Drogas de abuso
3
2. DROGAS DE ABUSO
O uso de drogas na sociedade perde-se na memória dos tempos. Textos antigos revelam que
os seres humanos usaram e abusaram deliberadamente de substâncias psicoactivas, induzindo
sensações corporais e estados psicológicos alterados. Contudo, é no século XX, devido à
confluência de múltiplos factores (ex. culturais, económicos, meios de comunicação) que os
consumos abusivos se difundem e intensificam [28-29].
2.1. DEFINIÇÃO
Em farmacologia, o termo droga designa, segundo diversos autores, toda a substância estranha
ao organismo que, quando introduzida neste, provoca alterações no seu funcionamento [30-
32]. Deste modo, o termo droga é bastante lato e abrangente, envolvendo todos os
medicamentos ou qualquer substância activa do ponto de vista farmacológico [33].
A Organização Mundial de Saúde (WHO, do inglês World Health Organization) define
farmacodependência como um “estado psíquico, causado pela acção recíproca entre um organismo vivo e um
fármaco, que se caracteriza por modificações do comportamento e por outras reacções que compreendem sempre
um impulso irreprimível de tomar o fármaco de forma contínua ou periódica a fim de experimentar os seus
efeitos psíquicos e, por vezes, para evitar o mal-estar produzido pela privação” [33].
A mesma organização define droga como “qualquer substância que tenha a capacidade de produzir um
estado de dependência e estimulação ou depressão do sistema nervoso central, resultante de alucinações ou
distúrbios nas funções motoras, cerebrais, comportamentais ou na percepção, e abuso similar e efeitos de doenças
às estabelecidas nas Tabelas I, II, III e IV – Classificação das Substâncias Psicotrópicas, Convenção
Substâncias Psicotrópicas de 1971, ONU –, devendo ser considerada uma ameaça à saúde pública e um
problema de controlo internacional” [34-35].
Deste modo, utilizar-se-á na presente dissertação o termo droga como referência a substâncias
psicoactivas, susceptíveis de consumo com fins não terapêuticos e ilícitos. Sob esta designação
genérica incluem-se várias substâncias químicas de origens diversas (naturais, sintéticas ou
semi-sintéticas), onde se englobam, entre as mais conhecidas, os opiáceos, a cocaína, os
canabinóides e as anfetaminas [36].
Drogas de abuso
4
2.2. CONSIDERAÇÕES SOBRE D
A expressão droga sintética refere
processo químico no qual os principais constituintes psicoactivos não derivam de substâncias
de origem natural. A referida expressão começou a ser utilizada como sinónimo de
recreativas, na sequência da popularidade do
outras feniletilaminas [9, 37-38]. Entre as drogas sintéticas mais conhecidas destacam
anfetaminas e a dietilamida de ácido lisérgico (LSD), enquanto o
metilenodioxianfetamina), entre outras drogas incluídas na lista
Known And I Loved: A Chemical Love Story
(PMAs), apresentam um historial relativamente rec
As drogas de design são análogos químicos de drogas controladas ou fármacos, sendo
especialmente “desenhadas” e modificadas pelos produtores ilícitos. Estas modificações
intencionais à estrutura molecular de uma substância proibida
obter efeitos farmacológicos análogos (ou mais fortes), evitando desse modo a acção da
justiça. A introdução de novos substituintes às moléculas originais e controladas permite a
estes indivíduos a prolificação de novas droga
como substâncias controladas [9].
2.3. DERIVADOS DE 2-FENILETILAMINAS
O termo derivados de 2-feniletilaminas
esqueleto básico da 2-feniletilamina, composto formado por um anel benzénico e uma cadeia
lateral de etilamina. A sua estrutura permite substituições (
carbonos alfa (α) e beta (β) e no grupo amina terminal, originando diversos derivados [3
40-43].
O mais conhecido derivado de feniletilaminas é a anfetamina, pelo que muitas vezes estas
drogas se designam por compostos (ou derivados) anfetamínicos.
(a)
Figura 2.1 – Estruturas químicas da 2
Os derivados das feniletilaminas têm origem sintética, e podem ser consumidos por via oral,
intravenosa (diluídas em água), fumados ou aspirados (em pó) [9,
Drogas de abuso
ONSIDERAÇÕES SOBRE DROGAS SINTÉTICAS E DROGAS DE DESIGN
refere-se a substâncias psicoactivas preparadas através de um
processo químico no qual os principais constituintes psicoactivos não derivam de substâncias
de origem natural. A referida expressão começou a ser utilizada como sinónimo de
, na sequência da popularidade do ecstasy (3,4-metilenodioximetanfetamina, MDMA) e
38]. Entre as drogas sintéticas mais conhecidas destacam
anfetaminas e a dietilamida de ácido lisérgico (LSD), enquanto o ecstasy
entre outras drogas incluídas na lista Pihkal - Phenethylamines I Have
Known And I Loved: A Chemical Love Story [39], como o 2C-T2, 2C-T-7 e p-metoxianfetaminas
(PMAs), apresentam um historial relativamente recente de consumo ilícito.
são análogos químicos de drogas controladas ou fármacos, sendo
especialmente “desenhadas” e modificadas pelos produtores ilícitos. Estas modificações
intencionais à estrutura molecular de uma substância proibida são levadas a cabo de forma a
obter efeitos farmacológicos análogos (ou mais fortes), evitando desse modo a acção da
justiça. A introdução de novos substituintes às moléculas originais e controladas permite a
estes indivíduos a prolificação de novas drogas “legais”, uma vez não estarem classificadas
como substâncias controladas [9].
FENILETILAMINAS
feniletilaminas refere-se a um grupo de substâncias que apresentam o
feniletilamina, composto formado por um anel benzénico e uma cadeia
lateral de etilamina. A sua estrutura permite substituições (-R) no anel aromático, nos
(β) e no grupo amina terminal, originando diversos derivados [3
O mais conhecido derivado de feniletilaminas é a anfetamina, pelo que muitas vezes estas
drogas se designam por compostos (ou derivados) anfetamínicos.
(b)
Estruturas químicas da 2-feniletilamina (a) e da anfetamina (b).
Os derivados das feniletilaminas têm origem sintética, e podem ser consumidos por via oral,
intravenosa (diluídas em água), fumados ou aspirados (em pó) [9,44-45]. Este tipo de drogas e
o
DESIGN
se a substâncias psicoactivas preparadas através de um
processo químico no qual os principais constituintes psicoactivos não derivam de substâncias
de origem natural. A referida expressão começou a ser utilizada como sinónimo de drogas
metilenodioximetanfetamina, MDMA) e
38]. Entre as drogas sintéticas mais conhecidas destacam-se as
cstasy e a MDA (3,4-
Phenethylamines I Have
metoxianfetaminas
são análogos químicos de drogas controladas ou fármacos, sendo
especialmente “desenhadas” e modificadas pelos produtores ilícitos. Estas modificações
são levadas a cabo de forma a
obter efeitos farmacológicos análogos (ou mais fortes), evitando desse modo a acção da
justiça. A introdução de novos substituintes às moléculas originais e controladas permite a
s “legais”, uma vez não estarem classificadas
se a um grupo de substâncias que apresentam o
feniletilamina, composto formado por um anel benzénico e uma cadeia
R) no anel aromático, nos
(β) e no grupo amina terminal, originando diversos derivados [3-4,8,
O mais conhecido derivado de feniletilaminas é a anfetamina, pelo que muitas vezes estas
feniletilamina (a) e da anfetamina (b).
Os derivados das feniletilaminas têm origem sintética, e podem ser consumidos por via oral,
45]. Este tipo de drogas e
Drogas de abuso
5
os seus efeitos tóxicos têm sido alvo de estudo, sendo muito frequente nas formulações
apreendidas a presença de outras substâncias que, no seu conjunto, aumentam a
imprevisibilidade dos efeitos associados à sua utilização, tornando-as bastante perigosas [46].
Genericamente, as principais acções farmacológicas dos derivados da feniletilamina podem ser
resumidas de acordo com o seu local de acção, nomeadamente ao nível do SNC; de facto,
como potentes estimulantes1 que são, produzem excitação, euforia e diminuição da fadiga,
aumentando o tempo de vigília. Estas drogas penetram rapidamente no SNC (onde exercem a
maior parte dos seus efeitos), induzindo um aumento da libertação de neurotransmissores
excitatórios (dopamina, noradrenalina e serotonina). Os derivados da feniletilamina com
propriedades estimulantes são também conhecidos por ATS [3-4, 47-51]. Contudo, alguns
ATS actuam ainda como potentes alucinogénios (ex. 2C-T-2, 2C-T-7) [4, 8, 52]. Como
substâncias de abuso, os ATS são passíveis de serem empregues isolados ou em associação
com outras drogas e álcool (fenómeno de policonsumo).
Na tabela 2.1 encontram-se resumidas as principais características físico-químicas dos
compostos em estudo na presente dissertação. Note-se ainda que todas as substâncias
presentes nesta tabela se encontram incluídas nas tabelas de Classificação das Substâncias
Psicotrópicas, Convenção Substâncias Psicotrópicas de 1971, ONU [53].
1As substâncias estimulantes ou psicoanalépticas potenciam a actividade do SNC, produzindo sensações de aumento de energia, do estado de vigília e diminuem a sensação de cansaço; por vezes potenciam a capacidade de concentração e podem produzir estados de excitação extrema em doses altas.
Tabela 2.1 - Características físico-químicas dos ATS em estudo.
a Valores experimentais obtidos na base de dados de propriedade físicob Ko/w: Logaritmo do coeficiente de partição do composto entre o octanol e a água, estimado a partir do programa EPI Suite.
ATS
Características
2C-T-2
Estrutura química
Nome IUPAC [54] 2-[4-(Etiltio)-2,5-
dimetoxifenil]etanamina
2
(propiltio)fenil]etanami
CAS[55] 207740-24-7
Fórmula molecular C12H19NO2S
Massa molecular
(g.mol-1) 241,35
pkaa ---
Ko/w b 2,59
químicas dos ATS em estudo.
Valores experimentais obtidos na base de dados de propriedade físico-químicas de Syracuse Research corporation (http://www.syrres.com/esc/phusdemo.htm
Ko/w: Logaritmo do coeficiente de partição do composto entre o octanol e a água, estimado a partir do programa EPI Suite.
2C-T-7 PMA PMMA Metcatinona
2-[2,5-Dimetoxi-4-
(propiltio)fenil]etanami
na
1-(4-
metoxifenil)propan
-2-amina
1-(4-metoxifenil)-
N-metil-propan-2-
amina
2-(metilamino)-1
fenil-propan-1-ona
207740-26-9 64-13-1 22331-70-0 49656-78-2
C13H21NO2S C10H15NO C11H17NO C10H13NO
255,38 165,232 179,259 163,22
--- 9,53 --- ---
3,08 1,84 2,30 1,85
http://www.syrres.com/esc/phusdemo.htm)
Efedrina Norefedrina
1-
ona
2-(metilamino)-1-
fenilpropan-1-ol
2-amino-1-
fenilpropan-1-ol
299-42-3 14838-15-4
C10H15NO C9H13NO
165,23 151,206
10,3 9,44
0,68 0,22
___________________________________________________________Drogas de abuso
2.3.1. SÉRIE 2C: 2C-T-2 E
Os compostos da família 2C encontram
drogas sintéticas. Estas drogas não possuem qualquer tipo de aplicação terapêutica legítima e
constam na lista Pihkal de Alexander Shulgin [39]. Possuem características estruturais de
feniletilaminas, estando associados efeitos estimulantes e alucinogénicos [39, 52, 56
A abreviatura “2C” deriva da nomenclatura proposta por Shulgin [39, 52, 56]. Todos os
compostos da designada série 2C têm em comum uma amina primária separada do anel
aromático por dois átomos de carbono (“2C”). O anel aromático encontra
grupos metoxi nas posições dois e cinco, possuindo ainda um substituinte lipofílico na posi
quatro (ex. grupos alquilo, halogéneos, enxofre (“T”, do sufixo “thio”)). Deste modo são
originados diversos compostos, tal como se pode observar na figura 2.2. Já o sufixo “
“-7” nos compostos 2C-T
estrutural [39, 52, 56-59].
2C-B
2C-I
Figura 2.2 – Estruturas químicas de alguns compostos da série 2C. Adaptado de [56].
Os compostos 2C-T-2 e 2C
1986, respectivamente. Ambas as sínteses, que requerem o uso de equipamento sofisticado e
um ambiente apropriado, encontram
de 1,4-dimetoxibenzeno para produzir um precursor preliminar, 2,5
descreve o composto assim obtido como o precursor de todos os compostos da família
“2C-T”, encontrando-se este comercialmente disponível [20, 57].
Entre 2000 e 2001 foram descritos casos fatais relacionados com o consumo de 2C
que, devido aos crescentes problemas associados a este tipo de drogas, as mesmas passaram a
___________________________________________________________Drogas de abuso
E 2C-T-7
Os compostos da família 2C encontram-se entre um conjunto de compostos designados como
. Estas drogas não possuem qualquer tipo de aplicação terapêutica legítima e
de Alexander Shulgin [39]. Possuem características estruturais de
feniletilaminas, estando associados efeitos estimulantes e alucinogénicos [39, 52, 56
A abreviatura “2C” deriva da nomenclatura proposta por Shulgin [39, 52, 56]. Todos os
tos da designada série 2C têm em comum uma amina primária separada do anel
aromático por dois átomos de carbono (“2C”). O anel aromático encontra
grupos metoxi nas posições dois e cinco, possuindo ainda um substituinte lipofílico na posi
quatro (ex. grupos alquilo, halogéneos, enxofre (“T”, do sufixo “thio”)). Deste modo são
originados diversos compostos, tal como se pode observar na figura 2.2. Já o sufixo “
T-2 ou 2C-T-7, respectivamente, não têm qualquer
2C-D 2C
2C-E 2C
Estruturas químicas de alguns compostos da série 2C. Adaptado de [56].
2 e 2C-T-7 foram sintetizados pela primeira vez por Shulgin em 1981 e
1986, respectivamente. Ambas as sínteses, que requerem o uso de equipamento sofisticado e
um ambiente apropriado, encontram-se descritas por Shulgin [39] e baseiam
dimetoxibenzeno para produzir um precursor preliminar, 2,5-dimetoxitiofenol. Shulgin
descreve o composto assim obtido como o precursor de todos os compostos da família
se este comercialmente disponível [20, 57].
re 2000 e 2001 foram descritos casos fatais relacionados com o consumo de 2C
que, devido aos crescentes problemas associados a este tipo de drogas, as mesmas passaram a
___________________________________________________________Drogas de abuso
7
se entre um conjunto de compostos designados como
. Estas drogas não possuem qualquer tipo de aplicação terapêutica legítima e
de Alexander Shulgin [39]. Possuem características estruturais de
feniletilaminas, estando associados efeitos estimulantes e alucinogénicos [39, 52, 56-59].
A abreviatura “2C” deriva da nomenclatura proposta por Shulgin [39, 52, 56]. Todos os
tos da designada série 2C têm em comum uma amina primária separada do anel
aromático por dois átomos de carbono (“2C”). O anel aromático encontra-se substituído com
grupos metoxi nas posições dois e cinco, possuindo ainda um substituinte lipofílico na posição
quatro (ex. grupos alquilo, halogéneos, enxofre (“T”, do sufixo “thio”)). Deste modo são
originados diversos compostos, tal como se pode observar na figura 2.2. Já o sufixo “-2” ou
7, respectivamente, não têm qualquer significado
2C-T-2
2C-T-7
Estruturas químicas de alguns compostos da série 2C. Adaptado de [56].
7 foram sintetizados pela primeira vez por Shulgin em 1981 e
1986, respectivamente. Ambas as sínteses, que requerem o uso de equipamento sofisticado e
se descritas por Shulgin [39] e baseiam-se na utilização
dimetoxitiofenol. Shulgin
descreve o composto assim obtido como o precursor de todos os compostos da família
re 2000 e 2001 foram descritos casos fatais relacionados com o consumo de 2C-T-7, pelo
que, devido aos crescentes problemas associados a este tipo de drogas, as mesmas passaram a
Drogas de abuso___________________________________________________________
8
ser controladas em diversos países da União Europeia, um dos quais Portugal [
assim, tem sido extremamente difícil avaliar o risco específico associado a estas substâncias
devido à falta de informação e de estudos científicos.
Actualmente, nenhum dos compostos possui qualquer utilização terapêutica ou industrial, pel
que o seu uso é considerado exclusivamente ilícito [57]. O
só sob a forma de pó ou comprimidos, mas também pode ser encontrado sob a forma de
cápsulas ou na forma líquida. Este parece ter diversos “nomes de rua”, inclui
Beautiful, Lucky seven, Seven-up,
encontrava-se comercialmente disponível na Europa como
tem associado qualquer tipo de “nome de rua” e
comprimidos (brancos, sem logótipo), pelo que a principal forma de administração é oral. No
entanto, a aspiração nasal é também referida [57].
Estudos efectuados por Shulgin
em doses entre 12-25 mg e 20
neurofarmacológicos de ambas as drogas é meramente baseada em especulações comparativas
com outros compostos parcialmente relacionados, como a 4
(2C-B) e a 2,5-dimetoxi-4-bromoanfetamina (DOB). Não se conhecem estudos relativos ao
metabolismo das referidas drogas em humanos. Theobald
do 2C-T-2 e 2C-T-7 em ratos, aplicando doses correspon
e concluíram que as reacções metabólicas são semelhantes para ambos os compostos,
incluindo N-acetilações, sulfoxidações,
58-59].
(a)
Figura 2.3 – Estruturas
Relatos de consumidores indiciam o início da acção das drogas entre 1
consumo, com efeitos prolongados até 6
no caso do 2C-T-7. No entanto,
consumidores referem que estas drogas actuam mais rapidamente e os efeitos duram menos
tempo em caso de consumo por via nasal [39,57].
abuso___________________________________________________________
ser controladas em diversos países da União Europeia, um dos quais Portugal [
assim, tem sido extremamente difícil avaliar o risco específico associado a estas substâncias
devido à falta de informação e de estudos científicos.
Actualmente, nenhum dos compostos possui qualquer utilização terapêutica ou industrial, pel
que o seu uso é considerado exclusivamente ilícito [57]. O 2C-T-7 encontra-se disponível, não
só sob a forma de pó ou comprimidos, mas também pode ser encontrado sob a forma de
cápsulas ou na forma líquida. Este parece ter diversos “nomes de rua”, inclui
, Seventh heaven, Red raspberry, Tweety bird mescaline e
se comercialmente disponível na Europa como Blue mystic [40, 52]. Já o 2C
tem associado qualquer tipo de “nome de rua” e encontra-se disponível sob a forma de pó ou
comprimidos (brancos, sem logótipo), pelo que a principal forma de administração é oral. No
entanto, a aspiração nasal é também referida [57].
Estudos efectuados por Shulgin [39,57] envolveram administração oral de 2C
25 mg e 20-30 mg, respectivamente. A discussão relativa a aspectos
neurofarmacológicos de ambas as drogas é meramente baseada em especulações comparativas
com outros compostos parcialmente relacionados, como a 4-bromo-2,5-dimetoxifeniletilamina
bromoanfetamina (DOB). Não se conhecem estudos relativos ao
metabolismo das referidas drogas em humanos. Theobald et al. [52] estudaram o metabolismo
7 em ratos, aplicando doses correspondentes às normalmente consumidas,
e concluíram que as reacções metabólicas são semelhantes para ambos os compostos,
acetilações, sulfoxidações, O-desmetilações, desaminações e hidroxidações [40,
(b)
Estruturas químicas das moléculas 2C-B (a) e DOB (b).
Relatos de consumidores indiciam o início da acção das drogas entre 1-
consumo, com efeitos prolongados até 6-8 horas, no caso do 2C-T-2, e até cerca de 15 horas,
7. No entanto, estes dados referem-se apenas à administração oral, e os
consumidores referem que estas drogas actuam mais rapidamente e os efeitos duram menos
tempo em caso de consumo por via nasal [39,57].
abuso___________________________________________________________
ser controladas em diversos países da União Europeia, um dos quais Portugal [20, 57]. Ainda
assim, tem sido extremamente difícil avaliar o risco específico associado a estas substâncias
Actualmente, nenhum dos compostos possui qualquer utilização terapêutica ou industrial, pelo
se disponível, não
só sob a forma de pó ou comprimidos, mas também pode ser encontrado sob a forma de
cápsulas ou na forma líquida. Este parece ter diversos “nomes de rua”, incluindo T-seven,
, Tweety bird mescaline e Tripstacy;
[40, 52]. Já o 2C-T-2 não
se disponível sob a forma de pó ou
comprimidos (brancos, sem logótipo), pelo que a principal forma de administração é oral. No
de 2C-T-2 e 2C-T-7
A discussão relativa a aspectos
neurofarmacológicos de ambas as drogas é meramente baseada em especulações comparativas
dimetoxifeniletilamina
bromoanfetamina (DOB). Não se conhecem estudos relativos ao
[52] estudaram o metabolismo
dentes às normalmente consumidas,
e concluíram que as reacções metabólicas são semelhantes para ambos os compostos,
desmetilações, desaminações e hidroxidações [40,
-2 horas após o
2, e até cerca de 15 horas,
se apenas à administração oral, e os
consumidores referem que estas drogas actuam mais rapidamente e os efeitos duram menos
___________________________________________________________Drogas de abuso
9
De momento não existem estudos efectuados em animais nem em humanos relativamente à
toxicidade geral, toxicidade reprodutiva, neurotoxicidade ou mutagenicidade e potencial
carcinogénico dos compostos em causa. Apenas se encontram disponíveis evidências
subjectivas de consumidores, envolvendo observações de aparentes efeitos adversos e
sintomas tóxicos. Há registos de violência, agitação, vómito, confusão mental, desorientação e
até mesmo coma, especialmente para o 2C-T-7 [57]. Embora não existam relatos de mortes ou
intoxicações não-fatais envolvendo 2C-T-2, encontram-se descritas situações fatais associadas
ao consumo de 2C-T-7, tal como já foi referido anteriormente [57, 60-61].
2.3.2. p-METOXIANFETAMINAS: PMA E PMMA
As p-metoxianfetaminas (PMAs) são drogas sintéticas derivadas de feniletilaminas [62-64]. O
PMA (Death, Dr. Death, Chicken Powder, Chicken Yellow, Mitsubishi, Double-Stack, Killer, Red Mitsubishi) [63,65] apareceu no mercado europeu pela primeira vez em Dezembro de 1998. É
um derivado metoxilado da anfetamina e entre os seus precursores e reagentes utilizados para
a sua síntese encontram-se o 4-metoxibenzaldeído, nitroetano, benzeno, metanol e
ciclohexano, todos eles disponíveis comercialmente [63]. É uma droga potente e possui
características semelhantes às anfetaminas, sendo potencialmente letal dada a estreita margem
de segurança. É normalmente encontrada em comprimidos, sozinha ou em associação com
outras anfetaminas, e tem sido associada a inúmeras intoxicações mortais [62-72]. Apesar de
não ter aplicação terapêutica, este composto é um intermediário para a síntese de alguns
fármacos, como o fenoterol e formeterol, ambos com acção broncodilatadora [63-64, 72].
O PMMA, que aparentemente não tem associado qualquer “nome de rua”, foi sintetizado pela
primeira vez em 1938 [73]. Trata-se de uma estrutura híbrida entre o PMA e a metanfetamina,
e entre os seus precursores e reagentes de síntese encontram-se a 4-metoxifenilcetona,
hidrocloreto de metilamina, cianoborohidreto de sódio, cloroformato de etilo e ácido fórmico
[63]. Apesar de também não ter qualquer aplicação terapêutica, o PMMA é um precursor
sintético da foledrina (p-hidroxianfetamina), um agente simpatomimético (“Veritol”, fármaco
não disponível em Portugal) [65,74], pelo que se encontra disponível comercialmente.
Ambos os compostos têm sido vendidos sob a forma de comprimidos para administração
oral, com a aparência de ecstasy e com logótipos apelativos (Mitsubishi, Jumbo, E, trevo de quatro
folhas, entre outros). Estes compostos têm sido ocasionalmente encontrados em comprimidos
rotulados de ecstasy, embora os seus efeitos sejam distintos [41, 63, 75-76]. A maioria dos
comprimidos contém PMA e PMMA em associação, podendo conter também anfetamina,
metanfetamina, MDMA ou efedrina. Assim, os PMAs não são administrados isoladamente, o
Drogas de abuso___________________________________________________________
10
que aumenta a sua toxicidade e adiciona mais um factor de risco: o factor da imprevisibilidade
da interacção entre drogas. Isto sucede porque aparentemente não existe um mercado
explícito na Europa para o PMA ou PMMA. A combinação destes dois compostos, vendida
com um logótipo similar ao do ecstasy, não parece ser acidental, mas sim uma associação
deliberada, cujo objectivo é simular os efeitos esperados com o consumo de MDMA. Por
outro lado, a grande disponibilidade dos precursores implicados na sua síntese pode potenciar
este fenómeno [63, 76-78].
O PMA foi o primeiro a ser inserido nas tabelas da Classificação das Substâncias Psicotrópicas,
Convenção Substâncias Psicotrópicas de 1971, ONU, pois é uma droga muito potente com
características similares às das anfetaminas [62-65,75,79]; de facto, em animais, a sua potência
como alucinogéneo é quase equivalente à do LSD [78], e cerca de cinco vezes mais potente
que a mescalina [64,79], sendo potencialmente letal [62, 80-82]. Por outro lado, o PMMA é
consumido no contexto da cultura “ecstasy”, na qual existem expectativas relativamente à
qualidade, rapidez e durabilidade dos efeitos. Consequentemente, os efeitos díspares daqueles
observados com o MDMA, mesmo quando em combinação com o PMA, levam ao consumo
de um maior número de comprimidos para atingir o mesmo resultado, aumentando
consequentemente o risco de overdose [63,82], com fatalidades associadas ao seu consumo
[67,69-70,81-82]. Na realidade, existe pouca informação relativamente ao PMMA, sendo o
PMA e MDMA muito mais conhecidos [63,75]. Sendo assim, algumas considerações feitas em
relação àquele baseiam-se em experiências com compostos estruturalmente relacionados [63].
Ainda assim, estudos recentes efectuados em animais indicam que este composto induz efeitos
estimulantes, que são considerados similares aos obtidos com MDMA, embora menos
potentes. Mais, este não apresenta efeitos alucinogénicos, ao contrário do PMA, sendo
considerado deste modo uma droga entactogénica [63,75,86].
Estudos realizados em cobaias mostram que o PMA e o PMMA parecem provocar os
mesmos efeitos tóxicos do MDMA, embora mais acentuados. Assim, são reportadas
hiperpirexia (hipertermia extrema), sendo o sintoma mais comum, agitação, arritmia,
convulsões, coma e neurotixicidade serotoninérgica em doses elevadas. O consumo repetido
de PMA ou PMMA pode causar inibição da isoenzima CYP2D6 (citocromo P450),
responsável pelo seu metabolismo hepático (reacções de O-desmetilação), consequentemente
aumentando a resposta hipertérmica. A toxicidade aguda do PMA e PMMA pode levar ao
aumento extraneuronal dos níveis de serotonina, pelo que à semelhança do MDMA, é possível
que estas drogas induzam a degeneração dos neurónios serotoninérgicos [63,75,85]. Já os
___________________________________________________________Drogas de abuso
11
efeitos em humanos apenas foram reportados por Shulgin [39], que descreve efeitos díspares
dos do MDMA.
2.3.3. CATINONAS: METCATINONA
A metcatinona é um estimulante psicoactivo de origem sintética, utilizado como droga
recreativa e considerada aditiva. Quimicamente é um derivado N-metilado da catinona, um
dos princípios psicoactivos que pode ser encontrado na planta Catha edulis (khat) [86-91].
