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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

Desenvolvimento e validação de métodos analíticos para

pesquisa de 2-feniletilaminas em fluidos biológicos

Alexandra Filipa Pereira Gonçalves

Mestrado em Química

Lisboa

2011

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

Desenvolvimento e validação de métodos analíticos para

pesquisa de 2-feniletilaminas em fluidos biológicos

Alexandra Filipa Pereira Gonçalves

Mestrado em Química

Orientação: Prof. Doutor José Manuel Florêncio Nogueira

Mestre Maria Suzel Costa de Sousa e Escada

Lisboa

2011

PREFÁCIO

O consumo de drogas de abuso sintéticas é cada vez mais recorrente, sendo já considerada

uma das epidemias do século XXI. Têm surgido no mercado ilícito novas drogas de abuso

sintéticas, em particular derivados de 2-feniletilaminas. A pertinência do estudo destes

compostos prende-se com o elevado grau de incidência da sua utilização recreativa e dos

efeitos psicoactivos que provocam. Torna-se por isso essencial num contexto forense, a

existência de métodos rápidos para pesquisa deste tipo de substâncias em amostras biológicas,

e passíveis de poderem ser utilizados em rotina.

A presente dissertação resulta da colaboração entre a Faculdade de Ciências da Universidade

de Lisboa e o Serviço de Toxicologia Forense (STF) da Delegação do sul do Instituto

Nacional de Medicina Legal, I. P. Pretendia-se então desenvolver e validar metodologias

analíticas para a pesquisa de derivados de 2-feniletilaminas em fluidos biológicos, com

aplicabilidade em rotina no STF. Resultou igualmente da colaboração o desenvolvimento de

uma metodologia analítica alternativa e inovadora para a análise de diversos derivados de 2-

feniletilaminas designada por micro-extracção adsorptiva em barra (BAµE), cuja invenção se

encontra sob pedido provisório de patente nacional.

O trabalho apresentado foi alvo de divulgação na comunidade científica, através de

comunicações em painel (“poster”) em encontros internacionais, assim como de

comunicações orais em encontros nacionais e ibéricos.

Comunicações em painel:

Development and validation of a method for the analysis of amphetamine-type

stimulants in whole blood by SPE-GC-MS. 19th Triennial Meeting of the

International Association of Forensic Sciences (IAFS), 2011, Funchal, Portugal.

Comunicações orais:

Selectividade: um parâmetro de validação muitas vezes subvalorizado.

I Jornadas Ibéricas de Toxicologia, 2011, Covilhã, Portugal.

Desenvolvimento e validação de métodos para análise de estimulantes do tipo

anfetamina em amostras biológicas. XXII Encontro Nacional de Química, 2011,

Braga, Portugal.

Publicações em revistas científicas indexadas:

Development of a Powdered Activated Carbon in Bar Adsorptive

Micro-extraction for the Analysis of Morphine and Codeine in Human Urine. A.F.P.

Gonçalves, N.R. Neng, A.S. Mestre, A.P. CArvalho, J.M.F. Nogueira. Aceite para

publicação em Journal of Chromatographic Sciences (9 Out 2011).

iii

AGRADECIMENTOS

A concretização da presente dissertação deve-se ao contributo de diversas pessoas e

entidades, às quais quero manifestar o meu profundo agradecimento.

Agradeço às instituições que apoiaram o trabalho desenvolvido, nomeadamente, ao Serviço

de Toxicologia Forense da Delegação do Sul do Instituto Nacional de Medicina Legal I.P.,

por me ter proporcionado um estágio, em excelentes instalações e condições de trabalho.

Ao Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade de

Lisboa agradeço condições que permitiram levar a cabo a segunda fase do trabalho.

Aos orientadores, Professor Doutor José Manuel F. Nogueira e Mestre Suzel Costa,

agradeço a orientação do presente trabalho, sugestões e conselhos. Agradeço ainda ao

Professor Doutor José Manuel F. Nogueira ter aceitado a orientação desta dissertação, seu

interesse, prontidão e auxílio. À Mestre Suzel Costa agradeço o seu grande

profissionalismo, os conhecimentos científicos transmitidos, dedicação, incentivo,

disponibilidade e paciência.

Ao Prof. Doutor Jorge Costa Santos, Director da Delegação de Lisboa do Instituto

Nacional de Medicina Legal, agradeço a oportunidade de realizar o estágio na Instituição,

assim como a disponibilização dos meios necessários à concretização do mesmo.

Dirijo um agradecimento muito especial ao Director do Serviço de Toxicologia Forense,

Mestre Mário Dias, por manter sempre a porta aberta nas inúmeras visitas ao STF e, em

especial, pela proposta de estágio, compreensão, interesse demonstrado, apoio

incondicional e constante incentivo.

Também do mesmo serviço, agradeço ao Dr. Antonio Castañera, director de qualidade,

pela formação e apoio em validação de métodos analíticos, acreditação de laboratórios e

gestão da qualidade.

Ao Doutor Mário Barroso uma palavra de gratidão. O interesse demonstrado no trabalho

desenvolvido, as suas sugestões, disponibilidade para discutir os problemas que iam

surgindo e a sua “irritante” boa disposição foram essenciais; um belo colega. À Dra. Suzana

Fonseca agradeço a excelente companhia nas longas manhãs e tardes de tratamento de

resultados, as conversas esclarecedoras, a eterna paciência para responder às minhas

questões e as amostras de urina. À Dra. Susana Simões agradeço a sua disponibilidade,

excelente companhia, conversas e esclarecimentos. Agradeço ainda o apoio prestado nos

ensaios realizados por LC-MS/MS, sem o qual estes não seriam possíveis.

iv

Aos restantes profissionais do serviço, Dr. Nuno Gonçalves, Dr. Francisco Vale,

Eng. Cláudia Maueza, Elsa Rodrigues, Luísa Almeida e Paula Rodrigues, agradeço o

companheirismo, a forma como me integraram na equipa e a paciência demonstrada para

com a entropia por mim causada na rotina do laboratório. Uma palavra de agradecimento

ao doutorando José Restolho pelo companheirismo, apoio e momentos de descontracção

passados no STF e congressos.

Aos colegas do Grupo de Ciência & Tecnologia de Separação da Faculdade de Ciências da

Universidade de Lisboa agradeço a companhia e as longas conversas.

Não posso também deixar de agradecer aos meus amigos, e a todas as pessoas que me

deram uma palavra de amizade e incentivo. Uma palavra muito especial à amiga Maria

Costa, pelo apoio incondicional, paciência, partilha de experiências e, acima de tudo, pelo

privilégio de me deixar entrar no seu mundo.

À minha família, em especial aos meus pais e irmã. Aos meus primos, ao Fábio, por me

fazer rir nos momentos de desespero. Aos meus queridos avós, pelo imenso carinho.

Ao Daniel, pelo amor e amizade. Obrigada pelo apoio e compreensão nos imensos fins-de-

semana e férias em que estive ausente.

v

ÍNDICE

PREFÁCIO ................................................................................................................................... i

AGRADECIMENTOS ................................................................................................................... iii

ÍNDICE GERAL ........................................................................................................................... v

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ xix

ÍNDICE DE TABELAS .................................................................................................................. xi

ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS E SÍMBOLOS .............................................................................. xiii

RESUMO .................................................................................................................................. xvii

PALAVRAS-CHAVE .................................................................................................................. xvii

ABSTRACT ................................................................................................................................ xix

KEYWORDS .............................................................................................................................. xix

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1

2. DROGAS DE ABUSO .............................................................................................................. 3

2.1. Definição ............................................................................................................................................... 3

2.2. Considerações sobre drogas sintéticas e drogas de design .............................................................. 4

2.3. Derivados de 2-feniletilaminas........................................................................................................... 4

2.3.1. Série 2C: 2C-T-2 e 2C-T-7 ............................................................................................................... 7

2.3.2. p-metoxianfetaminas: PMA e PMMA ............................................................................................ 9

2.3.3. Catinonas: Metcatinona .................................................................................................................. 11

2.3.4. Efedrinas: Efedrina e Norefedrina ............................................................................................... 12

2.4. Enquadramento: Novas drogas e tendências emergentes ........................................................... 13

3. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE DE DROGAS DE ABUSO .......................................................... 15

3.1. Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS).................................... 15

3.2. Técnicas de preparação de amostras ............................................................................................... 18

3.2.1. Extracção em Fase Sólida (SPE) ................................................................................................... 19

3.2.2. Extracção Sorptiva em Barra de Agitação (SBSE) ..................................................................... 21

3.2.3. Novos materiais e metodologias inovadoras ............................................................................... 23

3.2.3.1. Poliuretano vs. carvão activado .................................................................................................. 24

3.3. Revisão bibliográfica sobre análise de ATS em amostras biológicas ........................................ 25

3.4. Validação de métodos analíticos ...................................................................................................... 27

4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 31

4.1. Padrões e Reagentes .......................................................................................................................... 31

4.2. Soluções ............................................................................................................................................... 31

vi

4.3. Equipamento ...................................................................................................................................... 33

4.4. Materiais .............................................................................................................................................. 34

4.5. Condições Instrumentais .................................................................................................................. 35

4.5.1. GC-MS .............................................................................................................................................. 35

4.5.2. LC-MS/MS ....................................................................................................................................... 35

4.6. Amostras Biológicas .......................................................................................................................... 37

4.7. Identificação dos compostos ........................................................................................................... 38

4.8. Extracção em Fase Sólida (SPE) ..................................................................................................... 39

4.8.1. Pré-tratamento das amostras biológicas ....................................................................................... 39

4.8.2. Metodologia de extracção em fase sólida .................................................................................... 39

4.8.2.1.Metodologia de extração com as colunas Oasis® HLB ................................................... 39

4.8.2.2.Metodologia de extração com as colunas Oasis® MCX .................................................. 39

4.8.3. Derivatização química ..................................................................................................................... 40

4.8.3.1. MBTFA, MSTFA:TMS (95:5; v/v), MBDSTFA ou MSHFBA. .................................... 40

4.8.3.2. MSTFA/MBTFA ................................................................................................................... 40

4.8.3.3. PFPA/PFOH. ........................................................................................................................ 41

4.8.3.4. Py/Cloroformato de benzoílo ............................................................................................. 41

4.9. Quantificação ...................................................................................................................................... 41

4.10. Validação do método de ensaio para análise de ATS por SPE/GC-MS .................................. 42

4.10.1. Avaliação da selectividade ............................................................................................................ 43

4.10.2. Limites analíticos do método: limites de detecção e de quantificação ................................. 43

4.10.3. Linearidade ..................................................................................................................................... 44

4.10.4. Gama de trabalho ......................................................................................................................... 45

4.10.4.1. Regressão linear ponderada. ............................................................................................... 45

4.10.5. Precisão: repetibilidade e precisão intermédia ......................................................................... 46

4.10.6. Exactidão, veracidade e tendência ............................................................................................. 47

4.10.7. Recuperação da fase de extracção (eficiência de extracção) .................................................. 48

4.10.8. Presença de arrastamento (carry over) ......................................................................................... 49

4.10.9. Robustez ........................................................................................................................................ 49

4.11. Metodologia alternativa para análise de ATS em fluidos biológicos: Estudos preliminares .. 49

4.11.1. Preparação do micro-dispositivo de extracção ......................................................................... 50

4.11.2. Escolha do material adsorvente .................................................................................................. 50

4.11.3. Estudo do efeito de evaporação nos ATS ................................................................................. 51

4.11.4. Recuperação da fase de extracção (eficiência de extracção) ................................................... 52

4.11.4. Limite de detecção......................................................................................................................... 52

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 53

5.1. Identificação dos compostos ........................................................................................................... 53

vii

5.2. Extracção em Fase Sólida (SPE) ..................................................................................................... 56

5.2.1. Pré-tratamento das amostras biológicas ....................................................................................... 56

5.2.2. Metodologia de extracção .............................................................................................................. 56

5.2.3. Estudo do efeito de evaporação nos ATS ................................................................................... 57

5.2.4. Derivatização química ..................................................................................................................... 58

5.3. Validação do método de ensaio para análise de ATS por SPE/GC-MS .................................. 60

5.3.1. Avaliação da selectividade .............................................................................................................. 60

5.3.2. Limites analíticos do método: limites de detecção e de quantificação ................................... 63

5.3.3. Linearidade ....................................................................................................................................... 66

5.3.4. Gama de trabalho ........................................................................................................................... 68

5.3.4.1. Regressão linear ponderada. ................................................................................................. 69

5.3.5. Precisão e exactidão ....................................................................................................................... 71

5.3.6. Recuperação da fase de extracção (eficiência de extracção) .................................................... 72

5.3.7. Presença de arrastamento (carry over) ........................................................................................... 74

5.3.8. Robustez .......................................................................................................................................... 75

5.4. Metodologia alternativa para análise de ATS em fluidos biológicos: Estudos preliminares .. 75

5.4.1. Escolha do material adsorvente .................................................................................................... 76

5.4.2. Optimização dos parâmetros de LC-MS/MS ............................................................................. 78

5.4.3. Estudo do efeito de evaporação nos ATS ................................................................................... 78

5.4.4. Recuperação da fase de extracção (eficiência de extracção) ..................................................... 79

5.4.5. Limite de detecção ........................................................................................................................... 80

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................................... 81

7. PERSPECTIVAS FUTURAS.................................................................................................... 85

8. REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 87

9. ANEXOS ................................................................................................................................... I

ix

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1 – Estruturas químicas da 2-feniletilamina (a) e da anfetamina (b). .......................................... 4

Figura 2.2 – Estruturas químicas de alguns compostos da série 2C.. ......................................................... 7

Figura 2.3 – Estruturas químicas das moléculas 2C-B (a) e DOB (b). ....................................................... 8

Figura 2.4 – Síntese da metcatinona: reacção de oxidação da efedrina .................................................... 11

Figura 3.1 – Representação esquemática das etapas do método de SPE ................................................. 20

Figura 3.2 – Representação do mecanismo de extracção por SPE de modo misto (MCX) de uma

droga básica (propranolol). ....................................................................................................................... 21

Figura 3.3 – Imagem e representação esquemática de BAµE. .................................................................. 24

Figura 3.4 – Estrutura molecular do grupo uretano ................................................................................... 24

Figura 4.1 – Representação esquemática da barra de micro-extracção .................................................... 50

Figura 4.2 – Ilustração genérica do processo de pré-concentração dos analitos por BAµE-LD......... 51

Figura 5.1 – Identificação do 2C-T-2-N-TFA numa amostra de sangue total fortificada com 200

ng/mL dos ATS em estudo e à qual se adicionou o PI na mesma concentração: Confirmação

da presença dos três fragmentos iónicos de diagnóstico no cromatograma (a); Fragmentograma

de massa do 2C-T-2-N-TFA (b); Aplicação dos critérios de aceitação para a identificação do

2C-T-2-N-TFA (c).. ................................................................................................................................... 55

Figura 5.2 – Cromatogramas obtidos por SPE/GC-SIM-MS: alíquota de pool de sangue branco

fortificada com o PI (200 ng/mL) e os ATS (200 ng/mL) (a); alíquota da mesma pool de sangue

após fortificação a 200 ng/mL com o PI e os ATS, e os cinquenta e dois compostos

mencionados na tabela em anexo (b). ..................................................................................................... 62

Figura 5.3 – Cromatogramas obtidos na segunda fase do estudo da selectividade do método

analítico por SPE/GC-MS: alíquota de pool de sangue branco fortificada com o PI (200

ng/mL) e os ATS (200 ng/mL) (a); alíquota da mesma pool de sangue após fortificação com o

PI (200ng/mL) e os cinquenta e dois compostos mencionados na tabela em anexo (b)... ............ 63

Figura 5.4 – Distribuição do erro relativo percentual (ER%) em função das concentrações de 2C-

T-2-N-TFA obtida para o Modelo 1 (wi=1), Modelo 2 (wi=1/√x), Modelo 3 (wi=1/x),

Modelo 4 (wi=1/x2), Modelo 5 (wi= 1/√y), Modelo 6 (wi=1/y) e Modelo 7 (wi=1/y2). ............. 70

Figura 5.5 – Áreas cromatográficas obtidas por injecção em GC-MS dos extractos derivatizados

obtidos por SBSE(PDMS e PU) e BAµE(AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, MCX, StrataTM-X)

(n=1)............................................................................................................................................................. 77

Figura 5.6 – Áreas cromatográficas obtidas por BAµE (CA3)LD/LC-MS/MS no estudo da

evaporação dos extractos. ......................................................................................................................... 79

Figura 5.7 – Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos

compostos em estudo, calculada para um nível de concentração (n=3). .................................................. 79

xi

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 2.1 – Características físico-químicas dos ATS em estudo. .............................................................. 6

Tabela 3.1 – Detectores geralmente utilizados em GC. .............................................................................. 16

Tabela 4.1 – Gradiente de eluição utilizada para análise cromatográfica dos ATS em estudo.. ........... 36

Tabela 4.2 – Transições MRM, voltagem do cone, energia de colisão (Ecolisão) e tempo de retenção

(tR) dos analitos e PI.. ................................................................................................................................ 37

Tabela 4.3 – Intervalos máximos de tolerância permitidos para as abundâncias relativas dos

fragmentos de diagnóstico, monitorizados em modo SIM.. ............................................................... 38

Tabela 4.4 – Parâmetros de validação do método analítico de SPE/GC-MS para identificação e

quantificação de ATS em amostras de sangue total ............................................................................. 42

Tabela 5.1 – Razão massa/carga (m/z) dos fragmentos iónicos diagnóstico monitorizados em

modo SIM e tempo de retenção (tR) usados na identificação dos compostos derivatizados com

MBTFA........................................................................................................................................................ 53

Tabela 5.2 – Resultados obtidos no estudo do LOD e LOQ em três gamas de trabalho.. .................. 65

Tabela 5.3 – Resumo dos resultados obtidos referentes ao modelo de regressão linear simples para

os ATS em estudo.. .................................................................................................................................... 67

Tabela 5.4 – Resumo dos resultados obtidos no teste de Mandel para os ATS em estudo. ................ 68

Tabela 5.5 – Resumo dos resultados obtidos no teste de homogeneidade de variâncias. .................... 69

Tabela 5.6 – Erros relativos (ER%) por recurso à regressão linear simples e ponderada para cada

factor de ponderação empírico, referente ao 2C-T-2-N-TFA... ......................................................... 71

Tabela 5.7 – Resumo dos resultados obtidos no estudo da precisão e exactidão do método,

determinado para três níveis de concentração (concentrações de ATS expressas em ng/mL e

n=15)... ......................................................................................................................................................... 72

Tabela 5.8 – Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos

compostos em estudo, calculada para três níveis de concentração... ................................................. 74

xiii

ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS E SÍMBOLOS

2C-B 4-bromo-2,5-dimetoxifeniletilamina 2C-D 2,5-dimetoxi-4-metil-feniletilamina 2C-E 2,5-dimetoxi-4-etilfeniletilamina 2C-I 2,5-dimetoxi-4-iodofeniletilamina 2C-T-2 2-[4-(etiltio)-2,5-dimetoxifenil]etanamina 2C-T-7 2-[2,5-dimetoxi-4-(propiltio)fenil]etanamina AC Carvão activado (do inglês, Activated Carbon) ACN Acetonitrilo ANOVA Análise de Variância ATS Estimulantes do tipo anfetamina (do inglês, amphetamine-type stimulants)

BAµE Micro-Extração Adsorptiva em barra (do inglês bar adsorptive micro-extraction)

BAµE Micro-extracção adsortiva em barra (do inglês, Bar Adsorptive Micro-Extraction)

BSTFA N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamida CAS Chemical Abstracts Service

CE Electroforese Capilar (do inglês, Capillary Electrophoresis)

CE-MS Electroforese Capilar acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry)

CE-NPD Electroforese Capilar com Detector por Azoto e Fósforo (do inglês, Capillary Electrophoresis-Nitrogen-Phosphorous Detector)

CE-UV Electroforese Capilar com Detector de Ultravioleta (do inglês,Capillary Electrophoresis-Ultraviole Detector)

CI Ionização Química (do inglês, Chemical Ionization) cm Centímetro CRM Material de referência certificado (do ingês, certified reference material) CV% Coeficiente de variação percentual

CVSI Coeficiente de variação da precisão intermédia

DBD-F 4-(N,N-dimetilaminosulfonil)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole DBD-F 4-(N,N-dimetilaminosulfonil)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole DOB 2,5-dimetoxi-4-bromoanfetamina DOM 4-metil-2,5-dimetoxianfetamina e- Feixe de electrões

ECD Detector de Captura Electrónica (do inglês, Electron Capture Detector)

Ecolisão Energia de colisão EI Ionização Electrónica (do inglês, Electronic Ionization) EMR Erro médio relativo eV electrão volt

Fcrit Valor tabelado da distribuição F de Snedecor para (N-1;N-1;α)

FDA Food and Drug Admistration

FID Detector de Ionização de Chama (do inglês, Flame Ionization Detector)

xiv

FLD Detector de Fluorescência (do inglês, Fluorescence Detector) GC Cromatografia Gasosa (do inglês, Gas Chromatography)

GC-MS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, Gas Chromatography-Mass Spectrometry)

HCl Ácido clorídrico HFBA Anidrido heptafluorbutírico

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (do inglês, High-Performance Liquid Chromatography)

HPLC-MS Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, High-Performance Liquid Chromatography-Mass Sprectrometry)

ISO International Organization for Standardization

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

KH2PO4 di-hidrogenosfosfato de potássio

Ko/w Logaritmo do coeficiente de partição do composto entre o octanol e a água

KOH Hidróxido de potássio KPDMS/W Coeficiente de distribuição dos analitos entre o PDMS e a fase aquosa kV kilovolt LC Cromatografia Líquida (do inglês, Liquid Chromatography)

LC-MS/MS Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massa em Tandem (do inglês, Liquid Chromatography coupled with Tandem Mass Spectrometry

LD Dessorção líquida (do inglês, liquid desorption) LLE Extracção Líquido-Líquido (do inglês, Liquid-Liquid Extraction) LOD Limite de detecção (do inglês, Limit of Detection) LOQ Limite de quantificação (do inglês, Limit of Quantification) LSD Dietilamida do ácido lisérgico M Molaridade m/z Razão massa/carga mbar Milibar MBDB N-metil-1-(benzodioxol-5-il)-2-butanamina MBDSTFA N-metil-N-terc-butildimetilsilil-trifluoroacetamida MBTFA N-metil-bis-trifluoroacetamida mCPP 1-(3-clorofenil)piperazina MDA 3,4-metilenodioxianfetamina MDE N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina MDMA 3,4-metilenodioximetanfetamina MeOH Metanol

MEPS Microextracção em Seringa Empacotada (do inglês, Micro Extraction by Packed Sorbent)

mg Miligramas min Minuto MIP Impressão molecular em polímeros (do inglês, Molecular Imprinted Polymers) mL Mililitro mm Milímetro MRM Multiple Reaction Monitoring

MS Espetrometria de Massa (do inglês, Mass Spectrometry) MSAµE Micro-Extracção Adsortiva em Multi-Esferas

xv

(do inglês, Multi-Spheres Adsorptive Microextraction) MSHFBA N-metil-N-(trimetilsilil)heptafluorobutiramida MSTFA N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida N Normalidade N-1 Graus de liberdade

NPD Detector de Azoto e Fósforo (do inglês, Nitrogen-Phosphorus Detector)

N-TFA Derivados N-trifluoroacilados ºC Graus Celsius ONU Organização das Nações Unidas p.a para analysis

PDMS Polidimetilsiloxano (do inglês, Polydimethylsiloxane) PFPA Anidrido pentafluoropropiónico PFPOH Pentafluoropropanol pH Logaritmo negativo da concentração hidrogeniónica PI Padrão interno pka Constante de ionização PMA p-metoxianfetamina PMAs p-metoxianfetaminas PMMA p-metoximetanfetamina

PTV Vaporização com temperatura programada (do inglês, programmable temperature vaporization)

PU Poliuretano py Piridina r Coeficiente de correlação -R Grupo substituinte

R2 Coeficiente de determinação

ER% Erro relativo percentual Relacre Associação de Laboratórios Acreditados de Portugal rpm Rotações por minuto S/N Razão sinal/ruído (do inglês, signal-to-noise)

SBSE Extracção Sorptiva em Barra de Agitação (do inglês, Stir Bar Sorptive Extraction)

SI Precisão intermédia

SIM Monitorização selectiva de iões (do inglês, Selective Ion Monitoring, Single Ion Monitoring)

SNC Sistema nervoso central SPE Extracção em Fase Sólida (do inglês, Solid Phase Extraction) SPE/GC-MS Extracção em Fase Sólida/Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massa SPME Microextracção em Fase Sólida (do inglês, Solid Phase Microextraction) STF Serviço de Toxicologia Forense

Sy/x Desvio-padrão residual, erro-padrão

TCD Detector de Condutividade Térmica (do inglês, Thermal-Conductivity Detector)

tcrit Valor tabelado da distribuição t Student para (N-1;N-1;α/2)

TD Dessorção térmica (do inglês, thermal desorption)

xvi

TFAA Anidrido trifluoroacético TMCS Trimetilclorosilano TMS Trimetilsilil

tR Tempo de retenção

tRr Tempo de retenção relativo

u.m.a. Unidades de massa atómica

UPLC-FLD Cromatografia Líquida Ultra-Eficiente com detector de Fluorescência (do inglês, Ultra Performance Liquid Chromatrography-Fluorescence Detector)

UPLC-MS Cromatografia Líquida Ultra-Eficiente acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, Ultra Performance Liquid Chromatrography-Mass Spectrometry)

UV Ultravioleta v/v Volume/volume WADA World Anti-Doping Agency

WHO Organização Mundial de Saúde (do inglês, World Health Organization) Wi Factor de ponderação, peso WLQLR Regressão linear ponderada (do inglês, weighted least squares linear regression) α Nível de significância µg Micrograma µL Microlitros µm Micrómetros ΣRE% Somatório do erro relativo percentual

xvii

RESUMO

Têm surgido no mercado ilícito novas drogas de abuso sintéticas, em particular os

denominados estimulantes do tipo anfetamina (ATS), dentro dos quais se incluem os

compostos 2-[4-(etiltio)-2,5-dimetoxifenil]etanamina (2C-T-2), 2-[2,5-dimetoxi-4-

(propiltio)fenil]etanamina (2C-T-7), p-metoxianfetamina (PMA), p-metoximetanfetamina

(PMMA), efedrina, norefedrina e metcatinona. O consumo excessivo deste tipo de drogas

deve-se, em grande parte, à falsa ideia de inocuidade e ainda aos efeitos psicoactivos

estimulantes que apresentam, embora alguns ATS tenham sido associados a mortes na

Europa. A identificação e quantificação destas drogas em fluidos biológicos é imperativa,

particularmente em contexto forense, sendo esse o principal objectivo da presente

dissertação. Foi então desenvolvido e validado um método de identificação e quantificação

simultânea de ATS em amostras de sangue total, com análise por GC-MS em modo SIM

após extracção por SPE e derivatização. O método analítico revelou-se linear de 5 (limite

de quantificação) a 500 ng/mL, com coeficientes de determinação (R2) superiores a 0,99

para todos os analitos, excepto para a metcatinona (0,96). Os limites de detecção (LOD)

foram 1 ng/mL para todos os analitos e o método foi considerado selectivo e robusto. A

precisão variou de 7 a 14%, enquanto a exactidão se situou dentro de um intervalo de

± 15% para todos os analitos, com excepção da efedrina na concentração mais elevada

(17%) e metcatinona, cumprindo em geral os critérios aceites para a validação de métodos

bioanalíticos. A eficiência da extracção foi superior a 80% para todos os analitos em

estudo. O método desenvolvido e validado foi considerado adequado para confirmação

dos ATS e quantificação de 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, PMMA, efedrina e norefedrina em

amostras de sangue. Posteriormente, procedeu-se à aplicação de uma metodologia

alternativa para a análise dos ATS, a microextracção adsorptiva em barra (BAµE). Assim,

os analitos alvo foram extraídos de amostras de urina por BAµE(AC) e analisados por

LC-MS/MS. Considerando que a metodologia foi aplicada em condições padrão, os

resultados preliminares obtidos foram considerados satisfatórios, com a eficiência de

extracção a situar-se entre os 19% e os 48% e LOD de 2 ng/mL.