Entre os agentes psicoactivos presentes nas folhas de khat incluem-se a catinona, a catina
(norpseudoefedrina) e a norefedrina, mas ainda existem muitos compostos não estudados [87-
88,91]. A catinona assemelha-se às anfetaminas, tanto na estrutura química como nos efeitos
bioquímicos e comportamentais, embora apresente apenas cerca de metade da sua potência.
Este estimulante, bem como alguns dos seus derivados produzidos sinteticamente, como é o
caso da metcatinona, são substâncias controladas ao abrigo da Convenção das Nações Unidas sobre
as Substâncias Psicotrópicas (1971), o que não acontece com as folhas de khat. [86,89,92].
A primeira catinona sintética a aparecer no mercado como droga recreativa foi a metcatinona,
embora actualmente estejam a ser monitorizadas quinze catinonas, destacando-se a
metcatinona, a mefedrona, a metilona, e a metedrona, entre outras [86]. A metcatinona foi
sintetizada pela primeira vez em 1928 [93] como um intermediário na síntese da efedrina
(figura 2.4), tendo sido usada na ex-União Soviética nos anos 30 e 40 do século XX, como um
antidepressivo [86, 88]. Desde os anos 60 do século XX tem sido usada como uma droga
recreativa. Este estimulante, também conhecido por Cat, Jeff, Mulka, Cosmos ou Efedrona, é
normalmente aspirado, embora possa ser fumado, injectado ou administrado oralmente
[86,88-89]. É sintetizada com facilidade a partir da oxidação da efedrina (daí o nome
“efedrona”) [86,88-90], o que pode levantar alguns problemas no combate a esta droga ilícita.
Figura 2.4 – Síntese da metcatinona: reacção de oxidação da efedrina. Adaptado de [90].
Os derivados de catinonas existem sob duas formas isoméricas, tendo os isómeros ópticos da
metcatinona sido identificados em 1936. Tanto a S(-) como a R(+)-metcatinona foram
estudadas, tendo sido concluído que ambos eram activos, apesar do isómero S(-) ser cerca de
três a cinco vezes mais potente que o isómero R(+) [86,88-89]. A metcatinona é um potente
Drogas de abuso___________________________________________________________
12
estimulante e inibidor da recaptação da dopamina no SNC, sendo ainda mais potente que a
anfetamina. Como estimulante que é, a metcatinona causa euforia e diminuição do apetite
embora possa causar efeitos desagradáveis para o consumidor, tais como a hipertensão e
taquicardia. Em casos de doses elevadas podem surgir sintomas como confusão mental,
paranóia e psicoses, que tipicamente desaparecem com a cessação do consumo [86,88-
89,90,92].
2.3.4. EFEDRINAS: EFEDRINA E NOREFEDRINA
A efedrina e a norefedrina são estimulantes naturais com propriedades medicinais úteis,
podendo ser encontradas em determinadas plantas da espécie Ephedra [94-96]. A planta
Ephedra vulgaris (também conhecida por ma huang) é usada na medicina chinesa há pelo menos
cinco mil anos. Com efeito, textos chineses que datam do século XV recomendam o uso desta
planta pelas suas propriedades antipiréticas e antitússicas, bem como pela eficácia
demonstrada no tratamento de sintomas de artrite [94,96].
A efedrina foi isolada e sintetizada pela primeira vez em 1885 por Nagayoshi Nagi, um
químico japonês [97]. Já em 1930, a publicação por Chen e Schmidt de um artigo
recomendando a efedrina para o tratamento da asma, fez subir o interesse neste composto,
sendo que ainda hoje a efedrina tem aplicabilidade terapêutica, nomeadamente como
broncodilatador, antiasmático, antitússico e descongestionante nasal [96-100]. Já a norefedrina,
também utilizada como descongestionante nasal, tem aplicações na medicina veterinária,
sendo utilizada em fármacos para controlar a incontinência urinária em cães [94-95, 102]. No
entanto, os seus principais usos não são medicinais, sendo utilizadas ilicitamente como
suplemento dietético de emagrecimento e agentes dopantes. A efedrina é ainda um
intermediário na síntese de metanfetamina e metcatinona [94, 102-103].
A efedrina é também um potente estimulante do SNC [95,96,98,101,104] os seus efeitos
imediatos são atribuídos à estimulação da libertação da dopamina [95,98,104] e podem durar
até várias horas após a administração oral [95,100]. Em suma, a efedrina leva à melhoria do
humor e estado de alerta com diminuição da fadiga e sono [95-96,104]. Já a norefedrina
considera-se ter relativamente pouco efeito estimulante no SNC; no entanto, pode induzir
estados agitados, ansiedade, insónia e tremores, efeitos mascarados pelos fabricantes através
da adição de anti-histamínicos [95-96,102,105].
Foram efectuados estudos relativamente à eficácia e segurança da utilização de efedrina e
norefedrina em humanos para combater a obesidade. No geral, os estudos mostraram uma
___________________________________________________________Drogas de abuso
13
redução no peso estatisticamente significativa em pacientes obesos tratados com efedrinas em
relação a outros tratados com placebo. E embora estas efedrinas suprimam o apetite, o
principal mecanismo para promover a perda de peso parece ser o aumento do metabolismo
do tecido adiposo [106-108].
Devido à absorção rápida e completa da efedrina no tracto gastrointestinal, que geralmente
dura entre 2 a 2,5 horas, o início dos efeitos farmacológicos é geralmente evidente dentro de
uma hora após ingestão [99,107]. Uma vez absorvida, a efedrina distribui-se pelo organismo,
com maiores concentrações no fígado e rins, seguindo-se o cérebro, baço, tecidos adiposos e
saliva [98]. As efedrinas são lipofílicos, atravessando facilmente a barreira hemato-encefálica. É
esta a propriedade responsável pelos efeitos no SNC, que incluem a supressão do apetite,
ansiedade e alterações gástricas [100,107].
Os efeitos da efedrina duram aproximadamente uma hora, sendo a urina a principal via de
excreção [107]. Aproximadamente 95% da dose pode ser excretada na forma livre (55 a 75%)
ou sob a forma de metabolitos em 24 horas [99]. Cerca de 8-20% da efedrina administrada é
metabolizada a norefedrina através de uma N-desmetilação, enquanto 4-13% sofre
desaminação oxidativa, resultando na formação de 1-fenilpropano-1,2-diol, seguida de
oxidação da cadeia lateral formando ácido benzóico e ácido hipúrico. Já a norefedrina é
absorvida após ingestão oral; mais de 90% da dose consumida é excretada na urina sob a
forma livre em 24 horas, juntamente com pequenas quantidades de ácido hipúrico. Note-se
que na quantificação destas substâncias em urina devem ter-se em atenção a sua
farmacocinética [95, 98-99,107,110].
Os efeitos cardiovasculares adversos consequentes ao uso destas efedrinas estão bem
documentados na literatura, e incluem taquicardia, arritmia, hipertensão, angina peitoral,
enfarte do miocárdio e morte súbita. Também são expectáveis efeitos como acne, anorexia,
náuseas, confusão mental, insónia, pânico e agitação, entre outros [98-100, 107,110].
2.4. ENQUADRAMENTO: NOVAS DROGAS E TENDÊNCIAS EMERGENTES
As novas substâncias psicoactivas e os novos padrões de consumo de drogas podem ter
graves implicações em termos de saúde pública, especialmente porque nos últimos anos
surgiram no mercado ilegal novos compostos sintéticos não regulamentados. Verifica-se então
a comercialização de uma vasta gama de substâncias especialmente “desenhadas” de modo a
escaparem à fiscalização de substâncias proibidas, tal como produtos intencionalmente mal
rotulados.
Drogas de abuso___________________________________________________________
14
A capacidade demonstrada por alguns químicos para realizar sínteses orgânicas a baixo preço
gera ainda um acesso potencial a um número considerável de substâncias psicoactivas,
originando grupos de substâncias químicas novos, incluindo substâncias análogas, que podem
ser difíceis de detectar. Adicionalmente, algumas destas substâncias podem ter utilizações
legítimas [9].
A produção mundial de anfetaminas continua a estar concentrada na Europa, onde se
situavam 81% dos laboratórios notificados em 2007. Na Europa Ocidental e Central foram
efectuadas 36% das apreensões mundiais (no total, quase 24 toneladas), o que reflecte o papel
da Europa como principal produtor e consumidor destas drogas. Alguns Estados-Membros da
União Europeia (ex. Filândia) referem níveis relativamente elevados de consumo de
anfetaminas entre a população [9].
Note-se ainda que é usual detectar a presença de substâncias psicoactivas em muitos casos
médico-legais, quer resultantes de uma overdose, ou seja, casos de morte na sequência da acção
directa de drogas de abuso, quer resultantes da associação de uma droga com outros agentes
farmacológicos potenciadores ou sinérgicos (e. g. álcool, benzodiazepinas). Por outro lado, a
degradação de funções do SNC, provocada pelo consumo destas substâncias, prejudica a
capacidade de condução, aumentando consequentemente o risco de acidente.
Pelo exposto, e tendo em conta que em diversos países os compostos que figuram na tabela
2.2 se encontram controlados, é desejável que se assegurem métodos analíticos nos
laboratórios toxicológicos forenses para a análise qualitativa e quantitativa destas substâncias
em amostras biológicas.
Estratégias para análise de drogas de abuso
15
3. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE DE DROGAS DE ABUSO
3.1. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA (GC-MS)
Etimologicamente formada pela conjugação das palavras gregas “chroma” (cor) e “graphein”
(escrita), a cromatografia ou escrita da cor, é uma técnica analítica de separação por excelência,
tendo ganho relevo por volta de 1903, com o botânico russo Mikhail Semenovich Tswett
[111]. Desde então têm sido feitos inúmeros avanços, originando importantes progressos em
várias áreas científicas, [1,111-115], nomeadamente, na toxicologia forense.
Na cromatografia gasosa (GC), técnica desenvolvida através dos trabalhos de Prior, Martin e
Synge, a amostra é introduzida num injector, ligado à coluna cromatográfica. Dá-se então o
transporte dos compostos gasosos, ao longo da fase estacionária, por meio de uma fase móvel
gasosa (gás de arraste) e separados com base nos seus pontos de ebulição e polaridade
[1,111,114-115].
O hidrogénio, o hélio e o azoto são os gases mais usados como fase móvel. Estes devem ser
puros e quimicamente inertes e a sua escolha está relacionada com as vantagens e
inconvenientes associados a cada um deles, nomeadamente, custos, rapidez da análise e
segurança, sendo o hélio o mais habitual [1,111,113-115].
Usualmente, as injecções são realizadas de forma rápida, com recurso a micro-seringas que
injectam as misturas numa câmara de vaporização. A mistura vaporizada passa por um liner
inerte de vidro silanizado e, de seguida, os compostos entram na coluna cromatográfica, onde
são separados [1,111,113,115]. Existem diversos tipos de sistemas de injecção, apresentando
cada um vantagens e inconvenientes. Os sistemas de injecção que utilizam colunas capilares
operam frequentemente com e sem repartição de fluxo (split e splitless, respectivamente) ou sob
vaporização com temperatura programada (PTV). Os modos de operação split/splitless
permitem controlar a quantidade de amostra que é introduzida na coluna, a qual depende da
concentração dos compostos na mistura: no modo splitless toda a amostra é introduzida,
enquanto no modo split apenas uma fracção entra na coluna, sendo a restante amostra
eliminada através de uma válvula, evitando assim a saturação da coluna com elevadas
concentrações dos compostos [1,111,113,117-118].
A fase estacionária, sólida ou líquida, encontra-se no interior da coluna cromatográfica
(suporte físico de metal ou vidro), que pode ser empacota ou capilar, sendo esta última a mais
usual. Uma fase estacionária para GC deve obedecer a determinados critérios, como ser pouco
volátil (idealmente com ponto de ebulição 100°C acima do valor de temperatura máxima de
Estratégias para análise de drogas de abuso o
16
operação da coluna), estabilidade térmica e quimicamente inerte. As colunas capilares,
apresentam diversas vantagens em relação às colunas empacotadas pois são mais eficientes,
promovendo separações com maior resolução. [1,111,113-114,117].
Em GC, apesar da interacção com a fase estacionária também influenciar a ordem de eluição
dos compostos, esta é principalmente determinada pelos seus pontos de ebulição. Contudo, os
compostos apolares são, regra geral, mais facilmente separados por uma fase apolar, enquanto
para os polares uma fase polar origina uma separação mais eficiente. A fase apolar mais
simples é a de polidimetilsiloxano (PDMS), que apresenta vários grupos metilo. Alguns destes
grupos metilo podem ser substituídos por grupos diferentes (ex. grupos fenilo), variando
assim a polaridade da fase estacionária. Também a espessura da fase estacionária influencia a
eficiência da coluna; quando se pretende separar compostos com baixa volatilidade utilizam-se
colunas com espessuras mais finas, enquanto espessuras maiores são usadas para compostos
muito voláteis [1,111,113-114,117].
A temperatura a que se encontra a coluna deve ser controlada, uma vez ser um parâmetro
importante na separação dos compostos. Assim, numa separação isotérmica a coluna é
mantida a uma temperatura constante, enquanto um gradiente de temperaturas permite
aumentar a temperatura de forma gradual ou por patamares [1,111,113-114].
Um detector ideal para GC deve proporcionar sensibilidade adequada, originando limites de
detecção baixos, deve ser estável e reprodutível, originar uma resposta linear numa gama
alargada de concentrações. Deve ainda ser de fácil utilização e o seu tempo de resposta deve
ser reduzido e independente do fluxo. A sua resposta pode ser equivalente para todos os
analitos (detector universal) ou selectiva para determinadas grupos de compostos (detector
selectivo). Para além da GC ter a possibilidade de hifenação (ex. espectrómetro de massa),
existem diversos detectores convencionais, que devem ser escolhidos em função da aplicação
pretendida, sendo os mais comuns os que se apresentam na tabela 3.1 [1,114,118].
Tabela 3.1 - Detectores geralmente utilizados em GC [114].
Detector Tipo Aplicação
Ionização de chama (FID) Universal Análise de compostos com cadeias carbonadas
Condutividade térmica (TCD) Universal Análise de compostos gasosos
Captura electrónica (ECD) Selectivo Compostos com elevada afinidade electrónica
Azoto-fósforo (NPD) Selectivo Compostos contendo azoto e/ou fósforo
Estratégias para análise de drogas de abuso
17
A GC-MS é uma técnica hifenada, associando o poder da separação da GC à detecção
selectiva e sensível da MS. Assim, após separação cromatográfica, as moléculas, já na fonte de
ionização, são ionizadas e fragmentadas; os iões formados são então separados num analisador
de massa e detectados de acordo com a sua razão massa/carga (m/z). Dado que cada
composto sofre uma ionização e fragmentação características, o respectivo espectro de massa
permite identificar de forma inequívoca um composto, quer por comparação com bibliotecas
de espectros, quando o analito é conhecido, quer por dedução da estrutura molecular, para
compostos orgânicos desconhecidos [1,114,117-119].
Durante a ionização o analito é convertido numa espécie carregada por um de vários
processos de ionização existentes. Aquando da escolha do processo de ionização deve ter-se
em conta a quantidade de energia interna transferida durante o processo, assim como as
propriedades físico-químicas do analito-alvo. As técnicas de ionização convencionais,
nomeadamente a impacto electrónico (EI) e a ionização química (CI) requerem que o analito
esteja no estado de vapor para que se dê a interacção com um feixe electrões (e-), ou agentes
químicos, respectivamente [1,114,117-119]. Na EI, as moléculas são bombardeadas por um
feixe de e- (geralmente, 70 eV) quando entram na câmara de ionização. A colisão provoca uma
transferência de energia superior à necessária para a ionização das moléculas que, geralmente,
é usada pelos iões para se fragmentarem de uma forma característica; deste modo, podem
posteriormente ser comparados com bibliotecas de espectros para identificação de compostos
desconhecidos, uma vez serem reprodutíveis para a grande maioria dos compostos orgânicos.
O modo de ionização EI apresenta diversas vantagens, nomeadamente o facto de produzir
muitos iões, o que contribui para a obtenção de sensibilidades mais elevadas e originar
fragmentação extensa, muito útil para a identificação dos compostos. Todavia, esta
fragmentação pode ser também uma desvantagem, pois o ião molecular pode ser
completamente fragmentado, não sendo observado no espectro de massa e impedindo a
determinação da massa molecular do composto [1,114,117-119].
Após os iões serem produzidos, é necessário efectuar a sua separação com base na sua razão
m/z. Existem diversos analisadores de massa que permitem efectuar esta separação,
apresentando cada um vantagens e inconvenientes. Um dos analisadores de massa mais
comuns em GC-MS é o quadrupolo. Este pode analisar todas as razões m/z num determinado
intervalo de massas (varrimento contínuo, do inglês full scan) ou apenas algumas razões m/z
específicas (monitorização selectiva de iões, SIM, do inglês Selective Ion Monitoring). No modo
full scan todas as massas dentro de um intervalo geralmente definido entre valores de m/z de
50 e 600 são analisadas, obtendo-se um registo completo da análise dos iões da amostra. No
Estratégias para análise de drogas de abuso o
18
modo SIM, o analisador de massa detecta apenas alguns valores de m/z previamente
seleccionados, aumentando a sensibilidade, o que permite baixar os limites de detecção, visto
que mais tempo é dispendido a analisar cada um dos fragmentos iónicos com interesse [1,113-
114,117-119].
O detector de iões comummente usado em MS é o multiplicador de electrões, que apresenta
um tempo de resposta rápido (nanosegundos). Este sistema baseia-se no princípio de emissão
secundária de electrões, isto é, quando o ião atinge a superfície do dínodo de conversão ocorre
a libertação de alguns electrões que sofrem aceleração e colidem com o novo dínodo,
iniciando outro ciclo, sendo o sinal é ampliado 103-108 vezes [1,117-119].
3.2. TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
A etapa de preparação de amostra é geralmente o passo limitante de todo o processo analítico,
podendo envolver em média até cerca de dois terços do tempo total dispendido [21]. Esta
etapa abrange, fundamentalmente, a extracção e concentração dos analitos a partir da matriz
biológica, permitindo não só alcançar menores limites de detecção, mas também a limpeza dos
extractos, ou até mesmo a derivatização dos analitos, dependendo das suas características. A
escolha do modo de preparação de amostras depende principalmente da natureza dos analitos
(ex. volatilidade ou polaridade), da natureza da matriz e dos níveis de concentração que se
pretendem detectar. Neste sentido, a preparação das amostras é um processo de vital
importância, dele dependendo o sucesso da análise cromatográfica, pelo que as técnicas
utilizadas assumem extrema relevância [21].
Na actual era da “química verde”, conceito introduzido há cerca de vinte anos nos Estados
Unidos da América [120], as técnicas de preparação de amostras para análise cromatográfica já
não se compadecem com o excessivo consumo de solventes orgânicos tóxicos, como sucede
na extracção líquido-líquido (LLE), tendo em vista o impacto ambiental que esse
comportamento acarreta [120]. Neste sentido, têm surgido novos conceitos aliados a
metodologias que conseguem conjugar a miniaturização analítica com a redução ou até mesmo
a eliminação do consumo de solventes orgânicos (solventless), para enriquecimento de analitos-
alvo. Nesta área, destacam-se a SPE, a microextracção em fase sólida (SPME), a extracção
sorptiva em barra de agitação (SBSE) e a microextracção em seringa empacotada (MEPS),
entre outras, que para além de reduzirem a manipulação analítica, proporcionam significativa
sensibilidade na recuperação de analitos alvo, elevada reprodutibilidade, rapidez, baixo custo e
facilidade de automatização [21,113,121-125].
Estratégias para análise de drogas de abuso
19
3.2.1. EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
O conhecimento das propriedades adsortivas das superfícies sólidas remonta a várias décadas
atrás. A aplicação da técnica de SPE foi então incentivada pela utilização do carvão activado
(CA) no tratamento e purificação de água na década de 50. No entanto, a era moderna da SPE
começou em 1977, quando a empresa Waters disponibilizou comercialmente colunas
descartáveis contendo materiais sólidos [21].
O desenvolvimento de novos matérias sólidos estimulou o recurso à técnica de SPE, sendo
actualmente uma técnica vulgarizada, utilizada para a extracção, concentração e limpeza (clean-
up) do(s) analito(s) com interesse de diversos tipos de matrizes nas mais variadas áreas:
farmacêuticas [126], ambientais [127], alimentares [128] e toxicológicas [129-132]. Em relação
a outras técnicas de extracção amplamente usadas, como a LLE, a SPE destaca-se e apresenta
diversas vantagens, uma vez possuir grande versabilidade, combinando extracção com limpeza
e concentração de amostras, removendo os componentes interferentes da matriz, com
consumo reduzido de solventes orgânicos, permitindo também a troca de solventes (ex.
aquoso para orgânico), e utilização de menores volumes de amostra. Devido às suas
características, nos últimos anos, a SPE tem vindo a substituir quase por completo a LLE,
uma vez ter provado ser uma técnica muito poderosa na preparação de amostras para análise
cromatográfica e electroforética, sendo de fácil e rápida execução, selectiva, exacta, precisa,
não forma emulsões, fácil de automatização, pouco morosa, atinge níveis de recuperação de
analito significativos e com extractos limpos. É importante referir que a SPE raramente é
utilizada sem recorrer a outros tratamentos, nomeadamente a diluição ou ajuste de pH da
amostra. No entanto, esta técnica permite reduzir substancialmente outros tratamentos que
seriam necessários para isolar os analitos-alvo e que são mais morosos, como é o caso da LLE
[21,121,132-139].
Resumidamente, esta técnica de preparação consiste num processo que envolve a passagem de
uma solução que contém o composto de interesse através de uma coluna empacotada com
uma fase sólida (técnica dinâmica). O composto de interesse irá distribuir-se entre a amostra
no estado líquido e a fase sólida (sendo adsorvido na sua superfície) atingindo-se, assim, um
equilíbrio. Inicialmente, como resultado das interacções fortes que se estabelecem, o analito é
retido pela fase sólida e, desta forma, isolado da matriz (retenção). Posteriormente, são
eliminados os interferentes através da limpeza da fase estacionária. Após a concretização desta
etapa, segue-se a eluição, que consiste na dessorção do analito, ou seja, a sua remoção selectiva
da fase sólida e posterior recolha. Para tal, recorre-se a uma solução denominada eluente, à
qual o analito tem mais afinidade química e que arrastará o mesmo para o recipiente de
Estratégias para análise de drogas de abuso o
20
recolha colocado à saída da coluna. O extracto obtido, de volume reduzido, contém os
analitos concentrados, que posteriormente poderá ser directamente analisado por
cromatografia ou electroforese capilar (CE) ou, alternativamente, poderá ser evaporado e
reconstituído com um solvente mais adequado ao tipo de análise pretendida [21,121,133,135-
137,139-140]. A figura 3.1 representa, esquematicamente, as várias etapas do método SPE.
Passo 1: escolha do enchimento
Passo 2: acondicionamento
Passo 3: introdução da amostra
Passo 4: lavagem
Passo 5: eluição
Figura 3.1 - Representação esquemática das etapas do método de SPE: matriz ( ), impureza ( ), analito
( ), solvente A ( ), solvente B ( ), solvente C ( ). Adaptado de [141].
A variedade das fases estacionárias comercialmente disponíveis permite a existência de vários
mecanismos de interacção entre estas e o analito. Após o desenvolvimento e vasta aplicação
desta técnica, ficou bem claro que não existe uma fase extractiva universal capaz de extrair
analitos distintos nas mais diversas aplicações. Será então necessário fazer uma selecção
apropriada das fases sólidas consoante a área de trabalho ou grupos de compostos que se
pretendam analisar [21]. O tipo de enchimento sólido deve ser seleccionado de acordo com os
mecanismos de retenção pretendidos e pode ser classificado como fase normal, possuindo
grupos funcionais polares; fase reversa, possuindo grupos funcionais apolares; troca iónica,
podendo conter grupos funcionais aniónicos ou catiónicos e exclusão molecular, sendo o
mecanismo de separação baseado na dimensão do analito e dos poros da fase estacionária.
Existem os mais diversos tipos de adsorventes, e com as potencialidades dos materiais
poliméricos, que apresentam uma maior área superficial e maior capacidade quando
comparados às fases de sílica, dada a maior percentagem de carbono, surgem novas
possibilidades, nomeadamente a introdução de grupos funcionais aniónicos ligados (ex. ácidos
carboxílicos e sulfónicos, carboximetil) ou catiónicos (ex. trimetilaminopropril, aminopropil).
Porém, este tipo de fases é vulgarmente usado em associação com fases estacionárias de fase
reversa (SPE de modo misto
uma fase estacionária simultaneamente apolar (copolímero polidivenilbenzeno e N
vinilpirrolidona) e de troca catiónica forte (ácido sulfónico), pelo que ocorrem dois
mecanismos de retenção primários (
reter os analitos apolares mediante forças de van der Waals e os compostos básicos por
atracções electrostáticas. A utilização de um solvente orgânico adequado permitirá eluír os
compostos retidos por adsorção, ao passo que aqueles que foram retidos por troca iónica
serão eluídos por troca com um contra
forma molecular com o auxílio de eluentes iónicos, ácidos ou básicos [21, 121,133,135
137,139-140,142].
Figura 3.2 – Representação do mecanismo de extracção por SPE de modo(propranolol). Adaptado de [143].
Apesar das inúmeras vantagens anteriormente mencionadas, a preparação de amostras para
análise cromatográfica direcciona
amostra, redução do número de passos analíticos e tempo envolvidos, isenção de solventes
orgânicos (solventless) e miniaturização dos sistemas extractivos, principalmente com recurso às
inovadoras técnicas de extracção sortiva [21,144].
3.2.2. Extracção Sortiva em Barra
Em 1999, Pat Sandra e colaboradores [145
qual uma barra de agitação constituída por um magnete envolto numa fina película de vidro
revestido por PDMS é colocada numa amostra sob agitação, d
Estratégias para análise de drogas de abuso
SPE de modo misto). A título de exemplo, as colunas MCX da Waters®, possuem
ia simultaneamente apolar (copolímero polidivenilbenzeno e N
vinilpirrolidona) e de troca catiónica forte (ácido sulfónico), pelo que ocorrem dois
mecanismos de retenção primários (vide figura 3.2). Desta forma, esta fase estacionária pode
s apolares mediante forças de van der Waals e os compostos básicos por
atracções electrostáticas. A utilização de um solvente orgânico adequado permitirá eluír os
compostos retidos por adsorção, ao passo que aqueles que foram retidos por troca iónica
eluídos por troca com um contra-ião presente no solvente, ou por conversão à sua
forma molecular com o auxílio de eluentes iónicos, ácidos ou básicos [21, 121,133,135
Representação do mecanismo de extracção por SPE de modo misto (MCX) de uma droga básica (propranolol). Adaptado de [143].
Apesar das inúmeras vantagens anteriormente mencionadas, a preparação de amostras para
análise cromatográfica direcciona-se cada vez mais no sentido da diminuição do volume da
redução do número de passos analíticos e tempo envolvidos, isenção de solventes
) e miniaturização dos sistemas extractivos, principalmente com recurso às
inovadoras técnicas de extracção sortiva [21,144].
Extracção Sortiva em Barra de Agitação (SBSE)
Em 1999, Pat Sandra e colaboradores [145-146] desenvolveram uma nova técnica, a SBSE, na
qual uma barra de agitação constituída por um magnete envolto numa fina película de vidro
revestido por PDMS é colocada numa amostra sob agitação, de modo a promover
Estratégias para análise de drogas de abuso
21
). A título de exemplo, as colunas MCX da Waters®, possuem
ia simultaneamente apolar (copolímero polidivenilbenzeno e N-
vinilpirrolidona) e de troca catiónica forte (ácido sulfónico), pelo que ocorrem dois
figura 3.2). Desta forma, esta fase estacionária pode
s apolares mediante forças de van der Waals e os compostos básicos por
atracções electrostáticas. A utilização de um solvente orgânico adequado permitirá eluír os
compostos retidos por adsorção, ao passo que aqueles que foram retidos por troca iónica
ião presente no solvente, ou por conversão à sua
forma molecular com o auxílio de eluentes iónicos, ácidos ou básicos [21, 121,133,135-
misto (MCX) de uma droga básica
Apesar das inúmeras vantagens anteriormente mencionadas, a preparação de amostras para
se cada vez mais no sentido da diminuição do volume da
redução do número de passos analíticos e tempo envolvidos, isenção de solventes
) e miniaturização dos sistemas extractivos, principalmente com recurso às
146] desenvolveram uma nova técnica, a SBSE, na
qual uma barra de agitação constituída por um magnete envolto numa fina película de vidro
e modo a promover
Estratégias para análise de drogas de abuso o
22
simultaneamente a homogeneização da amostra e a extracção dos compostos para a fase
polimérica.