Palavras-chave: Estimulantes do tipo anfetamina; Sangue total; Urina; SPE ; BAµE;

GC-MS; LC-MS/MS; Validação

xix

ABSTRACT

New synthetic drugs of abuse have recently appeared in the illicit market, particularly the

so-called amphetamine-type stimulants (ATS), such as 2-[4-(ethylthio)-2,5-

dimethoxyphenyl]ethanamine (2C-T-2), 2-[2,5-dimethoxy-4-(propylthio)phenyl]ethanamine

(2C-T-7), p-methoxyamphetamine (PMA), p-methoxymethamphetamine (PMMA),

ephedrine, norephedrine and methcathinone. A remarkable increase has been observed in

the abuse of those drugs due in large part to the erroneous idea of safety and their

psychoactive effects, although some ATS have been associated to deaths in Europe. In this

sense, it’s justified the need of development of an analytical methodology for the

identification and quantification of these drugs in biological fluids, which was the main goal

of this work. Thus, a method for the simultaneous identification and quantification of ATS

in whole blood samples was developed and fully validated. These were analyzed by GC-MS

in SIM mode after SPE and derivatization. The method was linear from 5 (limit of

quantification) to 500 ng/mL, with determination coefficients (R2) higher than 0.99 for all

analytes, except for methcathinone (0.96). The limits of detection (LOD) were 1 ng/mL

for all analytes and the method was considered selective and robust. The precision ranged

from 7 to 14%, while accuracy was within a ± 15% interval for all analytes, except for

ephedrine at the highest concentration level (17%) and methcathinone, fulfilling the criteria

usually accepted for bioanalytical method validation. Extraction efficiency was higher than

80% for all analytes. Therefore, the method developed and validated was considered

adequate for screening and confirmation of all ATS and quantification of 2C-T-2, 2C-T-7,

PMA, PMMA, ephedrine and norephedrine in blood samples. An alternative procedure

was tested, the bar adsorptive micro-extraction (BAµE). Thus, the target analytes were

extracted from urine samples by BAµE(AC) and analyzed by LC-MS/MS. Considering that

the methodology was applied in standard conditions, the preliminary results were

satisfactory, presenting extraction efficiencies between 19% and 48% and LOD of 2

ng/mL.

Keywords: Amphetamine-type stimulants; Whole blood; Urine; SPE; BAµE; GC-MS;

LC-MS/MS; Validation

Introdução

1

1. INTRODUÇÃO

Os derivados anfetamínicos constituem a maior classe de estimulantes do sistema nervoso

central (SNC), tendo por base a molécula de 2-feniletilamina (ou β-feniletilamina),

distinguindo-se entre si pelos vários substituintes no anel e cadeia lateral [1-5]. Na sua

generalidade, estes derivados apresentam acção estimulante ao nível do SNC, mais evidenciada

na anfetamina, ou acção alucinogénica, típica da mescalina. Alguns destes compostos

apresentam características únicas, nomeadamente, capacidade para aumentar o poder de

introspecção, sentimentos de empatia, comunicação e indução de sentimentos de intimidade e

tranquilidade. Estas características levaram a que algumas destas drogas de abuso fossem

denominadas entactogénicas [6-8].

Neste sentido torna-se então conveniente estudar estas drogas de síntese, devido à elevada

incidência da sua utilização recreativa e aos efeitos tóxicos que provocam. Assim, e com o

crescente aumento do número de exames em cenário forense, torna-se essencial dispor de

métodos analíticos rápidos e suficientemente sensíveis, que permitam a monitorização destas

substâncias em amostras biológicas, passíveis de utilização na rotina laboratorial [9]. Por outro

lado, os resultados fornecidos pelo método analítico devem ser rigorosos, já que deles

dependem decisões e sentenças judiciais, com consequências económicas, sociais e jurídicas

sobre o indivíduo e/ou sobre a sociedade. Assim, e antes que possa ser utilizado em análises

de rotina, o método analítico desenvolvido deve ser validado, sendo necessário demonstrar

que este se adequa ao propósito a que se destina [10], ou seja, à detecção e quantificação de

substâncias estimulantes em amostras biológicas.

Nos últimos anos, diversas metodologias analíticas têm sido propostas para a determinação de

estimulantes do tipo anfetamina (de agora em diante ATS, do inglês amphetamine-type stimulant)

em matrizes biológicas (ex. urina, sangue, soro, cabelo) [11-16]. Para além do facto destes

compostos se encontrarem normalmente em concentrações reduzidas, a complexidade das

matrizes biológicas requer técnicas elaboradas de extracção e concentração, com vista à

obtenção de selectividade e sensibilidade adequadas.

A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) é, sem margem para

dúvidas, a técnica de excelência para identificação e quantificação de ATS, em particular

quando comparada com outras alternativas (ex. cromatografia líquida acoplada à

espectrometria de massa, LC-MS), cujos custos associados são mais elevados [13,17-19].

Comparativamente a outro tipo de detectores (ex. FID, NPD), a GC-MS permite a

identificação inequívoca de um determinado composto, condição obrigatória no Serviço de

Introdução o

2

Toxicologia Forense da Delegação do Sul do Instituto Nacional de Medicina Legal (STF),

principalmente se tivermos em consideração que se está a lidar com substâncias cujo consumo

é punível por lei [20].

Os métodos cromatográficos implicam normalmente um passo prévio de preparação das

amostras, processo este que é em geral moroso, podendo em muitos casos corresponder a

cerca de 80% do tempo de análise. O processo de preparação das amostras consiste não só na

extracção (ou enriquecimento) propriamente dita dos analitos da matriz, como também na

limpeza, concentração ou até mesmo a derivatização, dependendo das características das

substâncias em estudo [21]. Inúmeras publicações referentes à análise de ATS reportam a

extracção em fase sólida (SPE) [3,11, 22-27], pelas inúmeras vantagens que lhe estão

associadas, sendo também das técnicas mais utilizadas em análises forenses para a extracção e

pré-concentração de compostos orgânicos presentes em amostras de sangue total.

Neste contexto, o desenvolvimento e validação de métodos analíticos para pesquisa de 2-

feniletilaminas em fluidos biológicos está associado fundamentalmente a dois factores. O mais

relevante prende-se com a importância toxicológica que apresenta actualmente a determinação

deste grupo de substâncias em diferentes tipos de matrizes biológicas. Por um lado, algumas

das substâncias em análise (ex. 2-[4-(etiltio)-2,5-dimetoxifenil]etanamina, 2C-T-2, e

2-[2,5-dimetoxi-4 (propiltio)fenil]etanamina, 2C-T-7) são ainda pouco estudadas, não existindo

metodologias analíticas para a sua determinação em sangue total, pelo que a necessidade de

desenvolver métodos analíticos para a sua identificação e quantificação é claramente

justificada. Por outro lado, outros compostos, como a efedrina, norefedrina,

p-metoxianfetamina (PMA), p-metoximetanfetamina (PMMA) e metcatinona são de interesse

toxicológico, uma vez que são ATS com expressão no panorama de consumo de drogas,

sendo inclusivamente utilizados na produção de outras drogas sintéticas. O segundo factor

prende-se com a escassez de métodos validados na literatura para a triagem/confirmação e

quantificação simultânea dos compostos acima citados em amostras de sangue total e urina, o

que motivou este desenvolvimento.

Adicionalmente, e tendo em consideração as vantagens amplamente descritas na literatura

científica no que respeita à miniaturização, ao uso de novas tecnologias e materiais

adsorventes para a preparação de amostras biológicas, é relevante encarar outras alternativas

para a análise de ATS em amostras biológicas. Acresce que estas alternativas consomem

quantidades desprezíveis de solventes orgânicos, contribuindo deste modo para a utilização de

métodos “verdes” e mais amigos do ambiente [21].

Drogas de abuso

3

2. DROGAS DE ABUSO

O uso de drogas na sociedade perde-se na memória dos tempos. Textos antigos revelam que

os seres humanos usaram e abusaram deliberadamente de substâncias psicoactivas, induzindo

sensações corporais e estados psicológicos alterados. Contudo, é no século XX, devido à

confluência de múltiplos factores (ex. culturais, económicos, meios de comunicação) que os

consumos abusivos se difundem e intensificam [28-29].

2.1. DEFINIÇÃO

Em farmacologia, o termo droga designa, segundo diversos autores, toda a substância estranha

ao organismo que, quando introduzida neste, provoca alterações no seu funcionamento [30-

32]. Deste modo, o termo droga é bastante lato e abrangente, envolvendo todos os

medicamentos ou qualquer substância activa do ponto de vista farmacológico [33].

A Organização Mundial de Saúde (WHO, do inglês World Health Organization) define

farmacodependência como um “estado psíquico, causado pela acção recíproca entre um organismo vivo e um

fármaco, que se caracteriza por modificações do comportamento e por outras reacções que compreendem sempre

um impulso irreprimível de tomar o fármaco de forma contínua ou periódica a fim de experimentar os seus

efeitos psíquicos e, por vezes, para evitar o mal-estar produzido pela privação” [33].

A mesma organização define droga como “qualquer substância que tenha a capacidade de produzir um

estado de dependência e estimulação ou depressão do sistema nervoso central, resultante de alucinações ou

distúrbios nas funções motoras, cerebrais, comportamentais ou na percepção, e abuso similar e efeitos de doenças

às estabelecidas nas Tabelas I, II, III e IV – Classificação das Substâncias Psicotrópicas, Convenção

Substâncias Psicotrópicas de 1971, ONU –, devendo ser considerada uma ameaça à saúde pública e um

problema de controlo internacional” [34-35].

Deste modo, utilizar-se-á na presente dissertação o termo droga como referência a substâncias

psicoactivas, susceptíveis de consumo com fins não terapêuticos e ilícitos. Sob esta designação

genérica incluem-se várias substâncias químicas de origens diversas (naturais, sintéticas ou

semi-sintéticas), onde se englobam, entre as mais conhecidas, os opiáceos, a cocaína, os

canabinóides e as anfetaminas [36].

Drogas de abuso

4

2.2. CONSIDERAÇÕES SOBRE D

A expressão droga sintética refere

processo químico no qual os principais constituintes psicoactivos não derivam de substâncias

de origem natural. A referida expressão começou a ser utilizada como sinónimo de

recreativas, na sequência da popularidade do

outras feniletilaminas [9, 37-38]. Entre as drogas sintéticas mais conhecidas destacam

anfetaminas e a dietilamida de ácido lisérgico (LSD), enquanto o

metilenodioxianfetamina), entre outras drogas incluídas na lista

Known And I Loved: A Chemical Love Story

(PMAs), apresentam um historial relativamente rec

As drogas de design são análogos químicos de drogas controladas ou fármacos, sendo

especialmente “desenhadas” e modificadas pelos produtores ilícitos. Estas modificações

intencionais à estrutura molecular de uma substância proibida

obter efeitos farmacológicos análogos (ou mais fortes), evitando desse modo a acção da

justiça. A introdução de novos substituintes às moléculas originais e controladas permite a

estes indivíduos a prolificação de novas droga

como substâncias controladas [9].

2.3. DERIVADOS DE 2-FENILETILAMINAS

O termo derivados de 2-feniletilaminas

esqueleto básico da 2-feniletilamina, composto formado por um anel benzénico e uma cadeia

lateral de etilamina. A sua estrutura permite substituições (

carbonos alfa (α) e beta (β) e no grupo amina terminal, originando diversos derivados [3

40-43].

O mais conhecido derivado de feniletilaminas é a anfetamina, pelo que muitas vezes estas

drogas se designam por compostos (ou derivados) anfetamínicos.

(a)

Figura 2.1 – Estruturas químicas da 2

Os derivados das feniletilaminas têm origem sintética, e podem ser consumidos por via oral,

intravenosa (diluídas em água), fumados ou aspirados (em pó) [9,

Drogas de abuso

ONSIDERAÇÕES SOBRE DROGAS SINTÉTICAS E DROGAS DE DESIGN

refere-se a substâncias psicoactivas preparadas através de um


de origem natural. A referida expressão começou a ser utilizada como sinónimo de

, na sequência da popularidade do ecstasy (3,4-metilenodioximetanfetamina, MDMA) e

38]. Entre as drogas sintéticas mais conhecidas destacam

anfetaminas e a dietilamida de ácido lisérgico (LSD), enquanto o ecstasy

entre outras drogas incluídas na lista Pihkal - Phenethylamines I Have

Known And I Loved: A Chemical Love Story [39], como o 2C-T2, 2C-T-7 e p-metoxianfetaminas

(PMAs), apresentam um historial relativamente recente de consumo ilícito.

são análogos químicos de drogas controladas ou fármacos, sendo


intencionais à estrutura molecular de uma substância proibida são levadas a cabo de forma a



estes indivíduos a prolificação de novas drogas “legais”, uma vez não estarem classificadas

como substâncias controladas [9].

FENILETILAMINAS

feniletilaminas refere-se a um grupo de substâncias que apresentam o

feniletilamina, composto formado por um anel benzénico e uma cadeia

lateral de etilamina. A sua estrutura permite substituições (-R) no anel aromático, nos

(β) e no grupo amina terminal, originando diversos derivados [3


drogas se designam por compostos (ou derivados) anfetamínicos.

(b)

Estruturas químicas da 2-feniletilamina (a) e da anfetamina (b).


intravenosa (diluídas em água), fumados ou aspirados (em pó) [9,44-45]. Este tipo de drogas e

o

DESIGN

se a substâncias psicoactivas preparadas através de um


de origem natural. A referida expressão começou a ser utilizada como sinónimo de drogas

metilenodioximetanfetamina, MDMA) e

38]. Entre as drogas sintéticas mais conhecidas destacam-se as

cstasy e a MDA (3,4-

Phenethylamines I Have

metoxianfetaminas

são análogos químicos de drogas controladas ou fármacos, sendo


são levadas a cabo de forma a



s “legais”, uma vez não estarem classificadas

se a um grupo de substâncias que apresentam o

feniletilamina, composto formado por um anel benzénico e uma cadeia

R) no anel aromático, nos

(β) e no grupo amina terminal, originando diversos derivados [3-4,8,


feniletilamina (a) e da anfetamina (b).


45]. Este tipo de drogas e

Drogas de abuso

5

os seus efeitos tóxicos têm sido alvo de estudo, sendo muito frequente nas formulações

apreendidas a presença de outras substâncias que, no seu conjunto, aumentam a

imprevisibilidade dos efeitos associados à sua utilização, tornando-as bastante perigosas [46].

Genericamente, as principais acções farmacológicas dos derivados da feniletilamina podem ser

resumidas de acordo com o seu local de acção, nomeadamente ao nível do SNC; de facto,

como potentes estimulantes1 que são, produzem excitação, euforia e diminuição da fadiga,

aumentando o tempo de vigília. Estas drogas penetram rapidamente no SNC (onde exercem a

maior parte dos seus efeitos), induzindo um aumento da libertação de neurotransmissores

excitatórios (dopamina, noradrenalina e serotonina). Os derivados da feniletilamina com

propriedades estimulantes são também conhecidos por ATS [3-4, 47-51]. Contudo, alguns

ATS actuam ainda como potentes alucinogénios (ex. 2C-T-2, 2C-T-7) [4, 8, 52]. Como

substâncias de abuso, os ATS são passíveis de serem empregues isolados ou em associação

com outras drogas e álcool (fenómeno de policonsumo).

Na tabela 2.1 encontram-se resumidas as principais características físico-químicas dos

compostos em estudo na presente dissertação. Note-se ainda que todas as substâncias

presentes nesta tabela se encontram incluídas nas tabelas de Classificação das Substâncias

Psicotrópicas, Convenção Substâncias Psicotrópicas de 1971, ONU [53].

1As substâncias estimulantes ou psicoanalépticas potenciam a actividade do SNC, produzindo sensações de aumento de energia, do estado de vigília e diminuem a sensação de cansaço; por vezes potenciam a capacidade de concentração e podem produzir estados de excitação extrema em doses altas.

Tabela 2.1 - Características físico-químicas dos ATS em estudo.

a Valores experimentais obtidos na base de dados de propriedade físicob Ko/w: Logaritmo do coeficiente de partição do composto entre o octanol e a água, estimado a partir do programa EPI Suite.

ATS

Características

2C-T-2

Estrutura química

Nome IUPAC [54] 2-[4-(Etiltio)-2,5-

dimetoxifenil]etanamina

2

(propiltio)fenil]etanami

CAS[55] 207740-24-7

Fórmula molecular C12H19NO2S

Massa molecular

(g.mol-1) 241,35

pkaa ---

Ko/w b 2,59

químicas dos ATS em estudo.

Valores experimentais obtidos na base de dados de propriedade físico-químicas de Syracuse Research corporation (http://www.syrres.com/esc/phusdemo.htm

Ko/w: Logaritmo do coeficiente de partição do composto entre o octanol e a água, estimado a partir do programa EPI Suite.

2C-T-7 PMA PMMA Metcatinona

2-[2,5-Dimetoxi-4-

(propiltio)fenil]etanami

na

1-(4-

metoxifenil)propan

-2-amina

1-(4-metoxifenil)-

N-metil-propan-2-

amina

2-(metilamino)-1

fenil-propan-1-ona

207740-26-9 64-13-1 22331-70-0 49656-78-2

C13H21NO2S C10H15NO C11H17NO C10H13NO

255,38 165,232 179,259 163,22

--- 9,53 --- ---

3,08 1,84 2,30 1,85

http://www.syrres.com/esc/phusdemo.htm)

Efedrina Norefedrina

1-

ona

2-(metilamino)-1-

fenilpropan-1-ol

2-amino-1-

fenilpropan-1-ol

299-42-3 14838-15-4

C10H15NO C9H13NO

165,23 151,206

10,3 9,44

0,68 0,22

___________________________________________________________Drogas de abuso

2.3.1. SÉRIE 2C: 2C-T-2 E

Os compostos da família 2C encontram

drogas sintéticas. Estas drogas não possuem qualquer tipo de aplicação terapêutica legítima e

constam na lista Pihkal de Alexander Shulgin [39]. Possuem características estruturais de

feniletilaminas, estando associados efeitos estimulantes e alucinogénicos [39, 52, 56

A abreviatura “2C” deriva da nomenclatura proposta por Shulgin [39, 52, 56]. Todos os

compostos da designada série 2C têm em comum uma amina primária separada do anel

aromático por dois átomos de carbono (“2C”). O anel aromático encontra

grupos metoxi nas posições dois e cinco, possuindo ainda um substituinte lipofílico na posi

quatro (ex. grupos alquilo, halogéneos, enxofre (“T”, do sufixo “thio”)). Deste modo são

originados diversos compostos, tal como se pode observar na figura 2.2. Já o sufixo “

“-7” nos compostos 2C-T

estrutural [39, 52, 56-59].

2C-B

2C-I

Figura 2.2 – Estruturas químicas de alguns compostos da série 2C. Adaptado de [56].

Os compostos 2C-T-2 e 2C

1986, respectivamente. Ambas as sínteses, que requerem o uso de equipamento sofisticado e

um ambiente apropriado, encontram

de 1,4-dimetoxibenzeno para produzir um precursor preliminar, 2,5

descreve o composto assim obtido como o precursor de todos os compostos da família

“2C-T”, encontrando-se este comercialmente disponível [20, 57].

Entre 2000 e 2001 foram descritos casos fatais relacionados com o consumo de 2C

que, devido aos crescentes problemas associados a este tipo de drogas, as mesmas passaram a

___________________________________________________________Drogas de abuso

E 2C-T-7

Os compostos da família 2C encontram-se entre um conjunto de compostos designados como

. Estas drogas não possuem qualquer tipo de aplicação terapêutica legítima e

de Alexander Shulgin [39]. Possuem características estruturais de

feniletilaminas, estando associados efeitos estimulantes e alucinogénicos [39, 52, 56


tos da designada série 2C têm em comum uma amina primária separada do anel

aromático por dois átomos de carbono (“2C”). O anel aromático encontra

grupos metoxi nas posições dois e cinco, possuindo ainda um substituinte lipofílico na posi


originados diversos compostos, tal como se pode observar na figura 2.2. Já o sufixo “

T-2 ou 2C-T-7, respectivamente, não têm qualquer

2C-D 2C

2C-E 2C

Estruturas químicas de alguns compostos da série 2C. Adaptado de [56].

2 e 2C-T-7 foram sintetizados pela primeira vez por Shulgin em 1981 e


um ambiente apropriado, encontram-se descritas por Shulgin [39] e baseiam

dimetoxibenzeno para produzir um precursor preliminar, 2,5-dimetoxitiofenol. Shulgin


se este comercialmente disponível [20, 57].

re 2000 e 2001 foram descritos casos fatais relacionados com o consumo de 2C


___________________________________________________________Drogas de abuso

7

se entre um conjunto de compostos designados como

. Estas drogas não possuem qualquer tipo de aplicação terapêutica legítima e

de Alexander Shulgin [39]. Possuem características estruturais de

feniletilaminas, estando associados efeitos estimulantes e alucinogénicos [39, 52, 56-59].


tos da designada série 2C têm em comum uma amina primária separada do anel

aromático por dois átomos de carbono (“2C”). O anel aromático encontra-se substituído com

grupos metoxi nas posições dois e cinco, possuindo ainda um substituinte lipofílico na posição


originados diversos compostos, tal como se pode observar na figura 2.2. Já o sufixo “-2” ou

7, respectivamente, não têm qualquer significado

2C-T-2

2C-T-7

Estruturas químicas de alguns compostos da série 2C. Adaptado de [56].

7 foram sintetizados pela primeira vez por Shulgin em 1981 e


se descritas por Shulgin [39] e baseiam-se na utilização

dimetoxitiofenol. Shulgin


re 2000 e 2001 foram descritos casos fatais relacionados com o consumo de 2C-T-7, pelo


Drogas de abuso___________________________________________________________

8

ser controladas em diversos países da União Europeia, um dos quais Portugal [

assim, tem sido extremamente difícil avaliar o risco específico associado a estas substâncias

devido à falta de informação e de estudos científicos.

Actualmente, nenhum dos compostos possui qualquer utilização terapêutica ou industrial, pel

que o seu uso é considerado exclusivamente ilícito [57]. O

só sob a forma de pó ou comprimidos, mas também pode ser encontrado sob a forma de

cápsulas ou na forma líquida. Este parece ter diversos “nomes de rua”, inclui

Beautiful, Lucky seven, Seven-up,

encontrava-se comercialmente disponível na Europa como

tem associado qualquer tipo de “nome de rua” e

comprimidos (brancos, sem logótipo), pelo que a principal forma de administração é oral. No

entanto, a aspiração nasal é também referida [57].

Estudos efectuados por Shulgin

em doses entre 12-25 mg e 20

neurofarmacológicos de ambas as drogas é meramente baseada em especulações comparativas

com outros compostos parcialmente relacionados, como a 4

(2C-B) e a 2,5-dimetoxi-4-bromoanfetamina (DOB). Não se conhecem estudos relativos ao

metabolismo das referidas drogas em humanos. Theobald

do 2C-T-2 e 2C-T-7 em ratos, aplicando doses correspon

e concluíram que as reacções metabólicas são semelhantes para ambos os compostos,

incluindo N-acetilações, sulfoxidações,

58-59].

(a)

Figura 2.3 – Estruturas

Relatos de consumidores indiciam o início da acção das drogas entre 1

consumo, com efeitos prolongados até 6

no caso do 2C-T-7. No entanto,

consumidores referem que estas drogas actuam mais rapidamente e os efeitos duram menos

tempo em caso de consumo por via nasal [39,57].

abuso___________________________________________________________

ser controladas em diversos países da União Europeia, um dos quais Portugal [


devido à falta de informação e de estudos científicos.

Actualmente, nenhum dos compostos possui qualquer utilização terapêutica ou industrial, pel

que o seu uso é considerado exclusivamente ilícito [57]. O 2C-T-7 encontra-se disponível, não


cápsulas ou na forma líquida. Este parece ter diversos “nomes de rua”, inclui

, Seventh heaven, Red raspberry, Tweety bird mescaline e

se comercialmente disponível na Europa como Blue mystic [40, 52]. Já o 2C

tem associado qualquer tipo de “nome de rua” e encontra-se disponível sob a forma de pó ou


entanto, a aspiração nasal é também referida [57].

Estudos efectuados por Shulgin [39,57] envolveram administração oral de 2C

25 mg e 20-30 mg, respectivamente. A discussão relativa a aspectos


com outros compostos parcialmente relacionados, como a 4-bromo-2,5-dimetoxifeniletilamina

bromoanfetamina (DOB). Não se conhecem estudos relativos ao

metabolismo das referidas drogas em humanos. Theobald et al. [52] estudaram o metabolismo

7 em ratos, aplicando doses correspondentes às normalmente consumidas,


acetilações, sulfoxidações, O-desmetilações, desaminações e hidroxidações [40,

(b)

Estruturas químicas das moléculas 2C-B (a) e DOB (b).

Relatos de consumidores indiciam o início da acção das drogas entre 1-

consumo, com efeitos prolongados até 6-8 horas, no caso do 2C-T-2, e até cerca de 15 horas,

7. No entanto, estes dados referem-se apenas à administração oral, e os


tempo em caso de consumo por via nasal [39,57].

abuso___________________________________________________________

ser controladas em diversos países da União Europeia, um dos quais Portugal [20, 57]. Ainda


Actualmente, nenhum dos compostos possui qualquer utilização terapêutica ou industrial, pelo

se disponível, não


cápsulas ou na forma líquida. Este parece ter diversos “nomes de rua”, incluindo T-seven,

, Tweety bird mescaline e Tripstacy;

[40, 52]. Já o 2C-T-2 não

se disponível sob a forma de pó ou


de 2C-T-2 e 2C-T-7

A discussão relativa a aspectos


dimetoxifeniletilamina

bromoanfetamina (DOB). Não se conhecem estudos relativos ao

[52] estudaram o metabolismo

dentes às normalmente consumidas,


desmetilações, desaminações e hidroxidações [40,

-2 horas após o

2, e até cerca de 15 horas,

se apenas à administração oral, e os


___________________________________________________________Drogas de abuso

9

De momento não existem estudos efectuados em animais nem em humanos relativamente à

toxicidade geral, toxicidade reprodutiva, neurotoxicidade ou mutagenicidade e potencial

carcinogénico dos compostos em causa. Apenas se encontram disponíveis evidências

subjectivas de consumidores, envolvendo observações de aparentes efeitos adversos e

sintomas tóxicos. Há registos de violência, agitação, vómito, confusão mental, desorientação e

até mesmo coma, especialmente para o 2C-T-7 [57]. Embora não existam relatos de mortes ou

intoxicações não-fatais envolvendo 2C-T-2, encontram-se descritas situações fatais associadas

ao consumo de 2C-T-7, tal como já foi referido anteriormente [57, 60-61].

2.3.2. p-METOXIANFETAMINAS: PMA E PMMA

As p-metoxianfetaminas (PMAs) são drogas sintéticas derivadas de feniletilaminas [62-64]. O

PMA (Death, Dr. Death, Chicken Powder, Chicken Yellow, Mitsubishi, Double-Stack, Killer, Red Mitsubishi) [63,65] apareceu no mercado europeu pela primeira vez em Dezembro de 1998. É

um derivado metoxilado da anfetamina e entre os seus precursores e reagentes utilizados para

a sua síntese encontram-se o 4-metoxibenzaldeído, nitroetano, benzeno, metanol e

ciclohexano, todos eles disponíveis comercialmente [63]. É uma droga potente e possui

características semelhantes às anfetaminas, sendo potencialmente letal dada a estreita margem

de segurança. É normalmente encontrada em comprimidos, sozinha ou em associação com

outras anfetaminas, e tem sido associada a inúmeras intoxicações mortais [62-72]. Apesar de

não ter aplicação terapêutica, este composto é um intermediário para a síntese de alguns

fármacos, como o fenoterol e formeterol, ambos com acção broncodilatadora [63-64, 72].

O PMMA, que aparentemente não tem associado qualquer “nome de rua”, foi sintetizado pela

primeira vez em 1938 [73]. Trata-se de uma estrutura híbrida entre o PMA e a metanfetamina,

e entre os seus precursores e reagentes de síntese encontram-se a 4-metoxifenilcetona,

hidrocloreto de metilamina, cianoborohidreto de sódio, cloroformato de etilo e ácido fórmico

[63]. Apesar de também não ter qualquer aplicação terapêutica, o PMMA é um precursor

sintético da foledrina (p-hidroxianfetamina), um agente simpatomimético (“Veritol”, fármaco

não disponível em Portugal) [65,74], pelo que se encontra disponível comercialmente.

Ambos os compostos têm sido vendidos sob a forma de comprimidos para administração

oral, com a aparência de ecstasy e com logótipos apelativos (Mitsubishi, Jumbo, E, trevo de quatro

folhas, entre outros). Estes compostos têm sido ocasionalmente encontrados em comprimidos

rotulados de ecstasy, embora os seus efeitos sejam distintos [41, 63, 75-76]. A maioria dos

comprimidos contém PMA e PMMA em associação, podendo conter também anfetamina,

metanfetamina, MDMA ou efedrina. Assim, os PMAs não são administrados isoladamente, o

Drogas de abuso___________________________________________________________

10

que aumenta a sua toxicidade e adiciona mais um factor de risco: o factor da imprevisibilidade

da interacção entre drogas. Isto sucede porque aparentemente não existe um mercado

explícito na Europa para o PMA ou PMMA. A combinação destes dois compostos, vendida

com um logótipo similar ao do ecstasy, não parece ser acidental, mas sim uma associação

deliberada, cujo objectivo é simular os efeitos esperados com o consumo de MDMA. Por

outro lado, a grande disponibilidade dos precursores implicados na sua síntese pode potenciar

este fenómeno [63, 76-78].

O PMA foi o primeiro a ser inserido nas tabelas da Classificação das Substâncias Psicotrópicas,

Convenção Substâncias Psicotrópicas de 1971, ONU, pois é uma droga muito potente com

características similares às das anfetaminas [62-65,75,79]; de facto, em animais, a sua potência

como alucinogéneo é quase equivalente à do LSD [78], e cerca de cinco vezes mais potente

que a mescalina [64,79], sendo potencialmente letal [62, 80-82]. Por outro lado, o PMMA é

consumido no contexto da cultura “ecstasy”, na qual existem expectativas relativamente à

qualidade, rapidez e durabilidade dos efeitos. Consequentemente, os efeitos díspares daqueles

observados com o MDMA, mesmo quando em combinação com o PMA, levam ao consumo

de um maior número de comprimidos para atingir o mesmo resultado, aumentando

consequentemente o risco de overdose [63,82], com fatalidades associadas ao seu consumo

[67,69-70,81-82]. Na realidade, existe pouca informação relativamente ao PMMA, sendo o

PMA e MDMA muito mais conhecidos [63,75]. Sendo assim, algumas considerações feitas em

relação àquele baseiam-se em experiências com compostos estruturalmente relacionados [63].

Ainda assim, estudos recentes efectuados em animais indicam que este composto induz efeitos

estimulantes, que são considerados similares aos obtidos com MDMA, embora menos

potentes. Mais, este não apresenta efeitos alucinogénicos, ao contrário do PMA, sendo

considerado deste modo uma droga entactogénica [63,75,86].

Estudos realizados em cobaias mostram que o PMA e o PMMA parecem provocar os

mesmos efeitos tóxicos do MDMA, embora mais acentuados. Assim, são reportadas

hiperpirexia (hipertermia extrema), sendo o sintoma mais comum, agitação, arritmia,

convulsões, coma e neurotixicidade serotoninérgica em doses elevadas. O consumo repetido

de PMA ou PMMA pode causar inibição da isoenzima CYP2D6 (citocromo P450),

responsável pelo seu metabolismo hepático (reacções de O-desmetilação), consequentemente

aumentando a resposta hipertérmica. A toxicidade aguda do PMA e PMMA pode levar ao

aumento extraneuronal dos níveis de serotonina, pelo que à semelhança do MDMA, é possível

que estas drogas induzam a degeneração dos neurónios serotoninérgicos [63,75,85]. Já os

___________________________________________________________Drogas de abuso

11

efeitos em humanos apenas foram reportados por Shulgin [39], que descreve efeitos díspares

dos do MDMA.

2.3.3. CATINONAS: METCATINONA

A metcatinona é um estimulante psicoactivo de origem sintética, utilizado como droga

recreativa e considerada aditiva. Quimicamente é um derivado N-metilado da catinona, um

dos princípios psicoactivos que pode ser encontrado na planta Catha edulis (khat) [86-91].

Entre os agentes psicoactivos presentes nas folhas de khat incluem-se a catinona, a catina

(norpseudoefedrina) e a norefedrina, mas ainda existem muitos compostos não estudados [87-

88,91]. A catinona assemelha-se às anfetaminas, tanto na estrutura química como nos efeitos

bioquímicos e comportamentais, embora apresente apenas cerca de metade da sua potência.

Este estimulante, bem como alguns dos seus derivados produzidos sinteticamente, como é o

caso da metcatinona, são substâncias controladas ao abrigo da Convenção das Nações Unidas sobre

as Substâncias Psicotrópicas (1971), o que não acontece com as folhas de khat. [86,89,92].

A primeira catinona sintética a aparecer no mercado como droga recreativa foi a metcatinona,

embora actualmente estejam a ser monitorizadas quinze catinonas, destacando-se a

metcatinona, a mefedrona, a metilona, e a metedrona, entre outras [86]. A metcatinona foi

sintetizada pela primeira vez em 1928 [93] como um intermediário na síntese da efedrina

(figura 2.4), tendo sido usada na ex-União Soviética nos anos 30 e 40 do século XX, como um

antidepressivo [86, 88]. Desde os anos 60 do século XX tem sido usada como uma droga

recreativa. Este estimulante, também conhecido por Cat, Jeff, Mulka, Cosmos ou Efedrona, é

normalmente aspirado, embora possa ser fumado, injectado ou administrado oralmente

[86,88-89]. É sintetizada com facilidade a partir da oxidação da efedrina (daí o nome

“efedrona”) [86,88-90], o que pode levantar alguns problemas no combate a esta droga ilícita.

Figura 2.4 – Síntese da metcatinona: reacção de oxidação da efedrina. Adaptado de [90].

Os derivados de catinonas existem sob duas formas isoméricas, tendo os isómeros ópticos da

metcatinona sido identificados em 1936. Tanto a S(-) como a R(+)-metcatinona foram

estudadas, tendo sido concluído que ambos eram activos, apesar do isómero S(-) ser cerca de

três a cinco vezes mais potente que o isómero R(+) [86,88-89]. A metcatinona é um potente

Drogas de abuso___________________________________________________________

12

estimulante e inibidor da recaptação da dopamina no SNC, sendo ainda mais potente que a

anfetamina. Como estimulante que é, a metcatinona causa euforia e diminuição do apetite

embora possa causar efeitos desagradáveis para o consumidor, tais como a hipertensão e

taquicardia. Em casos de doses elevadas podem surgir sintomas como confusão mental,

paranóia e psicoses, que tipicamente desaparecem com a cessação do consumo [86,88-

89,90,92].

2.3.4. EFEDRINAS: EFEDRINA E NOREFEDRINA

A efedrina e a norefedrina são estimulantes naturais com propriedades medicinais úteis,

podendo ser encontradas em determinadas plantas da espécie Ephedra [94-96]. A planta

Ephedra vulgaris (também conhecida por ma huang) é usada na medicina chinesa há pelo menos

cinco mil anos. Com efeito, textos chineses que datam do século XV recomendam o uso desta

planta pelas suas propriedades antipiréticas e antitússicas, bem como pela eficácia

demonstrada no tratamento de sintomas de artrite [94,96].

A efedrina foi isolada e sintetizada pela primeira vez em 1885 por Nagayoshi Nagi, um

químico japonês [97]. Já em 1930, a publicação por Chen e Schmidt de um artigo

recomendando a efedrina para o tratamento da asma, fez subir o interesse neste composto,

sendo que ainda hoje a efedrina tem aplicabilidade terapêutica, nomeadamente como

broncodilatador, antiasmático, antitússico e descongestionante nasal [96-100]. Já a norefedrina,

também utilizada como descongestionante nasal, tem aplicações na medicina veterinária,

sendo utilizada em fármacos para controlar a incontinência urinária em cães [94-95, 102]. No

entanto, os seus principais usos não são medicinais, sendo utilizadas ilicitamente como

suplemento dietético de emagrecimento e agentes dopantes. A efedrina é ainda um

intermediário na síntese de metanfetamina e metcatinona [94, 102-103].

A efedrina é também um potente estimulante do SNC [95,96,98,101,104] os seus efeitos

imediatos são atribuídos à estimulação da libertação da dopamina [95,98,104] e podem durar

até várias horas após a administração oral [95,100]. Em suma, a efedrina leva à melhoria do

humor e estado de alerta com diminuição da fadiga e sono [95-96,104]. Já a norefedrina

considera-se ter relativamente pouco efeito estimulante no SNC; no entanto, pode induzir

estados agitados, ansiedade, insónia e tremores, efeitos mascarados pelos fabricantes através

da adição de anti-histamínicos [95-96,102,105].

Foram efectuados estudos relativamente à eficácia e segurança da utilização de efedrina e

norefedrina em humanos para combater a obesidade. No geral, os estudos mostraram uma

___________________________________________________________Drogas de abuso

13

redução no peso estatisticamente significativa em pacientes obesos tratados com efedrinas em

relação a outros tratados com placebo. E embora estas efedrinas suprimam o apetite, o

principal mecanismo para promover a perda de peso parece ser o aumento do metabolismo

do tecido adiposo [106-108].

Devido à absorção rápida e completa da efedrina no tracto gastrointestinal, que geralmente

dura entre 2 a 2,5 horas, o início dos efeitos farmacológicos é geralmente evidente dentro de

uma hora após ingestão [99,107]. Uma vez absorvida, a efedrina distribui-se pelo organismo,

com maiores concentrações no fígado e rins, seguindo-se o cérebro, baço, tecidos adiposos e

saliva [98]. As efedrinas são lipofílicos, atravessando facilmente a barreira hemato-encefálica. É

esta a propriedade responsável pelos efeitos no SNC, que incluem a supressão do apetite,

ansiedade e alterações gástricas [100,107].

Os efeitos da efedrina duram aproximadamente uma hora, sendo a urina a principal via de

excreção [107]. Aproximadamente 95% da dose pode ser excretada na forma livre (55 a 75%)

ou sob a forma de metabolitos em 24 horas [99]. Cerca de 8-20% da efedrina administrada é

metabolizada a norefedrina através de uma N-desmetilação, enquanto 4-13% sofre

desaminação oxidativa, resultando na formação de 1-fenilpropano-1,2-diol, seguida de

oxidação da cadeia lateral formando ácido benzóico e ácido hipúrico. Já a norefedrina é

absorvida após ingestão oral; mais de 90% da dose consumida é excretada na urina sob a

forma livre em 24 horas, juntamente com pequenas quantidades de ácido hipúrico. Note-se

que na quantificação destas substâncias em urina devem ter-se em atenção a sua

farmacocinética [95, 98-99,107,110].

Os efeitos cardiovasculares adversos consequentes ao uso destas efedrinas estão bem

documentados na literatura, e incluem taquicardia, arritmia, hipertensão, angina peitoral,

enfarte do miocárdio e morte súbita. Também são expectáveis efeitos como acne, anorexia,

náuseas, confusão mental, insónia, pânico e agitação, entre outros [98-100, 107,110].

2.4. ENQUADRAMENTO: NOVAS DROGAS E TENDÊNCIAS EMERGENTES

As novas substâncias psicoactivas e os novos padrões de consumo de drogas podem ter

graves implicações em termos de saúde pública, especialmente porque nos últimos anos

surgiram no mercado ilegal novos compostos sintéticos não regulamentados. Verifica-se então

a comercialização de uma vasta gama de substâncias especialmente “desenhadas” de modo a

escaparem à fiscalização de substâncias proibidas, tal como produtos intencionalmente mal

rotulados.

Drogas de abuso___________________________________________________________

14

A capacidade demonstrada por alguns químicos para realizar sínteses orgânicas a baixo preço

gera ainda um acesso potencial a um número considerável de substâncias psicoactivas,

originando grupos de substâncias químicas novos, incluindo substâncias análogas, que podem

ser difíceis de detectar. Adicionalmente, algumas destas substâncias podem ter utilizações

legítimas [9].

A produção mundial de anfetaminas continua a estar concentrada na Europa, onde se

situavam 81% dos laboratórios notificados em 2007. Na Europa Ocidental e Central foram

efectuadas 36% das apreensões mundiais (no total, quase 24 toneladas), o que reflecte o papel

da Europa como principal produtor e consumidor destas drogas. Alguns Estados-Membros da

União Europeia (ex. Filândia) referem níveis relativamente elevados de consumo de

anfetaminas entre a população [9].

Note-se ainda que é usual detectar a presença de substâncias psicoactivas em muitos casos

médico-legais, quer resultantes de uma overdose, ou seja, casos de morte na sequência da acção

directa de drogas de abuso, quer resultantes da associação de uma droga com outros agentes

farmacológicos potenciadores ou sinérgicos (e. g. álcool, benzodiazepinas). Por outro lado, a

degradação de funções do SNC, provocada pelo consumo destas substâncias, prejudica a

capacidade de condução, aumentando consequentemente o risco de acidente.

Pelo exposto, e tendo em conta que em diversos países os compostos que figuram na tabela

2.2 se encontram controlados, é desejável que se assegurem métodos analíticos nos

laboratórios toxicológicos forenses para a análise qualitativa e quantitativa destas substâncias

em amostras biológicas.

Estratégias para análise de drogas de abuso

15

3. ESTRATÉGIAS PARA ANÁLISE DE DROGAS DE ABUSO

3.1. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA (GC-MS)

Etimologicamente formada pela conjugação das palavras gregas “chroma” (cor) e “graphein”

(escrita), a cromatografia ou escrita da cor, é uma técnica analítica de separação por excelência,

tendo ganho relevo por volta de 1903, com o botânico russo Mikhail Semenovich Tswett

[111]. Desde então têm sido feitos inúmeros avanços, originando importantes progressos em

várias áreas científicas, [1,111-115], nomeadamente, na toxicologia forense.

Na cromatografia gasosa (GC), técnica desenvolvida através dos trabalhos de Prior, Martin e

Synge, a amostra é introduzida num injector, ligado à coluna cromatográfica. Dá-se então o

transporte dos compostos gasosos, ao longo da fase estacionária, por meio de uma fase móvel

gasosa (gás de arraste) e separados com base nos seus pontos de ebulição e polaridade

[1,111,114-115].

O hidrogénio, o hélio e o azoto são os gases mais usados como fase móvel. Estes devem ser

puros e quimicamente inertes e a sua escolha está relacionada com as vantagens e

inconvenientes associados a cada um deles, nomeadamente, custos, rapidez da análise e

segurança, sendo o hélio o mais habitual [1,111,113-115].

Usualmente, as injecções são realizadas de forma rápida, com recurso a micro-seringas que

injectam as misturas numa câmara de vaporização. A mistura vaporizada passa por um liner

inerte de vidro silanizado e, de seguida, os compostos entram na coluna cromatográfica, onde

são separados [1,111,113,115]. Existem diversos tipos de sistemas de injecção, apresentando

cada um vantagens e inconvenientes. Os sistemas de injecção que utilizam colunas capilares

operam frequentemente com e sem repartição de fluxo (split e splitless, respectivamente) ou sob

vaporização com temperatura programada (PTV). Os modos de operação split/splitless

permitem controlar a quantidade de amostra que é introduzida na coluna, a qual depende da

concentração dos compostos na mistura: no modo splitless toda a amostra é introduzida,

enquanto no modo split apenas uma fracção entra na coluna, sendo a restante amostra

eliminada através de uma válvula, evitando assim a saturação da coluna com elevadas

concentrações dos compostos [1,111,113,117-118].

A fase estacionária, sólida ou líquida, encontra-se no interior da coluna cromatográfica

(suporte físico de metal ou vidro), que pode ser empacota ou capilar, sendo esta última a mais

usual. Uma fase estacionária para GC deve obedecer a determinados critérios, como ser pouco

volátil (idealmente com ponto de ebulição 100°C acima do valor de temperatura máxima de

Estratégias para análise de drogas de abuso o

16

operação da coluna), estabilidade térmica e quimicamente inerte. As colunas capilares,

apresentam diversas vantagens em relação às colunas empacotadas pois são mais eficientes,

promovendo separações com maior resolução. [1,111,113-114,117].

Em GC, apesar da interacção com a fase estacionária também influenciar a ordem de eluição

dos compostos, esta é principalmente determinada pelos seus pontos de ebulição. Contudo, os

compostos apolares são, regra geral, mais facilmente separados por uma fase apolar, enquanto

para os polares uma fase polar origina uma separação mais eficiente. A fase apolar mais

simples é a de polidimetilsiloxano (PDMS), que apresenta vários grupos metilo. Alguns destes

grupos metilo podem ser substituídos por grupos diferentes (ex. grupos fenilo), variando

assim a polaridade da fase estacionária. Também a espessura da fase estacionária influencia a

eficiência da coluna; quando se pretende separar compostos com baixa volatilidade utilizam-se

colunas com espessuras mais finas, enquanto espessuras maiores são usadas para compostos

muito voláteis [1,111,113-114,117].

A temperatura a que se encontra a coluna deve ser controlada, uma vez ser um parâmetro

importante na separação dos compostos. Assim, numa separação isotérmica a coluna é

mantida a uma temperatura constante, enquanto um gradiente de temperaturas permite

aumentar a temperatura de forma gradual ou por patamares [1,111,113-114].

Um detector ideal para GC deve proporcionar sensibilidade adequada, originando limites de

detecção baixos, deve ser estável e reprodutível, originar uma resposta linear numa gama

alargada de concentrações. Deve ainda ser de fácil utilização e o seu tempo de resposta deve

ser reduzido e independente do fluxo. A sua resposta pode ser equivalente para todos os

analitos (detector universal) ou selectiva para determinadas grupos de compostos (detector

selectivo). Para além da GC ter a possibilidade de hifenação (ex. espectrómetro de massa),

existem diversos detectores convencionais, que devem ser escolhidos em função da aplicação

pretendida, sendo os mais comuns os que se apresentam na tabela 3.1 [1,114,118].

Tabela 3.1 - Detectores geralmente utilizados em GC [114].

Detector Tipo Aplicação

Ionização de chama (FID) Universal Análise de compostos com cadeias carbonadas

Condutividade térmica (TCD) Universal Análise de compostos gasosos

Captura electrónica (ECD) Selectivo Compostos com elevada afinidade electrónica

Azoto-fósforo (NPD) Selectivo Compostos contendo azoto e/ou fósforo


17

A GC-MS é uma técnica hifenada, associando o poder da separação da GC à detecção

selectiva e sensível da MS. Assim, após separação cromatográfica, as moléculas, já na fonte de

ionização, são ionizadas e fragmentadas; os iões formados são então separados num analisador

de massa e detectados de acordo com a sua razão massa/carga (m/z). Dado que cada

composto sofre uma ionização e fragmentação características, o respectivo espectro de massa

permite identificar de forma inequívoca um composto, quer por comparação com bibliotecas

de espectros, quando o analito é conhecido, quer por dedução da estrutura molecular, para

compostos orgânicos desconhecidos [1,114,117-119].

Durante a ionização o analito é convertido numa espécie carregada por um de vários

processos de ionização existentes. Aquando da escolha do processo de ionização deve ter-se

em conta a quantidade de energia interna transferida durante o processo, assim como as

propriedades físico-químicas do analito-alvo. As técnicas de ionização convencionais,

nomeadamente a impacto electrónico (EI) e a ionização química (CI) requerem que o analito

esteja no estado de vapor para que se dê a interacção com um feixe electrões (e-), ou agentes

químicos, respectivamente [1,114,117-119]. Na EI, as moléculas são bombardeadas por um

feixe de e- (geralmente, 70 eV) quando entram na câmara de ionização. A colisão provoca uma

transferência de energia superior à necessária para a ionização das moléculas que, geralmente,

é usada pelos iões para se fragmentarem de uma forma característica; deste modo, podem

posteriormente ser comparados com bibliotecas de espectros para identificação de compostos

desconhecidos, uma vez serem reprodutíveis para a grande maioria dos compostos orgânicos.

O modo de ionização EI apresenta diversas vantagens, nomeadamente o facto de produzir

muitos iões, o que contribui para a obtenção de sensibilidades mais elevadas e originar

fragmentação extensa, muito útil para a identificação dos compostos. Todavia, esta

fragmentação pode ser também uma desvantagem, pois o ião molecular pode ser

completamente fragmentado, não sendo observado no espectro de massa e impedindo a

determinação da massa molecular do composto [1,114,117-119].

Após os iões serem produzidos, é necessário efectuar a sua separação com base na sua razão

m/z. Existem diversos analisadores de massa que permitem efectuar esta separação,

apresentando cada um vantagens e inconvenientes. Um dos analisadores de massa mais

comuns em GC-MS é o quadrupolo. Este pode analisar todas as razões m/z num determinado

intervalo de massas (varrimento contínuo, do inglês full scan) ou apenas algumas razões m/z

específicas (monitorização selectiva de iões, SIM, do inglês Selective Ion Monitoring). No modo

full scan todas as massas dentro de um intervalo geralmente definido entre valores de m/z de

50 e 600 são analisadas, obtendo-se um registo completo da análise dos iões da amostra. No


18

modo SIM, o analisador de massa detecta apenas alguns valores de m/z previamente

seleccionados, aumentando a sensibilidade, o que permite baixar os limites de detecção, visto

que mais tempo é dispendido a analisar cada um dos fragmentos iónicos com interesse [1,113-

114,117-119].

O detector de iões comummente usado em MS é o multiplicador de electrões, que apresenta

um tempo de resposta rápido (nanosegundos). Este sistema baseia-se no princípio de emissão

secundária de electrões, isto é, quando o ião atinge a superfície do dínodo de conversão ocorre

a libertação de alguns electrões que sofrem aceleração e colidem com o novo dínodo,

iniciando outro ciclo, sendo o sinal é ampliado 103-108 vezes [1,117-119].

3.2. TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS

A etapa de preparação de amostra é geralmente o passo limitante de todo o processo analítico,

podendo envolver em média até cerca de dois terços do tempo total dispendido [21]. Esta

etapa abrange, fundamentalmente, a extracção e concentração dos analitos a partir da matriz

biológica, permitindo não só alcançar menores limites de detecção, mas também a limpeza dos

extractos, ou até mesmo a derivatização dos analitos, dependendo das suas características. A

escolha do modo de preparação de amostras depende principalmente da natureza dos analitos

(ex. volatilidade ou polaridade), da natureza da matriz e dos níveis de concentração que se

pretendem detectar. Neste sentido, a preparação das amostras é um processo de vital

importância, dele dependendo o sucesso da análise cromatográfica, pelo que as técnicas

utilizadas assumem extrema relevância [21].

Na actual era da “química verde”, conceito introduzido há cerca de vinte anos nos Estados

Unidos da América [120], as técnicas de preparação de amostras para análise cromatográfica já

não se compadecem com o excessivo consumo de solventes orgânicos tóxicos, como sucede

na extracção líquido-líquido (LLE), tendo em vista o impacto ambiental que esse

comportamento acarreta [120]. Neste sentido, têm surgido novos conceitos aliados a

metodologias que conseguem conjugar a miniaturização analítica com a redução ou até mesmo

a eliminação do consumo de solventes orgânicos (solventless), para enriquecimento de analitos-

alvo. Nesta área, destacam-se a SPE, a microextracção em fase sólida (SPME), a extracção

sorptiva em barra de agitação (SBSE) e a microextracção em seringa empacotada (MEPS),

entre outras, que para além de reduzirem a manipulação analítica, proporcionam significativa

sensibilidade na recuperação de analitos alvo, elevada reprodutibilidade, rapidez, baixo custo e

facilidade de automatização [21,113,121-125].


19

3.2.1. EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)

O conhecimento das propriedades adsortivas das superfícies sólidas remonta a várias décadas

atrás. A aplicação da técnica de SPE foi então incentivada pela utilização do carvão activado

(CA) no tratamento e purificação de água na década de 50. No entanto, a era moderna da SPE

começou em 1977, quando a empresa Waters disponibilizou comercialmente colunas

descartáveis contendo materiais sólidos [21].

O desenvolvimento de novos matérias sólidos estimulou o recurso à técnica de SPE, sendo

actualmente uma técnica vulgarizada, utilizada para a extracção, concentração e limpeza (clean-

up) do(s) analito(s) com interesse de diversos tipos de matrizes nas mais variadas áreas:

farmacêuticas [126], ambientais [127], alimentares [128] e toxicológicas [129-132]. Em relação

a outras técnicas de extracção amplamente usadas, como a LLE, a SPE destaca-se e apresenta

diversas vantagens, uma vez possuir grande versabilidade, combinando extracção com limpeza

e concentração de amostras, removendo os componentes interferentes da matriz, com

consumo reduzido de solventes orgânicos, permitindo também a troca de solventes (ex.

aquoso para orgânico), e utilização de menores volumes de amostra. Devido às suas

características, nos últimos anos, a SPE tem vindo a substituir quase por completo a LLE,

uma vez ter provado ser uma técnica muito poderosa na preparação de amostras para análise

cromatográfica e electroforética, sendo de fácil e rápida execução, selectiva, exacta, precisa,

não forma emulsões, fácil de automatização, pouco morosa, atinge níveis de recuperação de

analito significativos e com extractos limpos. É importante referir que a SPE raramente é

utilizada sem recorrer a outros tratamentos, nomeadamente a diluição ou ajuste de pH da

amostra. No entanto, esta técnica permite reduzir substancialmente outros tratamentos que

seriam necessários para isolar os analitos-alvo e que são mais morosos, como é o caso da LLE

[21,121,132-139].

Resumidamente, esta técnica de preparação consiste num processo que envolve a passagem de

uma solução que contém o composto de interesse através de uma coluna empacotada com

uma fase sólida (técnica dinâmica). O composto de interesse irá distribuir-se entre a amostra

no estado líquido e a fase sólida (sendo adsorvido na sua superfície) atingindo-se, assim, um

equilíbrio. Inicialmente, como resultado das interacções fortes que se estabelecem, o analito é

retido pela fase sólida e, desta forma, isolado da matriz (retenção). Posteriormente, são

eliminados os interferentes através da limpeza da fase estacionária. Após a concretização desta

etapa, segue-se a eluição, que consiste na dessorção do analito, ou seja, a sua remoção selectiva

da fase sólida e posterior recolha. Para tal, recorre-se a uma solução denominada eluente, à

qual o analito tem mais afinidade química e que arrastará o mesmo para o recipiente de


20

recolha colocado à saída da coluna. O extracto obtido, de volume reduzido, contém os

analitos concentrados, que posteriormente poderá ser directamente analisado por

cromatografia ou electroforese capilar (CE) ou, alternativamente, poderá ser evaporado e

reconstituído com um solvente mais adequado ao tipo de análise pretendida [21,121,133,135-

137,139-140]. A figura 3.1 representa, esquematicamente, as várias etapas do método SPE.

Passo 1: escolha do enchimento

Passo 2: acondicionamento

Passo 3: introdução da amostra

Passo 4: lavagem

Passo 5: eluição

Figura 3.1 - Representação esquemática das etapas do método de SPE: matriz ( ), impureza ( ), analito

( ), solvente A ( ), solvente B ( ), solvente C ( ). Adaptado de [141].

A variedade das fases estacionárias comercialmente disponíveis permite a existência de vários

mecanismos de interacção entre estas e o analito. Após o desenvolvimento e vasta aplicação

desta técnica, ficou bem claro que não existe uma fase extractiva universal capaz de extrair

analitos distintos nas mais diversas aplicações. Será então necessário fazer uma selecção

apropriada das fases sólidas consoante a área de trabalho ou grupos de compostos que se

pretendam analisar [21]. O tipo de enchimento sólido deve ser seleccionado de acordo com os

mecanismos de retenção pretendidos e pode ser classificado como fase normal, possuindo

grupos funcionais polares; fase reversa, possuindo grupos funcionais apolares; troca iónica,

podendo conter grupos funcionais aniónicos ou catiónicos e exclusão molecular, sendo o

mecanismo de separação baseado na dimensão do analito e dos poros da fase estacionária.

Existem os mais diversos tipos de adsorventes, e com as potencialidades dos materiais

poliméricos, que apresentam uma maior área superficial e maior capacidade quando

comparados às fases de sílica, dada a maior percentagem de carbono, surgem novas

possibilidades, nomeadamente a introdução de grupos funcionais aniónicos ligados (ex. ácidos

carboxílicos e sulfónicos, carboximetil) ou catiónicos (ex. trimetilaminopropril, aminopropil).