Regra geral, a barra é introduzida directamente na amostra aquosa, ou opcionalmente no
headspace, iniciando-se então o processo de extracção. Este é então determinado por vários
parâmetros, nomeadamente, tempo de extracção, volume de amostra, velocidade de agitação,
quantidade de PDMS empregue (26-126 µL), pH, polaridade e força iónica do meio, devendo
estes parâmetros ser optimizados para cada aplicação. Após a extracção, a barra é removida da
amostra, limpa (remoção de matriz) e introduzida num tubo de vidro para dessorção térmica
(TD), onde os analitos são dessorvidos com um injector PTV, sendo posteriormente
criofocados e analisados por GC. A TD, técnica de análise única (one-shot process), apresenta
como desvantagem o facto de a amostra não ser passível de re-análise, para além de ser apenas
compatível com GC, limitando o tipo de compostos que podem ser analisados. No entanto,
obtém-se elevada sensibilidade, já que toda a amostra entra no sistema cromatográfico; por
outro lado, este facto torna a SBSE numa técnica solventless, visto que os compostos são
dessorvidos sem recurso a solventes orgânicos. Alternativamente, e apesar de se acrescentar
mais um passo analítico, é possível aplicar dessorção líquida (LD), pois trata-se de um método
menos oneroso (não necessita de uma unidade de dessorção térmica), em que os extractos
podem ser re-analisados e os compostos a analisar podem não ser voláteis. Em LD a barra é
colocada num volume reduzido de solvente orgânico compatível com a fase extractante,
seguindo-se um tratamento ultrassónico, cuja temperatura, duração e tipo de solvente usado
são passíveis de optimização. Este modo de dessorção é compatível com diversas técnicas de
separação analítica, nomeadamente a GC, LC ou ainda a CE [21,145-149].
Em termos teóricos, a SBSE baseia-se num processo de equilíbrio estático. Estudos [145-146]
demonstram que existe correlação entre os coeficientes de partição relativos à distribuição dos
analitos entre a fase de PDMS e a matriz aquosa (KPDMS/W) e os coeficientes de partição
octanol-água (KO/W), o que constitui uma medida de polaridade dos compostos orgânicos e
fornece uma boa indicação da eficiência de extracção para cada composto [21,145-146].
Em suma, a SBSE é uma técnica de extracção e concentração que pode ser utilizada para a
determinação de compostos orgânicos ao nível vestigial de diversos tipos de matrizes [150-
155], sendo de fácil execução e isenta de solventes orgânicos tóxicos. Em condições não
agressivas, as barras de agitação podem efectuar dezenas ou centenas de extracções
consecutivas sem mostrarem sinais de deterioração. Contrariamente à SPME, para a qual já
existem no mercado diversos tipos de revestimentos poliméricos, na SBSE apenas se
encontram comercializadas barras de agitação revestidas com PDMS [148], pelo que este tipo
Estratégias para análise de drogas de abuso
23
de processo não responde de forma eficiente a analitos polares, a menos que se proceda a
estratégias de derivatização (ex. derivatização in situ). Neste sentido, tem-se assistido
recentemente à utilização de diversos materiais adsorventes, ao desenvolvimento de novos
materiais poliméricos para sorção [156-158] e ainda conceitos inovadores em relação às
técnicas de preparação de amostra, com a finalidade de recuperar analitos mais polares, como
é o caso da microextracção em seringa empacotada (MEPS) [159-160], da microextração
adsorptiva em barra (BAµE) [161-162], da micro-extracção adsortiva em multi-esferas
(MSAµE) [160-162], entre outras.
3.2.3. NOVOS MATERIAIS E METODOLOGIAS INOVADORAS
Como foi referido anteriormente, a filosofia da designada “química verde” direccionou a
química analítica para o desenvolvimento de técnicas solventless na preparação de amostras [21].
A fase extractiva mais comum nestas técnicas é o PDMS [148], que apesar das suas inúmeras
vantagens, não responde de forma eficiente a analitos polares ou termolábeis, não permitindo
obter valores significativos de recuperação para compostos de maior polaridade. A extracção
de compostos polares (log KO/W < 3) de diversos tipos de matrizes continua ainda hoje a ser
um desafio para os químicos analíticos [20]. Uma forma de ultrapassar esta limitação seria
recorrer à derivatização dos compostos, isto é, a reacções químicas que alteram as
propriedades do(s) analito(s) alvo. Neste contexto, seria necessário transformar os analitos
noutros que apresentassem menor polaridade de forma a permitir maior eficiência extractiva.
Contudo, apesar das vantagens inerentes à utilização de reacções de derivatização, estas
apresentam alguns inconvenientes, nomeadamente o facto de serem incompletas,
apresentarem baixos rendimentos e poderem originar vários compostos; por outro lado, são
um processo laborioso e moroso uma vez pressupor a adição de mais um passo analítico no
processo. É neste contexto que se insere a importância do desenvolvimento de novas
metodologias e materiais, de forma a permitir uma maior eficiência extractiva de compostos
com elevada polaridade [21], pelo que diversos grupos de investigação [163-169] têm vindo a
desenvolver novas fases extractivas no sentido de melhorar o processo de extracção deste tipo
de compostos.
Nos últimos anos, Nogueira e colaboradores [156-158,160] têm vindo a utilizar espumas de
poliuretano (PU) como fases extractivas para SBSE [156-158]. Desenvolveram ainda a
microextração adsorptiva em barra (BAµE), cujo procedimento extractivo é similar ao descrito
para a SBSE, com excepção à utilização de TD, permitindo a utilização de diversos materiais
Estratégias para análise de drogas de abuso
24
adsortivos [161-162]. A figura 3.3 representa esquematicamente o processo de extracção por
BAµE.
Figura 3.3 – Imagem e representação esquemática de BAµE. Adaptado de [161].
3.2.3.1. POLIURETANO VS CARVÃO
A estrutura principal da cadeia dos PUs é
poliol) e -R’ (provenientes de um isocianato di ou polifuncional), ligadas por grupos uretano
[171-172], como representado na figura 3.4.
Figura 3.4
A aplicação de espumas de PU para a extracção de compostos orgânicos foi já testada [156
158], uma vez ser um material bastante versátil. Esta versatilidade deve
síntese dos PUs, através do qual se podem formar monómeros com dif
funcionais, dependendo da aplicação desejada [173]. A presença destes grupos funcionais
origina interacções específicas com os analitos. Assim, as espumas de PU apresentam
alternativas às fases poliméricas para SBSE [166
compostos apolares, para os quais o PDMS apresenta baixa eficácia de extracção.
Nos estudos efectuados por Nogueira
satisfatórios: elevada estabilidade química, simplicidade
de uma fase polimérica atractiva para as técnicas de extracção.
Por outro lado, os carvões activados são sólidos amorfos, constituídos sobretudo por carbono
e que possuem capacidades adsorventes únicas e versáteis de
Estratégias para análise de drogas de abuso
162]. A figura 3.3 representa esquematicamente o processo de extracção por
Imagem e representação esquemática de BAµE. Adaptado de [161].
OLIURETANO VS CARVÃO ACTIVADO
A estrutura principal da cadeia dos PUs é constituída por secções -R (provenientes de um
R’ (provenientes de um isocianato di ou polifuncional), ligadas por grupos uretano
172], como representado na figura 3.4.
Figura 3.4 – Estrutura molecular do grupo uretano.
A aplicação de espumas de PU para a extracção de compostos orgânicos foi já testada [156
158], uma vez ser um material bastante versátil. Esta versatilidade deve-se ao processo de
síntese dos PUs, através do qual se podem formar monómeros com dif
funcionais, dependendo da aplicação desejada [173]. A presença destes grupos funcionais
origina interacções específicas com os analitos. Assim, as espumas de PU apresentam
alternativas às fases poliméricas para SBSE [166-169], nomeadamente para a extracção de
compostos apolares, para os quais o PDMS apresenta baixa eficácia de extracção.
Nos estudos efectuados por Nogueira et al. [170] os resultados foram considerados bastantes
satisfatórios: elevada estabilidade química, simplicidade e baixo custos associados, tratando
de uma fase polimérica atractiva para as técnicas de extracção.
Por outro lado, os carvões activados são sólidos amorfos, constituídos sobretudo por carbono
e que possuem capacidades adsorventes únicas e versáteis devido à extensa área externa que
grupo uretano
Estratégias para análise de drogas de abuso o
162]. A figura 3.3 representa esquematicamente o processo de extracção por
Imagem e representação esquemática de BAµE. Adaptado de [161].
R (provenientes de um
R’ (provenientes de um isocianato di ou polifuncional), ligadas por grupos uretano
A aplicação de espumas de PU para a extracção de compostos orgânicos foi já testada [156-
se ao processo de
síntese dos PUs, através do qual se podem formar monómeros com diferentes grupos
funcionais, dependendo da aplicação desejada [173]. A presença destes grupos funcionais
origina interacções específicas com os analitos. Assim, as espumas de PU apresentam-se como
amente para a extracção de
compostos apolares, para os quais o PDMS apresenta baixa eficácia de extracção.
. [170] os resultados foram considerados bastantes
e baixo custos associados, tratando-se
Por outro lado, os carvões activados são sólidos amorfos, constituídos sobretudo por carbono
vido à extensa área externa que
Estratégias para análise de drogas de abuso
25
apresentam, estrutura microporosa, elevada capacidade de adsorção, elevado grau de
reactividade superficial e relativa facilidade de regeneração [175-177]. Para além do carvão, os
materiais usados como precursores na preparação de carvões activados são materiais ricos em
carbono, na sua maioria subprodutos agrícolas (ex. cortiça). Desta forma, o carvão activado
apresenta-se como um composto de baixo custo, sendo esta uma vantagem inerente à sua
utilização como material adsorvente em metodologias extractivas [175-177].
O comportamento dos carvões activados em processos de adsorção é orientado pelas suas
características físicas e químicas. As primeiras englobam diversos parâmetros, nomeadamente
a área específica, o volume poroso e a distribuição do tamanho de poros, que determinam a
sua capacidade de adsorção. Já as características químicas relacionam-se principalmente com a
composição química da superfície exposta. A natureza polar da superfície do carvão activado
torna-o mais selectivo à adsorção de compostos polares do que apolares. No entanto, a
modificação química da superfície, através da introdução de heteroátomos (principalmente
oxigénio e azoto), tem um efeito importante nas propriedades adsortivas, determinando o grau
de interacção da superfície do carvão com o meio. Tendo em conta que a distribuição de
tamanho dos poros nos carvões activados pode ser ajustada pelo controlo dos parâmetros de
activação e do material precursor, torna-se clara a razão pela qual os carvões activados
apresentam uma vasta e tão diversificada gama de aplicações, uma vez a larga distribuição de
tamanho de poros associada à sua elevada área superficial, elevada capacidade de adsorção e
composição química superficial, tornando estes adsorventes muito versáteis [175-180].
3.3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA SOBRE ANÁLISE DE ATS EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS
Na generalidade, a primeira fase do despiste de substâncias proibidas, como os ATS e
produtos de biotransformação, passa pela realização de imuno-ensaios, de forma a diferenciar
resultados negativos de presumíveis resultados positivos. Os resultados positivos necessitam
de confirmação por um segundo método, mais sensível e que providencie níveis de confiança
mais elevados [20], vulgarmente, as técnicas de confirmação assentam em técnicas hifenadas,
nomeadamente cromatografia gasosa, líquida (LC) e electroforese capilar (CE), associadas a
sistemas de detecção por espectrometria de massa.
Apenas na última década aparecem descritos na literatura procedimentos analíticos para a
detecção e identificação de 2C-T-2 e 2C-T-7 em amostras biológicas. Ainda assim, a
quantidade de artigos disponíveis é francamente baixa, quase inexistentes em amostras post
mortem, à excepção do trabalho publicado por Curtis et al. [61]. Na literatura é então referida a
LLE [58,61,181-183] e SPE [5,11,26] como técnicas de preparação de amostras de plasma
Estratégias para análise de drogas de abuso o
26
[5,183], soro [11], sangue total [61,184], urina [24,61,182,184] e fígado [181], embora existam
igualmente alguns estudos em urina de cobaias (ratos), de forma a estabelecer as vias
metabólicas destes compostos [26,56,58,181,185]. Já as técnicas de separação referidas passam
pela cromatografia gasosa acoplada a um detector de azoto-fósforo (GC-NPD) [61],
electroforese capilar com detecção por ultravioleta (CE-UV) [185], fluorescência (CE-FLD)
[182,186] ou espectrometria de massa (CE-MS) [183], cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada à espectrometria de massa (HPLC-MS) [184], cromatografia líquida ultra-eficiente
acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) [8], GC-MS [5,26,56,58,61,181,184,187], e
mais recentemente a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa tandem
(LC-MS/MS) [11]. No entanto, face às exigências de identificação inequívoca dos analitos e às
consequências associadas a falsos resultados positivos, a utilização de cromatografia gasosa e
liquídia acopladas a detectores de massa é crucial num método de confirmação, em detrimento
da utilização de outros detectores (ex. NPD, UV). Adicionalmente, a CE [188] tem uma
aplicação pouco expressiva em toxicologia forense. Referências a reagentes de derivatização,
como por exemplo, isotiocianato de fluoresceína [182] ou 4-(N,N-dimetilaminosulfonil)-7-
fluoro-2,1,3-benzoxadiazole (DBD-F) [186] para aplicações usando detecção por fluorescência
e anidrido heptafluorobutírico (HFBA) [5] ou anidrido trifluoroacético (TFA) [24] para
aplicações em GC-MS são encontradas na literatura. Apesar das reacções de derivarização
serem aconselhadas aquando da utilização de GC-MS [183] alguns autores [181,56] não as
aplicam, especialmente quando se trata de estudos metabólicos em urina de cobaias.
A literatura relativa ao PMA e PMMA é mais extensa em comparação com os compostos
referidos anteriormente, encontrando-se diversos relatos de fatalidades atribuídas ao consumo
destas drogas [67,69-70]. Relativamente às técnicas de preparação de amostras, a LLE [82,189]
e SPE [13,67,75] são as técnicas mais referidas para a limpeza e concentração de amostras
biológicas, como são o caso do sangue [62,67,79,81-82,190-191], soro [11,69], urina
[67,79,82,190-191] e fígado [62]. Referências à SPME são escassas [192]. Grupos de
investigação debruçam-se ainda no estudo metabólico e toxicidade destes compostos, pelo que
se pode encontrar na literatura estudos em amostras biológicas de cobaias [24,193].
Encontram-se igualmente artigos onde são focadas apenas as técnicas de cromatográficas para
análise de padrões destes ATS, pelo que não são utilizadas técnicas de extracção e
concentração [8]. As técnicas de separação utilizadas passam pela UPLC-FLD [8], UPLC-MS
[8], GC-MS [13,70,75,79,189], LC-MS [79,82] e LC-MS/MS [11,79]. É mencionada a utilização
de anidrido trifluoroacético/acetato de etilo [41,79], anidrido pentafluoropropiónico
(PFPA)/pentafluoropropanol (PFPOH) [67] ou ainda com ácido acético anidrido/piridina
Estratégias para análise de drogas de abuso
27
[75], ou seja, reacções de acilação, bastante populares para derivatização de aminas aquando da
utilização de GC-MS. Aplicações em ULPC-FLD necessitam de derivatizações utilizando, por
exemplo, DBD-F [8].
Aa literatura não regista casos de fatalidades por consumo de metcatinona. Ainda assim são
referidas a LLE [17,194-196] e SPE [5,11] como técnica de preparação de amostras de sangue
total [195], soro [11], urina [17,90,194-195,197] e cabelo [198-199]. Já as técnicas de separação
referidas passam por GC-MS [17,194,197-198], HPLC-UV [90], LC-MS [199], CE [195,200] e
mais recentemente a LC-MS/MS [11,196]. Referências a reacções de acilação com HFBA
[194], PFPA [17] ou TFAA [198] para aplicações em GC-MS são encontradas na literatura.
Embora com pouca expressividade, encontram-se referências a fatalidades envolvendo o
consumo de efedrinas [201-202]. As técnicas de preparação de amostras mencionadas incluem
LLE [17,194-196,203], SPE [11,23,205-207] e SPME [208], para extrair estes compostos de
amostras de sangue [23,206], plasma [203,207], urina [23,195,204,206], cabelo [196]. As
técnicas de análise passam por GC-MS [209], UPLC-MS/MS [203], LC-MS/MS
[11,23,196,204]. As aplicações em GC-MS geralmente necessitam de derivatização prévia,
onde se destacam as reacções por acilação através de TFA [209,198], HFBA [194], PFPA [17],
cloreto de pentafluorobenzoílo (PFB-Cl) [210] ou N-metil-bis-trifluoroacetamida (MBTFA)
[211].
Os trabalhos experimentais de Wohlfarth et al. e Habrdova et al. [5,11] permitem, pela primeira
vez, efectuar a identificação e a quantificação simultânea de diversos ATS em amostras de
soro e plasma humano, assim como a validação da metodologia analítica. No método descrito
e validado pelos autores é utilizada, LC-MS/MS e GC-MS, respectivamente.
3.4. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Para garantir que um método analítico origina informação fiável sobre uma amostra, este deve
ser avaliado através de um conjunto de procedimentos sistemáticos bem delineados, processo
este vulgarmente designado por validação. A validação é um processo que tem início no
planeamento da estratégia analítica, e continua ao longo do desenvolvimento do método [212-
213].
A validação pode então ser definida como “a avaliação sistemática de um procedimento analítico para
demonstrar que está sob as condições nas quais deve ser aplicado” [214]; trata-se de “definir requisitos do
método e confirmar que este possui capacidade de desempenho consistente com o que se pretende da sua
aplicação” [212].
Estratégias para análise de drogas de abuso o
28
Existem razões diversas que justificam a implementação da validação dos métodos, já que
dados analíticos pouco fiáveis podem induzir a decisões erradas. De facto, a confiança nos
resultados analíticos é um aspecto fundamental nas mais diversas áreas; por exemplo, em
toxicologia forense, resultados pouco fiáveis podem ser contestados em tribunal. Actualmente,
e com o fim de demonstrar competência técnica e resultados analíticos confiáveis, os
laboratórios sujeitam-se a processos de acreditação, isto é, à avaliação de vários parâmetros
por parte de órgãos de âmbito nacional ou internacional [213].
Nos últimos anos surgiram várias publicações de artigos referentes a validação de métodos
analíticos [215-216] e bioanalíticos [217-222], com referências a definições, procedimentos e
parâmetros a validar. Contudo, as estratégias e definições nem sempre são coincidentes.
Organismos internacionais, como a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), a
ISO (International Organization for Standardization), a FDA (Food and Drug Admistration) e o grupo
EURACHEM, entre outros, publicaram documentos referentes à validação de métodos
analíticos [212,223,225], embora se verificam diferenças [226], o que origina alguma confusão
relativamente a nomenclatura e conceitos.
Na validação de um método bioanalítico diversas variáveis devem ser consideradas,
nomeadamente, processo de colheita da amostra, tipo de matriz biológica, preparação da
amostra, técnica analítica empregue e análise dos dados obtidos [220]. Assim, aquando do
desenvolvimento do método, a validação deve abranger o protocolo escrito, incluindo a
definição do sistema a validar, a descrição do procedimento experimental, a identificação dos
parâmetros de validação e a definição dos critérios de aceitação. Por fim, deve proceder-se à
elaboração de relatórios de validação, onde devem constar os resultados dos ensaios e ainda
conclusões da validação [228].
O desenvolvimento de um método analítico encontra-se então condicionado pela respectiva
validação, pois só após esta etapa se saberá se as condições analíticas estabelecidas conduzem
a resultados confiáveis. Caso os resultados obtidos no processo de validação não estejam de
acordo com os critérios de aceitação previamente estabelecidos poderá ser necessário alterar o
procedimento, que exigirá um novo estudo de validação [213].
Estratégias para análise de drogas de abuso
29
Segundo a norma NP EN ISO/IEC 17025 [229], sempre que um laboratório execute ensaios
terá que levar a cabo um processo de validação do método durante a sua implementação, ou
sempre que ocorra uma alteração relevante do mesmo. A validação de um método é então
progressivamente mais exigente para as seguintes situações:
Extensões e/ou modificações de métodos normalizados;
Métodos normalizados utilizados fora do âmbito de utilização prevista;
Métodos não normalizados;
Métodos criados e desenvolvidos pelo próprio laboratório.
No caso de métodos de confirmação quantitativos, como o desenvolvido no presente
trabalho, existe algum consenso quanto à necessidade de serem avaliados, pelo menos, os
seguintes parâmetros: selectividade, modelo de calibração (linearidade), estabilidade, precisão
(repetibilidade, precisão intermédia), limite de detecção, limite de quantificação e recuperação.
Deve ainda considerar-se a possibilidade de serem avaliados outros parâmetros (ex. robustez e
reprodutibilidade) [213].
Pelo exposto, a presente dissertação tem como objectivo o desenvolvimento e validação de
uma metodologia analítica, com vista à sua utilização na rotina pericial, para identificação e
quantificação de 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, PMMA, efedrina, norefedrina e metcatinona em
amostras de sangue total por SPE/GC-MS.
Adicionalmente, pretende-se aplicar metodologias inovadoras de extracção, nomeadamente, a
micro-extração adsorptiva em barra (BAµE), para a análise dos referidos ATS em amostras de
urina, com análise por GC-MS e LC-MS/MS.
Materiais e métodos
31
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. PADRÕES E REAGENTES
Os padrões de referência de (-)-efedrina, d,I-norefedrina, d,I-metcatinona, PMA e PMMA
(grau de pureza > 98,5%), foram obtidos Lipomed (Arlesheim, Suíça).
Os padrões de 2C-T-2 e 2C-T-7 foram gentilmente cedidos pelo Laboratório de Análises e
Dopagem do Instituto do Desporto de Portugal.
Os padrões internos anfetamina (d6), metanfetamina (d9), MDMA (d5), N-metil-1-
(benzodioxol-5-il)-2-butanamina (MBDB, d5), N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina (MDE, d5)
deuterados (grau de pureza 99%) foram fornecidos pela Cerilliant (Round Rock, EUA).
Os padrões de referência, utilizados no estudo da selectividade, com grau de pureza entre
98,5% e 99% foram adquiridos à Lipomed (Arlesheim, Suíça) e à Cerilliant (Round Rock,
EUA).
O acetato de etilo, cloroformato de benzoílo, ácido clorídrico (HCl, 37%), amónia (NH4OH,
25%), diclorometano, di-hidrogenosfosfato de potássio anidro (KH2PO4), n-hexano, metanol
(grau de pureza adequado a cromatografia gasosa), 2-propanol (p.a.), o ácido fómico (grau de
pureza 98-100%) e o acetonitrilo (ACN, grau de pureza adequado a LC-MS) foram fornecidos
pela Merck (Darmstadt, Alemanha).
A água desionizada, com resistividade de 18,2 MΩcm-1 à temperatura ambiente, foi produzida
num sistema de purificação de água Simplicity 185 (com lâmpada de UV) da Millipore
(Bedford, EUA).
Os reagentes de derivatização empregues N-metil-bis-trifluoroacetamida (MBTFA), N-metil-
N-trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA), trimetilclorosilano (TMCS), N-metil-N-terc-butil-
dimetilsilil-trifluoroacetamida (MBDSTFA), N-metil-N-(trimetilsilil)heptafluorobutiramida
(MSHFBA) foram adquiridos a Macherey-Nagel (Düren, Alemanha). O anidrido
trifluoroacético (TFAA) e o hidróxido de potássio (KOH) foram fornecidos por Riedel de
Haen (Seelze, Alemanha). A piridina (py, com grau de pureza 99,9%), o anidrido
pentafluoropropiónico (PFPA, grau de pureza 99%) e o pentafluoropropanol (PFPOH, grau
de pureza 97%) foram fornecidos pela Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha).
4.2. SOLUÇÕES As soluções padrão individuais das substâncias em estudo foram preparadas em metanol na
concentração de 1000 µg/mL e armazenadas a -10°C, ao abrigo da luz.
As soluções de trabalho a 100 µg/mL foram obtidas por diluição das respectivas soluções
padrão com metanol.
Materiais e métodos o
32
Para a SPE, por diluição das soluções de trabalho iniciais prepararam-se soluções de trabalho
com concentrações de 10, 2,5, 1 e 0,25 µg/mL utilizando como solvente o metanol. As
soluções de trabalho foram armazenadas entre 2 a 8°C, ao abrigo da luz.
As soluções de ácido clorídrico (0,1 N) foram preparadas num balão volumétrico de 250 mL
de capacidade, contendo de 100 mL água desionizada, tendo-se pipetado 5 mL de HCl 5 N.
Completou-se com água desionizada até perfazer o volume e homogeneizou-se por inversão.
As soluções de ácido clorídrico 5 N foram preparadas num balão volumétrico de 100 mL de
capacidade, contento 60 mL de água desionizada, tendo-se pipetado 64,3 mL de HCl 37%.
Completou-se com água desionizada até perfazer o volume e homogeneizou-se por inversão.
A solução de ácido clorídrico a 1% em metanol foi preparada num balão volumétrico de 100
mL de capacidade, contendo 60 mL de metanol ao qual se adicionou 1 mL de HCl
concentrado (37%). Perfez-se o volume com metanol, até 100 mL, e por fim a solução foi
agitada.
A solução de ácido clorídrico a 1% em 2-propanol foi preparada num balão volumétrico de
100 mL de capacidade, contendo 60 mL de metanol ao qual se adicionou 1 mL de 2-propanol
(37%). Perfez-se o volume com metanol, até 100 mL, e por fim a solução foi agitada.
As soluções de diclorometano/2-propanol/amónia (78:20:2, v/v/v) foram preparadas num
balão volumétrico de 100 mL de capacidade, para onde se pipetaram 78 mL de diclorometano,
tendo-se adicionado de seguida 20 mL de 2-propanol. As soluções foram homogeneizadas
vigorosamente e posteriormente adicionaram-se 2 mL de amónia e homogeneizou-se por
inversão.
As soluções de diclorometano/metanol (70:30, v/v) foram preparadas em balões volumétricos
de 100 mL de capacidade, contendo 30 mL de metanol, tendo-se pipetado 70 mL de
diclorometano e homogeneizado por inversão.
A fim de preparar as soluções tampão fosfato (0,1 M, pH 6,0±0,1) pesaram-se 13,6 g de
KH2PO4 e transferiu-se para um balão volumétrico de 1000 mL de capacidade com 900 mL
de água desionizada, homogeneizou-se num banho ultra-sónico até dissolução completa do
KH2PO4. Mediu-se o pH da solução e ajustou-se a pH 6,0±0,1 com uma solução de KOH a 1
M. Completou-se ao traço com água desionizada.
Metanol a 5% (v/v) (100 mL): Pipetaram-se 5 mL de metanol para um balão volumétrico de
100 mL de capacidade contendo 60 mL de água desionizada. Adicionou-se água até completar
o volume e homogeneizou-se por inversão.
Materiais e métodos
33
Ácido clorídrico a 1% em metanol (100 mL): Para um balão volumétrico de 100 mL de
capacidade contendo 60 mL de metanol adicionou-se 1 mL de HCl concentrado (37%). O
volume final de 100 mL foi obtido com metanol, a solução foi devidamente agitada.