Porém, este tipo de fases é vulgarmente usado em associação com fases estacionárias de fase

reversa (SPE de modo misto

uma fase estacionária simultaneamente apolar (copolímero polidivenilbenzeno e N

vinilpirrolidona) e de troca catiónica forte (ácido sulfónico), pelo que ocorrem dois

mecanismos de retenção primários (

reter os analitos apolares mediante forças de van der Waals e os compostos básicos por

atracções electrostáticas. A utilização de um solvente orgânico adequado permitirá eluír os

compostos retidos por adsorção, ao passo que aqueles que foram retidos por troca iónica

serão eluídos por troca com um contra

forma molecular com o auxílio de eluentes iónicos, ácidos ou básicos [21, 121,133,135

137,139-140,142].

Figura 3.2 – Representação do mecanismo de extracção por SPE de modo(propranolol). Adaptado de [143].

Apesar das inúmeras vantagens anteriormente mencionadas, a preparação de amostras para

análise cromatográfica direcciona

amostra, redução do número de passos analíticos e tempo envolvidos, isenção de solventes

orgânicos (solventless) e miniaturização dos sistemas extractivos, principalmente com recurso às

inovadoras técnicas de extracção sortiva [21,144].

3.2.2. Extracção Sortiva em Barra

Em 1999, Pat Sandra e colaboradores [145

qual uma barra de agitação constituída por um magnete envolto numa fina película de vidro

revestido por PDMS é colocada numa amostra sob agitação, d


SPE de modo misto). A título de exemplo, as colunas MCX da Waters®, possuem

ia simultaneamente apolar (copolímero polidivenilbenzeno e N


mecanismos de retenção primários (vide figura 3.2). Desta forma, esta fase estacionária pode

s apolares mediante forças de van der Waals e os compostos básicos por



eluídos por troca com um contra-ião presente no solvente, ou por conversão à sua

forma molecular com o auxílio de eluentes iónicos, ácidos ou básicos [21, 121,133,135

Representação do mecanismo de extracção por SPE de modo misto (MCX) de uma droga básica (propranolol). Adaptado de [143].


análise cromatográfica direcciona-se cada vez mais no sentido da diminuição do volume da

redução do número de passos analíticos e tempo envolvidos, isenção de solventes

) e miniaturização dos sistemas extractivos, principalmente com recurso às

inovadoras técnicas de extracção sortiva [21,144].

Extracção Sortiva em Barra de Agitação (SBSE)

Em 1999, Pat Sandra e colaboradores [145-146] desenvolveram uma nova técnica, a SBSE, na


revestido por PDMS é colocada numa amostra sob agitação, de modo a promover


21

). A título de exemplo, as colunas MCX da Waters®, possuem

ia simultaneamente apolar (copolímero polidivenilbenzeno e N-


figura 3.2). Desta forma, esta fase estacionária pode

s apolares mediante forças de van der Waals e os compostos básicos por



ião presente no solvente, ou por conversão à sua

forma molecular com o auxílio de eluentes iónicos, ácidos ou básicos [21, 121,133,135-

misto (MCX) de uma droga básica


se cada vez mais no sentido da diminuição do volume da

redução do número de passos analíticos e tempo envolvidos, isenção de solventes

) e miniaturização dos sistemas extractivos, principalmente com recurso às

146] desenvolveram uma nova técnica, a SBSE, na


e modo a promover


22

simultaneamente a homogeneização da amostra e a extracção dos compostos para a fase

polimérica.

Regra geral, a barra é introduzida directamente na amostra aquosa, ou opcionalmente no

headspace, iniciando-se então o processo de extracção. Este é então determinado por vários

parâmetros, nomeadamente, tempo de extracção, volume de amostra, velocidade de agitação,

quantidade de PDMS empregue (26-126 µL), pH, polaridade e força iónica do meio, devendo

estes parâmetros ser optimizados para cada aplicação. Após a extracção, a barra é removida da

amostra, limpa (remoção de matriz) e introduzida num tubo de vidro para dessorção térmica

(TD), onde os analitos são dessorvidos com um injector PTV, sendo posteriormente

criofocados e analisados por GC. A TD, técnica de análise única (one-shot process), apresenta

como desvantagem o facto de a amostra não ser passível de re-análise, para além de ser apenas

compatível com GC, limitando o tipo de compostos que podem ser analisados. No entanto,

obtém-se elevada sensibilidade, já que toda a amostra entra no sistema cromatográfico; por

outro lado, este facto torna a SBSE numa técnica solventless, visto que os compostos são

dessorvidos sem recurso a solventes orgânicos. Alternativamente, e apesar de se acrescentar

mais um passo analítico, é possível aplicar dessorção líquida (LD), pois trata-se de um método

menos oneroso (não necessita de uma unidade de dessorção térmica), em que os extractos

podem ser re-analisados e os compostos a analisar podem não ser voláteis. Em LD a barra é

colocada num volume reduzido de solvente orgânico compatível com a fase extractante,

seguindo-se um tratamento ultrassónico, cuja temperatura, duração e tipo de solvente usado

são passíveis de optimização. Este modo de dessorção é compatível com diversas técnicas de

separação analítica, nomeadamente a GC, LC ou ainda a CE [21,145-149].

Em termos teóricos, a SBSE baseia-se num processo de equilíbrio estático. Estudos [145-146]

demonstram que existe correlação entre os coeficientes de partição relativos à distribuição dos

analitos entre a fase de PDMS e a matriz aquosa (KPDMS/W) e os coeficientes de partição

octanol-água (KO/W), o que constitui uma medida de polaridade dos compostos orgânicos e

fornece uma boa indicação da eficiência de extracção para cada composto [21,145-146].

Em suma, a SBSE é uma técnica de extracção e concentração que pode ser utilizada para a

determinação de compostos orgânicos ao nível vestigial de diversos tipos de matrizes [150-

155], sendo de fácil execução e isenta de solventes orgânicos tóxicos. Em condições não

agressivas, as barras de agitação podem efectuar dezenas ou centenas de extracções

consecutivas sem mostrarem sinais de deterioração. Contrariamente à SPME, para a qual já

existem no mercado diversos tipos de revestimentos poliméricos, na SBSE apenas se

encontram comercializadas barras de agitação revestidas com PDMS [148], pelo que este tipo


23

de processo não responde de forma eficiente a analitos polares, a menos que se proceda a

estratégias de derivatização (ex. derivatização in situ). Neste sentido, tem-se assistido

recentemente à utilização de diversos materiais adsorventes, ao desenvolvimento de novos

materiais poliméricos para sorção [156-158] e ainda conceitos inovadores em relação às

técnicas de preparação de amostra, com a finalidade de recuperar analitos mais polares, como

é o caso da microextracção em seringa empacotada (MEPS) [159-160], da microextração

adsorptiva em barra (BAµE) [161-162], da micro-extracção adsortiva em multi-esferas

(MSAµE) [160-162], entre outras.

3.2.3. NOVOS MATERIAIS E METODOLOGIAS INOVADORAS

Como foi referido anteriormente, a filosofia da designada “química verde” direccionou a

química analítica para o desenvolvimento de técnicas solventless na preparação de amostras [21].

A fase extractiva mais comum nestas técnicas é o PDMS [148], que apesar das suas inúmeras

vantagens, não responde de forma eficiente a analitos polares ou termolábeis, não permitindo

obter valores significativos de recuperação para compostos de maior polaridade. A extracção

de compostos polares (log KO/W < 3) de diversos tipos de matrizes continua ainda hoje a ser

um desafio para os químicos analíticos [20]. Uma forma de ultrapassar esta limitação seria

recorrer à derivatização dos compostos, isto é, a reacções químicas que alteram as

propriedades do(s) analito(s) alvo. Neste contexto, seria necessário transformar os analitos

noutros que apresentassem menor polaridade de forma a permitir maior eficiência extractiva.

Contudo, apesar das vantagens inerentes à utilização de reacções de derivatização, estas

apresentam alguns inconvenientes, nomeadamente o facto de serem incompletas,

apresentarem baixos rendimentos e poderem originar vários compostos; por outro lado, são

um processo laborioso e moroso uma vez pressupor a adição de mais um passo analítico no

processo. É neste contexto que se insere a importância do desenvolvimento de novas

metodologias e materiais, de forma a permitir uma maior eficiência extractiva de compostos

com elevada polaridade [21], pelo que diversos grupos de investigação [163-169] têm vindo a

desenvolver novas fases extractivas no sentido de melhorar o processo de extracção deste tipo

de compostos.

Nos últimos anos, Nogueira e colaboradores [156-158,160] têm vindo a utilizar espumas de

poliuretano (PU) como fases extractivas para SBSE [156-158]. Desenvolveram ainda a

microextração adsorptiva em barra (BAµE), cujo procedimento extractivo é similar ao descrito

para a SBSE, com excepção à utilização de TD, permitindo a utilização de diversos materiais


24

adsortivos [161-162]. A figura 3.3 representa esquematicamente o processo de extracção por

BAµE.

Figura 3.3 – Imagem e representação esquemática de BAµE. Adaptado de [161].

3.2.3.1. POLIURETANO VS CARVÃO

A estrutura principal da cadeia dos PUs é

poliol) e -R’ (provenientes de um isocianato di ou polifuncional), ligadas por grupos uretano

[171-172], como representado na figura 3.4.

Figura 3.4

A aplicação de espumas de PU para a extracção de compostos orgânicos foi já testada [156

158], uma vez ser um material bastante versátil. Esta versatilidade deve

síntese dos PUs, através do qual se podem formar monómeros com dif

funcionais, dependendo da aplicação desejada [173]. A presença destes grupos funcionais

origina interacções específicas com os analitos. Assim, as espumas de PU apresentam

alternativas às fases poliméricas para SBSE [166

compostos apolares, para os quais o PDMS apresenta baixa eficácia de extracção.

Nos estudos efectuados por Nogueira

satisfatórios: elevada estabilidade química, simplicidade

de uma fase polimérica atractiva para as técnicas de extracção.

Por outro lado, os carvões activados são sólidos amorfos, constituídos sobretudo por carbono

e que possuem capacidades adsorventes únicas e versáteis de


162]. A figura 3.3 representa esquematicamente o processo de extracção por

Imagem e representação esquemática de BAµE. Adaptado de [161].

OLIURETANO VS CARVÃO ACTIVADO

A estrutura principal da cadeia dos PUs é constituída por secções -R (provenientes de um

R’ (provenientes de um isocianato di ou polifuncional), ligadas por grupos uretano

172], como representado na figura 3.4.

Figura 3.4 – Estrutura molecular do grupo uretano.

A aplicação de espumas de PU para a extracção de compostos orgânicos foi já testada [156

158], uma vez ser um material bastante versátil. Esta versatilidade deve-se ao processo de

síntese dos PUs, através do qual se podem formar monómeros com dif


origina interacções específicas com os analitos. Assim, as espumas de PU apresentam

alternativas às fases poliméricas para SBSE [166-169], nomeadamente para a extracção de


Nos estudos efectuados por Nogueira et al. [170] os resultados foram considerados bastantes

satisfatórios: elevada estabilidade química, simplicidade e baixo custos associados, tratando

de uma fase polimérica atractiva para as técnicas de extracção.


e que possuem capacidades adsorventes únicas e versáteis devido à extensa área externa que

grupo uretano


162]. A figura 3.3 representa esquematicamente o processo de extracção por

Imagem e representação esquemática de BAµE. Adaptado de [161].

R (provenientes de um

R’ (provenientes de um isocianato di ou polifuncional), ligadas por grupos uretano

A aplicação de espumas de PU para a extracção de compostos orgânicos foi já testada [156-

se ao processo de

síntese dos PUs, através do qual se podem formar monómeros com diferentes grupos


origina interacções específicas com os analitos. Assim, as espumas de PU apresentam-se como

amente para a extracção de


. [170] os resultados foram considerados bastantes

e baixo custos associados, tratando-se


vido à extensa área externa que


25

apresentam, estrutura microporosa, elevada capacidade de adsorção, elevado grau de

reactividade superficial e relativa facilidade de regeneração [175-177]. Para além do carvão, os

materiais usados como precursores na preparação de carvões activados são materiais ricos em

carbono, na sua maioria subprodutos agrícolas (ex. cortiça). Desta forma, o carvão activado

apresenta-se como um composto de baixo custo, sendo esta uma vantagem inerente à sua

utilização como material adsorvente em metodologias extractivas [175-177].

O comportamento dos carvões activados em processos de adsorção é orientado pelas suas

características físicas e químicas. As primeiras englobam diversos parâmetros, nomeadamente

a área específica, o volume poroso e a distribuição do tamanho de poros, que determinam a

sua capacidade de adsorção. Já as características químicas relacionam-se principalmente com a

composição química da superfície exposta. A natureza polar da superfície do carvão activado

torna-o mais selectivo à adsorção de compostos polares do que apolares. No entanto, a

modificação química da superfície, através da introdução de heteroátomos (principalmente

oxigénio e azoto), tem um efeito importante nas propriedades adsortivas, determinando o grau

de interacção da superfície do carvão com o meio. Tendo em conta que a distribuição de

tamanho dos poros nos carvões activados pode ser ajustada pelo controlo dos parâmetros de

activação e do material precursor, torna-se clara a razão pela qual os carvões activados

apresentam uma vasta e tão diversificada gama de aplicações, uma vez a larga distribuição de

tamanho de poros associada à sua elevada área superficial, elevada capacidade de adsorção e

composição química superficial, tornando estes adsorventes muito versáteis [175-180].

3.3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA SOBRE ANÁLISE DE ATS EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS

Na generalidade, a primeira fase do despiste de substâncias proibidas, como os ATS e

produtos de biotransformação, passa pela realização de imuno-ensaios, de forma a diferenciar

resultados negativos de presumíveis resultados positivos. Os resultados positivos necessitam

de confirmação por um segundo método, mais sensível e que providencie níveis de confiança

mais elevados [20], vulgarmente, as técnicas de confirmação assentam em técnicas hifenadas,

nomeadamente cromatografia gasosa, líquida (LC) e electroforese capilar (CE), associadas a

sistemas de detecção por espectrometria de massa.

Apenas na última década aparecem descritos na literatura procedimentos analíticos para a

detecção e identificação de 2C-T-2 e 2C-T-7 em amostras biológicas. Ainda assim, a

quantidade de artigos disponíveis é francamente baixa, quase inexistentes em amostras post

mortem, à excepção do trabalho publicado por Curtis et al. [61]. Na literatura é então referida a

LLE [58,61,181-183] e SPE [5,11,26] como técnicas de preparação de amostras de plasma


26

[5,183], soro [11], sangue total [61,184], urina [24,61,182,184] e fígado [181], embora existam

igualmente alguns estudos em urina de cobaias (ratos), de forma a estabelecer as vias

metabólicas destes compostos [26,56,58,181,185]. Já as técnicas de separação referidas passam

pela cromatografia gasosa acoplada a um detector de azoto-fósforo (GC-NPD) [61],

electroforese capilar com detecção por ultravioleta (CE-UV) [185], fluorescência (CE-FLD)

[182,186] ou espectrometria de massa (CE-MS) [183], cromatografia líquida de alta eficiência

acoplada à espectrometria de massa (HPLC-MS) [184], cromatografia líquida ultra-eficiente

acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) [8], GC-MS [5,26,56,58,61,181,184,187], e

mais recentemente a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa tandem

(LC-MS/MS) [11]. No entanto, face às exigências de identificação inequívoca dos analitos e às

consequências associadas a falsos resultados positivos, a utilização de cromatografia gasosa e

liquídia acopladas a detectores de massa é crucial num método de confirmação, em detrimento

da utilização de outros detectores (ex. NPD, UV). Adicionalmente, a CE [188] tem uma

aplicação pouco expressiva em toxicologia forense. Referências a reagentes de derivatização,

como por exemplo, isotiocianato de fluoresceína [182] ou 4-(N,N-dimetilaminosulfonil)-7-

fluoro-2,1,3-benzoxadiazole (DBD-F) [186] para aplicações usando detecção por fluorescência

e anidrido heptafluorobutírico (HFBA) [5] ou anidrido trifluoroacético (TFA) [24] para

aplicações em GC-MS são encontradas na literatura. Apesar das reacções de derivarização

serem aconselhadas aquando da utilização de GC-MS [183] alguns autores [181,56] não as

aplicam, especialmente quando se trata de estudos metabólicos em urina de cobaias.

A literatura relativa ao PMA e PMMA é mais extensa em comparação com os compostos

referidos anteriormente, encontrando-se diversos relatos de fatalidades atribuídas ao consumo

destas drogas [67,69-70]. Relativamente às técnicas de preparação de amostras, a LLE [82,189]

e SPE [13,67,75] são as técnicas mais referidas para a limpeza e concentração de amostras

biológicas, como são o caso do sangue [62,67,79,81-82,190-191], soro [11,69], urina

[67,79,82,190-191] e fígado [62]. Referências à SPME são escassas [192]. Grupos de

investigação debruçam-se ainda no estudo metabólico e toxicidade destes compostos, pelo que

se pode encontrar na literatura estudos em amostras biológicas de cobaias [24,193].

Encontram-se igualmente artigos onde são focadas apenas as técnicas de cromatográficas para

análise de padrões destes ATS, pelo que não são utilizadas técnicas de extracção e

concentração [8]. As técnicas de separação utilizadas passam pela UPLC-FLD [8], UPLC-MS

[8], GC-MS [13,70,75,79,189], LC-MS [79,82] e LC-MS/MS [11,79]. É mencionada a utilização

de anidrido trifluoroacético/acetato de etilo [41,79], anidrido pentafluoropropiónico

(PFPA)/pentafluoropropanol (PFPOH) [67] ou ainda com ácido acético anidrido/piridina


27

[75], ou seja, reacções de acilação, bastante populares para derivatização de aminas aquando da

utilização de GC-MS. Aplicações em ULPC-FLD necessitam de derivatizações utilizando, por

exemplo, DBD-F [8].

Aa literatura não regista casos de fatalidades por consumo de metcatinona. Ainda assim são

referidas a LLE [17,194-196] e SPE [5,11] como técnica de preparação de amostras de sangue

total [195], soro [11], urina [17,90,194-195,197] e cabelo [198-199]. Já as técnicas de separação

referidas passam por GC-MS [17,194,197-198], HPLC-UV [90], LC-MS [199], CE [195,200] e

mais recentemente a LC-MS/MS [11,196]. Referências a reacções de acilação com HFBA

[194], PFPA [17] ou TFAA [198] para aplicações em GC-MS são encontradas na literatura.

Embora com pouca expressividade, encontram-se referências a fatalidades envolvendo o

consumo de efedrinas [201-202]. As técnicas de preparação de amostras mencionadas incluem

LLE [17,194-196,203], SPE [11,23,205-207] e SPME [208], para extrair estes compostos de

amostras de sangue [23,206], plasma [203,207], urina [23,195,204,206], cabelo [196]. As

técnicas de análise passam por GC-MS [209], UPLC-MS/MS [203], LC-MS/MS

[11,23,196,204]. As aplicações em GC-MS geralmente necessitam de derivatização prévia,

onde se destacam as reacções por acilação através de TFA [209,198], HFBA [194], PFPA [17],

cloreto de pentafluorobenzoílo (PFB-Cl) [210] ou N-metil-bis-trifluoroacetamida (MBTFA)

[211].

Os trabalhos experimentais de Wohlfarth et al. e Habrdova et al. [5,11] permitem, pela primeira

vez, efectuar a identificação e a quantificação simultânea de diversos ATS em amostras de

soro e plasma humano, assim como a validação da metodologia analítica. No método descrito

e validado pelos autores é utilizada, LC-MS/MS e GC-MS, respectivamente.

3.4. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Para garantir que um método analítico origina informação fiável sobre uma amostra, este deve

ser avaliado através de um conjunto de procedimentos sistemáticos bem delineados, processo

este vulgarmente designado por validação. A validação é um processo que tem início no

planeamento da estratégia analítica, e continua ao longo do desenvolvimento do método [212-

213].

A validação pode então ser definida como “a avaliação sistemática de um procedimento analítico para

demonstrar que está sob as condições nas quais deve ser aplicado” [214]; trata-se de “definir requisitos do

método e confirmar que este possui capacidade de desempenho consistente com o que se pretende da sua

aplicação” [212].


28

Existem razões diversas que justificam a implementação da validação dos métodos, já que

dados analíticos pouco fiáveis podem induzir a decisões erradas. De facto, a confiança nos

resultados analíticos é um aspecto fundamental nas mais diversas áreas; por exemplo, em

toxicologia forense, resultados pouco fiáveis podem ser contestados em tribunal. Actualmente,

e com o fim de demonstrar competência técnica e resultados analíticos confiáveis, os

laboratórios sujeitam-se a processos de acreditação, isto é, à avaliação de vários parâmetros

por parte de órgãos de âmbito nacional ou internacional [213].

Nos últimos anos surgiram várias publicações de artigos referentes a validação de métodos

analíticos [215-216] e bioanalíticos [217-222], com referências a definições, procedimentos e

parâmetros a validar. Contudo, as estratégias e definições nem sempre são coincidentes.

Organismos internacionais, como a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), a

ISO (International Organization for Standardization), a FDA (Food and Drug Admistration) e o grupo

EURACHEM, entre outros, publicaram documentos referentes à validação de métodos

analíticos [212,223,225], embora se verificam diferenças [226], o que origina alguma confusão

relativamente a nomenclatura e conceitos.

Na validação de um método bioanalítico diversas variáveis devem ser consideradas,

nomeadamente, processo de colheita da amostra, tipo de matriz biológica, preparação da

amostra, técnica analítica empregue e análise dos dados obtidos [220]. Assim, aquando do

desenvolvimento do método, a validação deve abranger o protocolo escrito, incluindo a

definição do sistema a validar, a descrição do procedimento experimental, a identificação dos

parâmetros de validação e a definição dos critérios de aceitação. Por fim, deve proceder-se à

elaboração de relatórios de validação, onde devem constar os resultados dos ensaios e ainda

conclusões da validação [228].

O desenvolvimento de um método analítico encontra-se então condicionado pela respectiva

validação, pois só após esta etapa se saberá se as condições analíticas estabelecidas conduzem

a resultados confiáveis. Caso os resultados obtidos no processo de validação não estejam de

acordo com os critérios de aceitação previamente estabelecidos poderá ser necessário alterar o

procedimento, que exigirá um novo estudo de validação [213].


29

Segundo a norma NP EN ISO/IEC 17025 [229], sempre que um laboratório execute ensaios

terá que levar a cabo um processo de validação do método durante a sua implementação, ou

sempre que ocorra uma alteração relevante do mesmo. A validação de um método é então

progressivamente mais exigente para as seguintes situações:

Extensões e/ou modificações de métodos normalizados;

Métodos normalizados utilizados fora do âmbito de utilização prevista;

Métodos não normalizados;

Métodos criados e desenvolvidos pelo próprio laboratório.

No caso de métodos de confirmação quantitativos, como o desenvolvido no presente

trabalho, existe algum consenso quanto à necessidade de serem avaliados, pelo menos, os

seguintes parâmetros: selectividade, modelo de calibração (linearidade), estabilidade, precisão

(repetibilidade, precisão intermédia), limite de detecção, limite de quantificação e recuperação.

Deve ainda considerar-se a possibilidade de serem avaliados outros parâmetros (ex. robustez e

reprodutibilidade) [213].

Pelo exposto, a presente dissertação tem como objectivo o desenvolvimento e validação de

uma metodologia analítica, com vista à sua utilização na rotina pericial, para identificação e

quantificação de 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, PMMA, efedrina, norefedrina e metcatinona em

amostras de sangue total por SPE/GC-MS.

Adicionalmente, pretende-se aplicar metodologias inovadoras de extracção, nomeadamente, a

micro-extração adsorptiva em barra (BAµE), para a análise dos referidos ATS em amostras de

urina, com análise por GC-MS e LC-MS/MS.

Materiais e métodos

31

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. PADRÕES E REAGENTES

Os padrões de referência de (-)-efedrina, d,I-norefedrina, d,I-metcatinona, PMA e PMMA

(grau de pureza > 98,5%), foram obtidos Lipomed (Arlesheim, Suíça).

Os padrões de 2C-T-2 e 2C-T-7 foram gentilmente cedidos pelo Laboratório de Análises e

Dopagem do Instituto do Desporto de Portugal.

Os padrões internos anfetamina (d6), metanfetamina (d9), MDMA (d5), N-metil-1-

(benzodioxol-5-il)-2-butanamina (MBDB, d5), N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina (MDE, d5)

deuterados (grau de pureza 99%) foram fornecidos pela Cerilliant (Round Rock, EUA).

Os padrões de referência, utilizados no estudo da selectividade, com grau de pureza entre

98,5% e 99% foram adquiridos à Lipomed (Arlesheim, Suíça) e à Cerilliant (Round Rock,

EUA).

O acetato de etilo, cloroformato de benzoílo, ácido clorídrico (HCl, 37%), amónia (NH4OH,

25%), diclorometano, di-hidrogenosfosfato de potássio anidro (KH2PO4), n-hexano, metanol

(grau de pureza adequado a cromatografia gasosa), 2-propanol (p.a.), o ácido fómico (grau de

pureza 98-100%) e o acetonitrilo (ACN, grau de pureza adequado a LC-MS) foram fornecidos

pela Merck (Darmstadt, Alemanha).

A água desionizada, com resistividade de 18,2 MΩcm-1 à temperatura ambiente, foi produzida

num sistema de purificação de água Simplicity 185 (com lâmpada de UV) da Millipore

(Bedford, EUA).

Os reagentes de derivatização empregues N-metil-bis-trifluoroacetamida (MBTFA), N-metil-

N-trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA), trimetilclorosilano (TMCS), N-metil-N-terc-butil-

dimetilsilil-trifluoroacetamida (MBDSTFA), N-metil-N-(trimetilsilil)heptafluorobutiramida

(MSHFBA) foram adquiridos a Macherey-Nagel (Düren, Alemanha). O anidrido

trifluoroacético (TFAA) e o hidróxido de potássio (KOH) foram fornecidos por Riedel de

Haen (Seelze, Alemanha). A piridina (py, com grau de pureza 99,9%), o anidrido

pentafluoropropiónico (PFPA, grau de pureza 99%) e o pentafluoropropanol (PFPOH, grau

de pureza 97%) foram fornecidos pela Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha).

4.2. SOLUÇÕES As soluções padrão individuais das substâncias em estudo foram preparadas em metanol na

concentração de 1000 µg/mL e armazenadas a -10°C, ao abrigo da luz.

As soluções de trabalho a 100 µg/mL foram obtidas por diluição das respectivas soluções

padrão com metanol.

Materiais e métodos o

32

Para a SPE, por diluição das soluções de trabalho iniciais prepararam-se soluções de trabalho

com concentrações de 10, 2,5, 1 e 0,25 µg/mL utilizando como solvente o metanol. As

soluções de trabalho foram armazenadas entre 2 a 8°C, ao abrigo da luz.

As soluções de ácido clorídrico (0,1 N) foram preparadas num balão volumétrico de 250 mL

de capacidade, contendo de 100 mL água desionizada, tendo-se pipetado 5 mL de HCl 5 N.

Completou-se com água desionizada até perfazer o volume e homogeneizou-se por inversão.

As soluções de ácido clorídrico 5 N foram preparadas num balão volumétrico de 100 mL de

capacidade, contento 60 mL de água desionizada, tendo-se pipetado 64,3 mL de HCl 37%.

Completou-se com água desionizada até perfazer o volume e homogeneizou-se por inversão.

A solução de ácido clorídrico a 1% em metanol foi preparada num balão volumétrico de 100

mL de capacidade, contendo 60 mL de metanol ao qual se adicionou 1 mL de HCl

concentrado (37%). Perfez-se o volume com metanol, até 100 mL, e por fim a solução foi

agitada.

A solução de ácido clorídrico a 1% em 2-propanol foi preparada num balão volumétrico de

100 mL de capacidade, contendo 60 mL de metanol ao qual se adicionou 1 mL de 2-propanol

(37%). Perfez-se o volume com metanol, até 100 mL, e por fim a solução foi agitada.

As soluções de diclorometano/2-propanol/amónia (78:20:2, v/v/v) foram preparadas num

balão volumétrico de 100 mL de capacidade, para onde se pipetaram 78 mL de diclorometano,

tendo-se adicionado de seguida 20 mL de 2-propanol. As soluções foram homogeneizadas

vigorosamente e posteriormente adicionaram-se 2 mL de amónia e homogeneizou-se por

inversão.

As soluções de diclorometano/metanol (70:30, v/v) foram preparadas em balões volumétricos

de 100 mL de capacidade, contendo 30 mL de metanol, tendo-se pipetado 70 mL de

diclorometano e homogeneizado por inversão.

A fim de preparar as soluções tampão fosfato (0,1 M, pH 6,0±0,1) pesaram-se 13,6 g de

KH2PO4 e transferiu-se para um balão volumétrico de 1000 mL de capacidade com 900 mL

de água desionizada, homogeneizou-se num banho ultra-sónico até dissolução completa do

KH2PO4. Mediu-se o pH da solução e ajustou-se a pH 6,0±0,1 com uma solução de KOH a 1

M. Completou-se ao traço com água desionizada.

Metanol a 5% (v/v) (100 mL): Pipetaram-se 5 mL de metanol para um balão volumétrico de

100 mL de capacidade contendo 60 mL de água desionizada. Adicionou-se água até completar

o volume e homogeneizou-se por inversão.


33

Ácido clorídrico a 1% em metanol (100 mL): Para um balão volumétrico de 100 mL de

capacidade contendo 60 mL de metanol adicionou-se 1 mL de HCl concentrado (37%). O

volume final de 100 mL foi obtido com metanol, a solução foi devidamente agitada.

A solução de hidróxido de potássio (1M) foi preparada através da pesagem de pesados 5,61 g

de KOH para um balão volumétrico de 100 mL de capacidade contendo 80 mL de água

desionizada. A solução foi homogeneizada por inversão, completou-se com água desionizada

até preencher o volume, tendo esta sido devidamente agitada.

As soluções de ACN/MeOH (50:50, v/v) foram preparadas em balões volumétricos de 100

mL de capacidade, contendo 50 mL de ACN, tendo-se pipetado 50 mL de MeOH e

homogeneizado por inversão.

A fase móvel constituída por ACN/solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% (95:5, v/v) foi

preparada num balão volumétrico de 1000 mL, contedo 95 mL de ACN, tendo-se pipetado 5

mL de solução aquosa de ácido fórmico a 0,1%.

A fase móvel constituída por solução aquosa de ácido fórmico a 0,1%/ACN (95:5, v/v) foi

preparada num balão volumétrico de 1000 mL, contedo 95 mL de solução aquosa de ácido

fórmico a 0,1%/, tendo-se pipetado 5 mL de ACN.

4.3. EQUIPAMENTO

Balança analítica da Kern & Sohn GmbH, modelo 770-13 (Balingen-Frommern,

Alemanha);

Banho seco da Grant Instruments (Cambridge) Ltd, modelo QBT2 (Royston, Reino

Unido);

Banho ultra-sónico, modelo XB14 da Grant Instruments (Shepreth, Reino Unido);

Banho ultra-sónico equipado com termóstato (Branson® 3510 E-DTH, Danbury, CT,

EUA).

Centrífuga da marca Heraeus Sepatech GmbH e modelo Megafuge 1.0 (Osterode,

Alemanha);

Câmara para extracção em fase sólida manual com capacidade para 20 colunas (Vac

Master) adquirida a International Sorbent Technology Ltd (Hengoed, Reino Unido)

associada a uma bomba de vácuo, modelo N022AN18, fornecida por KNF Neuberger

GmbH (Freiburg, Alemanha);


34

Cromatógrafo gasoso modelo 6890N acoplado a um detector selectivo de massa

modelo 5973 Inert e dotado de um injector automático modelo 7683 da marca Agilent

Technologies Inc. (Waldbronn, Alemanha);

Cromatógrafo líquido modelo Alliance® 2795 acoplado a um detector selectivo de

massa com analisador de triplo quadrupolo APIESCi modelo Quattro MicroTM

(Micromass, Waters);

Desencapsulador da Chromacol (Welwyn Garden City, Reino Unido);

Encapsulador da Agilent (Palo Alto, EUA);

Evaporador da Techne (Cambridge) Ltd, modelo Dri-block DB-3 (Duxford

Cambridge, Reino Unido);

Homogeneizador, modelo SRT2, da Stuart Scientific (Redhill Surrey, Reino Unido);

Placa de agitação múltipla com quinze pontos de agitação (Variomag H+P

Labortechnik AG Multipoint 15, OberschleiBheim, Alemanha);

Potenciómetro, modelo Handylab1, da Schott-Geräte GmbH (Mainz, Alemanha);

Vortex, modelo ZX3, adquirido a Velp Scientifica srl (Usmate, Itália).

4.4. MATERIAIS

Barra de agitação comercial Twister revestida por um filme de PDMS (46 µL) fornecida

por Gerstel (Müllheim a/d Ruhr, Alemanha);

Barras para BAµE, com cerca de 15 mm de comprimento, foram desenvolvidas no

Laboratório de Cromatografia e Electroforese Capilar da Faculdade de Ciências da

Universidade de Lisboa;

Carvões activados Norit (CA1, CN 1, SX Plus, B Test Eur e SX), foram gentilmente

cedidos pela Salmon & Cia. (Holanda);

Colunas de extracção em fase sólida Oasis® HLB (60 mg de enchimento, 3 mL volume),

Oasis® MCX (60 mg de enchimento, 3 mL volume) fornecidas por Waters Corporation

(Milford, EUA) e StrataTM-X, fornecida por Phenomenex Inc (California, USA);

Liners de 4 mm de diâmetro interno, para split, com lã de vidro, da Agilent (Palo Alto,

EUA);

Polímero sintetizado no laboratório do Grupo de Ciência e Tecnologia de Separação da

Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa;

Septos Agilent Premium Inlet Septa, de 11 mm de diâmetro, fornecidos pela Agilent

Technologies (EUA);


35

4.5. CONDIÇÕES INSTRUMENTAIS

4.5.1. GC-MS

Foi utilizada uma coluna capilar de sílica fundida HP-5MS com 30 m de comprimento, 0,25

mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura do filme a fim de realizar as separações

cromatográficas. Com o intuito de atingir uma eficiência separativa adequada desenvolveu-se

um programa de temperaturas da coluna: temperatura inicial do forno de 90°C sustentada

durante 1,85 minutos, seguindo-se um gradiente térmico de 20°C por minuto até aos 300°C, a

temperatura final foi mantida constante durante 3 minutos. A temperatura do injector e do

detector (interface) foi mantida a 280°C. O volume de injecção foi de 2 µL, em modo split;

com uma razão de split de 1:10. Utilizou-se hélio como fase móvel (gás de arraste), de pureza

> 99,9996% da Praxair (Maia, Portugal), mantendo-se o fluxo deste constante (7,9 mL/min).

O espectrómetro de massa foi utilizado no modo de impacto electrónico, energia de 70 eV,

em modo de varrimento contínuo (modo full scan), com um varrimento num intervalo de

razões m/z de 50 a 550 u.m.a., e no modo SIM, atribuiu-se a cada composto em estudo três

fragmentos iónicos, considerando o Tr do composto. O atraso de solvente (do inglês, solvent

delay) foi de 6,00 minutos. A aquisição e tratamentos dos dados foram obtidos com os

softwares Enhanced ChemStation MSD Chem Station versão E.02.00493 de 2008, da Agilent

Technologies (Center Ville Road, EUA). Os liners utilizados foram silanizados e o injector foi

limpo a cada 100 análises, de modo a prevenir a diminuição da sensibilidade.

4.5.2. LC-MS/MS

A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna Waters Atlantis T3

(100 mm × 2,1 mm, 3 µm) a 35 ºC. Com o objectivo de obter uma eficiência separativa

adequada desenvolveu-se um gradiente de eluição com ACB / solução aquosa de ácido

fórmico a 0,1% (95:5, v/v) (A) e uma solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% / ACN (95:5,

v/v) (B), com um fluxo de 0,250 mL/min. O gradiente foi programado de acordo com as

indicações na tabela 4.1.


36

Tabela 4.1 - Gradiente de eluição utilizada para análise cromatográfica dos ATS em estudo.

Tempo / min % A % B

0,00 10 90

0,50 10 90

8,00 80 20

11,00 80 20

11,10 10 90

16,00 10 90

O volume de injecção utilizado foi de 10 µL. A operação do equipamento e a aquisição de

dados foram obtidas com o software MassLynxTM V4.1 SCN714 e o processamento de dados

foi efectuado com recurso ao software QuanLynxTM V4.1 SCN714. O equipamento foi

operado no modo de ionização ESI+ (electrospray positivo) e no modo MRM (multiple reaction

monitoring). Os parâmetros da fonte de ionização foram optimizados para a análise dos ATS e

as seguintes condições foram encontradas: voltagem da coluna, 1,0 kV; temperatura da fonte,

120 ºC; gás de dessolvatação (azoto) aquecido a 450ºC e com um fluxo de 600 L/h; não foi

usado gás de cone. As transições MRM, voltagem do cone e energia de colisão apropriadas

para cada analito individual e PI foram determinadas através de infusão directa de soluções-

padrão no espectrómetro de massa. A voltagem do cone foi ajustada a fim de maximizar a

intensidade do ião molecular protonado e a dissociação por colisão induzida foi efectuada. A

pressão do gás de colisão (árgon) foi mantida a aproximadamente 3,5×10-3 mbar, a energia de

colisão foi optimizada e seleccionaram-se dois iões produto para cada composto. As transições

MRM, com a correspondente voltagem de cone, energia de colisão e tempo de retenção para

os analitos e PI estão apresentadas na tabela seguinte.


37

Tabela 4.2 – Transições MRM, voltagem do cone, energia de colisão (Ecolisão) e tempo de retenção (tR) dos

analitos e PI.

Composto Transições (m/z) Cone (V) Ecolisão (eV) tR (min)

Norefedrina 152,3 → 117,0

152,3 → 134,0 20 11 1,98

Efedrina 166,3 → 117,0

166,0 → 148,0 20 15 2,33

Metcatinona 164,3 → 131,0

164,3 → 146,0 25 14 2,37

Anfetamina d6 142,1 → 125,1 15 8 3,36

Metanfetamina d9 159,2 → 125,1 20 11 3,43

PMA 166,3 → 121,0

166,3 → 149,0 20 10 3,58

PMMA 180,3 → 121,0

180,3 → 149,0 20 13 4,18

2C-T-2 242,3 → 210,0

242,3 → 225,0 20 12 6,08

2C-T-7 256,3 → 167,0

256,3 → 239,0 20 12 6,67

4.6. AMOSTRAS BIOLÓGICAS

As amostras brancas2 de sangue utilizadas durante o estudo da selectividade foram colhidas in

vivo ou post mortem no âmbito das actividades do INML. As amostras de sangue utilizadas no

estudo dos restantes parâmetros, também amostras brancas, eram provenientes do Instituto

Português do Sangue, tratando-se de sangue humano excedente de transfusões. Numa fase

posterior do estudo obtiveram-se amostras de urina de voluntários do STF, não consumidores

de drogas ou medicamentos. As amostras recebidas no STF para análise toxicológica foram

conservadas por congelação a -10°C.

2Por amostra branca entende-se uma amostra cuja matriz é equivalente à das amostras a analisar, embora isenta da(s) substância(s) a pesquisar.


38

4.7. IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS

De acordo com a agência mundial anti-doping (WADA, do inglês World Anti-Doping Agency) a

identificação de um composto numa amostra, por GC-MS em modo SIM, pressupõe o

reconhecimento de, pelo menos, três fragmentos iónicos diagnóstico no fragmentograma,

assim como a monitorização das respectivas intensidades relativas [230].

A abundância relativa de um fragmento diagnóstico, expressa como percentagem da

intensidade do fragmento mais intenso (pico base), foi determinada por integração da área do

pico cromatográfico seleccionado e normalizada ao pico base (que corresponde a 100%). Na

tabela 4.3 encontram-se descritos os intervalos de aceitação permitidos para as abundâncias

relativas utilizados na identificação dos compostos em estudo [230].

Tabela 4.3 - Intervalos máximos de tolerância permitidos para as abundâncias relativas dos fragmentos de

diagnóstico, monitorizados em modo SIM [230].

Abundância relativa

(% relativa ao pico base)

Intervalo máximo de tolerância permitido

(%)

> 50 ± 10 (intervalo absoluto)

25 a 50 ± 20 (intervalo relativo)

5 a < 25 ± 5 (intervalo absoluto)

< 5 ± 50 (intervalo relativo)

A WADA prevê ainda, como critérios de confirmação qualitativa, que a variação do tempo de

retenção do composto (tR) seja inferior a 2% ou ± 0,1 minutos, o que originasse um intervalo

menor [230]. Além disso, a variação do tempo de retenção relativo do composto (tRr), expresso

pela razão entre o tR do composto e o tR do padrão interno, deve ser inferior ou igual a 1%

quando comparado ao tRr do composto de referência, no caso de não se utilizar um análogo

deuterado como padrão interno; caso contrário a variação do tempo de retenção relativo do

composto deve ser inferior a 0,1% [230]. Por fim, a razão entre o sinal do fragmento

diagnóstico menos intenso e o sinal correspondente ao ruído da linha de base (razão

sinal/ruído) deverá ser superior a 3:1 [230]. A determinação da razão sinal/ruído (S/N) foi

realizada por recurso ao software do equipamento.


39

4.8. EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)

4.8.1. PRÉ-TRATAMENTO DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS

Tal como referido anteriormente, as amostras recebidas no STF são armazenadas a -10°C,

pelo que antes da extracção as amostras de sangue total foram descongeladas até atingirem a

temperatura ambiente. Através de movimentos de rotação e inversão, e durante 15 minutos, as

amostras foram homogeneizadas. De seguida, diluíu-se uma alíquota de sangue com 8 mL de

uma solução de tampão fosfato (KH2PO4 0,1 M, pH 6,0±0,1), procedeu-se à homogeneização

durante 10 minutos, seguida de centrifugação a 2500 r.p.m., durante 10 minutos, de forma a

remover possíveis partículas em suspensão, pelo que o precipitado obtido foi rejeitado.

4.8.2. METODOLOGIA DE EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA

Foram avaliados dois tipos de colunas na avaliação da extracção dos ATS, nomeadamente,

Oasis® HLB e Oasis® MCX. As colunas Oasis HLB da Waters® permitem a retenção de

analitos de uma vasta gama de polaridades por SPE de fase reversa enquanto o mecanismo

extractivo das colunas Oasis MCX da Waters® é de modo misto (fase reversa e troca iónica),

estando descrito ser eficiente para analitos básicos [231-233].

4.8.2.1. METODOLOGIA DE EXTRACÇÃO COM AS COLUNAS OASIS® HLB

O procedimento experimental foi baseado nas sugestões apresentadas pelo fabricante para a

extracção de drogas ácidas, básicas e neutras em sangue total [231-232]. As colunas de

extracção foram inicialmente condicionadas com 2 mL de metanol e com 2 mL de água

desionizada. Adicionaram-se as amostras, com uma razão de fluxo moderada e preparadas de

acordo com o descrito anteriormente (vide ponto 4.8.1), e procedeu-se à lavagem da fase

estacionária com 2 mL de metanol a 5%. Por fim, os analitos foram eluídos com 2 mL de

metanol.

4.8.2.2. METODOLOGIA DE EXTRACÇÃO COM AS COLUNAS OASIS® MCX

Optou-se por testar as condições estipuladas no procedimento experimental validado em vigor

no STF para extracção de anfetaminas da matriz sangue total devido à semelhança estrutural

entre os compostos em estudo. Assim, após condicionamento da coluna com 2 mL de

metanol e 2 mL de água desionizada, as amostras foram introduzidas na mesma, com uma

razão de fluxo moderada. Numa terceira etapa, que consistiu em lavar a coluna, utilizaram-me

2 mL de água desionizada, 2 mL de HCl a 0,1 N, 3 mL de solução diclorometano/metanol

(70:30; v/v) e 3 mL de n-hexano. As colunas foram secas, sob vácuo, durante 10 minutos.


40

Posteriormente, a eluição com 2 mL de diclorometano/isopropanol/amónia (78:20:2, v/v/v)

permite a recuperação dos compostos em estudo.

4.8.3. DERIVATIZAÇÃO QUÍMICA

Em experiências prévias constatou-se a necessidade de derivatizar os ATS em estudo. No

STF, os métodos de derivatização química mais usuais na análise de drogas de abuso por

GC-MS são a sililação e a acilação, reacções de derivatização frequentemente utilizadas para as

aminas primárias e secundárias [233], pelo que seis das sete reacções estudadas englobam este

tipo de derivatização.

Note-se que as fases orgânicas obtidas foram evaporadas até à secura sob uma corrente de

azoto, a uma temperatura de 40°C, para que o excesso de solvente fosse eliminado e os

analitos concentrados e só posteriormente eram sujeitas à derivatização. No entanto, tal como

foi descrito por Solans et al. [236], observaram-se perdas por volatilização destes compostos.

Assim, à semelhança do procedimento analítico aplicado no STF aquando da análise de

anfetaminas e compostos relacionados, à fase orgânica proveniente do procedimento

extractivo por SPE foram adicionados 20 µL de reagente de derivatização a utilizar na

respectiva experiência. As amostras foram então homogeneizadas durante 5 segundos no

vórtex e finalmente levadas à secura sob corrente de azoto.

4.8.3.1. MBTFA, MSTFA:TMS (95:5; v/v), MBDSTFA ou MSHFBA

No caso das reacções com MBTFA, MSTFA:TMS (95:5; v/v), MBDSTFA e MSHFBA o

procedimento foi similar. O resíduo seco resultante da evaporação da fase orgânica, obtida no

procedimento extractivo por SPE, foi solubilizado com 60 µL de reagente de derivatização

(MBTFA, MSTFA:TMS, MBDSTFA ou MSHFBA) e agitado no vórtex durante cerca de 15

segundos. Aqueceu-se a 80°C durante 30 minutos. Depois de arrefecer, até à temperatura

ambiente, a solução foi transferida para um vial e uma alíquota de 2 µL foi injectada no sistema

cromatográfico.

4.8.3.2. MSTFA/MBTFA

O resíduo seco procedente da evaporação da fase orgânica, obtida no procedimento extractivo

por SPE, foi solubilizado com 60 µL de MSTFA e agitado no vórtex durante cerca de 15

segundos. Aqueceu-se a 80°C durante 20 minutos. Depois de arrefecer até à temperatura

ambiente adicionou-se 30 µL de MBTFA e aqueceu-se a 80°C durante mais 10 minutos.


41

Depois de arrefecer, até à temperatura ambiente, a solução foi transferida para um vial e uma

alíquota de 2 µL foi injectada no sistema cromatográfico.

4.8.3.3. PFPA/PFOH

Ao eluato obtido após extracção por SPE adicionou-se 100 µL de uma solução de HCL 1%,

de forma a evitar perdas por evaporação. Após a evaporação adicionou-se ao resíduo seco 50

µL de PFPA e 25 µL de PFOH, tendo-se agitado no vórtex durante cerca de 15 segundos e

aquecido a 65ºC durante 20 minutos. Evaporou-se novamente até à secura, reconstituiu-se

com 50 µL de acetado de etilo e transferiu-se a solução para um vial e uma alíquota de 2 µL foi

injectada no sistema cromatográfico.

4.8.3.4. PY/CLOROFORMATO DE BENZOÍLO

A uma solução padrão dos ATS a 10 µg/mL adicionou-se 100 µL de etanol:py (4:1, v/v) e 40

µL de cloroformato de benzoílo. De seguida agitou-se a mesma durante 2 minutos no vórtex e

levou-se à secura sob corrente de azoto a 40 ºC. O resíduo seco foi reconstituído com 50 µL

de acetato de etilo e transferiu-se a solução para um vial e uma alíquota de 2 µL foi injectada

no sistema cromatográfico.

4.9. QUANTIFICAÇÃO

O tipo de calibração analítica deve ser adequado às análises e amostras ensaiadas. Assim, e em

métodos instrumentais de análise, vários métodos podem ser seleccionados, nomeadamente,

calibração pelo método da adição de padrão interno, ente outros. Cada uma destas escolhas

depende do caso em análise, pelo que cabe ao laboratório definir os critérios de escolha e

aplicabilidade, bem como estabelecer critérios de aceitação para as calibrações obtidas (ex.

linearidade, tipo de ajuste polinomial e coeficiente de correlação) [234]. Neste sentido, optou-

se pela análise quantitativa efectuada pelo método do padrão interno, onde um composto (PI)

é adicionado à amostra, numa concentração conhecida, antes de se proceder à extracção e

análise. Desta forma podem ser minimizadas fontes de variabilidade introduzidas nas várias

etapas pelas quais a amostra passa, sendo possível compensar alguns erros do método (ex.

evaporação, variação do volume de injecção, etc.) [235-236].

A fim de escolher o PI adequado, fortificaram-se com os ATS em estudo nove alíquotas (500

µL) de uma amostra de sangue branco, isenta dos compostos a pesquisar, na concentração de

200 ng/mL e adicionou-se 100 ng/mL da solução de PI (anfetamina d6, metanfetamina d9,


42

MDMA d5, MDE d5, MDBD d5), à totalidade das amostras e extraíram-se e analisaram-se de

acordo com a metodologia descrita, a fim de verificar a repetibilidade da razão entre a área

cromatográfica do PI e do analito.

4.10. VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE ATS POR SPE/GC-MS

Tal como já foi referido anteriormente, a confiança nos resultados analíticos é um aspecto

fundamental, pelo que antes de ser usado em análises forenses o método analítico deve ser

validado. O método analítico desenvolvido é um método interno, dado que não se baseia em

qualquer método de referência ou normalizado. Deste modo, pretende-se evidenciar a sua

adequação à confirmação qualitativa e quantitativa de ATS em amostras de sangue total por

SPE/GC-MS. Conforme o exposto, os parâmetros de validação do método analítico

desenvolvido para a identificação e quantificação de ATS em amostras de sangue total por

SPE-GC-MS avaliados encontram-se descritos na Tabela 4.4.

Tabela 4.4 - Parâmetros de validação do método analítico de SPE/GC-MS para identificação e quantificação de

ATS em amostras de sangue total [213].

Parâmetro Método de confirmação

qualitativo

Método de confirmação

quantitativo

Selectividade

Limite de detecção

Limite de quantificação

Linearidade

Gama de trabalho

Precisão intermédia

Repetibilidade

Exactidão (veracidade)

Eficiência de extracção

Arrastamento

Robustez


43

4.10.1. AVALIAÇÃO DA SELECTIVIDADE

Sucintamente, pode-se definir selectividade como a capacidade de um método para

discriminar o analito-alvo inequivocamente, sem que outros elementos eventualmente

presentes na amostra interfiram [235].

A avaliação da selectividade do método analítico efectuou-se em duas fases distintas. Na

primeira fase seleccionou-se um total de quarenta amostras de sangue total de fontes distintas,

sangue post mortem e sangue colhido in vivo, isentas dos analitos em estudo e representativas das

amostras analisadas no STF. Estas amostras foram então agrupadas em dez subgrupos de

alíquotas, de quatro origens diferentes, constituindo-se assim pools de amostras de sangue total.

A cada uma das pools retiraram-se duas alíquotas (500 µL): a uma delas adicionou-se 100 ng de

cada analito tendo sido adicionado a ambas 100 ng de PI, aplicado o método analítico

desenvolvido. Finalmente, compararam-se os resultados obtidos nos controlos, isto é, nas

alíquotas fortificadas com os analitos com os resultados obtidos nas alíquotas não fortificadas.

Numa segunda fase seleccionaram-se, aleatoriamente, cinco pools das anteriormente preparadas

e de cada uma delas foram utilizadas três alíquotas (500 µL): a uma das alíquotas adicionaram-

se os ATS em estudo (200 ng/mL) e PI (200 ng/mL), à segunda, para além do PI e os ATS na

mesma concentração foram também adicionados cinquenta e dois compostos passíveis de

serem encontrados em rotina no STF, nomeadamente, benzodiazepinas (400 ng/mL), cocaína

e metabolitos (1000 ng/mL), analgésicos (1000 ng/mL), anfetaminas (1000 ng/mL) e

canabinóides (300 ng/mL) e que pudessem interferir com a análise dos ATS (vide Anexo A) e

por fim, na terceira alíquota, foram apenas adicionados PI (200 ng/mL) e os cinquenta e dois

compostos. Os resultados obtidos para as cinco pools foram também comparados com um

controlo.

4.10.2. LIMITES ANALÍTICOS DO MÉTODO: LIMITES DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO

Efectuaram-se vinte e uma curvas de calibração, três por composto, por fortificação de

alíquotas (500 µL) de uma amostra de sangue branco, em três gamas distintas, entre 2 e 20

ng/mL (5 calibradores), entre 2 e 50 ng/mL (11 calibradores) e entre 5 e 500 ng/mL (11

calibradores). Adicionou-se 100 ng/mL da solução de PI a todas as amostras e aplicou-se o

método analítico desenvolvido.


44

4.10.3. LINEARIDADE

As recomendações relativas ao número de pontos de calibração necessários ao estudo da

linearidade de um método diferem bastante consoante os autores. Regra geral, recomenda-se a

utilização de cinco a oito pontos para o estudo de funções lineares e, eventualmente, mais

pontos para as não lineares [220,237-238]. Outros autores consideram que, estatisticamente, é

mais vantajoso a utilização de um menor número de níveis de calibração, embora com mais

replicados, pois facilita a detecção de pontos anómalos ou ainda a necessidade de utilizar

factores de ponderação na calibração [239].

Assim, prepararam-se sete curvas de calibração (uma por analito), mediante fortificação de

alíquotas (500 µL) de uma amostra de sangue branco, num total de onze calibradores,

uniformemente distribuídos na gama de trabalho: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500

ng/mL. A todas as amostras de calibração adicionou-se o PI (100 ng/mL) e foi aplicada a

metodologia já mencionada.

A recta de calibração foi obtida por aplicação do método dos mínimos quadrados, assumindo-

se que as diferenças entre a concentração real e a nominal (resíduos) apresentam distribuição

normal, valor nulo, sejam independentes e que se verifique homogeneidade de variâncias ao

longo da gama de trabalho (homocedasticidade) [240].

Os critérios de aceitação da curva de calibração devem também estar definidos de forma clara.

Assim, definiram-se valores superiores a 0,99 para o coeficiente de correlação linear (r) e de

determinação (R2) das curvas de calibração, a observação visual da distribuição dos resíduos ao

longo dos valores de concentração não deveria revelar tendências; na intercepção da curva

com o eixo das ordenadas, o valor zero deveria estar contido no intervalo de confiança de

95% [235,237,241]; e a exclusão de dados cujos valores residuais sejam superiores ao dobro do

erro-padrão (Sy/x) da curva de calibração (valores aberrantes). Note-se que o valor do R2 por si

só não garante a adequação do ajuste linear à curva de calibração. De facto, verifica-se que

pontos de calibração não equidistantes ou mesmo curvas de calibração com valores residuais

elevados podem ainda assim exibir valores de R2 elevados [241,243]. Sendo assim, utilizou-se o

teste de Mandel [244-246] (vide Anexo B), de modo a verificar qual dos modelos, linear ou não

linear, permitiria o melhor ajustamento dos pontos experimentais.


45

4.10.4. GAMA DE TRABALHO

A aplicação de um método analítico quantitativo exige a definição de um intervalo entre as

concentrações mínima e máxima esperadas para determinado analito, de forma a evitar

extrapolações. Este intervalo designa-se gama de trabalho [239,235].

Representando os extremos mínimo e máximo do intervalo de concentrações da curva de

calibração 5 ng/mL e 500 ng/mL, respectivamente, foram preparadas dez alíquotas (500 µL)

de amostras de sangue isentas dos compostos a analisar. O PI foi adicionado a todas as

alíquotas na concentração de 100 ng/mL. Estas dez réplicas independentes da primeira e

última amostra de calibração foram extraídas e analisadas de acordo com o método

desenvolvido. Por último, importa referir que a avaliação da gama de trabalho foi efectuada

em simultâneo com o estudo da linearidade do método analítico e para um modelo de

calibração linear.

A diminuição da gama de trabalho pode ser um recurso sempre que não se confirme

homogeneidade de variâncias entre os extremos da gama de trabalho, avaliada por aplicação de

um teste estatístico (vide Anexo C) [248]. No entanto, o método dos mínimos quadrados

ponderados [243,246,247,249] revelou-se a solução mais viável para encontrar a equação da

curva de calibração que melhor se ajusta aos resultados obtidos experimentalmente.

4.10.4.1. REGRESSÃO LINEAR PONDERADA

Nos casos em que a heterocedasticidade dos dados é evidenciada, a utilização da regressão

linear ponderada (WLSR, do inglês Weighted Least Squares Regression) é a melhor forma de

harmonizar as discrepâncias entre as variâncias dos diferentes pontos de calibração, por

recurso ao estudo de factores de ponderação empíricos, como aproximação simplista da

variância, baseados na variável independente (x) ou dependente (y): ; ;

√ ;

;

;

√

[240,243,246].