A solução de hidróxido de potássio (1M) foi preparada através da pesagem de pesados 5,61 g
de KOH para um balão volumétrico de 100 mL de capacidade contendo 80 mL de água
desionizada. A solução foi homogeneizada por inversão, completou-se com água desionizada
até preencher o volume, tendo esta sido devidamente agitada.
As soluções de ACN/MeOH (50:50, v/v) foram preparadas em balões volumétricos de 100
mL de capacidade, contendo 50 mL de ACN, tendo-se pipetado 50 mL de MeOH e
homogeneizado por inversão.
A fase móvel constituída por ACN/solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% (95:5, v/v) foi
preparada num balão volumétrico de 1000 mL, contedo 95 mL de ACN, tendo-se pipetado 5
mL de solução aquosa de ácido fórmico a 0,1%.
A fase móvel constituída por solução aquosa de ácido fórmico a 0,1%/ACN (95:5, v/v) foi
preparada num balão volumétrico de 1000 mL, contedo 95 mL de solução aquosa de ácido
fórmico a 0,1%/, tendo-se pipetado 5 mL de ACN.
4.3. EQUIPAMENTO
Balança analítica da Kern & Sohn GmbH, modelo 770-13 (Balingen-Frommern,
Alemanha);
Banho seco da Grant Instruments (Cambridge) Ltd, modelo QBT2 (Royston, Reino
Unido);
Banho ultra-sónico, modelo XB14 da Grant Instruments (Shepreth, Reino Unido);
Banho ultra-sónico equipado com termóstato (Branson® 3510 E-DTH, Danbury, CT,
EUA).
Centrífuga da marca Heraeus Sepatech GmbH e modelo Megafuge 1.0 (Osterode,
Alemanha);
Câmara para extracção em fase sólida manual com capacidade para 20 colunas (Vac
Master) adquirida a International Sorbent Technology Ltd (Hengoed, Reino Unido)
associada a uma bomba de vácuo, modelo N022AN18, fornecida por KNF Neuberger
GmbH (Freiburg, Alemanha);
Materiais e métodos o
34
Cromatógrafo gasoso modelo 6890N acoplado a um detector selectivo de massa
modelo 5973 Inert e dotado de um injector automático modelo 7683 da marca Agilent
Technologies Inc. (Waldbronn, Alemanha);
Cromatógrafo líquido modelo Alliance® 2795 acoplado a um detector selectivo de
massa com analisador de triplo quadrupolo APIESCi modelo Quattro MicroTM
(Micromass, Waters);
Desencapsulador da Chromacol (Welwyn Garden City, Reino Unido);
Encapsulador da Agilent (Palo Alto, EUA);
Evaporador da Techne (Cambridge) Ltd, modelo Dri-block DB-3 (Duxford
Cambridge, Reino Unido);
Homogeneizador, modelo SRT2, da Stuart Scientific (Redhill Surrey, Reino Unido);
Placa de agitação múltipla com quinze pontos de agitação (Variomag H+P
Labortechnik AG Multipoint 15, OberschleiBheim, Alemanha);
Potenciómetro, modelo Handylab1, da Schott-Geräte GmbH (Mainz, Alemanha);
Vortex, modelo ZX3, adquirido a Velp Scientifica srl (Usmate, Itália).
4.4. MATERIAIS
Barra de agitação comercial Twister revestida por um filme de PDMS (46 µL) fornecida
por Gerstel (Müllheim a/d Ruhr, Alemanha);
Barras para BAµE, com cerca de 15 mm de comprimento, foram desenvolvidas no
Laboratório de Cromatografia e Electroforese Capilar da Faculdade de Ciências da
Universidade de Lisboa;
Carvões activados Norit (CA1, CN 1, SX Plus, B Test Eur e SX), foram gentilmente
cedidos pela Salmon & Cia. (Holanda);
Colunas de extracção em fase sólida Oasis® HLB (60 mg de enchimento, 3 mL volume),
Oasis® MCX (60 mg de enchimento, 3 mL volume) fornecidas por Waters Corporation
(Milford, EUA) e StrataTM-X, fornecida por Phenomenex Inc (California, USA);
Liners de 4 mm de diâmetro interno, para split, com lã de vidro, da Agilent (Palo Alto,
EUA);
Polímero sintetizado no laboratório do Grupo de Ciência e Tecnologia de Separação da
Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa;
Septos Agilent Premium Inlet Septa, de 11 mm de diâmetro, fornecidos pela Agilent
Technologies (EUA);
Materiais e métodos
35
4.5. CONDIÇÕES INSTRUMENTAIS
4.5.1. GC-MS
Foi utilizada uma coluna capilar de sílica fundida HP-5MS com 30 m de comprimento, 0,25
mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura do filme a fim de realizar as separações
cromatográficas. Com o intuito de atingir uma eficiência separativa adequada desenvolveu-se
um programa de temperaturas da coluna: temperatura inicial do forno de 90°C sustentada
durante 1,85 minutos, seguindo-se um gradiente térmico de 20°C por minuto até aos 300°C, a
temperatura final foi mantida constante durante 3 minutos. A temperatura do injector e do
detector (interface) foi mantida a 280°C. O volume de injecção foi de 2 µL, em modo split;
com uma razão de split de 1:10. Utilizou-se hélio como fase móvel (gás de arraste), de pureza
> 99,9996% da Praxair (Maia, Portugal), mantendo-se o fluxo deste constante (7,9 mL/min).
O espectrómetro de massa foi utilizado no modo de impacto electrónico, energia de 70 eV,
em modo de varrimento contínuo (modo full scan), com um varrimento num intervalo de
razões m/z de 50 a 550 u.m.a., e no modo SIM, atribuiu-se a cada composto em estudo três
fragmentos iónicos, considerando o Tr do composto. O atraso de solvente (do inglês, solvent
delay) foi de 6,00 minutos. A aquisição e tratamentos dos dados foram obtidos com os
softwares Enhanced ChemStation MSD Chem Station versão E.02.00493 de 2008, da Agilent
Technologies (Center Ville Road, EUA). Os liners utilizados foram silanizados e o injector foi
limpo a cada 100 análises, de modo a prevenir a diminuição da sensibilidade.
4.5.2. LC-MS/MS
A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna Waters Atlantis T3
(100 mm × 2,1 mm, 3 µm) a 35 ºC. Com o objectivo de obter uma eficiência separativa
adequada desenvolveu-se um gradiente de eluição com ACB / solução aquosa de ácido
fórmico a 0,1% (95:5, v/v) (A) e uma solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% / ACN (95:5,
v/v) (B), com um fluxo de 0,250 mL/min. O gradiente foi programado de acordo com as
indicações na tabela 4.1.
Materiais e métodos o
36
Tabela 4.1 - Gradiente de eluição utilizada para análise cromatográfica dos ATS em estudo.
Tempo / min % A % B
0,00 10 90
0,50 10 90
8,00 80 20
11,00 80 20
11,10 10 90
16,00 10 90
O volume de injecção utilizado foi de 10 µL. A operação do equipamento e a aquisição de
dados foram obtidas com o software MassLynxTM V4.1 SCN714 e o processamento de dados
foi efectuado com recurso ao software QuanLynxTM V4.1 SCN714. O equipamento foi
operado no modo de ionização ESI+ (electrospray positivo) e no modo MRM (multiple reaction
monitoring). Os parâmetros da fonte de ionização foram optimizados para a análise dos ATS e
as seguintes condições foram encontradas: voltagem da coluna, 1,0 kV; temperatura da fonte,
120 ºC; gás de dessolvatação (azoto) aquecido a 450ºC e com um fluxo de 600 L/h; não foi
usado gás de cone. As transições MRM, voltagem do cone e energia de colisão apropriadas
para cada analito individual e PI foram determinadas através de infusão directa de soluções-
padrão no espectrómetro de massa. A voltagem do cone foi ajustada a fim de maximizar a
intensidade do ião molecular protonado e a dissociação por colisão induzida foi efectuada. A
pressão do gás de colisão (árgon) foi mantida a aproximadamente 3,5×10-3 mbar, a energia de
colisão foi optimizada e seleccionaram-se dois iões produto para cada composto. As transições
MRM, com a correspondente voltagem de cone, energia de colisão e tempo de retenção para
os analitos e PI estão apresentadas na tabela seguinte.
Materiais e métodos
37
Tabela 4.2 – Transições MRM, voltagem do cone, energia de colisão (Ecolisão) e tempo de retenção (tR) dos
analitos e PI.
Composto Transições (m/z) Cone (V) Ecolisão (eV) tR (min)
Norefedrina 152,3 → 117,0
152,3 → 134,0 20 11 1,98
Efedrina 166,3 → 117,0
166,0 → 148,0 20 15 2,33
Metcatinona 164,3 → 131,0
164,3 → 146,0 25 14 2,37
Anfetamina d6 142,1 → 125,1 15 8 3,36
Metanfetamina d9 159,2 → 125,1 20 11 3,43
PMA 166,3 → 121,0
166,3 → 149,0 20 10 3,58
PMMA 180,3 → 121,0
180,3 → 149,0 20 13 4,18
2C-T-2 242,3 → 210,0
242,3 → 225,0 20 12 6,08
2C-T-7 256,3 → 167,0
256,3 → 239,0 20 12 6,67
4.6. AMOSTRAS BIOLÓGICAS
As amostras brancas2 de sangue utilizadas durante o estudo da selectividade foram colhidas in
vivo ou post mortem no âmbito das actividades do INML. As amostras de sangue utilizadas no
estudo dos restantes parâmetros, também amostras brancas, eram provenientes do Instituto
Português do Sangue, tratando-se de sangue humano excedente de transfusões. Numa fase
posterior do estudo obtiveram-se amostras de urina de voluntários do STF, não consumidores
de drogas ou medicamentos. As amostras recebidas no STF para análise toxicológica foram
conservadas por congelação a -10°C.
2Por amostra branca entende-se uma amostra cuja matriz é equivalente à das amostras a analisar, embora isenta da(s) substância(s) a pesquisar.
Materiais e métodos o
38
4.7. IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS
De acordo com a agência mundial anti-doping (WADA, do inglês World Anti-Doping Agency) a
identificação de um composto numa amostra, por GC-MS em modo SIM, pressupõe o
reconhecimento de, pelo menos, três fragmentos iónicos diagnóstico no fragmentograma,
assim como a monitorização das respectivas intensidades relativas [230].
A abundância relativa de um fragmento diagnóstico, expressa como percentagem da
intensidade do fragmento mais intenso (pico base), foi determinada por integração da área do
pico cromatográfico seleccionado e normalizada ao pico base (que corresponde a 100%). Na
tabela 4.3 encontram-se descritos os intervalos de aceitação permitidos para as abundâncias
relativas utilizados na identificação dos compostos em estudo [230].
Tabela 4.3 - Intervalos máximos de tolerância permitidos para as abundâncias relativas dos fragmentos de
diagnóstico, monitorizados em modo SIM [230].
Abundância relativa
(% relativa ao pico base)
Intervalo máximo de tolerância permitido
(%)
> 50 ± 10 (intervalo absoluto)
25 a 50 ± 20 (intervalo relativo)
5 a < 25 ± 5 (intervalo absoluto)
< 5 ± 50 (intervalo relativo)
A WADA prevê ainda, como critérios de confirmação qualitativa, que a variação do tempo de
retenção do composto (tR) seja inferior a 2% ou ± 0,1 minutos, o que originasse um intervalo
menor [230]. Além disso, a variação do tempo de retenção relativo do composto (tRr), expresso
pela razão entre o tR do composto e o tR do padrão interno, deve ser inferior ou igual a 1%
quando comparado ao tRr do composto de referência, no caso de não se utilizar um análogo
deuterado como padrão interno; caso contrário a variação do tempo de retenção relativo do
composto deve ser inferior a 0,1% [230]. Por fim, a razão entre o sinal do fragmento
diagnóstico menos intenso e o sinal correspondente ao ruído da linha de base (razão
sinal/ruído) deverá ser superior a 3:1 [230]. A determinação da razão sinal/ruído (S/N) foi
realizada por recurso ao software do equipamento.
Materiais e métodos
39
4.8. EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
4.8.1. PRÉ-TRATAMENTO DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS
Tal como referido anteriormente, as amostras recebidas no STF são armazenadas a -10°C,
pelo que antes da extracção as amostras de sangue total foram descongeladas até atingirem a
temperatura ambiente. Através de movimentos de rotação e inversão, e durante 15 minutos, as
amostras foram homogeneizadas. De seguida, diluíu-se uma alíquota de sangue com 8 mL de
uma solução de tampão fosfato (KH2PO4 0,1 M, pH 6,0±0,1), procedeu-se à homogeneização
durante 10 minutos, seguida de centrifugação a 2500 r.p.m., durante 10 minutos, de forma a
remover possíveis partículas em suspensão, pelo que o precipitado obtido foi rejeitado.
4.8.2. METODOLOGIA DE EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA
Foram avaliados dois tipos de colunas na avaliação da extracção dos ATS, nomeadamente,
Oasis® HLB e Oasis® MCX. As colunas Oasis HLB da Waters® permitem a retenção de
analitos de uma vasta gama de polaridades por SPE de fase reversa enquanto o mecanismo
extractivo das colunas Oasis MCX da Waters® é de modo misto (fase reversa e troca iónica),
estando descrito ser eficiente para analitos básicos [231-233].
4.8.2.1. METODOLOGIA DE EXTRACÇÃO COM AS COLUNAS OASIS® HLB
O procedimento experimental foi baseado nas sugestões apresentadas pelo fabricante para a
extracção de drogas ácidas, básicas e neutras em sangue total [231-232]. As colunas de
extracção foram inicialmente condicionadas com 2 mL de metanol e com 2 mL de água
desionizada. Adicionaram-se as amostras, com uma razão de fluxo moderada e preparadas de
acordo com o descrito anteriormente (vide ponto 4.8.1), e procedeu-se à lavagem da fase
estacionária com 2 mL de metanol a 5%. Por fim, os analitos foram eluídos com 2 mL de
metanol.
4.8.2.2. METODOLOGIA DE EXTRACÇÃO COM AS COLUNAS OASIS® MCX
Optou-se por testar as condições estipuladas no procedimento experimental validado em vigor
no STF para extracção de anfetaminas da matriz sangue total devido à semelhança estrutural
entre os compostos em estudo. Assim, após condicionamento da coluna com 2 mL de
metanol e 2 mL de água desionizada, as amostras foram introduzidas na mesma, com uma
razão de fluxo moderada. Numa terceira etapa, que consistiu em lavar a coluna, utilizaram-me
2 mL de água desionizada, 2 mL de HCl a 0,1 N, 3 mL de solução diclorometano/metanol
(70:30; v/v) e 3 mL de n-hexano. As colunas foram secas, sob vácuo, durante 10 minutos.
Materiais e métodos o
40
Posteriormente, a eluição com 2 mL de diclorometano/isopropanol/amónia (78:20:2, v/v/v)
permite a recuperação dos compostos em estudo.
4.8.3. DERIVATIZAÇÃO QUÍMICA
Em experiências prévias constatou-se a necessidade de derivatizar os ATS em estudo. No
STF, os métodos de derivatização química mais usuais na análise de drogas de abuso por
GC-MS são a sililação e a acilação, reacções de derivatização frequentemente utilizadas para as
aminas primárias e secundárias [233], pelo que seis das sete reacções estudadas englobam este
tipo de derivatização.
Note-se que as fases orgânicas obtidas foram evaporadas até à secura sob uma corrente de
azoto, a uma temperatura de 40°C, para que o excesso de solvente fosse eliminado e os
analitos concentrados e só posteriormente eram sujeitas à derivatização. No entanto, tal como
foi descrito por Solans et al. [236], observaram-se perdas por volatilização destes compostos.
Assim, à semelhança do procedimento analítico aplicado no STF aquando da análise de
anfetaminas e compostos relacionados, à fase orgânica proveniente do procedimento
extractivo por SPE foram adicionados 20 µL de reagente de derivatização a utilizar na
respectiva experiência. As amostras foram então homogeneizadas durante 5 segundos no
vórtex e finalmente levadas à secura sob corrente de azoto.
4.8.3.1. MBTFA, MSTFA:TMS (95:5; v/v), MBDSTFA ou MSHFBA
No caso das reacções com MBTFA, MSTFA:TMS (95:5; v/v), MBDSTFA e MSHFBA o
procedimento foi similar. O resíduo seco resultante da evaporação da fase orgânica, obtida no
procedimento extractivo por SPE, foi solubilizado com 60 µL de reagente de derivatização
(MBTFA, MSTFA:TMS, MBDSTFA ou MSHFBA) e agitado no vórtex durante cerca de 15
segundos. Aqueceu-se a 80°C durante 30 minutos. Depois de arrefecer, até à temperatura
ambiente, a solução foi transferida para um vial e uma alíquota de 2 µL foi injectada no sistema
cromatográfico.
4.8.3.2. MSTFA/MBTFA
O resíduo seco procedente da evaporação da fase orgânica, obtida no procedimento extractivo
por SPE, foi solubilizado com 60 µL de MSTFA e agitado no vórtex durante cerca de 15
segundos. Aqueceu-se a 80°C durante 20 minutos. Depois de arrefecer até à temperatura
ambiente adicionou-se 30 µL de MBTFA e aqueceu-se a 80°C durante mais 10 minutos.
Materiais e métodos
41
Depois de arrefecer, até à temperatura ambiente, a solução foi transferida para um vial e uma
alíquota de 2 µL foi injectada no sistema cromatográfico.
4.8.3.3. PFPA/PFOH
Ao eluato obtido após extracção por SPE adicionou-se 100 µL de uma solução de HCL 1%,
de forma a evitar perdas por evaporação. Após a evaporação adicionou-se ao resíduo seco 50
µL de PFPA e 25 µL de PFOH, tendo-se agitado no vórtex durante cerca de 15 segundos e
aquecido a 65ºC durante 20 minutos. Evaporou-se novamente até à secura, reconstituiu-se
com 50 µL de acetado de etilo e transferiu-se a solução para um vial e uma alíquota de 2 µL foi
injectada no sistema cromatográfico.
4.8.3.4. PY/CLOROFORMATO DE BENZOÍLO
A uma solução padrão dos ATS a 10 µg/mL adicionou-se 100 µL de etanol:py (4:1, v/v) e 40
µL de cloroformato de benzoílo. De seguida agitou-se a mesma durante 2 minutos no vórtex e
levou-se à secura sob corrente de azoto a 40 ºC. O resíduo seco foi reconstituído com 50 µL
de acetato de etilo e transferiu-se a solução para um vial e uma alíquota de 2 µL foi injectada
no sistema cromatográfico.
4.9. QUANTIFICAÇÃO
O tipo de calibração analítica deve ser adequado às análises e amostras ensaiadas. Assim, e em
métodos instrumentais de análise, vários métodos podem ser seleccionados, nomeadamente,
calibração pelo método da adição de padrão interno, ente outros. Cada uma destas escolhas
depende do caso em análise, pelo que cabe ao laboratório definir os critérios de escolha e
aplicabilidade, bem como estabelecer critérios de aceitação para as calibrações obtidas (ex.
linearidade, tipo de ajuste polinomial e coeficiente de correlação) [234]. Neste sentido, optou-
se pela análise quantitativa efectuada pelo método do padrão interno, onde um composto (PI)
é adicionado à amostra, numa concentração conhecida, antes de se proceder à extracção e
análise. Desta forma podem ser minimizadas fontes de variabilidade introduzidas nas várias
etapas pelas quais a amostra passa, sendo possível compensar alguns erros do método (ex.
evaporação, variação do volume de injecção, etc.) [235-236].
A fim de escolher o PI adequado, fortificaram-se com os ATS em estudo nove alíquotas (500
µL) de uma amostra de sangue branco, isenta dos compostos a pesquisar, na concentração de
200 ng/mL e adicionou-se 100 ng/mL da solução de PI (anfetamina d6, metanfetamina d9,
Materiais e métodos o
42
MDMA d5, MDE d5, MDBD d5), à totalidade das amostras e extraíram-se e analisaram-se de
acordo com a metodologia descrita, a fim de verificar a repetibilidade da razão entre a área
cromatográfica do PI e do analito.
4.10. VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE ATS POR SPE/GC-MS
Tal como já foi referido anteriormente, a confiança nos resultados analíticos é um aspecto
fundamental, pelo que antes de ser usado em análises forenses o método analítico deve ser
validado. O método analítico desenvolvido é um método interno, dado que não se baseia em
qualquer método de referência ou normalizado. Deste modo, pretende-se evidenciar a sua
adequação à confirmação qualitativa e quantitativa de ATS em amostras de sangue total por
SPE/GC-MS. Conforme o exposto, os parâmetros de validação do método analítico
desenvolvido para a identificação e quantificação de ATS em amostras de sangue total por
SPE-GC-MS avaliados encontram-se descritos na Tabela 4.4.
Tabela 4.4 - Parâmetros de validação do método analítico de SPE/GC-MS para identificação e quantificação de
ATS em amostras de sangue total [213].
Parâmetro Método de confirmação
qualitativo
Método de confirmação
quantitativo
Selectividade
Limite de detecção
Limite de quantificação
Linearidade
Gama de trabalho
Precisão intermédia
Repetibilidade
Exactidão (veracidade)
Eficiência de extracção
Arrastamento
Robustez
Materiais e métodos
43
4.10.1. AVALIAÇÃO DA SELECTIVIDADE
Sucintamente, pode-se definir selectividade como a capacidade de um método para
discriminar o analito-alvo inequivocamente, sem que outros elementos eventualmente
presentes na amostra interfiram [235].
A avaliação da selectividade do método analítico efectuou-se em duas fases distintas. Na
primeira fase seleccionou-se um total de quarenta amostras de sangue total de fontes distintas,
sangue post mortem e sangue colhido in vivo, isentas dos analitos em estudo e representativas das
amostras analisadas no STF. Estas amostras foram então agrupadas em dez subgrupos de
alíquotas, de quatro origens diferentes, constituindo-se assim pools de amostras de sangue total.
A cada uma das pools retiraram-se duas alíquotas (500 µL): a uma delas adicionou-se 100 ng de
cada analito tendo sido adicionado a ambas 100 ng de PI, aplicado o método analítico
desenvolvido. Finalmente, compararam-se os resultados obtidos nos controlos, isto é, nas
alíquotas fortificadas com os analitos com os resultados obtidos nas alíquotas não fortificadas.
Numa segunda fase seleccionaram-se, aleatoriamente, cinco pools das anteriormente preparadas
e de cada uma delas foram utilizadas três alíquotas (500 µL): a uma das alíquotas adicionaram-
se os ATS em estudo (200 ng/mL) e PI (200 ng/mL), à segunda, para além do PI e os ATS na
mesma concentração foram também adicionados cinquenta e dois compostos passíveis de
serem encontrados em rotina no STF, nomeadamente, benzodiazepinas (400 ng/mL), cocaína
e metabolitos (1000 ng/mL), analgésicos (1000 ng/mL), anfetaminas (1000 ng/mL) e
canabinóides (300 ng/mL) e que pudessem interferir com a análise dos ATS (vide Anexo A) e
por fim, na terceira alíquota, foram apenas adicionados PI (200 ng/mL) e os cinquenta e dois
compostos. Os resultados obtidos para as cinco pools foram também comparados com um
controlo.
4.10.2. LIMITES ANALÍTICOS DO MÉTODO: LIMITES DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO
Efectuaram-se vinte e uma curvas de calibração, três por composto, por fortificação de
alíquotas (500 µL) de uma amostra de sangue branco, em três gamas distintas, entre 2 e 20
ng/mL (5 calibradores), entre 2 e 50 ng/mL (11 calibradores) e entre 5 e 500 ng/mL (11
calibradores). Adicionou-se 100 ng/mL da solução de PI a todas as amostras e aplicou-se o
método analítico desenvolvido.
Materiais e métodos o
44
4.10.3. LINEARIDADE
As recomendações relativas ao número de pontos de calibração necessários ao estudo da
linearidade de um método diferem bastante consoante os autores. Regra geral, recomenda-se a
utilização de cinco a oito pontos para o estudo de funções lineares e, eventualmente, mais
pontos para as não lineares [220,237-238]. Outros autores consideram que, estatisticamente, é
mais vantajoso a utilização de um menor número de níveis de calibração, embora com mais
replicados, pois facilita a detecção de pontos anómalos ou ainda a necessidade de utilizar
factores de ponderação na calibração [239].
Assim, prepararam-se sete curvas de calibração (uma por analito), mediante fortificação de
alíquotas (500 µL) de uma amostra de sangue branco, num total de onze calibradores,
uniformemente distribuídos na gama de trabalho: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500
ng/mL. A todas as amostras de calibração adicionou-se o PI (100 ng/mL) e foi aplicada a
metodologia já mencionada.
A recta de calibração foi obtida por aplicação do método dos mínimos quadrados, assumindo-
se que as diferenças entre a concentração real e a nominal (resíduos) apresentam distribuição
normal, valor nulo, sejam independentes e que se verifique homogeneidade de variâncias ao
longo da gama de trabalho (homocedasticidade) [240].
Os critérios de aceitação da curva de calibração devem também estar definidos de forma clara.
Assim, definiram-se valores superiores a 0,99 para o coeficiente de correlação linear (r) e de
determinação (R2) das curvas de calibração, a observação visual da distribuição dos resíduos ao
longo dos valores de concentração não deveria revelar tendências; na intercepção da curva
com o eixo das ordenadas, o valor zero deveria estar contido no intervalo de confiança de
95% [235,237,241]; e a exclusão de dados cujos valores residuais sejam superiores ao dobro do
erro-padrão (Sy/x) da curva de calibração (valores aberrantes). Note-se que o valor do R2 por si
só não garante a adequação do ajuste linear à curva de calibração. De facto, verifica-se que
pontos de calibração não equidistantes ou mesmo curvas de calibração com valores residuais
elevados podem ainda assim exibir valores de R2 elevados [241,243]. Sendo assim, utilizou-se o
teste de Mandel [244-246] (vide Anexo B), de modo a verificar qual dos modelos, linear ou não
linear, permitiria o melhor ajustamento dos pontos experimentais.
Materiais e métodos
45
4.10.4. GAMA DE TRABALHO
A aplicação de um método analítico quantitativo exige a definição de um intervalo entre as
concentrações mínima e máxima esperadas para determinado analito, de forma a evitar
extrapolações. Este intervalo designa-se gama de trabalho [239,235].
Representando os extremos mínimo e máximo do intervalo de concentrações da curva de
calibração 5 ng/mL e 500 ng/mL, respectivamente, foram preparadas dez alíquotas (500 µL)
de amostras de sangue isentas dos compostos a analisar. O PI foi adicionado a todas as
alíquotas na concentração de 100 ng/mL. Estas dez réplicas independentes da primeira e
última amostra de calibração foram extraídas e analisadas de acordo com o método
desenvolvido. Por último, importa referir que a avaliação da gama de trabalho foi efectuada
em simultâneo com o estudo da linearidade do método analítico e para um modelo de
calibração linear.
A diminuição da gama de trabalho pode ser um recurso sempre que não se confirme
homogeneidade de variâncias entre os extremos da gama de trabalho, avaliada por aplicação de
um teste estatístico (vide Anexo C) [248]. No entanto, o método dos mínimos quadrados
ponderados [243,246,247,249] revelou-se a solução mais viável para encontrar a equação da
curva de calibração que melhor se ajusta aos resultados obtidos experimentalmente.
4.10.4.1. REGRESSÃO LINEAR PONDERADA
Nos casos em que a heterocedasticidade dos dados é evidenciada, a utilização da regressão
linear ponderada (WLSR, do inglês Weighted Least Squares Regression) é a melhor forma de
harmonizar as discrepâncias entre as variâncias dos diferentes pontos de calibração, por
recurso ao estudo de factores de ponderação empíricos, como aproximação simplista da
variância, baseados na variável independente (x) ou dependente (y): ; ;
√ ;
;
;
√
[240,243,246].
O factor de ponderação empírico será seleccionado após a verificação de vários parâmetros,
nomeadamente, a estimativa do erro relativo percentual (ER%) (vide equação D.5, Anexo D), o
cálculo do somatório do erro relativo percentual (ΣER%) e a representação gráfica do ER%
em função da concentração, sendo que, neste último caso, os valores de ER% devem
encontrar-se distribuídos de forma aleatória e dispostos paralelamente (sob a forma de faixa
horizontal) em função das concentrações. O factor de ponderação mais adequado será aquele
que originar a banda horizontal mais estreita e um menor valor de ΣER% [240,250].
Materiais e métodos o
46
Prepararam-se então sete curvas de calibração (uma por composto), contento oitos pontos de
calibração. Utilizaram-se 500 µL de sangue branco, tendo este sido fortificado com os ATS em
estudo em concentrações de 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ng/mL. A todos os calibradores
foram adicionados o PI (100 ng/mL) e aplicado o método analítico desenvolvido. Este
procedimento foi repetido durante cinco dias.
4.10.5. PRECISÃO: REPETIBILIDADE E PRECISÃO INTERMÉDIA
A precisão do método analítico revela a capacidade do mesmo para obter resultados analíticos
concordantes entre si, ou seja, em condições bem definidas permite-nos estimar a dispersão de
resultados entre ensaios independentes, executados sobre uma mesma amostra ou amostras
semelhantes, ou mesmo em padrões [213,234-235,247]. Ainda que neste último caso, o efeito
de matriz não seja atenuado [248]. Quanto menor é esta dispersão maior a precisão do
método, e esta pode ser expressa por três medidas de dispersão: desvio-padrão, variância ou
coeficiente de variação percentual (CV%) [251-252].
Em regra este parâmetro pode ser subdividido em três níveis: repetibilidade, precisão
intermédia e reprodutibilidade [247,253]. O primeiro expressa o grau de dispersão obtido em
condições experimentais análogas, na ausência de factores que possam afectar os resultados
analíticos (ex. mesmo operador, mesmo equipamento, no mesmo laboratório), e num intervalo
de tempo reduzido (ex. no mesmo dia). A repetibilidade também é denominada de precisão
intra-ensaio ou intra-corrida. A influência das pequenas alterações que ocorrem diariamente
num laboratório (ex. equipamentos, analistas, lotes, ou dias diferentes) sobre os resultados
analíticos pode ser avaliada pela precisão intermédia, também denominada de variabilidade
intra-laboratorial ou precisão inter-corrida. Esta medida de dispersão afigura-se como a mais
representativa da variabilidade dos resultados analíticos obtidos num laboratório e por isso a
preferida [247] Existem várias formas de precisão intermédia, tantas quanto os factores
diversificados, a metodologia empregue no seu estudo depende do método analítico [247]. Por
último, a reprodutibilidade exprime o grau de concordância entre os resultados analíticos
obtidos por diferentes laboratórios (ex. ensaios interlaboratoriais) [247,253].
A metodologia adoptada no presente trabalho para o estudo da repetibilidade e precisão
intermédia, dado que neste trabalho não se efectuou o estudo da reprodutibilidade, baseou-se
na aplicação do método analítico desenvolvido a uma amostra de sangue branco fortificada em
p sequências analíticas diferentes. Numa mesma série, esta amostra foi extraída e analisada n
vezes em condições de repetibilidade, mas entre séries a influência das pequenas alterações
diárias sobre os resultados analíticos foi avaliada [248,251,254].
Materiais e métodos
47
As sete curvas de calibração, com oitos pontos de calibração, foram obtidas por fortificação
de alíquotas de uma amostra branca de sangue total. Utilizou-se o mesmo volume de sangue
para cada alíquota (500 µL) e os calibradores encontram-se uniformemente distribuídos na
gama de trabalho: 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400 e 500 ng/mL para todos os ATS em estudo.
Adicionalmente, foram preparadas amostras controlo, em triplicado, por fortificação de
alíquotas da amostra branca, em três níveis de concentração: 20, 250 e 450 ng/mL,
respectivamente gama baixa, média e elevada. A todas as alíquotas adicionou-se o PI (100
ng/mL) e, aplicou-se o método analítico desenvolvido, em condições de repetibilidade,
reagentes e equipamento iguais num curto intervalo de tempo mas preparadas de forma
independente.
Ao longo de um mês, em dias diferentes (n=5), repetiu-se o procedimento experimental,
tendo sido adicionados alguns factores de variabilidade à semelhança das condições operativas
que se deparam os analistas diariamente. Assim, e entre os dias, alteraram-se lotes de
reagentes, colunas de extracção e cromatográficas e amostras de sangue branco [253-254].
Utilizou-se a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados ponderados a fim de obter
as 5 curvas de calibração por composto, tendo os valores de concentração sido estimados por
interpolação da área cromatográfica relativa na equação de regressão linear ponderada.
Nos diferentes níveis de concentração, e para cada ATS, a variância da repetibilidade SR2 ) e da
precisão intermédia (SI2) foram estimadas por uma análise de variância (ANOVA) cujas
equações podem ser consultadas no Anexo E [240,254-255]. A precisão intermédia obtida foi
estimada pela raiz quadrada das variâncias (desvio-padrão) referida no Anexo E. As expressões
necessárias ao cálculo do coeficiente de variação de repetibilidade ), em termos
percentuais encontram-se também no mesmo anexo [240,254-255]. Este último, possibilita
avaliar a repetibilidade do método analítico, para cada gama de concentração estudada.
4.10.6. EXACTIDÃO E VERACIDADE
A exactidão expressa a concordância entre os resultados individuais obtidos após aplicação do
método analítico e o valor de referência que é aceite como real. É muitas vezes confundido
com veracidade, embora esta designação se refira à concordância entre o valor médio de um
conjunto de resultados analíticos obtidos após a aplicação do método analítico e o valor de
referência que é aceite como real [213,235,237].
A veracidade reúne dois componentes, erros aleatórios e sistemáticos e a esta componente
sistemática designa-se de tendência (do inglês, bias) [234]. Assim, a tendência de um método
Materiais e métodos o
48
analítico define-se como a diferença entre a melhor estimativa dos resultados obtidos após
aplicação do método e o valor de referência considerado convencionalmente como verdadeiro
e, geralmente, é determinada mediante a realização de ensaios com materiais de referência
certificados (CRM), participação em ensaios inter-laboratoriais ou através de amostras
fortificadas [236,242,248].
A veracidade do método analítico foi avaliada através dos valores de recuperação analítica
(quociente entre o valor observado e o valor esperado) obtidos mediante análise de amostras
brancas fortificadas, tendo em conta a indisponibilidade de CRM e possibilidade de
participação em ensaios inter-laboratoriais [256]. No entanto, deve ter-se em conta que a
recuperação estimada em amostras fortificadas pode diferir da que seria obtida numa amostra
em que o analito estivesse na sua forma nativa. Ainda assim, e no caso de amostras líquidas,
considera-se que a fortificação pode constituir uma boa representação do analito nativo [317].
Experimentalmente, a metodologia aplicada foi similar à descrita para a avaliação da precisão
intermédia. A exactidão, em percentagem, é expressa como o erro médio relativo da
concentração estimada (EMR) (Anexo D) [240] para cada nível de concentração.
4.10.7. RECUPERAÇÃO DA FASE DE EXTRACÇÃO (EFICIÊNCIA DE EXTRACÇÃO)
A avaliação da recuperação total não foi determinada, uma vez o método analítico apresentar
uma etapa de derivatização e os analitos derivatizados não serem comercializados sob a forma
de material de referência. No entanto, ao assumir-se que a etapa de derivatização apresenta
uma eficiência de 100%, a avaliação da recuperação da fase de extracção pode ser efectuada,
estimando desta forma a eficiência extractiva do método analítico [252].
Note-se que, segundo os critérios internos do STF, para métodos quantitativos as
concentrações testadas no estudo de recuperação devem obedecer aos seguintes critérios:
A concentração correspondente à “gama baixa” deve ser superior ao limite de
quantificação;
A concentração correspondente à “gama alta” deve ser igual ou inferior ao limite
superior de quantificação.
Assim, para a avaliação deste parâmetro escolheram-se três gamas de trabalho (500, 100 e 50
ng/mL) e extraíram-se dois conjuntos de alíquotas (500 µL) de sangue branco, em triplicado,
para cada uma das concentrações. Um dos conjuntos foi fortificado com os ATS antes da
extracção, tendo o outro sido fortificado depois de aplicado o processo extractivo e
imediatamente antes da evaporação. O PI (100 ng/mL) foi adicionado a todas as fases
Materiais e métodos
49
orgânicas, antes da etapa de evaporação. A eficiência da extracção foi avaliada mediante o
cálculo da recuperação, em percentagem (vide Anexo D) [237].
4.10.8. PRESENÇA DE ARRASTAMENTO (CARRY OVER)
Na avaliação da presença de arrastamento (do inglês, carry over) o procedimento de extracção,
derivatização e análise foi similar aos apresentados nas secções anteriores. No entanto, uma
das alíquotas da amostra branca não foi fortificada com os ATS, embora tenha sido sujeita às
mesmas condições analíticas das amostras fortificadas. Esta alíquota foi então injectada (n=3)
no GC-MS imediatamente a seguir à análise da amostra mais concentrada (500 ng/mL). O
procedimento foi repetido para as concentrações de 400 e 300 ng/mL, de forma a averiguar a
existência de fenómenos de carry over.
4.10.9. ROBUSTEZ
A capacidade de um método analítico suportar pequenas variações durante a sua realização
sem que os resultados se vejam afectados designa-se por robustez [235-236,247,252]. Este
parâmetro foi estudado, em condições de precisão intermédia, aquando do estudo da precisão
e exactidão.
4.11. METODOLOGIA ALTERNATIVA PARA ANÁLISE DE ATS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
ESTUDOS PRELIMINARES
As actuais exigências de celeridade das análises toxicológicas bem como o cumprimento dos
príncipios fundamentais da Química Verde levaram à necessidade de desenvolver
metodologias alternativas para a determinação de ATS em fluidos biológicos. Sendo assim,
testou-se uma alternativa à determinação de ATS em sangue por SPE/GC-MS. A alternativa
proposta baseia-se na utilização de uma técnica emergente de preparação de amostras, a
micro-extracção adsortiva em barra (BAµE) [161-162]. Acresce ainda que os métodos
imunoenzimáticos existentes para rastreio de drogas de abuso não permitem a sua detecção e a
urina é a amostra de eleição na triagem de anfetaminas e compostos relacionados [13,19,257],
pois a janela de detecção é de dias e as concentrações excretadas são mais elevadas. Neste
sentido, optou-se por utilizar esta metodologia em amostras de urina.
Materiais e métodos o
50
4.11.1. PREPARAÇÃO DO MICRO-DISPOSITIVO DE EXTRACÇÃO
Para preparação do micro-dispositivo BAµE foram utilizadas as fases extractivas mencionadas
no ponto 4.4. A preparação das barras de microextracção adsortiva envolveu o
desenvolvimento de um micro-dispositivo para a extracção de substâncias com diferentes
polaridades, encontrando-se sob pedido provisório de patente nacional [258]. O micro-
dispositivo, suporte cilíndrico em polipropileno com comprimento aproximado de 15 mm e 3
mm em diâmetro, foi revestido externamente com cola [161] e posteriormente com o material
sólido (adsorvente) finamente dividido, para que o mesmo aderisse à superfície do adesivo,
ficando o sólido suportado por colagem. Por fim, o micro-dispositivo (figura 4.1) foi lavado
com água com o intuito de remover o excesso de material adsorvente.
Figura 4.1 - Representação esquemática da barra de micro-extracção: 1 – barra de polipropileno; 2 – fase
extractiva. Adaptado de [161].
4.11.2. ESCOLHA DO MATERIAL ADSORVENTE
Uma das grandes vantagens da utilização da BAµE é a possibilidade de escolher o material
adsorvente a utilizar no dispositivo de extracção. Sendo assim, testaram-se os materiais
disponíveis: cinco tipos de carvões activados (designados por AC1, AC2, AC3, AC4 e AC5), o
enchimento da coluna MCX da Oasis®, o enchimento da coluna StrataTM-X da Phenomenex
Inc. e um poliuretano desenvolvido no laboratório do Grupo de Ciência e Tecnologia de
Separação da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa. A técnica BAµE, com recurso
aos materiais referidos foi comparada com SBSE.
Com o intuito de escolher o material adsorvente mais adequado à extracção dos ATS
realizaram-se nove ensaios, um por cada material adsorvente testado, medindo 15 mL de água
ultra-pura e 5 mL de urina (diluição 1:3), isenta dos compostos a analisar e previamente
filtrada, para um vial de vidro apropriado. Posteriormente, a solução aquosa foi fortificada
com os ATS em estudo numa concentração de 100 ng/mL, adicionadas três gotas de uma
solução de KOH 1M e inserida a barra de extracção e agitação, tendo-se por fim selado o vial
com um septo. A extracção foi promovida através da agitação da barra magnética durante três
horas, à temperatura ambiente, com uma velocidade de agitação de 1000 rpm (condições
padrão). Posteriormente, a barra de extracção foi retirada e seca num papel limpo com o
auxílio de uma pinça, e de seguida transferida para um
ACN:MeOH (50:50, v/v) para se proceder à retroextracção através de tratamento ultra
durante 30 minutos a 25ºC. Excepcionalmente, para o ensaio efectuado para o adsorvente
retirado da coluna MCX o solvente de retroextracção utilizado foi uma mistura
diclorometano:2-propanol:amónia (78:20:2, v/v/v), uma vez ser este o eluente utilizado no
método validado por SPE. Posteriormente, a barra de extracção foi removida com o auxílio de
uma pinça e ao extracto orgânico foi adicionado 20 µL de MBTFA, levado à evaporaçã
secura sob corrente suave de azoto, tendo o resíduo sido re
a fim de efectuar a reacção de derivatização (aquecimento a 80ºC durante 30 minutos). O
extracto obtido foi transferido para um
MS.
Figura 4.2 - Ilustração genérica do processo de pré
4.11.3. ESTUDO DO EFEITO DE E
Após a escolha do material adsorvente mais adequado à extracção dos ATS estudou
processo de minimizar as perdas de analitos por volatilização durante a evaporação dos
extractos, pois a separação cromatográfica passaria a efectuar
a derivatização química. Assim, o procedimento experimental adoptado foi igua
no ponto 1.2.2 mas no extracto orgânico obtido e antes da etapa de evaporação testaram
quatro hipóteses (em triplicado): evaporação à temperatura ambiente, sem corrente de azoto;
evaporação sob corrente de azoto a 40ºC; evaporação sob corr
previamente ao extracto uma solução de HCl a 1% em MeOH; evaporação sob corrente de
azoto, adicionando previamente ao extracto uma solução de HCl a 1% em isopropanol. O
resíduo foi então re-dissolvido em 70 µL da fase móvel B, se
Materiais e métodos
ura ambiente, com uma velocidade de agitação de 1000 rpm (condições
padrão). Posteriormente, a barra de extracção foi retirada e seca num papel limpo com o
auxílio de uma pinça, e de seguida transferida para um vial contendo 3 mL de uma solução de
(50:50, v/v) para se proceder à retroextracção através de tratamento ultra
durante 30 minutos a 25ºC. Excepcionalmente, para o ensaio efectuado para o adsorvente
retirado da coluna MCX o solvente de retroextracção utilizado foi uma mistura
propanol:amónia (78:20:2, v/v/v), uma vez ser este o eluente utilizado no
método validado por SPE. Posteriormente, a barra de extracção foi removida com o auxílio de
uma pinça e ao extracto orgânico foi adicionado 20 µL de MBTFA, levado à evaporaçã
secura sob corrente suave de azoto, tendo o resíduo sido re-dissolvido com 60 µL de MBTFA
a fim de efectuar a reacção de derivatização (aquecimento a 80ºC durante 30 minutos). O
extracto obtido foi transferido para um vial e uma alíquota (2 uL) foi injectada no sistema GC
Ilustração genérica do processo de pré-concentração dos analitos por BAµE-
STUDO DO EFEITO DE EVAPORAÇÃO NOS ATS
Após a escolha do material adsorvente mais adequado à extracção dos ATS estudou
processo de minimizar as perdas de analitos por volatilização durante a evaporação dos
extractos, pois a separação cromatográfica passaria a efectuar-se por LC-MS/MS, sem recurso
a derivatização química. Assim, o procedimento experimental adoptado foi igua
no ponto 1.2.2 mas no extracto orgânico obtido e antes da etapa de evaporação testaram
quatro hipóteses (em triplicado): evaporação à temperatura ambiente, sem corrente de azoto;
evaporação sob corrente de azoto a 40ºC; evaporação sob corrente de azoto, adicionando
previamente ao extracto uma solução de HCl a 1% em MeOH; evaporação sob corrente de
azoto, adicionando previamente ao extracto uma solução de HCl a 1% em isopropanol. O
dissolvido em 70 µL da fase móvel B, seguido de análise por LC
Materiais e métodos
51
ura ambiente, com uma velocidade de agitação de 1000 rpm (condições
padrão). Posteriormente, a barra de extracção foi retirada e seca num papel limpo com o
contendo 3 mL de uma solução de
(50:50, v/v) para se proceder à retroextracção através de tratamento ultra-sónico
durante 30 minutos a 25ºC. Excepcionalmente, para o ensaio efectuado para o adsorvente
retirado da coluna MCX o solvente de retroextracção utilizado foi uma mistura
propanol:amónia (78:20:2, v/v/v), uma vez ser este o eluente utilizado no
método validado por SPE. Posteriormente, a barra de extracção foi removida com o auxílio de
uma pinça e ao extracto orgânico foi adicionado 20 µL de MBTFA, levado à evaporação até à
dissolvido com 60 µL de MBTFA
a fim de efectuar a reacção de derivatização (aquecimento a 80ºC durante 30 minutos). O
injectada no sistema GC-
-LD.
Após a escolha do material adsorvente mais adequado à extracção dos ATS estudou-se o
processo de minimizar as perdas de analitos por volatilização durante a evaporação dos
MS/MS, sem recurso
a derivatização química. Assim, o procedimento experimental adoptado foi igual ao descrito
no ponto 1.2.2 mas no extracto orgânico obtido e antes da etapa de evaporação testaram-se
quatro hipóteses (em triplicado): evaporação à temperatura ambiente, sem corrente de azoto;
ente de azoto, adicionando
previamente ao extracto uma solução de HCl a 1% em MeOH; evaporação sob corrente de
azoto, adicionando previamente ao extracto uma solução de HCl a 1% em isopropanol. O
guido de análise por LC-MS/MS.
Materiais e métodos o
52
4.11.4. RECUPERAÇÃO DA FASE DE EXTRACÇÃO (EFICIÊNCIA DE EXTRACÇÃO)
Posteriormente estudou-se a recuperação da metodologia desenvolvida. Sendo assim,
extraíram-se dois conjuntos de alíquotas (5 mL de urina branca diluída em 15 mL de água
ultra-pura), isentas dos compostos a analisar, em triplicado. Enquanto um dos conjuntos foi
fortificado antes da extracção, o outro só foi fortificado após o término do processo
extractivo e antecedendo a etapa de evaporação da fase orgânica. O PI foi adicionado a todas
as fases orgânicas obtidas na concentração de 100 ng/mL, antes da evaporação. O processo de
extracção e retroextracção ocorreu de igual forma à descrita no ponto 4.10.2. Após término do
processo de retroextracção a barra de extracção foi então retirada com o auxilio de uma pinça
e ao extracto orgânico era adicionado 100 µL de uma solução de HCl a 1% em MeOH, levado
à evaporação até à secura sob corrente suave de azoto, tendo o resíduo sido re-dissolvido em
70 µL da fase móvel B, seguido de análise por LC-MS/MS.
4.11.5. LIMITE DE DETECÇÃO
O estudo do limite de detecção foi efectuado em simultâneo com o estudo da eficiência da
fase de extracção. Realizaram-se então quatro ensaios, um por cada nível de concentração dos
ATS (2, 5, 10 e 20 ng/mL) medindo 15 mL de água ultra-pura e 5 mL de urina branca
previamente filtrada, para um vial de vidro apropriado. Posteriormente, a solução aquosa foi
fortificada com os ATS em estudo de acordo com a concentração pretendida, adicionado o PI
(100 ng/mL), adicionadas três gotas de uma solução de KOH 1M e inserida a barra de
extracção e agitação, tendo-se por fim selado o vial. A extracção e retroextracção foram
efectuadas nas condições padrão já referidas. As barras de extracção foram então retiradas
com o auxilio de uma pinça e ao extracto orgânico era adicionado 100 µL de uma solução de
HCl a 1% em MeOH, evaporado até à secura sob corrente suave de azoto, tendo o resíduo
sido re-dissolvido em 70 µL da fase móvel B, seguido de análise por LC-MS/MS. O LOD foi
então determinado através do método visual [241].
Resultados e discussão
53
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS
Após a análise dos espectros de massa dos ATS em estudo, obtidos em modo full scan,
pretendia-se seleccionar os fragmentos iónicos diagnóstico (valores m/z) característicos de
modo a que estes fossem utilizados em modo SIM, aumentando assim a sensibilidade e
selectividade da análise por GC-MS. No entanto, tal como referenciado na literatura [22,79],
constatou-se que os espectros de massa apresentavam fragmentos iónicos de fraca intensidade
e/ou massas moleculares baixas (vide Anexo F, a título de exemplo), o que dificultava a sua
identificação em modo SIM, para além da perda de selectividade e sensibilidade.
Esta limitação conduziu à derivatização analítica dos ATS, nomeadamente à acilação com
MBTFA, o que facilitou a sua identificação [22,79], pois obtiveram-se espectros de massa mais
expressivos, devido ao aumento da massa molecular dos ATS, oferecendo um modo de
fragmentação mais complexo, pelo que os fragmentos iónicos são mais característicos,
observando-se ainda o pico correspondente ao ião molecular. Encontram-se na Tabela 5.1 os
fragmentos iónicos diagnóstico (valores m/z) monitorizados em modo SIM e respectivo
tempo de retenção (tR) dos ATS, obtidos mediante análise por GC-MS após acilação com
MBTFA.
Tabela 5.1 - Razão massa/carga (m/z) dos fragmentos iónicos diagnóstico monitorizados em modo SIM e
tempo de retenção (tR) usados na identificação dos compostos derivatizados com MBTFA.
Composto Fragmento iónico (m/z) tR / min
2C-T-2-N-TFA 211, 224, 337 10,8
2C-T-7-N-TFA 225, 238, 351 11,1
PMA-N-TFA 121, 148, 261 7,8
PMMA-N-TFA 121, 148, 154 8,5
Metcatinona-N-TFA 105, 110, 154 7,3
Efedrina-N,O-TFA 110, 154, 244 6,9
Norefedrina-N-TFA 140, 203, 230 6,4
*Anfetamina-N-TFA d6 144 6,2
*Metanfetamina-N-TFA d9 161 7,0
*MDMA-N-TFA d5 158 9,1
*MDE-N-TFA d5 173 9,4
*MDBD-N-TFA d5 172 9,5
*padrão interno; pico base
Resultados e discussão o
54
A fim de se proceder à aplicação dos critérios de aceitação para a identificação inequívoca dos
ATS na amostra biológica foi necessário proceder à escolha do PI mais adequado a cada
analito. Este composto deve possuir alguns requisitos, designadamente, deve ser
quimicamente similar ao analito, idealmente um análogo deuterado deste, e apresentar
estabilidade. O PI é sujeito às mesmas condições analíticas dos compostos alvo durante a
separação cromatográfica, pelo que o tR do ATS pode ser calculado relativamente ao tR do PI,
minimizando diferenças no tR, que por vezes ocorrem entre corridas diferentes [1]. Assim,
sendo após realização das primeiras experiências, verificou-se que o análogo deuterado da
anfetamina seria o PI mais indicado para a análise do 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, efedrina e
norefedrina enquanto a metanfetamina deuterada seria mais adequada para a análise de PMMA
e metcatinona (vide Anexo G).
É possível observar-se na figura 5.1 os resultados obtidos através da fortificação com os ATS
(200 ng/mL) de uma amostra branca de sangue total. Esta foi processada e analisada por
SPE/GC-MS, com derivatização com MBTFA. Apresentam-se igualmente os critérios de
aceitação propostos pela WADA [230] para a identificação inequívoca de analitos em amostras
biológicas por GC-MS, exemplificando-se a aplicação destes critérios na confirmação
qualitativa do 2C-T-2-N-TFA.
(a)
(c)
AMOSTRA
Área Abs
m/z 211 207113
m/z 337 117641
m/z 224
CONTROLO
Área Abs
m/z 211 206732
m/z 337 119372
m/z 224
CRITÉRIOS
Rel.iónicas
90.000 110,000
47.742 67,742
20.154 30,230
Figura 5.1 - Identificação do 2C-T
em estudo e à qual se adicionou o PI na mesma concentração: Confirmação da presença dos três fragmentos
iónicos de diagnóstico no cromatograma (a); Fragmentograma
2C-T-2-N-TFA (b); Aplicação dos critérios de aceitação para a identificação do 2C
Verificam-se então todos os critérios recomendados pela WADA para a confirmação
qualitativa do 2C-T-2-N-TFA. A identificação
confirmada.
Resultados e discussão
Área Abs Área Rel S/N trA
207113 100,000 10,831 6,256
117641 56,800 10,834 6,256
52322 25,263 21.7 10,831 6,256
Área Abs Área Rel S/N trA
206732 100,000 10,834 6,261
119372 57,742 10,838 6,261
52080 25,192 26.3 10,836 6,261
Rel.iónicas S/N ∆tr (± 0,1 minuto) ∆t
110,000 > 3 10,734 10,934 1,713
67,742 > 3 10,738 10,938 1,714
30,230 > 3 10,736 10,936 1,713
T-2-N-TFA numa amostra de sangue total fortificada com 200 ng/mL dos ATS
em estudo e à qual se adicionou o PI na mesma concentração: Confirmação da presença dos três fragmentos
iónicos de diagnóstico no cromatograma (a); Fragmentograma
TFA (b); Aplicação dos critérios de aceitação para a identificação do 2C-T-2-N
se então todos os critérios recomendados pela WADA para a confirmação
TFA. A identificação inequívoca dos restantes ATS foi igualmente
(b)
211
224
m/z 211
m/z 337
m/z 224
Resultados e discussão
55
trP trR
6,256 1,731
6,256 1,732
6,256 1,731
trP trR
6,261 0,578
6,261 0,578
6,261 0,578
∆trR (± 1% relativo)
1,713 1,748
1,714 1,748
1,713 1,748
TFA numa amostra de sangue total fortificada com 200 ng/mL dos ATS
em estudo e à qual se adicionou o PI na mesma concentração: Confirmação da presença dos três fragmentos
de massa do
N-TFA (c).
se então todos os critérios recomendados pela WADA para a confirmação
dos restantes ATS foi igualmente
337
Resultados e discussão o
56
5.2. EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
5.2.1. PRÉ-TRATAMENTO DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS
A necessidade de determinar inúmeros compostos numa análise toxicológica, a utilização de
metodologias analíticas distintas e a existência de amostras biológicas cujo volume é diminuto
(em regra, inferior a 10 mL) justificou a necessidade de utilizar um volume inicial de 0,5 mL de
sangue.
As amostras biológicas requerem, em geral, um pré-tratamento, uma vez apresentarem
concentrações elevadas de macromoléculas ou material em suspensão, podendo obstruir os
poros do adsorvente sólido da coluna de SPE durante a fase de extracção [260-261]. Assim,
procedeu-se à diluição das mesmas permitindo reduzir a sua viscosidade. Note-se que a
diluição da amostra com solução tampão fosfato (KH2PO4 0,1 M, pH 6,0±0,1) também
permitiu controlar o pH da mesma. Já a centrifugação das amostras após a diluição induziu a
sedimentação dos interferentes sólidos, diminuindo assim o risco de obstrução dos poros do
adsorvente [260-261].