O factor de ponderação empírico será seleccionado após a verificação de vários parâmetros,

nomeadamente, a estimativa do erro relativo percentual (ER%) (vide equação D.5, Anexo D), o

cálculo do somatório do erro relativo percentual (ΣER%) e a representação gráfica do ER%

em função da concentração, sendo que, neste último caso, os valores de ER% devem

encontrar-se distribuídos de forma aleatória e dispostos paralelamente (sob a forma de faixa

horizontal) em função das concentrações. O factor de ponderação mais adequado será aquele

que originar a banda horizontal mais estreita e um menor valor de ΣER% [240,250].


46

Prepararam-se então sete curvas de calibração (uma por composto), contento oitos pontos de

calibração. Utilizaram-se 500 µL de sangue branco, tendo este sido fortificado com os ATS em

estudo em concentrações de 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ng/mL. A todos os calibradores

foram adicionados o PI (100 ng/mL) e aplicado o método analítico desenvolvido. Este

procedimento foi repetido durante cinco dias.

4.10.5. PRECISÃO: REPETIBILIDADE E PRECISÃO INTERMÉDIA

A precisão do método analítico revela a capacidade do mesmo para obter resultados analíticos

concordantes entre si, ou seja, em condições bem definidas permite-nos estimar a dispersão de

resultados entre ensaios independentes, executados sobre uma mesma amostra ou amostras

semelhantes, ou mesmo em padrões [213,234-235,247]. Ainda que neste último caso, o efeito

de matriz não seja atenuado [248]. Quanto menor é esta dispersão maior a precisão do

método, e esta pode ser expressa por três medidas de dispersão: desvio-padrão, variância ou

coeficiente de variação percentual (CV%) [251-252].

Em regra este parâmetro pode ser subdividido em três níveis: repetibilidade, precisão

intermédia e reprodutibilidade [247,253]. O primeiro expressa o grau de dispersão obtido em

condições experimentais análogas, na ausência de factores que possam afectar os resultados

analíticos (ex. mesmo operador, mesmo equipamento, no mesmo laboratório), e num intervalo

de tempo reduzido (ex. no mesmo dia). A repetibilidade também é denominada de precisão

intra-ensaio ou intra-corrida. A influência das pequenas alterações que ocorrem diariamente

num laboratório (ex. equipamentos, analistas, lotes, ou dias diferentes) sobre os resultados

analíticos pode ser avaliada pela precisão intermédia, também denominada de variabilidade

intra-laboratorial ou precisão inter-corrida. Esta medida de dispersão afigura-se como a mais

representativa da variabilidade dos resultados analíticos obtidos num laboratório e por isso a

preferida [247] Existem várias formas de precisão intermédia, tantas quanto os factores

diversificados, a metodologia empregue no seu estudo depende do método analítico [247]. Por

último, a reprodutibilidade exprime o grau de concordância entre os resultados analíticos

obtidos por diferentes laboratórios (ex. ensaios interlaboratoriais) [247,253].

A metodologia adoptada no presente trabalho para o estudo da repetibilidade e precisão

intermédia, dado que neste trabalho não se efectuou o estudo da reprodutibilidade, baseou-se

na aplicação do método analítico desenvolvido a uma amostra de sangue branco fortificada em

p sequências analíticas diferentes. Numa mesma série, esta amostra foi extraída e analisada n

vezes em condições de repetibilidade, mas entre séries a influência das pequenas alterações

diárias sobre os resultados analíticos foi avaliada [248,251,254].


47

As sete curvas de calibração, com oitos pontos de calibração, foram obtidas por fortificação

de alíquotas de uma amostra branca de sangue total. Utilizou-se o mesmo volume de sangue

para cada alíquota (500 µL) e os calibradores encontram-se uniformemente distribuídos na

gama de trabalho: 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400 e 500 ng/mL para todos os ATS em estudo.

Adicionalmente, foram preparadas amostras controlo, em triplicado, por fortificação de

alíquotas da amostra branca, em três níveis de concentração: 20, 250 e 450 ng/mL,

respectivamente gama baixa, média e elevada. A todas as alíquotas adicionou-se o PI (100

ng/mL) e, aplicou-se o método analítico desenvolvido, em condições de repetibilidade,

reagentes e equipamento iguais num curto intervalo de tempo mas preparadas de forma

independente.

Ao longo de um mês, em dias diferentes (n=5), repetiu-se o procedimento experimental,

tendo sido adicionados alguns factores de variabilidade à semelhança das condições operativas

que se deparam os analistas diariamente. Assim, e entre os dias, alteraram-se lotes de

reagentes, colunas de extracção e cromatográficas e amostras de sangue branco [253-254].

Utilizou-se a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados ponderados a fim de obter

as 5 curvas de calibração por composto, tendo os valores de concentração sido estimados por

interpolação da área cromatográfica relativa na equação de regressão linear ponderada.

Nos diferentes níveis de concentração, e para cada ATS, a variância da repetibilidade SR2 ) e da

precisão intermédia (SI2) foram estimadas por uma análise de variância (ANOVA) cujas

equações podem ser consultadas no Anexo E [240,254-255]. A precisão intermédia obtida foi

estimada pela raiz quadrada das variâncias (desvio-padrão) referida no Anexo E. As expressões

necessárias ao cálculo do coeficiente de variação de repetibilidade ), em termos

percentuais encontram-se também no mesmo anexo [240,254-255]. Este último, possibilita

avaliar a repetibilidade do método analítico, para cada gama de concentração estudada.

4.10.6. EXACTIDÃO E VERACIDADE

A exactidão expressa a concordância entre os resultados individuais obtidos após aplicação do

método analítico e o valor de referência que é aceite como real. É muitas vezes confundido

com veracidade, embora esta designação se refira à concordância entre o valor médio de um

conjunto de resultados analíticos obtidos após a aplicação do método analítico e o valor de

referência que é aceite como real [213,235,237].

A veracidade reúne dois componentes, erros aleatórios e sistemáticos e a esta componente

sistemática designa-se de tendência (do inglês, bias) [234]. Assim, a tendência de um método


48

analítico define-se como a diferença entre a melhor estimativa dos resultados obtidos após

aplicação do método e o valor de referência considerado convencionalmente como verdadeiro

e, geralmente, é determinada mediante a realização de ensaios com materiais de referência

certificados (CRM), participação em ensaios inter-laboratoriais ou através de amostras

fortificadas [236,242,248].

A veracidade do método analítico foi avaliada através dos valores de recuperação analítica

(quociente entre o valor observado e o valor esperado) obtidos mediante análise de amostras

brancas fortificadas, tendo em conta a indisponibilidade de CRM e possibilidade de

participação em ensaios inter-laboratoriais [256]. No entanto, deve ter-se em conta que a

recuperação estimada em amostras fortificadas pode diferir da que seria obtida numa amostra

em que o analito estivesse na sua forma nativa. Ainda assim, e no caso de amostras líquidas,

considera-se que a fortificação pode constituir uma boa representação do analito nativo [317].

Experimentalmente, a metodologia aplicada foi similar à descrita para a avaliação da precisão

intermédia. A exactidão, em percentagem, é expressa como o erro médio relativo da

concentração estimada (EMR) (Anexo D) [240] para cada nível de concentração.

4.10.7. RECUPERAÇÃO DA FASE DE EXTRACÇÃO (EFICIÊNCIA DE EXTRACÇÃO)

A avaliação da recuperação total não foi determinada, uma vez o método analítico apresentar

uma etapa de derivatização e os analitos derivatizados não serem comercializados sob a forma

de material de referência. No entanto, ao assumir-se que a etapa de derivatização apresenta

uma eficiência de 100%, a avaliação da recuperação da fase de extracção pode ser efectuada,

estimando desta forma a eficiência extractiva do método analítico [252].

Note-se que, segundo os critérios internos do STF, para métodos quantitativos as

concentrações testadas no estudo de recuperação devem obedecer aos seguintes critérios:

A concentração correspondente à “gama baixa” deve ser superior ao limite de

quantificação;

A concentração correspondente à “gama alta” deve ser igual ou inferior ao limite

superior de quantificação.

Assim, para a avaliação deste parâmetro escolheram-se três gamas de trabalho (500, 100 e 50

ng/mL) e extraíram-se dois conjuntos de alíquotas (500 µL) de sangue branco, em triplicado,

para cada uma das concentrações. Um dos conjuntos foi fortificado com os ATS antes da

extracção, tendo o outro sido fortificado depois de aplicado o processo extractivo e

imediatamente antes da evaporação. O PI (100 ng/mL) foi adicionado a todas as fases


49

orgânicas, antes da etapa de evaporação. A eficiência da extracção foi avaliada mediante o

cálculo da recuperação, em percentagem (vide Anexo D) [237].

4.10.8. PRESENÇA DE ARRASTAMENTO (CARRY OVER)

Na avaliação da presença de arrastamento (do inglês, carry over) o procedimento de extracção,

derivatização e análise foi similar aos apresentados nas secções anteriores. No entanto, uma

das alíquotas da amostra branca não foi fortificada com os ATS, embora tenha sido sujeita às

mesmas condições analíticas das amostras fortificadas. Esta alíquota foi então injectada (n=3)

no GC-MS imediatamente a seguir à análise da amostra mais concentrada (500 ng/mL). O

procedimento foi repetido para as concentrações de 400 e 300 ng/mL, de forma a averiguar a

existência de fenómenos de carry over.

4.10.9. ROBUSTEZ

A capacidade de um método analítico suportar pequenas variações durante a sua realização

sem que os resultados se vejam afectados designa-se por robustez [235-236,247,252]. Este

parâmetro foi estudado, em condições de precisão intermédia, aquando do estudo da precisão

e exactidão.

4.11. METODOLOGIA ALTERNATIVA PARA ANÁLISE DE ATS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:

ESTUDOS PRELIMINARES

As actuais exigências de celeridade das análises toxicológicas bem como o cumprimento dos

príncipios fundamentais da Química Verde levaram à necessidade de desenvolver

metodologias alternativas para a determinação de ATS em fluidos biológicos. Sendo assim,

testou-se uma alternativa à determinação de ATS em sangue por SPE/GC-MS. A alternativa

proposta baseia-se na utilização de uma técnica emergente de preparação de amostras, a

micro-extracção adsortiva em barra (BAµE) [161-162]. Acresce ainda que os métodos

imunoenzimáticos existentes para rastreio de drogas de abuso não permitem a sua detecção e a

urina é a amostra de eleição na triagem de anfetaminas e compostos relacionados [13,19,257],

pois a janela de detecção é de dias e as concentrações excretadas são mais elevadas. Neste

sentido, optou-se por utilizar esta metodologia em amostras de urina.


50

4.11.1. PREPARAÇÃO DO MICRO-DISPOSITIVO DE EXTRACÇÃO

Para preparação do micro-dispositivo BAµE foram utilizadas as fases extractivas mencionadas

no ponto 4.4. A preparação das barras de microextracção adsortiva envolveu o

desenvolvimento de um micro-dispositivo para a extracção de substâncias com diferentes

polaridades, encontrando-se sob pedido provisório de patente nacional [258]. O micro-

dispositivo, suporte cilíndrico em polipropileno com comprimento aproximado de 15 mm e 3

mm em diâmetro, foi revestido externamente com cola [161] e posteriormente com o material

sólido (adsorvente) finamente dividido, para que o mesmo aderisse à superfície do adesivo,

ficando o sólido suportado por colagem. Por fim, o micro-dispositivo (figura 4.1) foi lavado

com água com o intuito de remover o excesso de material adsorvente.

Figura 4.1 - Representação esquemática da barra de micro-extracção: 1 – barra de polipropileno; 2 – fase

extractiva. Adaptado de [161].

4.11.2. ESCOLHA DO MATERIAL ADSORVENTE

Uma das grandes vantagens da utilização da BAµE é a possibilidade de escolher o material

adsorvente a utilizar no dispositivo de extracção. Sendo assim, testaram-se os materiais

disponíveis: cinco tipos de carvões activados (designados por AC1, AC2, AC3, AC4 e AC5), o

enchimento da coluna MCX da Oasis®, o enchimento da coluna StrataTM-X da Phenomenex

Inc. e um poliuretano desenvolvido no laboratório do Grupo de Ciência e Tecnologia de

Separação da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa. A técnica BAµE, com recurso

aos materiais referidos foi comparada com SBSE.

Com o intuito de escolher o material adsorvente mais adequado à extracção dos ATS

realizaram-se nove ensaios, um por cada material adsorvente testado, medindo 15 mL de água

ultra-pura e 5 mL de urina (diluição 1:3), isenta dos compostos a analisar e previamente

filtrada, para um vial de vidro apropriado. Posteriormente, a solução aquosa foi fortificada

com os ATS em estudo numa concentração de 100 ng/mL, adicionadas três gotas de uma

solução de KOH 1M e inserida a barra de extracção e agitação, tendo-se por fim selado o vial

com um septo. A extracção foi promovida através da agitação da barra magnética durante três

horas, à temperatura ambiente, com uma velocidade de agitação de 1000 rpm (condições

padrão). Posteriormente, a barra de extracção foi retirada e seca num papel limpo com o

auxílio de uma pinça, e de seguida transferida para um

ACN:MeOH (50:50, v/v) para se proceder à retroextracção através de tratamento ultra

durante 30 minutos a 25ºC. Excepcionalmente, para o ensaio efectuado para o adsorvente

retirado da coluna MCX o solvente de retroextracção utilizado foi uma mistura

diclorometano:2-propanol:amónia (78:20:2, v/v/v), uma vez ser este o eluente utilizado no

método validado por SPE. Posteriormente, a barra de extracção foi removida com o auxílio de

uma pinça e ao extracto orgânico foi adicionado 20 µL de MBTFA, levado à evaporaçã

secura sob corrente suave de azoto, tendo o resíduo sido re

a fim de efectuar a reacção de derivatização (aquecimento a 80ºC durante 30 minutos). O

extracto obtido foi transferido para um

MS.

Figura 4.2 - Ilustração genérica do processo de pré

4.11.3. ESTUDO DO EFEITO DE E

Após a escolha do material adsorvente mais adequado à extracção dos ATS estudou

processo de minimizar as perdas de analitos por volatilização durante a evaporação dos

extractos, pois a separação cromatográfica passaria a efectuar

a derivatização química. Assim, o procedimento experimental adoptado foi igua

no ponto 1.2.2 mas no extracto orgânico obtido e antes da etapa de evaporação testaram

quatro hipóteses (em triplicado): evaporação à temperatura ambiente, sem corrente de azoto;

evaporação sob corrente de azoto a 40ºC; evaporação sob corr

previamente ao extracto uma solução de HCl a 1% em MeOH; evaporação sob corrente de

azoto, adicionando previamente ao extracto uma solução de HCl a 1% em isopropanol. O

resíduo foi então re-dissolvido em 70 µL da fase móvel B, se


ura ambiente, com uma velocidade de agitação de 1000 rpm (condições


auxílio de uma pinça, e de seguida transferida para um vial contendo 3 mL de uma solução de

(50:50, v/v) para se proceder à retroextracção através de tratamento ultra



propanol:amónia (78:20:2, v/v/v), uma vez ser este o eluente utilizado no


uma pinça e ao extracto orgânico foi adicionado 20 µL de MBTFA, levado à evaporaçã

secura sob corrente suave de azoto, tendo o resíduo sido re-dissolvido com 60 µL de MBTFA


extracto obtido foi transferido para um vial e uma alíquota (2 uL) foi injectada no sistema GC

Ilustração genérica do processo de pré-concentração dos analitos por BAµE-

STUDO DO EFEITO DE EVAPORAÇÃO NOS ATS

Após a escolha do material adsorvente mais adequado à extracção dos ATS estudou


extractos, pois a separação cromatográfica passaria a efectuar-se por LC-MS/MS, sem recurso

a derivatização química. Assim, o procedimento experimental adoptado foi igua

no ponto 1.2.2 mas no extracto orgânico obtido e antes da etapa de evaporação testaram


evaporação sob corrente de azoto a 40ºC; evaporação sob corrente de azoto, adicionando



dissolvido em 70 µL da fase móvel B, seguido de análise por LC


51

ura ambiente, com uma velocidade de agitação de 1000 rpm (condições


contendo 3 mL de uma solução de

(50:50, v/v) para se proceder à retroextracção através de tratamento ultra-sónico



propanol:amónia (78:20:2, v/v/v), uma vez ser este o eluente utilizado no


uma pinça e ao extracto orgânico foi adicionado 20 µL de MBTFA, levado à evaporação até à

dissolvido com 60 µL de MBTFA


injectada no sistema GC-

-LD.

Após a escolha do material adsorvente mais adequado à extracção dos ATS estudou-se o


MS/MS, sem recurso

a derivatização química. Assim, o procedimento experimental adoptado foi igual ao descrito

no ponto 1.2.2 mas no extracto orgânico obtido e antes da etapa de evaporação testaram-se


ente de azoto, adicionando



guido de análise por LC-MS/MS.


52


Posteriormente estudou-se a recuperação da metodologia desenvolvida. Sendo assim,

extraíram-se dois conjuntos de alíquotas (5 mL de urina branca diluída em 15 mL de água

ultra-pura), isentas dos compostos a analisar, em triplicado. Enquanto um dos conjuntos foi

fortificado antes da extracção, o outro só foi fortificado após o término do processo

extractivo e antecedendo a etapa de evaporação da fase orgânica. O PI foi adicionado a todas

as fases orgânicas obtidas na concentração de 100 ng/mL, antes da evaporação. O processo de

extracção e retroextracção ocorreu de igual forma à descrita no ponto 4.10.2. Após término do

processo de retroextracção a barra de extracção foi então retirada com o auxilio de uma pinça

e ao extracto orgânico era adicionado 100 µL de uma solução de HCl a 1% em MeOH, levado

à evaporação até à secura sob corrente suave de azoto, tendo o resíduo sido re-dissolvido em

70 µL da fase móvel B, seguido de análise por LC-MS/MS.

4.11.5. LIMITE DE DETECÇÃO

O estudo do limite de detecção foi efectuado em simultâneo com o estudo da eficiência da

fase de extracção. Realizaram-se então quatro ensaios, um por cada nível de concentração dos

ATS (2, 5, 10 e 20 ng/mL) medindo 15 mL de água ultra-pura e 5 mL de urina branca

previamente filtrada, para um vial de vidro apropriado. Posteriormente, a solução aquosa foi

fortificada com os ATS em estudo de acordo com a concentração pretendida, adicionado o PI

(100 ng/mL), adicionadas três gotas de uma solução de KOH 1M e inserida a barra de

extracção e agitação, tendo-se por fim selado o vial. A extracção e retroextracção foram

efectuadas nas condições padrão já referidas. As barras de extracção foram então retiradas

com o auxilio de uma pinça e ao extracto orgânico era adicionado 100 µL de uma solução de

HCl a 1% em MeOH, evaporado até à secura sob corrente suave de azoto, tendo o resíduo

sido re-dissolvido em 70 µL da fase móvel B, seguido de análise por LC-MS/MS. O LOD foi

então determinado através do método visual [241].

Resultados e discussão

53

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS

Após a análise dos espectros de massa dos ATS em estudo, obtidos em modo full scan,

pretendia-se seleccionar os fragmentos iónicos diagnóstico (valores m/z) característicos de

modo a que estes fossem utilizados em modo SIM, aumentando assim a sensibilidade e

selectividade da análise por GC-MS. No entanto, tal como referenciado na literatura [22,79],

constatou-se que os espectros de massa apresentavam fragmentos iónicos de fraca intensidade

e/ou massas moleculares baixas (vide Anexo F, a título de exemplo), o que dificultava a sua

identificação em modo SIM, para além da perda de selectividade e sensibilidade.

Esta limitação conduziu à derivatização analítica dos ATS, nomeadamente à acilação com

MBTFA, o que facilitou a sua identificação [22,79], pois obtiveram-se espectros de massa mais

expressivos, devido ao aumento da massa molecular dos ATS, oferecendo um modo de

fragmentação mais complexo, pelo que os fragmentos iónicos são mais característicos,

observando-se ainda o pico correspondente ao ião molecular. Encontram-se na Tabela 5.1 os

fragmentos iónicos diagnóstico (valores m/z) monitorizados em modo SIM e respectivo

tempo de retenção (tR) dos ATS, obtidos mediante análise por GC-MS após acilação com

MBTFA.

Tabela 5.1 - Razão massa/carga (m/z) dos fragmentos iónicos diagnóstico monitorizados em modo SIM e

tempo de retenção (tR) usados na identificação dos compostos derivatizados com MBTFA.

Composto Fragmento iónico (m/z) tR / min

2C-T-2-N-TFA 211, 224, 337 10,8

2C-T-7-N-TFA 225, 238, 351 11,1

PMA-N-TFA 121, 148, 261 7,8

PMMA-N-TFA 121, 148, 154 8,5

Metcatinona-N-TFA 105, 110, 154 7,3

Efedrina-N,O-TFA 110, 154, 244 6,9

Norefedrina-N-TFA 140, 203, 230 6,4

*Anfetamina-N-TFA d6 144 6,2

*Metanfetamina-N-TFA d9 161 7,0

*MDMA-N-TFA d5 158 9,1

*MDE-N-TFA d5 173 9,4

*MDBD-N-TFA d5 172 9,5

*padrão interno; pico base

Resultados e discussão o

54

A fim de se proceder à aplicação dos critérios de aceitação para a identificação inequívoca dos

ATS na amostra biológica foi necessário proceder à escolha do PI mais adequado a cada

analito. Este composto deve possuir alguns requisitos, designadamente, deve ser

quimicamente similar ao analito, idealmente um análogo deuterado deste, e apresentar

estabilidade. O PI é sujeito às mesmas condições analíticas dos compostos alvo durante a

separação cromatográfica, pelo que o tR do ATS pode ser calculado relativamente ao tR do PI,

minimizando diferenças no tR, que por vezes ocorrem entre corridas diferentes [1]. Assim,

sendo após realização das primeiras experiências, verificou-se que o análogo deuterado da

anfetamina seria o PI mais indicado para a análise do 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, efedrina e

norefedrina enquanto a metanfetamina deuterada seria mais adequada para a análise de PMMA

e metcatinona (vide Anexo G).

É possível observar-se na figura 5.1 os resultados obtidos através da fortificação com os ATS

(200 ng/mL) de uma amostra branca de sangue total. Esta foi processada e analisada por

SPE/GC-MS, com derivatização com MBTFA. Apresentam-se igualmente os critérios de

aceitação propostos pela WADA [230] para a identificação inequívoca de analitos em amostras

biológicas por GC-MS, exemplificando-se a aplicação destes critérios na confirmação

qualitativa do 2C-T-2-N-TFA.

(a)

(c)

AMOSTRA

Área Abs

m/z 211 207113

m/z 337 117641

m/z 224

CONTROLO

Área Abs

m/z 211 206732

m/z 337 119372

m/z 224

CRITÉRIOS

Rel.iónicas

90.000 110,000

47.742 67,742

20.154 30,230

Figura 5.1 - Identificação do 2C-T

em estudo e à qual se adicionou o PI na mesma concentração: Confirmação da presença dos três fragmentos

iónicos de diagnóstico no cromatograma (a); Fragmentograma

2C-T-2-N-TFA (b); Aplicação dos critérios de aceitação para a identificação do 2C

Verificam-se então todos os critérios recomendados pela WADA para a confirmação

qualitativa do 2C-T-2-N-TFA. A identificação

confirmada.


Área Abs Área Rel S/N trA

207113 100,000 10,831 6,256

117641 56,800 10,834 6,256

52322 25,263 21.7 10,831 6,256

Área Abs Área Rel S/N trA

206732 100,000 10,834 6,261

119372 57,742 10,838 6,261

52080 25,192 26.3 10,836 6,261

Rel.iónicas S/N ∆tr (± 0,1 minuto) ∆t

110,000 > 3 10,734 10,934 1,713

67,742 > 3 10,738 10,938 1,714

30,230 > 3 10,736 10,936 1,713

T-2-N-TFA numa amostra de sangue total fortificada com 200 ng/mL dos ATS


iónicos de diagnóstico no cromatograma (a); Fragmentograma

TFA (b); Aplicação dos critérios de aceitação para a identificação do 2C-T-2-N

se então todos os critérios recomendados pela WADA para a confirmação

TFA. A identificação inequívoca dos restantes ATS foi igualmente

(b)

211

224

m/z 211

m/z 337

m/z 224


55

trP trR

6,256 1,731

6,256 1,732

6,256 1,731

trP trR

6,261 0,578

6,261 0,578

6,261 0,578

∆trR (± 1% relativo)

1,713 1,748

1,714 1,748

1,713 1,748

TFA numa amostra de sangue total fortificada com 200 ng/mL dos ATS


de massa do

N-TFA (c).

se então todos os critérios recomendados pela WADA para a confirmação

dos restantes ATS foi igualmente

337


56

5.2. EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)

5.2.1. PRÉ-TRATAMENTO DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS

A necessidade de determinar inúmeros compostos numa análise toxicológica, a utilização de

metodologias analíticas distintas e a existência de amostras biológicas cujo volume é diminuto

(em regra, inferior a 10 mL) justificou a necessidade de utilizar um volume inicial de 0,5 mL de

sangue.

As amostras biológicas requerem, em geral, um pré-tratamento, uma vez apresentarem

concentrações elevadas de macromoléculas ou material em suspensão, podendo obstruir os

poros do adsorvente sólido da coluna de SPE durante a fase de extracção [260-261]. Assim,

procedeu-se à diluição das mesmas permitindo reduzir a sua viscosidade. Note-se que a

diluição da amostra com solução tampão fosfato (KH2PO4 0,1 M, pH 6,0±0,1) também

permitiu controlar o pH da mesma. Já a centrifugação das amostras após a diluição induziu a

sedimentação dos interferentes sólidos, diminuindo assim o risco de obstrução dos poros do

adsorvente [260-261].

5.2.2. METODOLOGIA DE EXTRACÇÃO

Nesta etapa foi avaliada a extracção com recurso a colunas Oasis® HLB e Oasis® MCX. Os

adsorventes poliméricos das referidas colunas distinguem-se face a outros copolímeros

disponíveis comercialmente pela sua eficiência extractiva elevada, reprodutibilidade e aquando

da extracção não se verificam perdas de analitos quando o adsorvente seca [231], o que

permite maior autonomia ao analista. Além disso, os adsorventes usados nos dois tipos de

colunas são estáveis numa gama de pH entre 1 e 14, permitindo a retenção de um grande

número de compostos, com diferentes polaridades [231,262].

Após a realização das experiências (n=9) com as colunas Oasis® HLB não foram obtidos

resultados reprodutíveis, verificando-se a ausência de alguns dos ATS em estudo (PMA,

PMMA, efedrina, norefedrina e metcatinona) na gama alta (500 ng/mL), ou até mesmo a

ausência de todos os ATS, na gama baixa (5 ng/mL). Na gama média (100 ng/mL) foi

possível determinar a eficiência extractiva das colunas Oasis® HLB (vide Anexo H),

observando para a maioria dos compostos recuperação médias entre 5,7 e 105,4%, estando

associados CV% elevados. Assim, a extracção dos compostos encontrava-se comprometida

(vide cromatogramas em Anexo). Apesar de na literatura se encontrarem referências à

extracção de ATS por SPE mediante colunas Oasis® HLB [263-264], o trabalho de Cela et al.

[265] compara a eficiência extractiva entre polímeros molecularmente impressos (MIPs, do


57

inglês molecularly imprinted polymers), colunas Oasis® MCX e Oasis® HLB, referindo que as

últimas demonstraram a pior eficiência extractiva para vários compostos, incluindo efedrinas e

catinonas.

Os resultados obtidos apontam para as colunas Oasis® MCX como as mais adequadas para a

extracção de todos os compostos em estudo, à semelhança de outros estudos efectuados [265-

268]. De facto, a presença de grupos sulfónicos no polímero (fase estacionária de modo misto,

troca catiónica e fase reversa) parece favorecer a retenção selectiva dos ATS (que possuem

uma função amina), comparativamente às HLB [269]. A diluição do sangue total com solução

de tampão fosfato possibilitou o controlo do pH da amostra biológica, uma vez que os ATS

em estudo apresentavam características básicas e com grupos funcionais ionizáveis (amina

primária e secundária). Assim, os compostos ionizados originam, maioritariamente, espécies

catiónicas, conduzindo a um aumento da adsorção dos compostos básicos por interacções

electrostáticas com os grupos aniónicos. Aquando da lavagem da coluna, a água permite

remover apenas os interferentes da matriz e, posteriormente, o HCl completará o processo ao

permitir a eluição de proteínas e outras matérias não retidas na fase estacionária, assegurando

ainda a protonação dos ATS [262,269]. O diclorometano/metanol (70:30) permite ainda a

remoção de compostos polares, neutros e ácidos. Interferentes hidrofóbicos, gorduras e até

vestígios de água são eliminados mediante a lavagem com n-hexano [269]. Finalmente, a

eluição com solução de diclorometano/isopropanol/amónia (78:20:2, v/v/v), também

utilizada por Wohlfarth et al. [11] permite a recuperação dos compostos em estudo.

5.2.3. Estudo do EFEITO DE EVAPORAÇÃO NOS ATS

É referido na literatura a perda de analitos voláteis, como é o caso dos ATS em estudo

[11,82,], durante a etapa de evaporação da fase orgânica obtida por SPE. No entanto, alguns

autores desvalorizam a perda de analitos durante o processo de evaporação, considerando que

esta não é significativa, especialmente se este se der em condições suaves [10,25]. Ainda assim,

alguns autores referem que o passo de evaporação sem a adição de algum reagente específico

será ineficaz na redução de perdas de analitos com baixos pesos moleculares, mesmo quando

o procedimento ocorre à temperatura ambiente [233]. Sendo assim, diferentes autores sugerem

a adição de reagentes que conduzam à formação de derivados de sais (ex. cloridratos, acetatos

ou reagentes de acilação), prevenindo assim a perda de analitos voláteis [11,233,270]. Sugere-se

então, antes da etapa de evaporação, a adição aos eluatos obtidos de uma solução metanólica

de HCl, formando cloridratos menos voláteis [11,233,270], ou a adição de TMCS [233],

MBTFA [233,271], ou outros reagentes. Neste trabalho, optou-se por adicionar 20 µL do


58

reagente de derivatização (MBTFA) antes de conduzir as amostras à secura, à semelhança do

procedimento adoptado pelo STF para análise de piperazinas e anfetaminas [272].

5.2.4. DERIVATIZAÇÃO QUÍMICA

As primeiras experiências, efectuadas em GC-MS sem recurso à derivatização química,

evidenciaram, para além de espectros de massa com pouca informação estrutural tal como

referido anteriormente (vide ponto 5.1), a presença de picos cromatográficos com arrastamento

(tailing) e até perda de sinal cromatográfico nos compostos norefedrina e metcatinona. De

facto, muitos compostos apresentam um mau comportamento cromatográfico, o qual está

geralmente associado à presença de grupos funcionais polares (ex. COOH, OH, NH, SH). No

caso concreto das aminas, existe ainda a possibilidade de interacção destas com a sílica fundida

ou a fase estacionária, assim como a sua decomposição, causando alargamento dos picos

cromatográficos. Infelizmente, a maioria dos compostos de interesse toxicológico encontram-

se nesta situação [273]. Uma forma de contornar estas dificuldades passa pela derivatização

química, isto é, modificação química dos grupos funcionais através de reacções apropriadas,

geralmente efectuadas de modo a produzir derivados dotados de propriedades adequadas para

a sua separação e detecção cromatográfica [274]. Adicionalmente, a derivatização pode

também melhorar a forma do pico cromatográfico através da redução da cauda (tailing),

aumentar a sensibilidade e selectividade e melhorar a resolução dos compostos [273].

De facto, em GC, a transformação de uma amina na amida correspondente mediante

derivatização apresenta várias vantagens. Os derivados obtidos são menos polares do que os

compostos iniciais e a substituição dos hidrogénios activos da função amina reduz a tendência

para formar pontes de hidrogénio [273], consequentemente, o respectivo comportamento

cromatográfico é melhorado [275]. No caso particular da análise de aminas por GC, a prática

da derivatização encontra-se documentada na bibliografia, sendo muitos e de vários tipos os

reagentes derivatizantes que já foram propostos para o efeito, onde as reacções de alquilação,

formação de carbamatos, acilação e sililação assumem particular importância, embora as duas

últimas sejam as mais usuais [273,275-277].

Assim, foram avaliadas três tipos de reacções de derivatização, a sililação, a acilação e a

formação de carbamatos, e sete reagentes de derivatização, MSTFA:TMCS (95:5), MBDSTFA,

MSHFBA, MSTFA/MBTFA, MBTFA, PFPA/PFPOH e py/cloroformato de benzoílo.

Os derivados silil são amplamente utilizados em GC e usualmente são formados através da

substituição dos hidrogénios activos com o grupo trimetilsilil. No entanto, os reagentes


59

sililação e derivados trimetilsilil são hidroliticamente instáveis e devem ser protegidos da

humidade [277], o que pode constituir um problema no STF, dado o elevado número de

amostras que processa simultaneamente, o que prolonga o tempo que decorre desde a

derivatização até à injecção no sistema cromatográfico e onde, por vezes, é necessário

proceder à re-injecção dos extractos. No decorrer da experiência levada a cabo com os

reagentes MSTFA:TMCS, MBDSTFA e MSHFBA verificou-se que estes seriam ineficazes

para os fins proposto, pois estes originavam derivados mono e di-substituídos para a efedrina,

para além da reacção não ser completa, uma vez observar-se picos referentes à efedrina não

derivatizada.

A acilação é uma das mais populares derivatizações para aminas primárias e secundárias. De

facto, os derivados de acilo, por análise por GC-MS, tendem a originar mecanismos de

fragmentação capazes de fornecer informação estrutural bastante útil. No entanto, um dos

factores que leva à sua utilização intensiva torna-se também uma desvantagem: a sua elevada

reactividade. Esta característica é responsável por diversos problemas quando o excesso de

reagente é introduzido no sistema cromatográfico juntamente com os analitos derivatizados,

pois alguns deles provocam danos irreversíveis na fase estacionária das colunas

cromatográficas usadas [276,277]. Foram testados dois reagentes de acilação, o MBTFA e o

PFPA/PFPOH. O primeiro é utilizado no STF aquando da confirmação e quantificação de

anfetaminas no sangue por GC-MS. De facto, a reacção de acilação dos ATS com o MBTFA

satisfez os critérios estabelecidos para a formação de derivatizados: realizou a modificação

desejada e observou-se a formação de um único derivatizado para todos os compostos,

excepto para a efedrina, onde se constatou a formação de dois derivados; além disso, foi

rápida, e reprodutível [279-280]. Mais, o MBTFA é um potente reagente de derivatização e o

seu excesso não necessita de ser removido, possibilitando a sua injecção no sistema

cromatográfico [271,277]. A reacção levada a cabo com PFPA/PFPOH, apesar de ser

referenciada na bibliografia para a derivatização de anfetaminas [278] não se mostrou

satisfatória, pois o cromatograma apresentava bastantes interferências, não tendo sido possível

identificar os compostos em estudo.

Foi igualmente testada uma reacção de sililação seguida de uma acilação, utilizando o reagente

MSTFA seguido de MBTFA, com o objectivo de evitar a formação de dois compostos na

reacção de derivatização da efedrina, mediante a formação selectiva de derivados N-TFA-O-

TMS [277]. No entanto, o objectivo não foi alcançado e constatou-se a formação de dois

compostos na reacção de derivatização deste ATS.


60

Finalmente, testou-se a reacção de formação de carbamatos. Hughes et al. [281] utilizaram este

tipo de derivatização na análise de anfetamina e metanfetamina, apesar de não ser a

derivatização mais comum para este tipo de compostos. Neste tipo de reacção é adicionado

um grupo alquilo ao átomo de azoto da amina e a principal vantagem desta derivatização é o

facto de se poder levar a cabo em meio aquoso, o que permite derivatização in situ em

amostras biológicas. No entanto, o cromatograma obtido apresentava muitos interferentes,

inúmeros picos cromatográficos, alguns bastante largos, pelo que não se detectaram os

analitos alvo. Adicionalmente, verificou-se, mediante observação da alteração dos tR, que as

sucessivas injecções de extractos derivatizados com este reagente provocavam alterações na

coluna cromatográfica, danificando-a. Pelo exposto, a escolha do reagente de derivatização

recaiu no MBTFA.

5.3. VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO PARA ANÁLISE DE ATS POR SPE/GC-MS

5.3.1. AVALIAÇÃO DA SELECTIVIDADE

Um método instrumental de análise que produz uma resposta para uma única substância é

designado como específico (ex. métodos espectrométricos), já um método que produz várias

respostas para diversos compostos químicos, mas que consegue distinguir a resposta de um

analito de todas as outras respostas, é designado como selectivo (ex. métodos

cromatográficos) [235,282]. Assim, na presente dissertação, será utilizado o termo

selectividade.

Pode descrever-se a selectividade de um método analítico como sendo a sua aptidão para

discriminar inequivocamente as substâncias de interesse, mesmo quando estão presentes

outros constituintes ou analitos numa matriz complexa [10,213,235,252,282]. Não se encontra

descrito na literatura uma metodologia pré-estabelecida para o estudo da selectividade de um

método analítico. Uma forma relativamente simples de avaliar este parâmetro passa por

comprovar a inexistência de sinais analíticos que possam interferir com os sinais analíticos dos

compostos de interesse em amostras brancas e, desta forma, prejudicar a identificação dos

analitos (no mínimo, 6 amostras brancas de diferentes origens) [235,237]. No entanto, subsiste

uma elevada probabilidade de que interferências relativamente raras provocadas por outras

substâncias ou constituintes da matriz não sejam detectadas por via desta metodologia [226],

tal como referenciado por Gonçalves et al. aquando de um falso resultado negativo de

benzoilecgonina devido a interferência de nordiazepam [283].


61

Assim, afigura-se mais representativo da realidade uma outra forma de avaliar a selectividade,

que consiste em fortificar amostras brancas com o analito em concentrações próximas dos

limiares analíticos, avaliando-se então os resultados obtidos, mediante critérios previamente

definidos [282,284]. Além disso, no presente trabalho, optou-se pela utilização de pools de

sangue ao invés de amostras unitárias, aumentando consideravelmente a heterogeneidade das

amostras [248], simulando as situações possíveis de encontrar em rotina no STF. A

identificação inequívoca do analito na amostra é então realizada mediante a confirmação dos

quatro critérios de confirmação. Assim, segundo os referidos critérios, foram consideradas

negativas as alíquotas de pools de sangue às quais os ATS não foram adicionados, sendo

consideradas positivas aquelas cujas alíquotas foram fortificadas. Neste sentido, a selectividade

do método foi demonstrada, com a ausência de falsos resultados positivos ou negativos.

Surge ainda uma nova abordagem na forma de avaliar a selectividade: sugere-se que amostras

brancas sejam fortificadas simultaneamente com os analitos em estudo e com outros

compostos passíveis de ser encontradas em rotina, em concentrações elevadas, avaliando-se

então se os resultados assim obtidos são ou não aceitáveis. Para este efeito, a presença de um

interferente é considerada inaceitável quando afecta a capacidade de identificação e/ou a

exactidão da quantificação do analito [226,284,285]. Assim, cinco pools, seleccionadas

aleatoriamente, foram fortificadas com cinquenta e dois compostos diferentes que pudessem

interferir com a análise dos ATS (vide Anexo). Segundo os resultados obtidos, não se

observam interferências significativas, apesar das elevadas concentrações dos compostos

adicionados, tendo sido cumpridos os critérios já mencionados.

Na figura 5.2 apresentam-se, a título de exemplo para os compostos 2C-T-2-N-TFA e 2C-T-

7-N-TFA, dois cromatogramas referentes à análise de uma alíquota de uma pool de sangue

branca fortificada com os ATS e PI (200 ng/mL), e uma segunda alíquota, da mesma pool,

fortificada com os ATS e PI (200 ng/mL) e os cinquenta e dois compostos referidos (vide

tabela, Anexo A).


62

(a) (b)

Figura 5.2 - Cromatogramas obtidos por SPE/GC-MS: alíquota de pool de sangue branco fortificada com o PI

(200 ng/mL) e os ATS (200 ng/mL) (a); alíquota da mesma pool de sangue após fortificação a

200 ng/mL com o PI e os ATS, e os cinquenta e dois compostos mencionados na tabela em Anexo (b).

Saliente-se que na Figura 5.4 é possível observar fragmentos iónicos característicos de outras

drogas de abuso (ex. 1-(3-clorofenil)piperazina, mCPP, e mescalina). Esta situação deve-se à

importância de metodologias para determinação simultânea de várias drogas de abuso, devido

ao fenómeno de policonsumo. Assim, foi desenvolvida uma MACRO onde figuram

anfetaminas e piperazinas, já validadas pelo STF, e ainda os ATS em estudo (vide Anexo I).

Considerando ainda que o procedimento de análise é idêntico para as anfetaminas, piperazinas

e ATS, uma só análise permite identificar cerca de 19 compostos diferentes, o que assume

particular importância em toxicologia forense, pela escassez de amostra disponível.

Observando a figura 5.2, parece não existir interferentes para os compostos 2C-T-2-N-TFA e

2C-T-7-N-TFA. Na figura 5.3, analisando o cromatograma referente à alíquota da pool

fortificada com o PI e os analitos alvo e comparando com a alíquota da mesma pool fortificada

apenas com o PI e os cinquenta e dois composto, verifica-se que, para o mesmo tR do analito

(2C-T-2-N-TFA e 2C-T-7-N-TFA), não se observam interferentes, apenas o ruído

instrumental.


63

Figura 5.3 - Cromatogramas obtidos na segunda fase do estudo da selectividade do método analítico por

SPE/GC-MS: alíquota de pool de sangue branco fortificada com o PI (200 ng/mL) e os ATS (200 ng/mL) (a);

alíquota da mesma pool de sangue após fortificação com o PI (200ng/mL) e os cinquenta e dois compostos

mencionados na tabela em Anexo (b).

Quando se pretende confirmar qualitativamente e/ou quantificar um analito, e em particular

compostos relacionados com a anfetamina e metanfetamina, como é o caso dos ATS, em

matrizes complexas (ex. sangue) é difícil de evitar a presença de substâncias interferentes. No

entanto, a sua presença foi considerada aceitável, dado não interferir na confirmação

qualitativa dos ATS, de acordo com os critérios previamente estabelecidos. Para além dos

critérios adoptados da WADA [230], o STF, num método de confirmação qualitativa, exige

que a percentagem de falsos resultados positivos e de falsos resultados negativos seja,

respectivamente, de 0% e igual ou inferior a 10%. Tendo em conta que não se detectaram

falsos resultados positivos ou negativos, nem foram observadas interferências no tR e

fragmentos iónicos monitorizados, considera-se que o método desenvolvido é selectivo.

5.3.2. LIMITES ANALÍTICOS: LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO

O LOD de um método analítico define-se como a quantidade mínima de analito alvo que

pode ser detectada, o que não significa que possa ser quantificada de modo exacto. Já o LOQ

refere-se à quantidade mínima do analito alvo que pode ser quantificada com precisão e

exactidão consideradas adequadas [10,213,235,247,252,282].


64

A abordagem a seguir na determinação destes limites não reúne consenso, pois existem várias

metodologias para a sua determinação: avaliação visual [224,235, 241,247,252,282], razão S/N

[224,235,241,247,252,282] ou baseada em parâmetros da curva de calibração

[224,235,241,247,282,252]. O primeiro método baseia-se na adição de concentrações

crescentes de analito à matriz, para que seja possível distinguir o sinal analítico, estabelecendo-

se assim o LOD e LOQ através da menor quantidade que é possível detectar e quantificar,

respectivamente. O segundo método, aplicado a métodos analíticos onde se observe ruído da

linha de base (ex. técnicas cromatográficas), consiste na análise da razão S/N. Para tal,

comparam-se os sinais de amostras brancas com os sinais de amostras com concentrações

baixas do analito. Regra geral, estabeleceu-se que as razões S/N devem ser pelo menos iguais a

3 e 10, respectivamente no LOD e LOQ [224,235,241,282,252]. No entanto, este

procedimento apresenta algumas limitações em toxicologia forense, devido à complexidade

das matrizes utilizadas [10]. Os métodos anteriormente descritos são muito utilizados pela sua

rapidez, contudo o facto de se basearem em parâmetros qualitativos surge como uma

desvantagem [241]. Assim, neste trabalho, optou-se pelo cálculo dos limiares analíticos assente

em parâmetros da curva de calibração (erro padrão, Sy/x, e declive), dado que apresenta maior

fiabilidade estatística, pois considera o intervalo de confiança da regressão [10,241]. O LOD e

LOQ são então definidos como a concentração mínima de uma substância que pode ser

detectada e quantificada, respectivamente, com um determinado grau de confiança (em regra,

99% ou 95%) [241]. No entanto, este método tem sido menos utilizado que os dois métodos

anteriores devido à maior complexidade de cálculos necessários. Note-se que este método

pode conduzir a valores irrealistas caso não se verifique homogeneidade de variâncias e

linearidade até à origem, bem como a concentrações sobrestimadas, caso a curva de calibração

abranja toda a gama de trabalho [10]. Diversos autores [252, 285] apontam outra metodologia

para determinar o LOQ, baseada nos valores de precisão e exactidão. Esta é, provavelmente, a

abordagem mais prática e serve-se da própria definição de LOQ para determinar este

parâmetro, isto é, o LOQ é a menor concentração de analito que pode ser quantificado com

precisão e exactidão aceitáveis (≤ 20%) [252]. Independentemente do método de

determinação utilizado, os limites estimados devem ser realistas. Esta é a razão pela qual,

através da fortificação de amostras brancas com o analito na concentração obtida para o LOQ,

se deve comprovar que os resultados assim obtidos apresentam precisão e exactidão

consideradas aceitáveis (± 20%) [10].

Sendo assim, determinaram-se os limiares analíticos para os ATS em estudo, em três gamas de

trabalho distintas, 2-25 ng/mL, 2-50 ng/mL e 5-500 ng/mL utilizando parâmetros da curva


65

de calibração, o desvio-padrão residual e o declive da curva (vide Anexo D). O facto de se ter

optado por estudar os limites analíticos em três gamas de trabalho deve-se ao facto destes

valores não serem estáticos, o seu cálculo por recurso a diferentes curvas de calibração e

intervalos de concentrações permitirá então obter limites analíticos distintos [10], pelo que será

interessante constatar essa oscilação. O resumo dos resultados obtidos encontra-se na tabela

5.2.

Tabela 5.2 – Resultados obtidos no estudo do LOD e LOQ em três gamas de trabalho.

Compostos

LOD LOQ

2-20

ng/mL

2-50

ng/mL

5-500

ng/mL

2-20

ng/mL

2-50

ng/mL

5-500

ng/mL

2C-T-2-N-TFA 1,83 5,57 15,18 5,56 16,88 46,00 2C-T-7-N-TFA 1,33 5,21 5,68 4,03 15,73 17,22 PMA-N-TFA 1,19 4,70 4,48 3,60 14,23 13,57

PMMA-N-TFA 2,69 3,09 11,20 8,15 9,36 33,95 Efedrina-N,O-TFA 1,41 4,54 156,61 4,28 13,77 474,61 Norefedrina-N-TFA 0,80 3,08 10,38 2,41 9,32 31,47 Metcatinona-N-TFA 2,18 5,55 9,94 6,60 16,81 30,13

Tal como se pode observar, os limites analíticos baixam com a diminuição da gama de

trabalho, em conformidade com a literatura [10], que refere que no seu cálculo não devem ser

utilizados os dados obtidos de curvas de calibração estabelecidas para toda a gama de trabalho,

pois obter-se-iam concentrações de LOD e LOQ superiores às que o método é efectivamente

capaz de atingir [10,252]. Segundo a metodologia baseada em parâmetros da recta de

calibração ter-se-iam LOQ de 2,41 a 8,15 ng/mL. Contudo, alguns autores [252,285]

defendem que a metodologia mais prática para a determinação do LQ deve ser baseada nos

valores de precisão e exactidão (≤ 20%). Assim, optou-se pela utilização dessa metodologia,

uma vez fornecer maior fiabilidade nos resultados. De acordo com os resultados obtidos

aquando do estudo da precisão (vide ponto 5.3.5) é legítimo afirmar que o método analítico

desenvolvido tem um LOQ de 5 ng/mL para todos os ATS em estudo, pelo que a

quantificação destes compostos abaixo deste valor não é aceitável, assim sendo este será o

calibrador mais baixo da curva de calibração [282].

Apesar de não ser necessário a determinação do LOD em métodos quantitativos [226], este

parâmetro foi determinado. Assim, mais uma vez, por utilização dos parâmetros da recta de

calibração, obtêm-se LOD de 0,28 a 2,69 ng/mL, embora o método visual permita obter


66

LOD de 1 ng/mL para todos os ATS em estudo. Assim, fixou-se o LOD de 1 ng/mL para os

ATS.

Na literatura não se encontram métodos validados para a quantificação dos compostos da

série 2C na matriz sangue total. Boatto et al., para matriz plasma humano, validou uma

metodologia para a extracção de vários compostos da série 2C por meio de LLE/CE-MS,

tendo alcançado LOD entre 11,3 e 23,0 ng/mL e LOQ entre 27,3 e 43,0 ng/mL [183].

Wohlfarth et al. [11] em soro humano obteve LOD de 1 ng/mL para estes compostos,

mediante SPE/LC-MS/MS. Kerrigan et al. [26] em urina obteve LOD entre 2-10 ng/mL e

LOQ de 10 ng/mL para estes compostos, por SPE/GC-MS. Kudo et al. [13], também por

SPE/GC-MS, obteve em sangue total LOD de 50 ng/mL para o PMMA e 7 ng/mL para o

PMA, valores francamente superiores aos obtidos no presente trabalho. Mortier et al. [82]

obteve LOD entre 2,5-5 ng/mL e LOQ de 10 ng/mL para os compostos analisados, entre os

quais PMA. Sørensen [196], por LC-MS/MS, obteve LOD de 2,7 ng/mL para a norefedrina,

2,5 ng/mL para a efedrina e 2,1 ng/mL para a metcatinona, em amostras de sangue total.

Fernández et al. [12] para os compostos estudados obtiveram LOQ entre 2,5-25 ng/mL, entre

os quais o PMA e efedrina.

5.3.3. LINEARIDADE

A linearidade de um método analítico define-se como a capacidade deste para obter respostas

analíticas (variável dependente) directamente proporcionais às concentrações de analito

(variável independente) adicionadas à matriz, obtendo-se então uma curva ou recta de

calibração [235,241,253,282]. Geralmente, a regressão linear é a abordagem mais adoptada,

surgindo daí a designação de recta de calibração. No entanto, existem situações cuja resposta

analítica não obedece a uma calibração linear.

Inicialmente, assumiu-se que os resultados obtidos obedeciam a um modelo de regressão

linear simples. Deste modo, a avaliação da linearidade foi efectuada com recurso a

funcionalidades do Excel e na figura J.1 (vide Anexo J), encontra-se exemplificado para o

composto 2C-T-2-N-TFA o tratamento de resultados efectuado. Na tabela 5.3 encontram-se

resumidos os resultados obtidos no estudo do modelo de regressão linear simples.


67

Tabela 5.3 – Resumo dos resultados obtidos referentes ao modelo de regressão linear simples para os ATS em

estudo.

Composto Ião

(m/z) Equação da recta R2 Sy/x

Intervalo de intercepção da

ordenada na origem

95% inferior 95% superior

2C-T-2-N-TFA 337 y = 0,0011x - 0,0015 0,9989 0,0069 -0,0079 0,0050

2C-T-7-N-TFA 351 y = 0,0012x - 0,0036 0,9993 0,0062 -0,0095 0,0022

PMA-N-TFA 261 y = 0,0005x - 0,0028 0,9983 0,0038 -0,0063 0,0007

PMMA-N-TFA 154 y = 0,0018x + 0,0076 0,9939 0,0258 -0,0319 0,0166

Efedrina-N,O-TFA 244 y = 0,0003x - 5,9×10-5 0,9979 0,0028 -0,0027 0,0026

Norefedrina-N-TFA 230 y = 0,0017x - 0,0075 0,9947 0,0236 -0,0296 0,0147

Metcatinona-N-TFA 154 y = 0,0013x - 0,0149 0,9637 0,0449 -0,0561 0,0263

Assim, a linearidade foi comprovada no intervalo de 5 a 500, ng/mL, através da análise dos

coeficientes de correlação e de determinação (r>0,99 e R2 >0,99) para todos os ATS, excepto

para a metcatinona. Verificou-se igualmente que para todos os ATS as curvas de calibração

obtidas passam pela origem. Mais ainda, a observação visual da distribuição dos resíduos não

evidenciou tendências. Note-se que para todos os ATS, exceptuando a metcatinona, foi

necessário excluir um valor aberrante3.

No entanto, a confirmação da linearidade do método analítico não deve assentar unicamente

nos parâmetros obtidos na regressão linear, ou na representação gráfica da sua função ou

ainda na distribuição dos resíduos ao longo dos valores de concentração [241,252]. Por

conseguinte, utilizou-se também o teste de Mandel na avaliação da linearidade [245], pois

pretendia-se comparar qual dos modelos de regressão, linear ou não linear (quadrática) se

ajustaria melhor aos pontos de calibração (vide Anexo B). Na tabela 5.4 encontram-se os

valores de de Fcal, calculados de acordo com as expressões em anexo (vide anexo) e depois

comparados com os valores tabelados da distribuição F de Snedecor (Fcrit). Os resultados

obtidos comprovam que, no intervalo de concentrações seleccionado, entre 5 e 500 ng/mL, o

modelo de regressão linear parece ser o que melhor se ajusta aos pontos da curva de calibração

para todos os ATS em estudo.

3 Valor aberrante é aquele cujo valor de resíduo é superior, em módulo, ao dobro do desvio-padrão residual obtido para a curva de calibração (Sy/x).


68

Tabela 5.4 – Resumo dos resultados obtidos no teste de Mandel para os ATS em estudo.

Composto Teste de Mandel (Fcal) Critério de decisão

Fcal ≤ Fcrit (N-1; N-1; 0,95)

2C-T-2-N-TFA 6,77×10-8 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95)

2C-T-7-N-TFA 1,17×10-4 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95)

PMA-N-TFA 2,25×10-3 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95

PMMA-N-TFA 1,69×10-2 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95

Efedrina-N,O-TFA 3,06×10-5 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95)

Norefedrina-N-TFA 1,73×10-3 Fcal ≤ 2,98 F(10; 10; 0,95)

Metcatinona-N-TFA 1,51×10-2 Fcal ≤ 2.82 F(11; 11; 0,95)

5.3.4. GAMA DE TRABALHO

Nos métodos instrumentais de análise é comum a utilização de modelos de regressão linear

simples. Neste caso, parte-se do pressuposto de que o modelo é homocedástico, isto é,

presume-se que as concentrações de analito adicionadas à matriz estão isentas de erros e que

os resíduos (diferença entre o valor obtido e o valor estimado por interpolação na curva de

calibração) são independentes, apresentam uma distribuição Normal e a mesma variância no

intervalo de concentrações estudado [240-241].

Este pressuposto, em contexto forense, raramente se verifica. A variância, ao longo da gama

de trabalho, não é constante. Assim, é importante verificar se existem diferenças estaticamente

significativas entre variâncias num modelo de regressão linear através da aplicação do teste de

homogeneidade de variâncias (teste F) e da análise gráfica da distribuição dos resíduos em

função das concentrações adicionadas à matriz [240-241].

Desta forma, o teste de homogeneidade de variâncias (vide Anexo C) permitiu verificar se de

facto existiam diferenças estatisticamente significativas entre as variâncias nos extremos do

intervalo de concentrações seleccionado, entre 5-500 ng/mL. Na tabela 5.5 apresentam-se os

resultados obtidos após aplicação do teste F (Fcal) e respectiva comparação com o valor

tabelado (Fcrit).


69

Tabela 5.5 - Resumo dos resultados obtidos no teste de homogeneidade de variâncias.

Composto Teste de homogeneidade de

variâncias (Fcal)

Critério de decisão

Fcal ≤ Fcrit (9; 9; 0,95)

2C-T-2-N-TFA 3633,8

Fcal ≤ 3,18 F(9; 9; 0,95)

2C-T-7-N-TFA 5120,5

PMA-N-TFA 3482,5

PMMA-N-TFA 2316,4

Efedrina-N,O-TFA 2108,8

Norefedrina-N-TFA 4361,8

Metcatinona-N-TFA 23366,3

Tal como se pode observar na tabela 5.5, os valores de Fcal foram superiores aos de Fcrit para

todos os ATS, pelo que se depreende que existem diferenças estatisticamente significativas

entre as variâncias nos extremos da gama de trabalho. Trata-se, portanto, de um modelo

heterocedástico [240-241].