5.2.2. METODOLOGIA DE EXTRACÇÃO
Nesta etapa foi avaliada a extracção com recurso a colunas Oasis® HLB e Oasis® MCX. Os
adsorventes poliméricos das referidas colunas distinguem-se face a outros copolímeros
disponíveis comercialmente pela sua eficiência extractiva elevada, reprodutibilidade e aquando
da extracção não se verificam perdas de analitos quando o adsorvente seca [231], o que
permite maior autonomia ao analista. Além disso, os adsorventes usados nos dois tipos de
colunas são estáveis numa gama de pH entre 1 e 14, permitindo a retenção de um grande
número de compostos, com diferentes polaridades [231,262].
Após a realização das experiências (n=9) com as colunas Oasis® HLB não foram obtidos
resultados reprodutíveis, verificando-se a ausência de alguns dos ATS em estudo (PMA,
PMMA, efedrina, norefedrina e metcatinona) na gama alta (500 ng/mL), ou até mesmo a
ausência de todos os ATS, na gama baixa (5 ng/mL). Na gama média (100 ng/mL) foi
possível determinar a eficiência extractiva das colunas Oasis® HLB (vide Anexo H),
observando para a maioria dos compostos recuperação médias entre 5,7 e 105,4%, estando
associados CV% elevados. Assim, a extracção dos compostos encontrava-se comprometida
(vide cromatogramas em Anexo). Apesar de na literatura se encontrarem referências à
extracção de ATS por SPE mediante colunas Oasis® HLB [263-264], o trabalho de Cela et al.
[265] compara a eficiência extractiva entre polímeros molecularmente impressos (MIPs, do
Resultados e discussão
57
inglês molecularly imprinted polymers), colunas Oasis® MCX e Oasis® HLB, referindo que as
últimas demonstraram a pior eficiência extractiva para vários compostos, incluindo efedrinas e
catinonas.
Os resultados obtidos apontam para as colunas Oasis® MCX como as mais adequadas para a
extracção de todos os compostos em estudo, à semelhança de outros estudos efectuados [265-
268]. De facto, a presença de grupos sulfónicos no polímero (fase estacionária de modo misto,
troca catiónica e fase reversa) parece favorecer a retenção selectiva dos ATS (que possuem
uma função amina), comparativamente às HLB [269]. A diluição do sangue total com solução
de tampão fosfato possibilitou o controlo do pH da amostra biológica, uma vez que os ATS
em estudo apresentavam características básicas e com grupos funcionais ionizáveis (amina
primária e secundária). Assim, os compostos ionizados originam, maioritariamente, espécies
catiónicas, conduzindo a um aumento da adsorção dos compostos básicos por interacções
electrostáticas com os grupos aniónicos. Aquando da lavagem da coluna, a água permite
remover apenas os interferentes da matriz e, posteriormente, o HCl completará o processo ao
permitir a eluição de proteínas e outras matérias não retidas na fase estacionária, assegurando
ainda a protonação dos ATS [262,269]. O diclorometano/metanol (70:30) permite ainda a
remoção de compostos polares, neutros e ácidos. Interferentes hidrofóbicos, gorduras e até
vestígios de água são eliminados mediante a lavagem com n-hexano [269]. Finalmente, a
eluição com solução de diclorometano/isopropanol/amónia (78:20:2, v/v/v), também
utilizada por Wohlfarth et al. [11] permite a recuperação dos compostos em estudo.
5.2.3. Estudo do EFEITO DE EVAPORAÇÃO NOS ATS
É referido na literatura a perda de analitos voláteis, como é o caso dos ATS em estudo
[11,82,], durante a etapa de evaporação da fase orgânica obtida por SPE. No entanto, alguns
autores desvalorizam a perda de analitos durante o processo de evaporação, considerando que
esta não é significativa, especialmente se este se der em condições suaves [10,25]. Ainda assim,
alguns autores referem que o passo de evaporação sem a adição de algum reagente específico
será ineficaz na redução de perdas de analitos com baixos pesos moleculares, mesmo quando
o procedimento ocorre à temperatura ambiente [233]. Sendo assim, diferentes autores sugerem
a adição de reagentes que conduzam à formação de derivados de sais (ex. cloridratos, acetatos
ou reagentes de acilação), prevenindo assim a perda de analitos voláteis [11,233,270]. Sugere-se
então, antes da etapa de evaporação, a adição aos eluatos obtidos de uma solução metanólica
de HCl, formando cloridratos menos voláteis [11,233,270], ou a adição de TMCS [233],
MBTFA [233,271], ou outros reagentes. Neste trabalho, optou-se por adicionar 20 µL do
Resultados e discussão o
58
reagente de derivatização (MBTFA) antes de conduzir as amostras à secura, à semelhança do
procedimento adoptado pelo STF para análise de piperazinas e anfetaminas [272].
5.2.4. DERIVATIZAÇÃO QUÍMICA
As primeiras experiências, efectuadas em GC-MS sem recurso à derivatização química,
evidenciaram, para além de espectros de massa com pouca informação estrutural tal como
referido anteriormente (vide ponto 5.1), a presença de picos cromatográficos com arrastamento
(tailing) e até perda de sinal cromatográfico nos compostos norefedrina e metcatinona. De
facto, muitos compostos apresentam um mau comportamento cromatográfico, o qual está
geralmente associado à presença de grupos funcionais polares (ex. COOH, OH, NH, SH). No
caso concreto das aminas, existe ainda a possibilidade de interacção destas com a sílica fundida
ou a fase estacionária, assim como a sua decomposição, causando alargamento dos picos
cromatográficos. Infelizmente, a maioria dos compostos de interesse toxicológico encontram-
se nesta situação [273]. Uma forma de contornar estas dificuldades passa pela derivatização
química, isto é, modificação química dos grupos funcionais através de reacções apropriadas,
geralmente efectuadas de modo a produzir derivados dotados de propriedades adequadas para
a sua separação e detecção cromatográfica [274]. Adicionalmente, a derivatização pode
também melhorar a forma do pico cromatográfico através da redução da cauda (tailing),
aumentar a sensibilidade e selectividade e melhorar a resolução dos compostos [273].
De facto, em GC, a transformação de uma amina na amida correspondente mediante
derivatização apresenta várias vantagens. Os derivados obtidos são menos polares do que os
compostos iniciais e a substituição dos hidrogénios activos da função amina reduz a tendência
para formar pontes de hidrogénio [273], consequentemente, o respectivo comportamento
cromatográfico é melhorado [275]. No caso particular da análise de aminas por GC, a prática
da derivatização encontra-se documentada na bibliografia, sendo muitos e de vários tipos os
reagentes derivatizantes que já foram propostos para o efeito, onde as reacções de alquilação,
formação de carbamatos, acilação e sililação assumem particular importância, embora as duas
últimas sejam as mais usuais [273,275-277].
Assim, foram avaliadas três tipos de reacções de derivatização, a sililação, a acilação e a
formação de carbamatos, e sete reagentes de derivatização, MSTFA:TMCS (95:5), MBDSTFA,
MSHFBA, MSTFA/MBTFA, MBTFA, PFPA/PFPOH e py/cloroformato de benzoílo.
Os derivados silil são amplamente utilizados em GC e usualmente são formados através da
substituição dos hidrogénios activos com o grupo trimetilsilil. No entanto, os reagentes
Resultados e discussão
59
sililação e derivados trimetilsilil são hidroliticamente instáveis e devem ser protegidos da
humidade [277], o que pode constituir um problema no STF, dado o elevado número de
amostras que processa simultaneamente, o que prolonga o tempo que decorre desde a
derivatização até à injecção no sistema cromatográfico e onde, por vezes, é necessário
proceder à re-injecção dos extractos. No decorrer da experiência levada a cabo com os
reagentes MSTFA:TMCS, MBDSTFA e MSHFBA verificou-se que estes seriam ineficazes
para os fins proposto, pois estes originavam derivados mono e di-substituídos para a efedrina,
para além da reacção não ser completa, uma vez observar-se picos referentes à efedrina não
derivatizada.
A acilação é uma das mais populares derivatizações para aminas primárias e secundárias. De
facto, os derivados de acilo, por análise por GC-MS, tendem a originar mecanismos de
fragmentação capazes de fornecer informação estrutural bastante útil. No entanto, um dos
factores que leva à sua utilização intensiva torna-se também uma desvantagem: a sua elevada
reactividade. Esta característica é responsável por diversos problemas quando o excesso de
reagente é introduzido no sistema cromatográfico juntamente com os analitos derivatizados,
pois alguns deles provocam danos irreversíveis na fase estacionária das colunas
cromatográficas usadas [276,277]. Foram testados dois reagentes de acilação, o MBTFA e o
PFPA/PFPOH. O primeiro é utilizado no STF aquando da confirmação e quantificação de
anfetaminas no sangue por GC-MS. De facto, a reacção de acilação dos ATS com o MBTFA
satisfez os critérios estabelecidos para a formação de derivatizados: realizou a modificação
desejada e observou-se a formação de um único derivatizado para todos os compostos,
excepto para a efedrina, onde se constatou a formação de dois derivados; além disso, foi
rápida, e reprodutível [279-280]. Mais, o MBTFA é um potente reagente de derivatização e o
seu excesso não necessita de ser removido, possibilitando a sua injecção no sistema
cromatográfico [271,277]. A reacção levada a cabo com PFPA/PFPOH, apesar de ser
referenciada na bibliografia para a derivatização de anfetaminas [278] não se mostrou
satisfatória, pois o cromatograma apresentava bastantes interferências, não tendo sido possível
identificar os compostos em estudo.
Foi igualmente testada uma reacção de sililação seguida de uma acilação, utilizando o reagente
MSTFA seguido de MBTFA, com o objectivo de evitar a formação de dois compostos na
reacção de derivatização da efedrina, mediante a formação selectiva de derivados N-TFA-O-
TMS [277]. No entanto, o objectivo não foi alcançado e constatou-se a formação de dois
compostos na reacção de derivatização deste ATS.
Resultados e discussão o
60
Finalmente, testou-se a reacção de formação de carbamatos. Hughes et al. [281] utilizaram este
tipo de derivatização na análise de anfetamina e metanfetamina, apesar de não ser a
derivatização mais comum para este tipo de compostos. Neste tipo de reacção é adicionado
um grupo alquilo ao átomo de azoto da amina e a principal vantagem desta derivatização é o
facto de se poder levar a cabo em meio aquoso, o que permite derivatização in situ em
amostras biológicas. No entanto, o cromatograma obtido apresentava muitos interferentes,
inúmeros picos cromatográficos, alguns bastante largos, pelo que não se detectaram os
analitos alvo. Adicionalmente, verificou-se, mediante observação da alteração dos tR, que as
sucessivas injecções de extractos derivatizados com este reagente provocavam alterações na
coluna cromatográfica, danificando-a. Pelo exposto, a escolha do reagente de derivatização
recaiu no MBTFA.
5.3. VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE ATS POR SPE/GC-MS
5.3.1. AVALIAÇÃO DA SELECTIVIDADE
Um método instrumental de análise que produz uma resposta para uma única substância é
designado como específico (ex. métodos espectrométricos), já um método que produz várias
respostas para diversos compostos químicos, mas que consegue distinguir a resposta de um
analito de todas as outras respostas, é designado como selectivo (ex. métodos
cromatográficos) [235,282]. Assim, na presente dissertação, será utilizado o termo
selectividade.
Pode descrever-se a selectividade de um método analítico como sendo a sua aptidão para
discriminar inequivocamente as substâncias de interesse, mesmo quando estão presentes
outros constituintes ou analitos numa matriz complexa [10,213,235,252,282]. Não se encontra
descrito na literatura uma metodologia pré-estabelecida para o estudo da selectividade de um
método analítico. Uma forma relativamente simples de avaliar este parâmetro passa por
comprovar a inexistência de sinais analíticos que possam interferir com os sinais analíticos dos
compostos de interesse em amostras brancas e, desta forma, prejudicar a identificação dos
analitos (no mínimo, 6 amostras brancas de diferentes origens) [235,237]. No entanto, subsiste
uma elevada probabilidade de que interferências relativamente raras provocadas por outras
substâncias ou constituintes da matriz não sejam detectadas por via desta metodologia [226],
tal como referenciado por Gonçalves et al. aquando de um falso resultado negativo de
benzoilecgonina devido a interferência de nordiazepam [283].
Resultados e discussão
61
Assim, afigura-se mais representativo da realidade uma outra forma de avaliar a selectividade,
que consiste em fortificar amostras brancas com o analito em concentrações próximas dos
limiares analíticos, avaliando-se então os resultados obtidos, mediante critérios previamente
definidos [282,284]. Além disso, no presente trabalho, optou-se pela utilização de pools de
sangue ao invés de amostras unitárias, aumentando consideravelmente a heterogeneidade das
amostras [248], simulando as situações possíveis de encontrar em rotina no STF. A
identificação inequívoca do analito na amostra é então realizada mediante a confirmação dos
quatro critérios de confirmação. Assim, segundo os referidos critérios, foram consideradas
negativas as alíquotas de pools de sangue às quais os ATS não foram adicionados, sendo
consideradas positivas aquelas cujas alíquotas foram fortificadas. Neste sentido, a selectividade
do método foi demonstrada, com a ausência de falsos resultados positivos ou negativos.
Surge ainda uma nova abordagem na forma de avaliar a selectividade: sugere-se que amostras
brancas sejam fortificadas simultaneamente com os analitos em estudo e com outros
compostos passíveis de ser encontradas em rotina, em concentrações elevadas, avaliando-se
então se os resultados assim obtidos são ou não aceitáveis. Para este efeito, a presença de um
interferente é considerada inaceitável quando afecta a capacidade de identificação e/ou a
exactidão da quantificação do analito [226,284,285]. Assim, cinco pools, seleccionadas
aleatoriamente, foram fortificadas com cinquenta e dois compostos diferentes que pudessem
interferir com a análise dos ATS (vide Anexo). Segundo os resultados obtidos, não se
observam interferências significativas, apesar das elevadas concentrações dos compostos
adicionados, tendo sido cumpridos os critérios já mencionados.
Na figura 5.2 apresentam-se, a título de exemplo para os compostos 2C-T-2-N-TFA e 2C-T-
7-N-TFA, dois cromatogramas referentes à análise de uma alíquota de uma pool de sangue
branca fortificada com os ATS e PI (200 ng/mL), e uma segunda alíquota, da mesma pool,
fortificada com os ATS e PI (200 ng/mL) e os cinquenta e dois compostos referidos (vide
tabela, Anexo A).
Resultados e discussão o
62
(a) (b)
Figura 5.2 - Cromatogramas obtidos por SPE/GC-MS: alíquota de pool de sangue branco fortificada com o PI
(200 ng/mL) e os ATS (200 ng/mL) (a); alíquota da mesma pool de sangue após fortificação a
200 ng/mL com o PI e os ATS, e os cinquenta e dois compostos mencionados na tabela em Anexo (b).
Saliente-se que na Figura 5.4 é possível observar fragmentos iónicos característicos de outras
drogas de abuso (ex. 1-(3-clorofenil)piperazina, mCPP, e mescalina). Esta situação deve-se à
importância de metodologias para determinação simultânea de várias drogas de abuso, devido
ao fenómeno de policonsumo. Assim, foi desenvolvida uma MACRO onde figuram
anfetaminas e piperazinas, já validadas pelo STF, e ainda os ATS em estudo (vide Anexo I).
Considerando ainda que o procedimento de análise é idêntico para as anfetaminas, piperazinas
e ATS, uma só análise permite identificar cerca de 19 compostos diferentes, o que assume
particular importância em toxicologia forense, pela escassez de amostra disponível.
Observando a figura 5.2, parece não existir interferentes para os compostos 2C-T-2-N-TFA e
2C-T-7-N-TFA. Na figura 5.3, analisando o cromatograma referente à alíquota da pool
fortificada com o PI e os analitos alvo e comparando com a alíquota da mesma pool fortificada
apenas com o PI e os cinquenta e dois composto, verifica-se que, para o mesmo tR do analito
(2C-T-2-N-TFA e 2C-T-7-N-TFA), não se observam interferentes, apenas o ruído
instrumental.
Resultados e discussão
63
Figura 5.3 - Cromatogramas obtidos na segunda fase do estudo da selectividade do método analítico por
SPE/GC-MS: alíquota de pool de sangue branco fortificada com o PI (200 ng/mL) e os ATS (200 ng/mL) (a);
alíquota da mesma pool de sangue após fortificação com o PI (200ng/mL) e os cinquenta e dois compostos
mencionados na tabela em Anexo (b).
Quando se pretende confirmar qualitativamente e/ou quantificar um analito, e em particular
compostos relacionados com a anfetamina e metanfetamina, como é o caso dos ATS, em
matrizes complexas (ex. sangue) é difícil de evitar a presença de substâncias interferentes. No
entanto, a sua presença foi considerada aceitável, dado não interferir na confirmação
qualitativa dos ATS, de acordo com os critérios previamente estabelecidos. Para além dos
critérios adoptados da WADA [230], o STF, num método de confirmação qualitativa, exige
que a percentagem de falsos resultados positivos e de falsos resultados negativos seja,
respectivamente, de 0% e igual ou inferior a 10%. Tendo em conta que não se detectaram
falsos resultados positivos ou negativos, nem foram observadas interferências no tR e
fragmentos iónicos monitorizados, considera-se que o método desenvolvido é selectivo.
5.3.2. LIMITES ANALÍTICOS: LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO
O LOD de um método analítico define-se como a quantidade mínima de analito alvo que
pode ser detectada, o que não significa que possa ser quantificada de modo exacto. Já o LOQ
refere-se à quantidade mínima do analito alvo que pode ser quantificada com precisão e
exactidão consideradas adequadas [10,213,235,247,252,282].
Resultados e discussão o
64
A abordagem a seguir na determinação destes limites não reúne consenso, pois existem várias
metodologias para a sua determinação: avaliação visual [224,235, 241,247,252,282], razão S/N
[224,235,241,247,252,282] ou baseada em parâmetros da curva de calibração
[224,235,241,247,282,252]. O primeiro método baseia-se na adição de concentrações
crescentes de analito à matriz, para que seja possível distinguir o sinal analítico, estabelecendo-
se assim o LOD e LOQ através da menor quantidade que é possível detectar e quantificar,
respectivamente. O segundo método, aplicado a métodos analíticos onde se observe ruído da
linha de base (ex. técnicas cromatográficas), consiste na análise da razão S/N. Para tal,
comparam-se os sinais de amostras brancas com os sinais de amostras com concentrações
baixas do analito. Regra geral, estabeleceu-se que as razões S/N devem ser pelo menos iguais a
3 e 10, respectivamente no LOD e LOQ [224,235,241,282,252]. No entanto, este
procedimento apresenta algumas limitações em toxicologia forense, devido à complexidade
das matrizes utilizadas [10]. Os métodos anteriormente descritos são muito utilizados pela sua
rapidez, contudo o facto de se basearem em parâmetros qualitativos surge como uma
desvantagem [241]. Assim, neste trabalho, optou-se pelo cálculo dos limiares analíticos assente
em parâmetros da curva de calibração (erro padrão, Sy/x, e declive), dado que apresenta maior
fiabilidade estatística, pois considera o intervalo de confiança da regressão [10,241]. O LOD e
LOQ são então definidos como a concentração mínima de uma substância que pode ser
detectada e quantificada, respectivamente, com um determinado grau de confiança (em regra,
99% ou 95%) [241]. No entanto, este método tem sido menos utilizado que os dois métodos
anteriores devido à maior complexidade de cálculos necessários. Note-se que este método
pode conduzir a valores irrealistas caso não se verifique homogeneidade de variâncias e
linearidade até à origem, bem como a concentrações sobrestimadas, caso a curva de calibração
abranja toda a gama de trabalho [10]. Diversos autores [252, 285] apontam outra metodologia
para determinar o LOQ, baseada nos valores de precisão e exactidão. Esta é, provavelmente, a
abordagem mais prática e serve-se da própria definição de LOQ para determinar este
parâmetro, isto é, o LOQ é a menor concentração de analito que pode ser quantificado com
precisão e exactidão aceitáveis (≤ 20%) [252]. Independentemente do método de
determinação utilizado, os limites estimados devem ser realistas. Esta é a razão pela qual,
através da fortificação de amostras brancas com o analito na concentração obtida para o LOQ,
se deve comprovar que os resultados assim obtidos apresentam precisão e exactidão
consideradas aceitáveis (± 20%) [10].
Sendo assim, determinaram-se os limiares analíticos para os ATS em estudo, em três gamas de
trabalho distintas, 2-25 ng/mL, 2-50 ng/mL e 5-500 ng/mL utilizando parâmetros da curva
Resultados e discussão
65
de calibração, o desvio-padrão residual e o declive da curva (vide Anexo D). O facto de se ter
optado por estudar os limites analíticos em três gamas de trabalho deve-se ao facto destes
valores não serem estáticos, o seu cálculo por recurso a diferentes curvas de calibração e
intervalos de concentrações permitirá então obter limites analíticos distintos [10], pelo que será
interessante constatar essa oscilação. O resumo dos resultados obtidos encontra-se na tabela
5.2.
Tabela 5.2 – Resultados obtidos no estudo do LOD e LOQ em três gamas de trabalho.
Compostos
LOD LOQ
2-20
ng/mL
2-50
ng/mL
5-500
ng/mL
2-20
ng/mL
2-50
ng/mL
5-500
ng/mL
2C-T-2-N-TFA 1,83 5,57 15,18 5,56 16,88 46,00 2C-T-7-N-TFA 1,33 5,21 5,68 4,03 15,73 17,22 PMA-N-TFA 1,19 4,70 4,48 3,60 14,23 13,57
PMMA-N-TFA 2,69 3,09 11,20 8,15 9,36 33,95 Efedrina-N,O-TFA 1,41 4,54 156,61 4,28 13,77 474,61 Norefedrina-N-TFA 0,80 3,08 10,38 2,41 9,32 31,47 Metcatinona-N-TFA 2,18 5,55 9,94 6,60 16,81 30,13
Tal como se pode observar, os limites analíticos baixam com a diminuição da gama de
trabalho, em conformidade com a literatura [10], que refere que no seu cálculo não devem ser
utilizados os dados obtidos de curvas de calibração estabelecidas para toda a gama de trabalho,
pois obter-se-iam concentrações de LOD e LOQ superiores às que o método é efectivamente
capaz de atingir [10,252]. Segundo a metodologia baseada em parâmetros da recta de
calibração ter-se-iam LOQ de 2,41 a 8,15 ng/mL. Contudo, alguns autores [252,285]
defendem que a metodologia mais prática para a determinação do LQ deve ser baseada nos
valores de precisão e exactidão (≤ 20%). Assim, optou-se pela utilização dessa metodologia,
uma vez fornecer maior fiabilidade nos resultados. De acordo com os resultados obtidos
aquando do estudo da precisão (vide ponto 5.3.5) é legítimo afirmar que o método analítico
desenvolvido tem um LOQ de 5 ng/mL para todos os ATS em estudo, pelo que a
quantificação destes compostos abaixo deste valor não é aceitável, assim sendo este será o
calibrador mais baixo da curva de calibração [282].
Apesar de não ser necessário a determinação do LOD em métodos quantitativos [226], este
parâmetro foi determinado. Assim, mais uma vez, por utilização dos parâmetros da recta de
calibração, obtêm-se LOD de 0,28 a 2,69 ng/mL, embora o método visual permita obter
Resultados e discussão o
66
LOD de 1 ng/mL para todos os ATS em estudo. Assim, fixou-se o LOD de 1 ng/mL para os
ATS.
Na literatura não se encontram métodos validados para a quantificação dos compostos da
série 2C na matriz sangue total. Boatto et al., para matriz plasma humano, validou uma
metodologia para a extracção de vários compostos da série 2C por meio de LLE/CE-MS,
tendo alcançado LOD entre 11,3 e 23,0 ng/mL e LOQ entre 27,3 e 43,0 ng/mL [183].
Wohlfarth et al. [11] em soro humano obteve LOD de 1 ng/mL para estes compostos,
mediante SPE/LC-MS/MS. Kerrigan et al. [26] em urina obteve LOD entre 2-10 ng/mL e
LOQ de 10 ng/mL para estes compostos, por SPE/GC-MS. Kudo et al. [13], também por
SPE/GC-MS, obteve em sangue total LOD de 50 ng/mL para o PMMA e 7 ng/mL para o
PMA, valores francamente superiores aos obtidos no presente trabalho. Mortier et al. [82]
obteve LOD entre 2,5-5 ng/mL e LOQ de 10 ng/mL para os compostos analisados, entre os
quais PMA. Sørensen [196], por LC-MS/MS, obteve LOD de 2,7 ng/mL para a norefedrina,
2,5 ng/mL para a efedrina e 2,1 ng/mL para a metcatinona, em amostras de sangue total.
Fernández et al. [12] para os compostos estudados obtiveram LOQ entre 2,5-25 ng/mL, entre
os quais o PMA e efedrina.
5.3.3. LINEARIDADE
A linearidade de um método analítico define-se como a capacidade deste para obter respostas
analíticas (variável dependente) directamente proporcionais às concentrações de analito
(variável independente) adicionadas à matriz, obtendo-se então uma curva ou recta de
calibração [235,241,253,282]. Geralmente, a regressão linear é a abordagem mais adoptada,
surgindo daí a designação de recta de calibração. No entanto, existem situações cuja resposta
analítica não obedece a uma calibração linear.
Inicialmente, assumiu-se que os resultados obtidos obedeciam a um modelo de regressão
linear simples. Deste modo, a avaliação da linearidade foi efectuada com recurso a
funcionalidades do Excel e na figura J.1 (vide Anexo J), encontra-se exemplificado para o
composto 2C-T-2-N-TFA o tratamento de resultados efectuado. Na tabela 5.3 encontram-se
resumidos os resultados obtidos no estudo do modelo de regressão linear simples.
Resultados e discussão
67
Tabela 5.3 – Resumo dos resultados obtidos referentes ao modelo de regressão linear simples para os ATS em
estudo.
Composto Ião
(m/z) Equação da recta R2 Sy/x
Intervalo de intercepção da
ordenada na origem
95% inferior 95% superior
2C-T-2-N-TFA 337 y = 0,0011x - 0,0015 0,9989 0,0069 -0,0079 0,0050
2C-T-7-N-TFA 351 y = 0,0012x - 0,0036 0,9993 0,0062 -0,0095 0,0022
PMA-N-TFA 261 y = 0,0005x - 0,0028 0,9983 0,0038 -0,0063 0,0007
PMMA-N-TFA 154 y = 0,0018x + 0,0076 0,9939 0,0258 -0,0319 0,0166
Efedrina-N,O-TFA 244 y = 0,0003x - 5,9×10-5 0,9979 0,0028 -0,0027 0,0026
Norefedrina-N-TFA 230 y = 0,0017x - 0,0075 0,9947 0,0236 -0,0296 0,0147
Metcatinona-N-TFA 154 y = 0,0013x - 0,0149 0,9637 0,0449 -0,0561 0,0263
Assim, a linearidade foi comprovada no intervalo de 5 a 500, ng/mL, através da análise dos
coeficientes de correlação e de determinação (r>0,99 e R2 >0,99) para todos os ATS, excepto
para a metcatinona. Verificou-se igualmente que para todos os ATS as curvas de calibração
obtidas passam pela origem. Mais ainda, a observação visual da distribuição dos resíduos não
evidenciou tendências. Note-se que para todos os ATS, exceptuando a metcatinona, foi
necessário excluir um valor aberrante3.
No entanto, a confirmação da linearidade do método analítico não deve assentar unicamente
nos parâmetros obtidos na regressão linear, ou na representação gráfica da sua função ou
ainda na distribuição dos resíduos ao longo dos valores de concentração [241,252]. Por
conseguinte, utilizou-se também o teste de Mandel na avaliação da linearidade [245], pois
pretendia-se comparar qual dos modelos de regressão, linear ou não linear (quadrática) se
ajustaria melhor aos pontos de calibração (vide Anexo B). Na tabela 5.4 encontram-se os
valores de de Fcal, calculados de acordo com as expressões em anexo (vide anexo) e depois
comparados com os valores tabelados da distribuição F de Snedecor (Fcrit). Os resultados
obtidos comprovam que, no intervalo de concentrações seleccionado, entre 5 e 500 ng/mL, o
modelo de regressão linear parece ser o que melhor se ajusta aos pontos da curva de calibração
para todos os ATS em estudo.
3 Valor aberrante é aquele cujo valor de resíduo é superior, em módulo, ao dobro do desvio-padrão residual obtido para a curva de calibração (Sy/x).
Resultados e discussão o
68
Tabela 5.4 – Resumo dos resultados obtidos no teste de Mandel para os ATS em estudo.
Composto Teste de Mandel (Fcal) Critério de decisão
Fcal ≤ Fcrit (N-1; N-1; 0,95)
2C-T-2-N-TFA 6,77×10-8 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95)
2C-T-7-N-TFA 1,17×10-4 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95)
PMA-N-TFA 2,25×10-3 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95
PMMA-N-TFA 1,69×10-2 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95
Efedrina-N,O-TFA 3,06×10-5 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95)
Norefedrina-N-TFA 1,73×10-3 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95)
Metcatinona-N-TFA 1,51×10-2 Fcal ≤ 2.82 F(11; 11; 0,95)
5.3.4. GAMA DE TRABALHO
Nos métodos instrumentais de análise é comum a utilização de modelos de regressão linear
simples. Neste caso, parte-se do pressuposto de que o modelo é homocedástico, isto é,
presume-se que as concentrações de analito adicionadas à matriz estão isentas de erros e que
os resíduos (diferença entre o valor obtido e o valor estimado por interpolação na curva de
calibração) são independentes, apresentam uma distribuição Normal e a mesma variância no
intervalo de concentrações estudado [240-241].
Este pressuposto, em contexto forense, raramente se verifica. A variância, ao longo da gama
de trabalho, não é constante. Assim, é importante verificar se existem diferenças estaticamente
significativas entre variâncias num modelo de regressão linear através da aplicação do teste de
homogeneidade de variâncias (teste F) e da análise gráfica da distribuição dos resíduos em
função das concentrações adicionadas à matriz [240-241].
Desta forma, o teste de homogeneidade de variâncias (vide Anexo C) permitiu verificar se de
facto existiam diferenças estatisticamente significativas entre as variâncias nos extremos do
intervalo de concentrações seleccionado, entre 5-500 ng/mL. Na tabela 5.5 apresentam-se os
resultados obtidos após aplicação do teste F (Fcal) e respectiva comparação com o valor
tabelado (Fcrit).
Resultados e discussão
69
Tabela 5.5 - Resumo dos resultados obtidos no teste de homogeneidade de variâncias.
Composto Teste de homogeneidade de
variâncias (Fcal)
Critério de decisão
Fcal ≤ Fcrit (9; 9; 0,95)
2C-T-2-N-TFA 3633,8
Fcal ≤ 3,18 F(9; 9; 0,95)
2C-T-7-N-TFA 5120,5
PMA-N-TFA 3482,5
PMMA-N-TFA 2316,4
Efedrina-N,O-TFA 2108,8
Norefedrina-N-TFA 4361,8
Metcatinona-N-TFA 23366,3
Tal como se pode observar na tabela 5.5, os valores de Fcal foram superiores aos de Fcrit para
todos os ATS, pelo que se depreende que existem diferenças estatisticamente significativas
entre as variâncias nos extremos da gama de trabalho. Trata-se, portanto, de um modelo
heterocedástico [240-241].
5.3.4.1. REGRESSÃO LINEAR PONDERADA
Diante de heterocedasticidade torna-se necessário diminuir a gama de trabalho até que o
contrário se verifique ou escolher um modelo de regressão mais apropriado. O modelo mais
adequado seria então aquele em que o factor de ponderação fosse o inverso da variância,
contudo é inexequível, exigiria vários replicados por calibrador e tendo em conta que sempre
que o método analítico é aplicado é necessário efectuar uma curva de calibração e três
amostras controlo (estas em duplicado ou triplicado), além das amostras a quantificar (também
elas em duplicado), o tempo dispendido na sua execução e os custos associados seriam
elevados. Portanto, recorreu-se à aplicação de factores de ponderação empíricos, tais como:
; ;
√ ;
;
;
√ [240,288].
A estimativa do erro relativo percentual (ER%), o qual compara a concentração obtida através
da equação resultante da regressão, com a concentração teórica do analito permitiu seleccionar
o factor de ponderação mais adequado. Este seria o que permitisse obter o menor valor no
somatório de todos os valores de ER% na gama de trabalho (ΣER%) e cuja representação
gráfica dos seus valores em função da concentração dos ATS evidenciasse que estes se
encontravam distribuídos aleatoriamente e numa faixa horizontal estreita. Quanto mais
Resultados e discussão o
70
diminuta fosse essa faixa melhor se adequaria [240,285,288]. Adicionalmente, exigia-se que as
curvas de calibração apresentassem um R2 ≥ 0,99.
Seleccionaram-se os seis factores de ponderação empíricos já mencionados e compararam-se
os resultados obtidos nos modelos de regressão ponderada com os obtidos no modelo de
regressão linear simples. Utilizou-se, neste estudo, o software Minitab®, versão 16 e os valores
de ΣER% e ER% foram estimados de acordo com as equações no Anexo D.
Na figura 5.4 representam-se os valores de ER% em função das concentrações, para o modelo
de regressão linear simples (Modelo 1) e para os modelos de regressão linear ponderada
(Modelos 2-7).
Figura 5.4 – Distribuição do erro relativo percentual (ER%) em função das concentrações de 2C-T-2-N-TFA obtida para o Modelo 1 (wi=1), Modelo 2 (wi=1/√x), Modelo 3 (wi=1/x), Modelo 4 (wi=1/x2), Modelo 5 (wi= 1/√y), Modelo 6 (wi=1/y) e Modelo 7 (wi=1/y2).
-500
0
500
1000
1500
0 200 400 600
ER
%
Concentração (ng/mL)
Modelo 1
-50
0
50
100
0 200 400
ER
%
Concentração (ng/mL)
Modelo 2
-40
-20
0
20
40
0 100 200 300 400 500ER
%
Concentração (ng/mL)
Modelo 3
-30
-20
-10
0
10
20
0 200 400
ER
%
Concentração (ng/mL)
Modelo 4
-50
0
50
0 200 400
ER
%
Concentração (ng/mL)
Modelo 5
-40
-20
0
20
40
0 100 200 300 400 500ER
%
Concentração (ng/mL)
Modelo 6
-30
-20
-10
0
10
20
0 100 200 300 400 500
ER
%
Concentração (ng/mL)
Modelo 7
Resultados e discussão
71
Com o Modelo 1 nas concentrações mais baixas, próximas do limite inferior da curva de
calibração, obtiveram-se valores sobrestimados. Já os Modelos 3, 4, 6 e 7 apresentam melhores
resultados nessas concentrações.
Baseado na minimização do somatório de ER%, encontram-se na Tabela 5.6 os resultados
obtidos referentes ao 2C-T-2-N-TFA, onde se observa que os Modelos 3 e 6 parecem ser os
mais adequados dado que apresentam um menor valor de ∑ER%, 325,70 e 309,40,
respectivamente. Considerando que ao Modelo 3 (wi=1/x) está associado o valor de R2 mais
elevado, e também de acordo com a figura 5.6, este foi o factor de ponderação seleccionado.
Pelos mesmos motivos, o mesmo modelo foi eleito para os restantes ATS em estudo.
Tabela 5.6 – Erros relativos (ER%) por recurso à regressão linear simples e ponderada para cada factor de
ponderação empírico, referente ao 2C-T-2-N-TFA.
Concentração na amostra (ng/mL)
Modelo 1 Modelo 2 Modelo
3 Modelo
4 Modelo
5 Modelo
6 Modelo
7
1√
1
1
1
1
1
5 2378,18 319,53 93,73 16,85 298,05 82,50 14,55
10 1458,60 112,25 21,25 32,74 102,08 19,24 31,18 50 972,54 17,50 20,92 18,63 17,54 20,33 20,09 100 723,40 91,90 95,88 82,38 91,97 93,82 72,66 200 810,66 32,80 29,42 9,78 32,09 26,45 12,26 300 844,75 22,20 18,14 14,01 21,28 15,52 19,25 400 70,27 13,14 16,23 30,75 13,64 17,73 42,90 500 881,54 21,89 30,11 54,39 23,14 33,79 68,53
∑ER% 8139,95 631,20 325,70 259,53 599,78 309,40 281,43
R2 0,9942 0,9947 0,9937 0,9890 0,9945 0,9930 0,9869
5.3.5. PRECISÃO E EXACTIDÃO
Os resultados obtidos encontram-se sintetizados na tabela 5.7 e foram estimados utilizando as
expressões constantes no Anexo D e a análise de variância com um factor (ANOVA), no
Anexo E. Como se pode verificar na tabela, o método analítico desenvolvido não era
adequado à quantificação da metcatinona em amostras de sangue total, uma vez que os valores
de CV% referentes à precisão intermédia foram bastante elevados (iguais ou superiores a 20%
em toda a gama de trabalho). Estes valores podem ser atribuídos à falta de linearidade
demonstrada pela metcatinona. Nos restantes ATS os valores de CV% da precisão intermédia
e repetibilidade encontram-se dentro dos valores exigidos na literatura, ou seja, iguais ou
inferiores a 20% próximo do LOQ e 15% nas restantes concentrações [235,241,252]. Tendo
em conta que o valor de EMR (%) exprime a exactidão do método analítico, constata-se, por
observação da tabela 5.7, que os valores obtidos, se encontram dentro dos limites
Resultados e discussão o
72
considerados aceitáveis (± 20% próximo do LOQ e ± 15% nas restantes gamas de
concentração), com excepção para a efedrina, na gama de trabalho mais concentrada, onde se
obteve um valor ligeiramente superior (16,9%). Ainda assim, considerando que os valores de
ERM aceites no STF para todas as gamas de concentração é de ± 20% considerou-se que a
efedrina, ao nível mais elevado de concentração, cumpre os critérios estipulados de exactidão.
Adicionalmente, encontram-se na literatura situações similares, cujo processo de validação não
foi posto em causa [285].
Tabela 5.7 – Resumo dos resultados obtidos no estudo da precisão e exactidão do método, determinado para
três níveis de concentração (concentrações de ATS expressas em ng/mL e n=15).
Composto Concentração
real Repetibilidade
(CVR)
Precisão intermédia
(CVSI)
EMR (%)
Concentração estimada
2C-T-2-N-TFA
20 5,6 10,2 -15,4 16,9 84,6
250 3,9 11,2 -11,9 220,3 88,1
450 6,3 11,4 -2,4 439,4 97,6
2C-T-7-N-TFA
20 5,9 10,9 -5,6 18,9 94,4
250 4,2 9,2 -2,6 243,5 97,4
450 5,0 7,7 7,2 484,3 107,6
PMA-N-TFA
20 6,7 9,7 -11,5 17,7 88,5
250 5,5 8,0 -2,0 244,9 98,0
450 5,2 8,2 5,1 473,0 105,1
PMMA-N-TFA
20 4,9 13,2 1,1 20,26 101,3
250 4,9 11,2 -4,0 239,9 96,0
450 4,5 13,8 2,5 461,1 102,5
Efedrina-N,O-TFA
20 7,3 9,9 10,0 22,0 110,0
250 5,1 11,1 6,2 265,5 106,2
450 8,0 9,6 16,9 525,9 116,9
Norefedrina-N-TFA
20 6,5 7,4 -11,0 17,8 89,0
250 4,9 7,7 -6,6 233,4 93,4
450 5,0 8,0 -0,5 447,7 99,5
Metcatinona-N-TFA
20 7,1 31,9 -5,1 19,9 82,8
250 8,4 20,2 0,1 250,1 99,5
450 9,4 21,9 7,2 482,5 106,8
5.3.6. RECUPERAÇÃO DA FASE DE EXTRACÇÃO (EFICIÊNCIA DE EXTRACÇÃO)
A quantidade ou a percentagem de analito que é recuperada após aplicação do método
analítico à matriz que o contém, quando comparada com a quantidade que está efectivamente
presente na amostra, define-se como recuperação do método analítico [252,286]. Segundo
Resultados e discussão
73
Peters et al. [247,252], o valor de recuperação não é importante, desde que os dados referentes
aos limiares analíticos, precisão e exactidão sejam aceitáveis.
A avaliação da recuperação absoluta do método não pôde ser efectuada, apenas a sua
eficiência de extracção foi estudada [252]. Assim, a recuperação, em percentagem, pode ser
descrita pela equação D.7 (vide Anexo D). No estudo da eficiência de extracção é importante
ter em conta que o analito adicionado não está, necessariamente, na sua forma nativa
[235,282], sendo também importante referir que a eficiência extractiva varia em função da
concentração do analito [235]. Deste modo, a eficiência extractiva foi avaliada em três gamas
de concentração: nas gamas baixa, média e alta.
Na Tabela 5.8 encontram-se os valores de recuperação médios, a três níveis de concentração,
em percentagem (%), da fase de extracção por SPE para os ATS em estudo. Note-se que,
apesar de as recomendações incidirem sobre valores de recuperação próximos de 100%
podem ser aceites valores abaixo deste valor, desde que apresentem precisão e exactidão
adequadas [282]. Aliás, segundo Ribani et al. [235] os intervalos aceitáveis para valores de
recuperação situam-se entre 70 e 120%, com desvio padrão relativo até 20%, exceptuando
situações em que a complexidade da matriz justifique intervalos de 20 a 120%, com desvio
padrão relativo até 15%. Adicionalmente, o critério interno do STF para a aceitação dos
resultados obtidos na avaliação da recuperação indica que esta se deve encontrar entre 40-
120%.
A eficiência de extracção mostrou-se muito satisfatória, entre 87,1% e 103,4%. E tal como
referido anteriormente, observam-se ligeiras flutuações nos valores obtidos para a recuperação
do método, ao variar a gama de concentrações. Note-se que para a metcatinona este
parâmetro não foi determinado uma vez este composto não verificar os critérios estabelecidos
aquando do estudo da precisão.
Resultados e discussão o
74
Tabela 5.8 - Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos compostos em
estudo, calculada para três níveis de concentração.
ATS Recuperação média ± cv (%)
500 ng/mL 100 ng/mL 50 ng/mL
2C-T-2-N-TFA 91,2 ± 7,5 97,3 ± 9,0 100,3 ± 7,6
2C-T-7-N-TFA 87,1± 8,3 95,8 ± 9,9 88,6 ± 3,8
PMA-N-TFA 103,4 ± 8,2 102,9 ± 6,2 101,6 ± 6,2
PMMA-N-TFA 100,1 ± 1,2 99,6 ± 1,1 99,5 ± 2,1
Efedrina-N,O-TFA 95,2 ± 9,9 98,9 ± 3,5 104,8 ± 9,4
Norefedrina-N-TFA 91,9 ± 8,6 92,5 ± 5,5 93,4 ± 9,4
Metcatinona-N-TFA --- --- ---
5.3.7. PRESENÇA DE ARRASTAMENTO (CARRY OVER)
A análise em série de diversas amostras pode arrastar um analito que esteja presente em
concentração elevada numa amostra para outras amostras analisadas posteriormente
(fenómeno de arrastamento ou carry over). O carry over pode, portanto, ser definido como um
aumento de concentração numa amostra, proveniente de vestígios de amostras anteriores,
possivelmente existentes no injector, liner, coluna e/ou detector [287]. Assim, este fenómeno
pode originar sérios problemas, caso não seja detectado, influenciando a exactidão e precisão
do método analítico, especialmente nas gamas de concentração mais baixas e até originar um
falso resultado positivo. Consequentemente, este parâmetro deve ser investigado e
minimizado durante a validação do método analítico, bem como reavaliado periodicamente.
O arrastamento foi avaliado conforme a metodologia mencionada no ponto 4.10.8.
Observando os resultados obtidos (vide Anexo K) constata-se que para o PMA e efedrina não
se observam fenómenos de arrastamento. Nos compostos 2C-T-2, 2C-T-7 e PMMA o
fenómeno de arrastamento embora observável é pouco evidenciado. Já a norefedrina é o
composto que mais sofre fenómenos de arrastamento, mesmo quando a amostra analisada
anteriormente apresenta concentrações baixas deste composto (300 ng/mL), e após três
injecções de amostra branca a sua presença é ainda detectada (2,69% de área cromatográfica
em relação à área cromatográfica da amostra fortificada).
Considerando os resultados obtidos e não perdendo de vista que o método analítico
desenvolvido irá ser utilizado em rotina no STF deverá ter-se presente que os ATS em estudo
são susceptíveis de sofrerem fenómenos de arrastamento. Assim, numa sequência analítica
onde várias amostras distintas são analisadas, e por vezes com concentrações de ATS muito
Resultados e discussão
75
elevadas, devem introduzir-se injecções de lavagem, entre amostras, na sequência, a fim de
evitar possíveis fenómenos de arrastamento entre amostras.
5.3.8. ROBUSTEZ
Na avaliação da robustez de um método analítico pretende-se demonstrar que os resultados
analíticos se mantêm inalteráveis mesmo quando ocorrem pequenas modificações
experimentais [235,241,282].
Segundo Peters e Maurer [252], uma validação completa não deve necessariamente incluir a
avaliação de robustez, embora possa ser muito útil durante a fase de desenvolvimento do
método, permitindo detectar problemas que podem ocorrer durante a validação. No entanto, a
avaliação deste parâmetro deve ser efectuada durante a validação, em particular, se se
pretender que o método seja utilizado noutro equipamento (ex. CG-MS) ou laboratório, ou
executado por outro operador [235-236,252]. Outros autores [226] incluem a avaliação da
robustez no estudo da precisão do método, pelo que também foi esta última a metodologia
adoptada para avaliar este parâmetro.
Assim, mesmo com a mudança de analistas, soluções e lotes de colunas cromatográficas
aquando do estudo da precisão intermédia, o método desenvolvido para a identificação dos
ATS por SPE/GC-MS mostrou-se robusto e a sua capacidade para confirmar qualitativamente
todos os analitos em estudo não foi afectada ao longo deste estudo. O método mostrou-se
robusto para a quantificação de todos os ATS em estudo, excepto a metcatinona, cujos
critérios de aceitação definidos para o estudo da linearidade e precisão não foram cumpridos.
Note-se que Sørensen [196] também referiu que as catinonas (ex. metcatinona) são instáveis
em sangue total, embora a estabilidade possa ser incrementada através da acidificação da
matriz. Apesar de ter sido levada a cabo a acidificação da matriz aquando do pré-tratamento
das amostras, a instabilidade deste composto manteve-se.
5.4. METODOLOGIA ALTERNATIVA PARA ANÁLISE DE ATS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
ESTUDOS PRELIMINARES
Tal como foi referido anteriormente, a etapa de preparação de amostra é vital no processo
analítico. A escolha do modo de preparação de amostras depende principalmente da natureza
dos analitos (ex. volatilidade ou polaridade), da natureza da matriz e dos níveis de
concentração que se pretendem detectar [21]. Assim, a SPE tem sido o método de eleição para
preparação de amostras biológicas. Contudo, esta técnica pode apresentar desvantagens,
Resultados e discussão o
76
nomeadamente, o elevado consumo de solventes orgânicos, entre outras. Já as técnicas de
micro-extracção têm sido vastamente aplicadas na última década apresentando, no entanto,
diversas limitações. A SPME, por exemplo, permite a extracção de compostos numa vasta
gama de polaridades, contudo a quantidade de material polimérico é reduzida, pelo que a
eficiência de extracção de analitos ao nível vestigial em matrizes complexas pode ser
drasticamente limitada. A SBSE veio colmatar esta limitação, embora apresente limitações na
extracção de compostos polares, como os ATS em estudo [21]. Deste modo, é almejado, do
ponto de vista analítico, o desenvolvimento de novas técnicas de preparação de amostras
adequadas a volumes reduzidos de amostra, em concordância com os princípios da Química
Verde e indicadas para compostos polares.
Considerando que os ATS em estudo são polares, com log KO/W compreendidos entre 0,83 e
3,08 e que Nogueira e colaboradores [156-158,160-161] têm vindo a debruçar-se sobre a
temática de extracção de compostos polares, para as quais as técnicas convencionais não dão
uma resposta eficaz sem recurso a derivatização, optou-se por aplicar as mais recentes técnicas
proposta por este autor, nomeadamente, BAµE, na extracção dos ATS.
5.4.1. ESCOLHA DO MATERIAL ADSORVENTE
Dos vários materiais adsorventes testados (PU, PDMS, AC, enchimento das colunas MCX e
StrataTM-X) pretendia-se seleccionar o que respondesse de forma mais eficaz à extracção dos
ATS em estudo. A escassez de padrões dos ATS limitou a quantidade de ensaios disponíveis.
Compararam-se então as áreas cromatográficas obtidas nos extractos derivatizados obtidos
por BAµE-LD/GC-MS para cada um dos nove materiais. Desta forma, a escolha do material
adsorvente recaiu no que originou maior área dos picos cromatográficos dos ATS. Os
resultados obtidos apresentam-se na figura 5.5.
Figura 5.5 - Áreas cromatográficas obtidas por injecção em GC
SBSE(PDMS e PU) e BAµE(AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, MCX, Strata
Tal como previsto, por meio da técnica SBSE não se alcançam v
cromatográficas dos picos relativos aos ATS [21], quando comparados com outros materiais
adsorventes, como os ACs. Esta situação deve
qual estes não têm afinidade para com o material
Como se pode constatar na figura 5.5, os materiais que proporcionaram as maiores áreas
cromatográficas foram carvões activados, nomeadamente, o AC 2, AC 3 e AC 4. Analisando
os resultados obtidos optou
resultados para os compostos 2C
quais ainda existe pouca informação e metodologia analítica disponível. Tal como foi referido
anteriormente, os ACs possuem capacidades a
área externa, estrutura microporosa, elevada capacidade de adsorção e elevado grau de
reactividade superficial [175-
este tipo de material.
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2CT2
Áre
a cr
om
ato
grá
fica
PDMS
Resultados e discussão
Áreas cromatográficas obtidas por injecção em GC-MS dos extractos derivatizados obtidos por
SBSE(PDMS e PU) e BAµE(AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, MCX, StrataTM-X).
Tal como previsto, por meio da técnica SBSE não se alcançam valores elevados nas áreas
cromatográficas dos picos relativos aos ATS [21], quando comparados com outros materiais
adsorventes, como os ACs. Esta situação deve-se às suas características polares, motivo pelo
qual estes não têm afinidade para com o material utilizado na SBSE(PDMS).
Como se pode constatar na figura 5.5, os materiais que proporcionaram as maiores áreas
cromatográficas foram carvões activados, nomeadamente, o AC 2, AC 3 e AC 4. Analisando
os resultados obtidos optou-se por seleccionar o AC 3, uma vez apresentar os melhores
resultados para os compostos 2C-T-2 e 2C-T-7, compostos relativamente recentes, sobre os
quais ainda existe pouca informação e metodologia analítica disponível. Tal como foi referido
anteriormente, os ACs possuem capacidades adsorventes únicas e versáteis devido à extensa
área externa, estrutura microporosa, elevada capacidade de adsorção e elevado grau de
-180], o que justifica a elevadas áreas cromatográficas obtidas com
2CT7 Efedrina Norefedrina PMA PMMA
PDMS PU Srata X AC 1 AC 2 AC 3 AC 4
Resultados e discussão
77
MS dos extractos derivatizados obtidos por
alores elevados nas áreas
cromatográficas dos picos relativos aos ATS [21], quando comparados com outros materiais
se às suas características polares, motivo pelo
utilizado na SBSE(PDMS).
Como se pode constatar na figura 5.5, os materiais que proporcionaram as maiores áreas
cromatográficas foram carvões activados, nomeadamente, o AC 2, AC 3 e AC 4. Analisando
ma vez apresentar os melhores
7, compostos relativamente recentes, sobre os
quais ainda existe pouca informação e metodologia analítica disponível. Tal como foi referido
dsorventes únicas e versáteis devido à extensa
área externa, estrutura microporosa, elevada capacidade de adsorção e elevado grau de
180], o que justifica a elevadas áreas cromatográficas obtidas com
PMMA Metcatinona
AC 5 MCX
Resultados e discussão o
78
5.4.2. OPTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS DE LC-MS/MS
Actualmente, o LC-MS/MS é considerada uma técnica de referência em toxicologia, devido
essencialmente à elevada selectividade da espectrometria de massa em tandem (MS/MS),
diminuindo deste modo possíveis interferências, pelo que permite identificações com elevado
grau de confiança [289].
Os resultados obtidos por BAµE-LD/GC-MS revelaram-se satisfatórios, pelo que a hipótese
de analisar os mesmos ATS por LC-MS/MS pareceu ideal, tendo em conta as vantagens acima
mencionadas mas também considerando que se estaria a eliminar um passo analítico,
nomeadamente a derivatização dos analitos, o que se apresenta como uma grande vantagem.
O desenvolvimento de um método cromatográfico, como a LC-MS/MS, requer a optimização
de vários parâmetros, sendo por isso um processo demorado e dispendioso [289]. Numa
primeira abordagem, com o intuito de reduzir os recursos necessários ao desenvolvimento de
uma nova metodologia, considerou-se como ponto de partida a informação experimental
proveniente da metodologia descrita por Wohlfarth et al. [11] e Simões et al. [19]. As condições
cromatográficas então estabelecidas permitiram a separação dos ATS, em tempo analítico
adequado (< 8 minutos), na matriz urina (vide Anexo L).
5.4.3. ESTUDO DO EFEITO DE EVAPORAÇÃO NOS ATS
O estudo do processo de evaporação dos extractos foi necessário, pois já era conhecida a
problemática da perda dos analitos por volatilização. Constata-se que, de facto, este estudo era
essencial, pois como evidencia a figura 5.6, a evaporação lenta, à temperatura ambiente e sem
recurso à corrente de azoto leva a perdas de analito, tal como não adicionar qualquer tipo de
solução ou reagente que evite estas perdas quando a evaporação é efectuada em sob corrente
de azoto, à temperatura ambiente. Portanto, a melhor alternativa seria adicionar uma solução
de HCl 1% em metanol, de forma a minimizar a perdas de analitos por volatilização, devido à
formação de cloridratos, tal como descrito por outros autores [11,233,270].
Figura 5.6 - Áreas cromatográficas obtidas por BAµE(CA3)LD/LC
extractos.
Note-se que a inexistência de dados referentes aos compostos 2C
deste parâmetro deve-se a uma degradação dos mesmos. A soluçã
não se encontraria com a qualidade desejada, pelo foi preparada uma nova solução padrão
com os ATS para a continuidade do estudo.
5.4.4. RECUPERAÇÃO DA FASE D
Apesar da eficiência do método varia
se de um estudo preliminar, o estudo efectuou
resultados obtidos encontram
Figura 5.7 - Recuperação média, em percentagem (%),
estudo, calculada para um nível de concentração.
Como se pode observar, a eficiência de extracção encontra
de variação entre 3,5 e 11,4% (
com os obtidos no estudo da eficiência de extracção por SPE/GC
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Norefedrina
Evaporação lentaAdição de HCl/MeOH
0102030405060708090
100
Rec
up
eraç
ão (
%)
Resultados e discussão
Áreas cromatográficas obtidas por BAµE(CA3)LD/LC-MS/MS no estudo da evaporação dos
se que a inexistência de dados referentes aos compostos 2C-T-2 e 2C
se a uma degradação dos mesmos. A solução utilizada nestes estudos já
não se encontraria com a qualidade desejada, pelo foi preparada uma nova solução padrão
com os ATS para a continuidade do estudo.
ECUPERAÇÃO DA FASE DE EXTRACÇÃO (EFICIÊNCIA DE EXTRAC
Apesar da eficiência do método variar em função da concentração da substância, dado tratar
se de um estudo preliminar, o estudo efectuou-se apenas na concentração de 100 ng/mL. Os
resultados obtidos encontram-se na figura 5.7.
Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos compostos em
estudo, calculada para um nível de concentração.
Como se pode observar, a eficiência de extracção encontra-se entre 18 e 48%, com coeficiente
de variação entre 3,5 e 11,4% (vide Anexo M). Os CV% obtidos nesta fase estão de acordo
com os obtidos no estudo da eficiência de extracção por SPE/GC
Norefedrina Efedrina PMA PMMA Metcatinona
Evaporação lenta Sem adição de soluçãoAdição de HCl/MeOH Adição de HCl/i-PrOH
Resultados e discussão
79
MS/MS no estudo da evaporação dos
2 e 2C-T-7 no estudo
o utilizada nestes estudos já
não se encontraria com a qualidade desejada, pelo foi preparada uma nova solução padrão
EFICIÊNCIA DE EXTRACÇÃO)
r em função da concentração da substância, dado tratar-
se apenas na concentração de 100 ng/mL. Os
da fase de extracção, para cada um dos compostos em
se entre 18 e 48%, com coeficiente
nesta fase estão de acordo
com os obtidos no estudo da eficiência de extracção por SPE/GC-MS, embora as
Metcatinona
Resultados e discussão o
80
recuperações sejam francamente inferiores. Segundo os critérios internos em vigor no STF, a
recuperação de um método analítico deve encontrar-se entre 40 e 120% e apenas a efedrina,
norefedrina e metcatinona apresentam recuperações inferiores a 40%, embora estes valores só
fossem aceites caso fosse demonstrada a exactidão e precisão do método [247,252], no
processo de validação do mesmo.
Tendo em conta que estes valores de recuperação foram obtidos em condições padrão, isto é,
sem optimização dos parâmetros experimentais associados à extracção (velocidade e tempo de
agitação, temperatura, pH, força iónica e modificador orgânico) e retroextracção (solventes
orgânicos, tempo e temperatura de retroextracção) [161-162], os valores são bastante
satisfatórios, pois tratou-se apenas numa primeira abordagem à metodologia. É expectável que
estes valores aumentem após optimização dos referidos parâmetros.
Note-se ainda que uma etapa crítica na análise dos ATS é a evaporação e reconstituição do
extracto obtido após extracção, onde, provavelmente houve perdas de analito. Será também
esclarecedor referir que as condições de retroextracção são agressivas para o dispositivo de
BAµE, o que induzia à libertação de partículas de carvão e cola para o extracto, o que poderia
interferir com a análise dos analitos.
5.4.5. LIMITE DE DETECÇÃO
O estudo dos limites de detecção foi efectuado, embora pouco exaustivamente, visto tratar-se
de um estudo preliminar. Neste sentido, por BAµE(AC3)/LC-MS/MS atingiram-se LOD de 2
ng/mL. Observando a intensidade do sinal cromatográfico constata-se que seria possível
alcançar limites mais baixos, pois verifica-se que a razão S/N do ião menos abundante é
bastante superior a 3, para todos os ATS, excepto o 2C-T-7. No entanto, seria aceitável a
utilização de apenas uma transição MRM para a confirmação e quantificação deste composto,
caso fosse demonstrado que o método é selectivo e isento de interferências, à semelhança do
procedimento adoptado no STF para confirmação e quantificação de misoprostol. Seria então
relevante levar adiante o estudo desta metodologia, aplicando-a à identificação e quantificação
de ATS em amostras biológicas.
Considerações finais
81
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Foi desenvolvida e validada uma metodologia analítica simples e eficaz para identificação e
quantificação simultânea de 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, PMMA, efedrina, norefedrina e
metcatinona em amostras de sangue total, por SPE-GC-MS. Saliente-se que não se encontram
na literatura métodos validados para identificação e quantificação simultânea dos ATS
estudados em amostras de sangue total.
As condições cromatográficas estabelecidas permitiram boa resolução entre os ATS
derivatizados com MBTFA, em tempo analítico adequado (<16 minutos). A aplicação dos
critérios em vigor no STF, consoante recomendações da WADA, permitiu a identificação
inequívoca dos mesmos. Note-se que foram avaliados três tipos de reacções de derivatização
química: a sililação, a acilação e a formação de carbamatos, por intermédio de sete reagentes de
derivatização distintos. Esta etapa permitiu melhorar o comportamento cromatográfico e
facilitou a identificação dos ATS devido à aquisição de espectros de massa mais característicos.
A ausência de análogos deuterados exigiu a utilização de compostos estruturalmente
semelhantes como PI, nomeadamente a anfetamina-d6 para o 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, efedrina
e norefedrina e a metanfetamina-d9 para o PMMA e metcatinona.
Os ATS foram extraídos de amostras de sangue total por SPE de modo misto, utilizando
colunas Oasis® MCX, permitindo recuperar todos os analitos e obter extractos limpos, ao
contrário do observado aquando da utilização de colunas Oasis® HLB.
Relativamente à validação do método de SPE-GC-MS, os resultados obtidos atestam que este
era adequado à identificação de todos os ATS estudados em amostras de sangue total. De
facto, o estudo alargado da selectividade, efectuado em duas fases distintas, com pools
constituídas por amostras de sangue total provenientes de 40 origens diferentes, permitiu um
estudo próximo das condições possivelmente encontradas em rotina. Adicionalmente, a
fortificação de pools com 52 compostos passíveis de ser encontrados em análises em contexto
forense facultaram dados adicionais relativamente à ausência de interferências. Assim, por
aplicação dos critérios em vigor, conclui-se que o método é selectivo, sem interferências e com
0% de falsos resultados positivos ou negativos. A sensibilidade do método foi também
evidenciada (LOD de 1 ng/mL), permitindo a detecção destes compostos em sangue total,
utilizando um volume de amostra reduzido (500 µL). Adicionalmente, não foram observados
fenómenos de arrastamento significativos, sendo o método robusto para a identificação de
todos os ATS estudados.
Considerações finais o
82
Já os resultados referentes à quantificação de ATS revelam que o método desenvolvido era
adequado aos seus propósitos para todos os analitos, excepto para a metcatinona, cujos
critérios estabelecidos no estudo da linearidade e precisão não foram verificados. A linearidade
do método foi evidenciada entre 5 e 500 ng/mL; no entanto, verificou-se uma distribuição
heterocedástica dos resíduos, pelo que se recorreu à utilização de uma regressão linear
ponderada. Sendo assim, os estudos apontaram para um factor de ponderação de 1/ para
todos os ATS. A determinação dos limiares analíticos, através de diferentes metodologias e
curvas de calibração, permitiu concluir que estes não são estáticos, sofrem oscilações. Por
aplicação da definição de LOQ obtiveram-se, com precisão e exactidão adequadas, valores de
5 ng/mL para todos os ATS.
Exceptuando para a metcatinona, a precisão, exactidão e robustez do método analítico
revelaram-se apropriadas para a quantificação de todos os ATS, pois, para os níveis de
concentração estudados, os valores de CV% obtidos no estudo da precisão intermédia (≤
14%) são adequados, tal como os da repetibilidade (≤ 8%). Já os valores de EMR obtidos
estão dentro dos limites considerados adequados, com excepção da efedrina, a 450 ng/mL
(17%).
O estudo da eficiência de extracção, em diferentes níveis de concentração, revelou
recuperações médias entre 87% e 103%, valores bastante aceitáveis e dentro dos limites
impostos. Foi também avaliada, quantitativamente, a presença de arrastamento, observando-se
que os compostos PMA e efedrina não sofrem fenómenos de arrastamento; no entanto, este
fenómeno é observado nos outros ATS em estudo, especialmente no caso da norefedrina
(2,69%) para concentrações iguais ou superiores a 300 ng/mL. Assim, conclui-se que numa
sequência analítica onde várias amostras distintas são analisadas devem introduzir-se injecções
de lavagem, a fim de evitar possíveis contaminações entre amostras.
Foi ainda aplicada uma metodologia alternativa para a análise de ATS em amostras de urina.
Considerando que os compostos em estudo são polares, aplicou-se uma das mais recentes
técnicas proposta por Nogueira et al., nomeadamente, BAµE. Assim, por BAµE-GC-MS
constatou-se que, dos vários materiais adsorventes estudados (AC, PU, PDMS, material
polimérico provenientes de colunas MCX e StrataTM-X), os que de um modo geral alcançaram
maiores áreas dos picos cromatográficos dos ATS, foram os ACs, em especial o CA3.
Ao analisar os ATS por LC-MS/MS eliminou-se o passo analítico de derivatização. No
entanto, observaram-se perdas de analito por volatilização durante a etapa de evaporação dos
Considerações finais
83
extractos orgânicos, pelo que seria necessário adicionar um agente que impedisse esse
fenómeno. Concluiu-se então que a melhor alternativa seria adicionar uma solução de HCl 1%
em metanol, de forma a evitar as perdas de analitos.
O estudo da eficiência de extracção evidenciou resultados satisfatórios, com recuperações
entre 18% (norefedrina) e 48% (PMMA) e CV% entre 3,5 e 11,4%. Note-se que esta é a
primeira vez que se descreve a utilização de BAµE para a extracção destes compostos.
Adicionalmente, trata-se de dados obtidos em condições padrão.
Relativamente aos LOD, constatou-se que eram iguais a 2 ng/mL para todos os ATS em
estudo. No entanto, e atendendo ao sinal cromatográfico observado (razão S/N >> 3),
conclui-se que seria possível alcançar limites mais baixos, pelo que seria relevante levar adiante
o estudo desta metodologia aplicada aos ATS em causa.
Assim, e atendendo à inexistência de métodos de triagem para este tipo de compostos, a
metodologia proposta parece ser viável para este fim, após respectiva validação.
Pelo exposto pode afirmar-se que os objectivos previamente delineados foram alcançados.
Perspectivas futuras
85
7. PERSPECTIVAS FUTURAS
Perspectivando trabalhos futuros, propõe-se a realização de estudos de avaliação da
estabilidade dos ATS, com especial foco na metcatinona.
Com a disponibilidade de uma nova técnica extractiva, BAµE, propor-se-ia alargar os estudos,
optimizando os parâmetros experimentais à extracção e dessorção, e posterior validação da
metodologia. Saliente-se que o micro-dispositivo usado em BAµE pode ser revestido com os
mais diversos materiais adsorventes, para além da possibildiade de modificar a propriedades
químicas e físicas dos ACs, tornando-os mais versáteis para a BAµE. Adicionalmente, é
possível testar a utilização de diferentes fases extractivas no mesmo micro-dispositivo de
BAµE, o que poderá possibilitar a extracção simultânea de compostos com diferentes
características.
Mais, poderá ser testado outro tipo de suporte físico para o AC, de forma a aumentar a
resistência mecânica, aumentando assim o número de extracções efectuadas por cada micro-
dispositivo.
Desta forma, perspectivam-se novas aplicações baseadas nesta nova metodologia para análises
das mais variadas classes de compostos.
Referências
87
8. Referências
A lista apresentada foi elaborada em conformidade com as directrizes do International Committee
of Medical Journal Editors (grupo de Vancouver): “Uniform requirements for manuscripts
submitted to biomedical journals: Sample references”, cujas directrizes [última modificação em
2011 Jul 15; consultado em 2011 Set 10] estão disponíveis em:
http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html
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ANEXOS
III
ANEXO A: LISTA DE COMPOSTOS TESTADOS NO ESTUDO DA
SELECTIVIDADE
Tabela A.1 - Compostos testados como interferentes no estudo da selectividade.
clobazam estazolam lorazepam morfina
diazepam bromazepam clordiazepóxido 11-OH-THC
desmetilflunitrazepam oxazepam (+/-) - metadona cocaína
α-OH-alprazolam triazolam fentanil MDA
desalquilflurazepam flurazepam papaverina BZP
7-aminoclonazepam flunitrazepam mescalina ∆9-THC
7-aminoflunitram lormetazepam benzoilecgonina codeína
2-OH-etilflurazepam prazepam d-metanfetamina MDMA
brotizolam zolpidem THCCOOH mCPP
nordiazepam demoxepam 6-MAM TFMPP
α-OH-trizolam loprazolam EME d,I-HMMA
alprazolam midazolam d-anfetamina d,I-HMA
halazepam temazepam cis-tramadol MDEA
IV
ANEXO B: AVALIAÇÃO DA LINEARIDADE (TESTE DE MANDEL)
A avaliação da linearidade, por intermédio do teste de Mandel, permite avaliar qual dos modelos,
linear ou não linear (quadrático), origina o melhor ajuste dos pontos de calibração. Assim, é
necessário determinar a variância da correlação linear e a variância da correlação quadrática. A
diferença entre estas é expressa pela Equação B.1:
Equação B.1: DS N 2 S/ N 3 S
Onde:
N representa o número de amostras de calibração;
S/ a variância da correlação linear;
S a variância da correlação não linear (quadrática).
Calcula-se então o valor de teste (Fcal), de acordo com a equação B.2:
Equação B.2: F!"# DS
S
Submete-se agora o valor obtido a comparação com o valor tabelado da distribuição F de Snedecor
(N-1;N-1;α). Como critério de decisão tem-se:
se Fcal ≤ Fcrit as diferenças entre as variâncias não são estatisticamente significativas e
consequentemente a função de calibração é linear.
se Fcal > Fcrit as diferenças entre as variâncias são estatisticamente significativas e
consequentemente a função de calibração não é linear.
V
ANEXO C: TESTE DE HOMOGENEIDADE DE VARIÂNCIAS
Iniciou-se o teste da homogeneidade de variâncias com o cálculo das variâncias associadas ao
primeiro (S) e último (S$ ) calibradores, de acordo com a equação C.1:
Equação C.1: S% ∑ '%( )*+(,-% 1
Onde:
S% representa a variância;
i a amostra de calibração (i =1,2,3, …10);
j o número de réplicas efectuadas para cada amostra de calibração (para i=1 e i=10);
n o número de resultados obtidos;
yi o resultado obtido;
) a média dos resultados obtidos.
Posteriormente, através das equações C.2 e C.3, é possível calcular o valor teste (Fcal):
Equação C.2: F!"# S$
S , se S$ 1 S
Equação C.3: F!"# S
S$ , se S 1 S$
Submete-se agora o valor obtido a comparação com o valor tabelado da distribuição F de Snedecor
(N-1;N-1). Como critério de decisão tem-se:
se Fcal ≤ Fcrit as diferenças de variâncias não são estatisticamente significativas e
consequentemente a gama de trabalho está bem ajustada.
se Fcal > Fcrit as diferenças de variâncias são estatisticamente significativas e
consequentemente a gama de trabalho não está bem ajustada.
VI
ANEXO D: OUTRAS EQUAÇÕES USADAS
Equação D.1: LOD '3,3 S/*b
Onde:
LOD representa o limite de detecção;
Sy/x o desvio-padrão residual;
b o declive da curva de calibração.
Equação D.2: LOQ 10 S/b
Onde:
LOQ representa o limite de detecção;
Equação D.3 7% 89:;<=>?%@%8+
Onde:
Ri representa a recuperação para cada nível de concentração e para cada dia;
Cobserv o valor observado;
Cadicion o valor esperado.
VII
Equação D.4 7A ∑ 7%B%,C
Onde:
7A representa a recuperação média;
p o número de grupos (dias);
Ri a recuperação média de n replicados obtidos em condições de repetibilidade.
Equação D.5: ER % CHIJ C"KLIJC"KLIJ
100
Onde:
ER(%) representa o erro relativo percentual;
Cest a concentração estimada na amostra;
Camost a concentração real na amostra;
Equação D.6: EMR média das concentrações estimadas valor teórico valor teórico 100
Onde EMR representa o o erro médio relativo da concentração estimada.
VIII
Equação D.7 7YZ[CY\]çã^
_@; _B%;`
_@ _B%`
Onde:
Ace representa a área cromatográfica absoluta do composto obtida na amostra fortificada antes da
extracção;
Apie é a área cromatográfica absoluta do PI obtida na amostra fortificada antes da extracção;
Ac é a área cromatográfica absoluta do composto obtida na amostra fortificada após a extracção e
no mesmo nível de concentração;
Api é a área cromatográfica absoluta do PI obtida na amostra fortificada após a extracção e no
mesmo nível de concentração.
IX
ANEXO E: PRECISÃO E ANÁLISE ANOVA
Tabela E.1 – Análise de variância. Tabela ANOVA para o modelo experimental utilizado no estudo da repetibilidade e precisão intermédia.
Fonte de variação Somas dos Quadrados
(SS)
Graus de
Liberdade
Quadrados médios
(MS)
Inter grupos (run) aa<b+ -c'd) de*B
%, p-1 fa<b+ -∑ 'd) de*B
%,C 1
Intra grupos
(residual) aa< cc'd%( dA%*+
(,
B
%, p(p-1) fa<
∑ ∑ 'd%( dA%*+(,B%,
CC 1
Total SST pn-1 fag aag- 1
Onde: p representa o número de sequências analíticas (run) na qual a amostra é analisada; n o número de replicados efectuados em cada sequência analítica; Xij um resultado individual, de uma amostra, analisado no j-ésimo replicado e na i-ésima sequência; X i a média de j replicados obtidos na sequência i; de exprime a grande média, calculada como a média das médias dos resultados obtidos em p sequências diferentes. Tabela E.2 – Cálculo das estimativas das variâncias para o modelo experimental utilizado no estudo da repetibilidade e precisão intermédia.
Variância Expressão Graus de liberdade
Variância da repetibilidade a a fa< p(n-1)
Variância Between-run a<b+ a<b+ fa<b+ fa<-
Variância da precisão intermédia ah ah a< i a<b+
Variância da média a a fa<b+
- p-1
Onde: SR
2 ) representa a variância da repetibilidade; (SI
2) a precisão intermédia;
X
Equação E.1 adA 100
Onde:
representa o coeficiente de variação de repetibilidade, expresso em percentagem;
a o desvio-padrão de repetibilidade;
dA o valor médio.
Equação E.2: jh ahdA 100
Onde:
jh representa o coeficiente de variação da precisão intermédia, expresso em percentagem;
ah é o desvio-padrão da precisão intermédia;
dA é a média dos resultados obtidos.
XI
ANEXO F: CROMATOGRAMAS E ESPECTROS DE MASSA
Figura F.1 – Cromatograma obtido por GC-MS de uma solução padrão de PMA (10 µg/mL) não
derivatizado (a) e respectivo espectro de massa, obtido em modo full scan (b).
Figura F.2 – Cromatograma obtido por GC-MS de uma solução padrão de PMA (10 µg/mL) derivatizado
com MBTFA (a) e respectivo espectro de massa, obtido em modo full scan (b).
(a)
(b)
(a)
(b)
XII
ANEXO G: PADRÃO INTERNO
Tabela G.1- Estudo da repetibilidade da área relativa (CV%) dos ATS mediante diferentes padrões internos.
Compostos PI CV% da área relativa
2C-T-2
Anfetamina d6 8,124
Metanfetamina d9 15,970
MDMA d5 15,719 MDE d5 10,853 MBDB d5 16,525
2C-T-7
Anfetamina d6 12,136
Metanfetamina d9 19,258
MDMA d5 17,721 MDE d5 12,350 MBDB d5 18,066
PMA
Anfetamina d6 3,766 Metanfetamina d9 17,797
MDMA d5 18,907
MDE d5 14,799 MBDB d5 20,037
PMMA Anfetamina d6 21,968
Metanfetamina d9 7,571
MDMA d5 8,687
MDE d5 7,914
MBDB d5 4,324
Metcatinona
Anfetamina d6 13,512 Metanfetamina d9 5,176
MDMA d5 10,276 MDE d5 8,664
MBDB d5 10,726
Efedrina
Anfetamina d6 7,238
Metanfetamina d9 16,312
MDMA d5 16,271
MDE d5 12,501
MBDB d5 17,25475
Norefedrina
Anfetamina d6 6,143 Metanfetamina d9 19,514
MDMA d5 20,213 MDE d5 16,109 MBDB d5 21,29166
XIII
ANEXO H: EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA - OASIS® HLB
Tabela H.1 - Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos compostos
em estudo, calculada para um nível de concentração.
ATS Recuperação média ± cv (%)
100 ng/mL
2C-T-2-N-TFA 19,9 ± 19,6
2C-T-7-N-TFA 105,4 ± 10,7
PMA-N-TFA 9,9 ± 18,0
PMMA-N-TFA 20,2 ± 19,4
Efedrina-N,O-TFA 14,9 ± 43,7
Norefedrina-N-TFA 5,7 ± 8,5
Metcatinona-N-TFA ---
XIV
ANEXO I: MACRO
Figura I.1 – Cromatogramas obtidos no estudo da linearidade do método SPE/GC-MS numa MACRO
desenvolvida: sangue branco fortificado com PI (100 ng/mL) e ATS (100 ng/mL).
XV
Figura I.1 (continuação) – Cromatogramas obtidos no estudo da linearidade do método SPE/GC-MS
numa MACRO desenvolvida: sangue branco fortificado com PI (100 ng/mL) e ATS (100 ng/mL).
XVI
Figura I.1 (continuação) – Cromatogramas obtidos no estudo da linearidade do método SPE/GC-MS
numa MACRO desenvolvida: sangue branco fortificado com PI (100 ng/mL) e ATS (100 ng/mL).
XVII
ANEXO J: TRATAMENTO ESTATÍSTICO NO ESTUDO DA LINEARIDADE
Concentração (ng/mL)
Área analito
Área P.I. Área
Relativa
5 2401 450349 0,005331
10 5631 498985 0,011285
20 10228 494608 0,020679
30 16422 540362 0,030391
40 22794 515867 0,044186
50 27456 463429 0,059245
100 44348 444171 0,099844
200 105235 483259 0,217761
400 248698 544818 0,456479
500 263389 482120 0,546314 Resultado residual
Observação Y previsto Residuais Residuais-
padrão
1 0,00409038 0,00124104 0,190466105 2 0,00964828 0,00163663 0,251177813 3 0,02076408 -8,5078E-05 -0,013057215 4 0,03187988 -0,00148914 -0,228542941 5 0,04299568 0,00119012 0,182651233 6 0,05411149 0,00513383 0,787902957 7 0,1096905 -0,00984607 -1,511101739 8 0,22084852 -0,00308744 -0,473837662 9 0,44316456 0,01331449 2,043408921
10 0,55432258 -0,00800838 -1,22906747
Estatística de regressão
R múltiplo 0,999451998 Quadrado de R 0,998904296 Quadrado de R ajustado 0,998767333 Erro-padrão 0,006911071
Observações 10
ANOVA gl SQ MQ F F de significância
Regressão 1 0,34834642 0,348346 7293,2413 3,94295E-13 Residual 8 0,0003821 4,78E-05
Total 9 0,34872852
Coeficientes Erro-padrão Stat t valor P
95% inferior
95% superior
Interceptar -0,00147 0,002808 -0,5226 0,6154 -0,00794 0,00501 Variável X 1 0,001112 1,3E-05 85,4005 4E-13 0,001082 0,00114
XVIII
Figura J.1 – Exemplificação do tratamento estatístico no estudo de avaliação da linearidade para o 2C-T-2-N-TFA.
ANEXO K: DADOS REFERENTES AO ESTUDO DO ARRASTAMENTO (CARRY
OVER)
Tabela K.1 – Estudo quantitativo do fenómeno de arrastamento. Dados obtidos por
SPE/GC-MS de amostra brancas (branco) após injecção de uma amostra fortificada a 500 ng/mL com os
ATS em estudo.
Composto Injecção Área Anal.
Tr Área P.I.
Área rel. %
2C-T-2
Amostra 316479 10,812 440089 0,719 100 Branco 1 214 10,814 416044 0,000 0,0715 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
2C-T-7
Amostra 281294 11,163 440089 0,639 100 Branco 1 389 11,166 416044 0,000 0,146 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
PMA
Amostra 106529 7,89 440089 0,242 100 Branco 1 nd nd 0 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
PMMA
Amostra 258954 8,616 345994 0,748 100 Branco 1 5075 8,618 296202 0,017 2,289 Branco 2 1372 8,617 292221 0,005 0,627 Branco 3 nd nd 0
Efedrina
Amostra 69406 6,978 440089 0,00002 100 Branco 1 nd nd 0 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
Norefedrina
Amostra 468614 6,477 440089 1,064 100 Branco 1 6443 6,484 416044 0,015 1,454 Branco 2 6054 6,477 381096 0,016 1,492 Branco 3 5469 6,489 362943 0,0150 1,415
nd - Não detectado
XIX
Tabela K.2 - Estudo quantitativo do fenómeno de arrastamento. Dados obtidos por
SPE/GC-MS de amostra brancas (branco) após injecção de uma amostra fortificada a 400 ng/mL com os
ATS em estudo.
Composto Injecção Área Anal.
Tr Área P.I.
Área rel. %
2C-T-2
Amostra 213587 10,811 429693 0,497 100 Branco 1 309 10,813 368878 0,000838 0,169 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
2C-T-7
Amostra 188481 11,162 429693 0,439 100 Branco 1 356 11,165 368878 0,001 0,220 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
PMA
Amostra 82735 7,889 429693 0,193 100 Branco 1 nd nd 0 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
PMMA
Amostra 175587 8,615 324104 0,542 100 Branco 1 2605 8,616 265674 0,010 1,809 Branco 2 819 8,619 232422 0,004 0,650 Branco 3 nd nd 0
Efedrina
Amostra 50543 6,978 429693 0,118 100 Branco 1 nd nd 0 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
Norefedrina
Amostra 353921 6,477 429693 0,824 100 Branco 1 5570 6,489 368878 0,015 1,833 Branco 2 5026 6,487 325110 0,015 1,879 Branco 3 5086 6,477 325814 0,016 1,895
nd - Não detectado
XX
Tabela K.3 - Estudo quantitativo do fenómeno de arrastamento. Dados obtidos por
SPE/GC-MS de amostra brancas (branco) após injecção de uma amostra fortificada a 300 ng/mL com os
ATS em estudo.
Composto Injecção Área Anal.
Tr Área P.I.
Área rel. %
2C-T-2
Amostra 127602 10,811 416986 0,306 100 Branco 1 150 10,814 313321 0,000479 0,156 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
2C-T-7
Amostra 113362 11,162 416986 0,272 100 Branco 1 238 11,165 313321 0,001 0,248 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
PMA
Amostra 54903 7,889 416986 0,132 100 Branco 1 nd nd 0 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
PMMA
Amostra 108699 8,615 288541 0,377 100 Branco 1 2532 8,617 220444 0,011 3,048 Branco 2 803 8,614 199686 0,004 1,067 Branco 3 nd nd 0
Efedrina
Amostra 35245 6,977 416986 0,084 100 Branco 1 nd nd 0 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0
Norefedrina
Amostra 241823 6,476 416986 0,579 100 Branco 1 4876 6,487 313321 0,015 2,683 Branco 2 4164 6,482 268723 0,015 2,672 Branco 3 3931 6,479 254002 0,0154 2,669
nd - Não detectado
ANEXO L: CROMATOGRAMA DE
Figura L.1 – Cromatograma obtido por BAµE(AC3)com os ATS em estudo (20 ng/mL).
ROMATOGRAMA DE LC-MS/MS
Cromatograma obtido por BAµE(AC3)-LD/LC-MS/MS de uma amostra de urina fortificada com os ATS em estudo (20 ng/mL).
XXI
MS/MS de uma amostra de urina fortificada
XXII
ANEXO M: RECUPERAÇÃO DO MÉTODO BAµE(AC 3)-LD/LC-MS/MS
Tabela M.1 - Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção por BAµE(AC3), para cada um
dos compostos em estudo, calculada para um nível de concentração (n=3).
ATS Recuperação média ± cv (%)
100 ng/mL
2C-T-2-N-TFA 37,2 ± 11,4
2C-T-7-N-TFA 45,9 ± 9,5
PMA-N-TFA 47,8 ± 4,8
PMMA-N-TFA 48,7 ± 9,4
Efedrina-N,O-TFA 31,7 ± 5,9
Norefedrina-N-TFA 18,7 ± 3,5
Metcatinona-N-TFA 25,9 ± 6,6
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