5.3.4.1. REGRESSÃO LINEAR PONDERADA

Diante de heterocedasticidade torna-se necessário diminuir a gama de trabalho até que o

contrário se verifique ou escolher um modelo de regressão mais apropriado. O modelo mais

adequado seria então aquele em que o factor de ponderação fosse o inverso da variância,

contudo é inexequível, exigiria vários replicados por calibrador e tendo em conta que sempre

que o método analítico é aplicado é necessário efectuar uma curva de calibração e três

amostras controlo (estas em duplicado ou triplicado), além das amostras a quantificar (também

elas em duplicado), o tempo dispendido na sua execução e os custos associados seriam

elevados. Portanto, recorreu-se à aplicação de factores de ponderação empíricos, tais como:

; ;

√ ;

;

;

√ [240,288].

A estimativa do erro relativo percentual (ER%), o qual compara a concentração obtida através

da equação resultante da regressão, com a concentração teórica do analito permitiu seleccionar

o factor de ponderação mais adequado. Este seria o que permitisse obter o menor valor no

somatório de todos os valores de ER% na gama de trabalho (ΣER%) e cuja representação

gráfica dos seus valores em função da concentração dos ATS evidenciasse que estes se

encontravam distribuídos aleatoriamente e numa faixa horizontal estreita. Quanto mais


70

diminuta fosse essa faixa melhor se adequaria [240,285,288]. Adicionalmente, exigia-se que as

curvas de calibração apresentassem um R2 ≥ 0,99.

Seleccionaram-se os seis factores de ponderação empíricos já mencionados e compararam-se

os resultados obtidos nos modelos de regressão ponderada com os obtidos no modelo de

regressão linear simples. Utilizou-se, neste estudo, o software Minitab®, versão 16 e os valores

de ΣER% e ER% foram estimados de acordo com as equações no Anexo D.

Na figura 5.4 representam-se os valores de ER% em função das concentrações, para o modelo

de regressão linear simples (Modelo 1) e para os modelos de regressão linear ponderada

(Modelos 2-7).

Figura 5.4 – Distribuição do erro relativo percentual (ER%) em função das concentrações de 2C-T-2-N-TFA obtida para o Modelo 1 (wi=1), Modelo 2 (wi=1/√x), Modelo 3 (wi=1/x), Modelo 4 (wi=1/x2), Modelo 5 (wi= 1/√y), Modelo 6 (wi=1/y) e Modelo 7 (wi=1/y2).

-500

0

500

1000

1500

0 200 400 600

ER

%

Concentração (ng/mL)

Modelo 1

-50

0

50

100

0 200 400

ER

%


Modelo 2

-40

-20

0

20

40

0 100 200 300 400 500ER

%


Modelo 3

-30

-20

-10

0

10

20

0 200 400

ER

%


Modelo 4

-50

0

50

0 200 400

ER

%


Modelo 5

-40

-20

0

20

40

0 100 200 300 400 500ER

%


Modelo 6

-30

-20

-10

0

10

20

0 100 200 300 400 500

ER

%


Modelo 7


71

Com o Modelo 1 nas concentrações mais baixas, próximas do limite inferior da curva de

calibração, obtiveram-se valores sobrestimados. Já os Modelos 3, 4, 6 e 7 apresentam melhores

resultados nessas concentrações.

Baseado na minimização do somatório de ER%, encontram-se na Tabela 5.6 os resultados

obtidos referentes ao 2C-T-2-N-TFA, onde se observa que os Modelos 3 e 6 parecem ser os

mais adequados dado que apresentam um menor valor de ∑ER%, 325,70 e 309,40,

respectivamente. Considerando que ao Modelo 3 (wi=1/x) está associado o valor de R2 mais

elevado, e também de acordo com a figura 5.6, este foi o factor de ponderação seleccionado.

Pelos mesmos motivos, o mesmo modelo foi eleito para os restantes ATS em estudo.

Tabela 5.6 – Erros relativos (ER%) por recurso à regressão linear simples e ponderada para cada factor de

ponderação empírico, referente ao 2C-T-2-N-TFA.

Concentração na amostra (ng/mL)

Modelo 1 Modelo 2 Modelo

3 Modelo

4 Modelo

5 Modelo

6 Modelo

7

1√

1

1

1

1

1

5 2378,18 319,53 93,73 16,85 298,05 82,50 14,55

10 1458,60 112,25 21,25 32,74 102,08 19,24 31,18 50 972,54 17,50 20,92 18,63 17,54 20,33 20,09 100 723,40 91,90 95,88 82,38 91,97 93,82 72,66 200 810,66 32,80 29,42 9,78 32,09 26,45 12,26 300 844,75 22,20 18,14 14,01 21,28 15,52 19,25 400 70,27 13,14 16,23 30,75 13,64 17,73 42,90 500 881,54 21,89 30,11 54,39 23,14 33,79 68,53

∑ER% 8139,95 631,20 325,70 259,53 599,78 309,40 281,43

R2 0,9942 0,9947 0,9937 0,9890 0,9945 0,9930 0,9869

5.3.5. PRECISÃO E EXACTIDÃO

Os resultados obtidos encontram-se sintetizados na tabela 5.7 e foram estimados utilizando as

expressões constantes no Anexo D e a análise de variância com um factor (ANOVA), no

Anexo E. Como se pode verificar na tabela, o método analítico desenvolvido não era

adequado à quantificação da metcatinona em amostras de sangue total, uma vez que os valores

de CV% referentes à precisão intermédia foram bastante elevados (iguais ou superiores a 20%

em toda a gama de trabalho). Estes valores podem ser atribuídos à falta de linearidade

demonstrada pela metcatinona. Nos restantes ATS os valores de CV% da precisão intermédia

e repetibilidade encontram-se dentro dos valores exigidos na literatura, ou seja, iguais ou

inferiores a 20% próximo do LOQ e 15% nas restantes concentrações [235,241,252]. Tendo

em conta que o valor de EMR (%) exprime a exactidão do método analítico, constata-se, por

observação da tabela 5.7, que os valores obtidos, se encontram dentro dos limites


72

considerados aceitáveis (± 20% próximo do LOQ e ± 15% nas restantes gamas de

concentração), com excepção para a efedrina, na gama de trabalho mais concentrada, onde se

obteve um valor ligeiramente superior (16,9%). Ainda assim, considerando que os valores de

ERM aceites no STF para todas as gamas de concentração é de ± 20% considerou-se que a

efedrina, ao nível mais elevado de concentração, cumpre os critérios estipulados de exactidão.

Adicionalmente, encontram-se na literatura situações similares, cujo processo de validação não

foi posto em causa [285].

Tabela 5.7 – Resumo dos resultados obtidos no estudo da precisão e exactidão do método, determinado para

três níveis de concentração (concentrações de ATS expressas em ng/mL e n=15).

Composto Concentração

real Repetibilidade

(CVR)

Precisão intermédia

(CVSI)

EMR (%)

Concentração estimada

2C-T-2-N-TFA

20 5,6 10,2 -15,4 16,9 84,6

250 3,9 11,2 -11,9 220,3 88,1

450 6,3 11,4 -2,4 439,4 97,6

2C-T-7-N-TFA

20 5,9 10,9 -5,6 18,9 94,4

250 4,2 9,2 -2,6 243,5 97,4

450 5,0 7,7 7,2 484,3 107,6

PMA-N-TFA

20 6,7 9,7 -11,5 17,7 88,5

250 5,5 8,0 -2,0 244,9 98,0

450 5,2 8,2 5,1 473,0 105,1

PMMA-N-TFA

20 4,9 13,2 1,1 20,26 101,3

250 4,9 11,2 -4,0 239,9 96,0

450 4,5 13,8 2,5 461,1 102,5

Efedrina-N,O-TFA

20 7,3 9,9 10,0 22,0 110,0

250 5,1 11,1 6,2 265,5 106,2

450 8,0 9,6 16,9 525,9 116,9

Norefedrina-N-TFA

20 6,5 7,4 -11,0 17,8 89,0

250 4,9 7,7 -6,6 233,4 93,4

450 5,0 8,0 -0,5 447,7 99,5

Metcatinona-N-TFA

20 7,1 31,9 -5,1 19,9 82,8

250 8,4 20,2 0,1 250,1 99,5

450 9,4 21,9 7,2 482,5 106,8


A quantidade ou a percentagem de analito que é recuperada após aplicação do método

analítico à matriz que o contém, quando comparada com a quantidade que está efectivamente

presente na amostra, define-se como recuperação do método analítico [252,286]. Segundo


73

Peters et al. [247,252], o valor de recuperação não é importante, desde que os dados referentes

aos limiares analíticos, precisão e exactidão sejam aceitáveis.

A avaliação da recuperação absoluta do método não pôde ser efectuada, apenas a sua

eficiência de extracção foi estudada [252]. Assim, a recuperação, em percentagem, pode ser

descrita pela equação D.7 (vide Anexo D). No estudo da eficiência de extracção é importante

ter em conta que o analito adicionado não está, necessariamente, na sua forma nativa

[235,282], sendo também importante referir que a eficiência extractiva varia em função da

concentração do analito [235]. Deste modo, a eficiência extractiva foi avaliada em três gamas

de concentração: nas gamas baixa, média e alta.

Na Tabela 5.8 encontram-se os valores de recuperação médios, a três níveis de concentração,

em percentagem (%), da fase de extracção por SPE para os ATS em estudo. Note-se que,

apesar de as recomendações incidirem sobre valores de recuperação próximos de 100%

podem ser aceites valores abaixo deste valor, desde que apresentem precisão e exactidão

adequadas [282]. Aliás, segundo Ribani et al. [235] os intervalos aceitáveis para valores de

recuperação situam-se entre 70 e 120%, com desvio padrão relativo até 20%, exceptuando

situações em que a complexidade da matriz justifique intervalos de 20 a 120%, com desvio

padrão relativo até 15%. Adicionalmente, o critério interno do STF para a aceitação dos

resultados obtidos na avaliação da recuperação indica que esta se deve encontrar entre 40-

120%.

A eficiência de extracção mostrou-se muito satisfatória, entre 87,1% e 103,4%. E tal como

referido anteriormente, observam-se ligeiras flutuações nos valores obtidos para a recuperação

do método, ao variar a gama de concentrações. Note-se que para a metcatinona este

parâmetro não foi determinado uma vez este composto não verificar os critérios estabelecidos

aquando do estudo da precisão.


74

Tabela 5.8 - Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos compostos em

estudo, calculada para três níveis de concentração.

ATS Recuperação média ± cv (%)

500 ng/mL 100 ng/mL 50 ng/mL

2C-T-2-N-TFA 91,2 ± 7,5 97,3 ± 9,0 100,3 ± 7,6

2C-T-7-N-TFA 87,1± 8,3 95,8 ± 9,9 88,6 ± 3,8

PMA-N-TFA 103,4 ± 8,2 102,9 ± 6,2 101,6 ± 6,2

PMMA-N-TFA 100,1 ± 1,2 99,6 ± 1,1 99,5 ± 2,1

Efedrina-N,O-TFA 95,2 ± 9,9 98,9 ± 3,5 104,8 ± 9,4

Norefedrina-N-TFA 91,9 ± 8,6 92,5 ± 5,5 93,4 ± 9,4

Metcatinona-N-TFA --- --- ---

5.3.7. PRESENÇA DE ARRASTAMENTO (CARRY OVER)

A análise em série de diversas amostras pode arrastar um analito que esteja presente em

concentração elevada numa amostra para outras amostras analisadas posteriormente

(fenómeno de arrastamento ou carry over). O carry over pode, portanto, ser definido como um

aumento de concentração numa amostra, proveniente de vestígios de amostras anteriores,

possivelmente existentes no injector, liner, coluna e/ou detector [287]. Assim, este fenómeno

pode originar sérios problemas, caso não seja detectado, influenciando a exactidão e precisão

do método analítico, especialmente nas gamas de concentração mais baixas e até originar um

falso resultado positivo. Consequentemente, este parâmetro deve ser investigado e

minimizado durante a validação do método analítico, bem como reavaliado periodicamente.

O arrastamento foi avaliado conforme a metodologia mencionada no ponto 4.10.8.

Observando os resultados obtidos (vide Anexo K) constata-se que para o PMA e efedrina não

se observam fenómenos de arrastamento. Nos compostos 2C-T-2, 2C-T-7 e PMMA o

fenómeno de arrastamento embora observável é pouco evidenciado. Já a norefedrina é o

composto que mais sofre fenómenos de arrastamento, mesmo quando a amostra analisada

anteriormente apresenta concentrações baixas deste composto (300 ng/mL), e após três

injecções de amostra branca a sua presença é ainda detectada (2,69% de área cromatográfica

em relação à área cromatográfica da amostra fortificada).

Considerando os resultados obtidos e não perdendo de vista que o método analítico

desenvolvido irá ser utilizado em rotina no STF deverá ter-se presente que os ATS em estudo

são susceptíveis de sofrerem fenómenos de arrastamento. Assim, numa sequência analítica

onde várias amostras distintas são analisadas, e por vezes com concentrações de ATS muito


75

elevadas, devem introduzir-se injecções de lavagem, entre amostras, na sequência, a fim de

evitar possíveis fenómenos de arrastamento entre amostras.

5.3.8. ROBUSTEZ

Na avaliação da robustez de um método analítico pretende-se demonstrar que os resultados

analíticos se mantêm inalteráveis mesmo quando ocorrem pequenas modificações

experimentais [235,241,282].

Segundo Peters e Maurer [252], uma validação completa não deve necessariamente incluir a

avaliação de robustez, embora possa ser muito útil durante a fase de desenvolvimento do

método, permitindo detectar problemas que podem ocorrer durante a validação. No entanto, a

avaliação deste parâmetro deve ser efectuada durante a validação, em particular, se se

pretender que o método seja utilizado noutro equipamento (ex. CG-MS) ou laboratório, ou

executado por outro operador [235-236,252]. Outros autores [226] incluem a avaliação da

robustez no estudo da precisão do método, pelo que também foi esta última a metodologia

adoptada para avaliar este parâmetro.

Assim, mesmo com a mudança de analistas, soluções e lotes de colunas cromatográficas

aquando do estudo da precisão intermédia, o método desenvolvido para a identificação dos

ATS por SPE/GC-MS mostrou-se robusto e a sua capacidade para confirmar qualitativamente

todos os analitos em estudo não foi afectada ao longo deste estudo. O método mostrou-se

robusto para a quantificação de todos os ATS em estudo, excepto a metcatinona, cujos

critérios de aceitação definidos para o estudo da linearidade e precisão não foram cumpridos.

Note-se que Sørensen [196] também referiu que as catinonas (ex. metcatinona) são instáveis

em sangue total, embora a estabilidade possa ser incrementada através da acidificação da

matriz. Apesar de ter sido levada a cabo a acidificação da matriz aquando do pré-tratamento

das amostras, a instabilidade deste composto manteve-se.

5.4. METODOLOGIA ALTERNATIVA PARA ANÁLISE DE ATS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:

ESTUDOS PRELIMINARES

Tal como foi referido anteriormente, a etapa de preparação de amostra é vital no processo

analítico. A escolha do modo de preparação de amostras depende principalmente da natureza

dos analitos (ex. volatilidade ou polaridade), da natureza da matriz e dos níveis de

concentração que se pretendem detectar [21]. Assim, a SPE tem sido o método de eleição para

preparação de amostras biológicas. Contudo, esta técnica pode apresentar desvantagens,


76

nomeadamente, o elevado consumo de solventes orgânicos, entre outras. Já as técnicas de

micro-extracção têm sido vastamente aplicadas na última década apresentando, no entanto,

diversas limitações. A SPME, por exemplo, permite a extracção de compostos numa vasta

gama de polaridades, contudo a quantidade de material polimérico é reduzida, pelo que a

eficiência de extracção de analitos ao nível vestigial em matrizes complexas pode ser

drasticamente limitada. A SBSE veio colmatar esta limitação, embora apresente limitações na

extracção de compostos polares, como os ATS em estudo [21]. Deste modo, é almejado, do

ponto de vista analítico, o desenvolvimento de novas técnicas de preparação de amostras

adequadas a volumes reduzidos de amostra, em concordância com os princípios da Química

Verde e indicadas para compostos polares.

Considerando que os ATS em estudo são polares, com log KO/W compreendidos entre 0,83 e

3,08 e que Nogueira e colaboradores [156-158,160-161] têm vindo a debruçar-se sobre a

temática de extracção de compostos polares, para as quais as técnicas convencionais não dão

uma resposta eficaz sem recurso a derivatização, optou-se por aplicar as mais recentes técnicas

proposta por este autor, nomeadamente, BAµE, na extracção dos ATS.

5.4.1. ESCOLHA DO MATERIAL ADSORVENTE

Dos vários materiais adsorventes testados (PU, PDMS, AC, enchimento das colunas MCX e

StrataTM-X) pretendia-se seleccionar o que respondesse de forma mais eficaz à extracção dos

ATS em estudo. A escassez de padrões dos ATS limitou a quantidade de ensaios disponíveis.

Compararam-se então as áreas cromatográficas obtidas nos extractos derivatizados obtidos

por BAµE-LD/GC-MS para cada um dos nove materiais. Desta forma, a escolha do material

adsorvente recaiu no que originou maior área dos picos cromatográficos dos ATS. Os

resultados obtidos apresentam-se na figura 5.5.

Figura 5.5 - Áreas cromatográficas obtidas por injecção em GC

SBSE(PDMS e PU) e BAµE(AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, MCX, Strata

Tal como previsto, por meio da técnica SBSE não se alcançam v

cromatográficas dos picos relativos aos ATS [21], quando comparados com outros materiais

adsorventes, como os ACs. Esta situação deve

qual estes não têm afinidade para com o material

Como se pode constatar na figura 5.5, os materiais que proporcionaram as maiores áreas

cromatográficas foram carvões activados, nomeadamente, o AC 2, AC 3 e AC 4. Analisando

os resultados obtidos optou

resultados para os compostos 2C

quais ainda existe pouca informação e metodologia analítica disponível. Tal como foi referido

anteriormente, os ACs possuem capacidades a

área externa, estrutura microporosa, elevada capacidade de adsorção e elevado grau de

reactividade superficial [175-

este tipo de material.

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2CT2

Áre

a cr

om

ato

grá

fica

PDMS


Áreas cromatográficas obtidas por injecção em GC-MS dos extractos derivatizados obtidos por

SBSE(PDMS e PU) e BAµE(AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, MCX, StrataTM-X).

Tal como previsto, por meio da técnica SBSE não se alcançam valores elevados nas áreas


adsorventes, como os ACs. Esta situação deve-se às suas características polares, motivo pelo

qual estes não têm afinidade para com o material utilizado na SBSE(PDMS).



os resultados obtidos optou-se por seleccionar o AC 3, uma vez apresentar os melhores

resultados para os compostos 2C-T-2 e 2C-T-7, compostos relativamente recentes, sobre os


anteriormente, os ACs possuem capacidades adsorventes únicas e versáteis devido à extensa


-180], o que justifica a elevadas áreas cromatográficas obtidas com

2CT7 Efedrina Norefedrina PMA PMMA

PDMS PU Srata X AC 1 AC 2 AC 3 AC 4


77

MS dos extractos derivatizados obtidos por

alores elevados nas áreas


se às suas características polares, motivo pelo

utilizado na SBSE(PDMS).



ma vez apresentar os melhores

7, compostos relativamente recentes, sobre os


dsorventes únicas e versáteis devido à extensa


180], o que justifica a elevadas áreas cromatográficas obtidas com

PMMA Metcatinona

AC 5 MCX


78

5.4.2. OPTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS DE LC-MS/MS

Actualmente, o LC-MS/MS é considerada uma técnica de referência em toxicologia, devido

essencialmente à elevada selectividade da espectrometria de massa em tandem (MS/MS),

diminuindo deste modo possíveis interferências, pelo que permite identificações com elevado

grau de confiança [289].

Os resultados obtidos por BAµE-LD/GC-MS revelaram-se satisfatórios, pelo que a hipótese

de analisar os mesmos ATS por LC-MS/MS pareceu ideal, tendo em conta as vantagens acima

mencionadas mas também considerando que se estaria a eliminar um passo analítico,

nomeadamente a derivatização dos analitos, o que se apresenta como uma grande vantagem.

O desenvolvimento de um método cromatográfico, como a LC-MS/MS, requer a optimização

de vários parâmetros, sendo por isso um processo demorado e dispendioso [289]. Numa

primeira abordagem, com o intuito de reduzir os recursos necessários ao desenvolvimento de

uma nova metodologia, considerou-se como ponto de partida a informação experimental

proveniente da metodologia descrita por Wohlfarth et al. [11] e Simões et al. [19]. As condições

cromatográficas então estabelecidas permitiram a separação dos ATS, em tempo analítico

adequado (< 8 minutos), na matriz urina (vide Anexo L).

5.4.3. ESTUDO DO EFEITO DE EVAPORAÇÃO NOS ATS

O estudo do processo de evaporação dos extractos foi necessário, pois já era conhecida a

problemática da perda dos analitos por volatilização. Constata-se que, de facto, este estudo era

essencial, pois como evidencia a figura 5.6, a evaporação lenta, à temperatura ambiente e sem

recurso à corrente de azoto leva a perdas de analito, tal como não adicionar qualquer tipo de

solução ou reagente que evite estas perdas quando a evaporação é efectuada em sob corrente

de azoto, à temperatura ambiente. Portanto, a melhor alternativa seria adicionar uma solução

de HCl 1% em metanol, de forma a minimizar a perdas de analitos por volatilização, devido à

formação de cloridratos, tal como descrito por outros autores [11,233,270].

Figura 5.6 - Áreas cromatográficas obtidas por BAµE(CA3)LD/LC

extractos.

Note-se que a inexistência de dados referentes aos compostos 2C

deste parâmetro deve-se a uma degradação dos mesmos. A soluçã

não se encontraria com a qualidade desejada, pelo foi preparada uma nova solução padrão

com os ATS para a continuidade do estudo.

5.4.4. RECUPERAÇÃO DA FASE D

Apesar da eficiência do método varia

se de um estudo preliminar, o estudo efectuou

resultados obtidos encontram

Figura 5.7 - Recuperação média, em percentagem (%),

estudo, calculada para um nível de concentração.

Como se pode observar, a eficiência de extracção encontra

de variação entre 3,5 e 11,4% (

com os obtidos no estudo da eficiência de extracção por SPE/GC

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

Norefedrina

Evaporação lentaAdição de HCl/MeOH

0102030405060708090

100

Rec

up

eraç

ão (

%)


Áreas cromatográficas obtidas por BAµE(CA3)LD/LC-MS/MS no estudo da evaporação dos

se que a inexistência de dados referentes aos compostos 2C-T-2 e 2C

se a uma degradação dos mesmos. A solução utilizada nestes estudos já


com os ATS para a continuidade do estudo.

ECUPERAÇÃO DA FASE DE EXTRACÇÃO (EFICIÊNCIA DE EXTRAC

Apesar da eficiência do método variar em função da concentração da substância, dado tratar

se de um estudo preliminar, o estudo efectuou-se apenas na concentração de 100 ng/mL. Os

resultados obtidos encontram-se na figura 5.7.

Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos compostos em

estudo, calculada para um nível de concentração.

Como se pode observar, a eficiência de extracção encontra-se entre 18 e 48%, com coeficiente

de variação entre 3,5 e 11,4% (vide Anexo M). Os CV% obtidos nesta fase estão de acordo

com os obtidos no estudo da eficiência de extracção por SPE/GC

Norefedrina Efedrina PMA PMMA Metcatinona

Evaporação lenta Sem adição de soluçãoAdição de HCl/MeOH Adição de HCl/i-PrOH


79

MS/MS no estudo da evaporação dos

2 e 2C-T-7 no estudo

o utilizada nestes estudos já


EFICIÊNCIA DE EXTRACÇÃO)

r em função da concentração da substância, dado tratar-

se apenas na concentração de 100 ng/mL. Os

da fase de extracção, para cada um dos compostos em

se entre 18 e 48%, com coeficiente

nesta fase estão de acordo

com os obtidos no estudo da eficiência de extracção por SPE/GC-MS, embora as

Metcatinona


80

recuperações sejam francamente inferiores. Segundo os critérios internos em vigor no STF, a

recuperação de um método analítico deve encontrar-se entre 40 e 120% e apenas a efedrina,

norefedrina e metcatinona apresentam recuperações inferiores a 40%, embora estes valores só

fossem aceites caso fosse demonstrada a exactidão e precisão do método [247,252], no

processo de validação do mesmo.

Tendo em conta que estes valores de recuperação foram obtidos em condições padrão, isto é,

sem optimização dos parâmetros experimentais associados à extracção (velocidade e tempo de

agitação, temperatura, pH, força iónica e modificador orgânico) e retroextracção (solventes

orgânicos, tempo e temperatura de retroextracção) [161-162], os valores são bastante

satisfatórios, pois tratou-se apenas numa primeira abordagem à metodologia. É expectável que

estes valores aumentem após optimização dos referidos parâmetros.

Note-se ainda que uma etapa crítica na análise dos ATS é a evaporação e reconstituição do

extracto obtido após extracção, onde, provavelmente houve perdas de analito. Será também

esclarecedor referir que as condições de retroextracção são agressivas para o dispositivo de

BAµE, o que induzia à libertação de partículas de carvão e cola para o extracto, o que poderia

interferir com a análise dos analitos.

5.4.5. LIMITE DE DETECÇÃO

O estudo dos limites de detecção foi efectuado, embora pouco exaustivamente, visto tratar-se

de um estudo preliminar. Neste sentido, por BAµE(AC3)/LC-MS/MS atingiram-se LOD de 2

ng/mL. Observando a intensidade do sinal cromatográfico constata-se que seria possível

alcançar limites mais baixos, pois verifica-se que a razão S/N do ião menos abundante é

bastante superior a 3, para todos os ATS, excepto o 2C-T-7. No entanto, seria aceitável a

utilização de apenas uma transição MRM para a confirmação e quantificação deste composto,

caso fosse demonstrado que o método é selectivo e isento de interferências, à semelhança do

procedimento adoptado no STF para confirmação e quantificação de misoprostol. Seria então

relevante levar adiante o estudo desta metodologia, aplicando-a à identificação e quantificação

de ATS em amostras biológicas.

Considerações finais

81

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Foi desenvolvida e validada uma metodologia analítica simples e eficaz para identificação e

quantificação simultânea de 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, PMMA, efedrina, norefedrina e

metcatinona em amostras de sangue total, por SPE-GC-MS. Saliente-se que não se encontram

na literatura métodos validados para identificação e quantificação simultânea dos ATS

estudados em amostras de sangue total.

As condições cromatográficas estabelecidas permitiram boa resolução entre os ATS

derivatizados com MBTFA, em tempo analítico adequado (<16 minutos). A aplicação dos

critérios em vigor no STF, consoante recomendações da WADA, permitiu a identificação

inequívoca dos mesmos. Note-se que foram avaliados três tipos de reacções de derivatização

química: a sililação, a acilação e a formação de carbamatos, por intermédio de sete reagentes de

derivatização distintos. Esta etapa permitiu melhorar o comportamento cromatográfico e

facilitou a identificação dos ATS devido à aquisição de espectros de massa mais característicos.

A ausência de análogos deuterados exigiu a utilização de compostos estruturalmente

semelhantes como PI, nomeadamente a anfetamina-d6 para o 2C-T-2, 2C-T-7, PMA, efedrina

e norefedrina e a metanfetamina-d9 para o PMMA e metcatinona.

Os ATS foram extraídos de amostras de sangue total por SPE de modo misto, utilizando

colunas Oasis® MCX, permitindo recuperar todos os analitos e obter extractos limpos, ao

contrário do observado aquando da utilização de colunas Oasis® HLB.

Relativamente à validação do método de SPE-GC-MS, os resultados obtidos atestam que este

era adequado à identificação de todos os ATS estudados em amostras de sangue total. De

facto, o estudo alargado da selectividade, efectuado em duas fases distintas, com pools

constituídas por amostras de sangue total provenientes de 40 origens diferentes, permitiu um

estudo próximo das condições possivelmente encontradas em rotina. Adicionalmente, a

fortificação de pools com 52 compostos passíveis de ser encontrados em análises em contexto

forense facultaram dados adicionais relativamente à ausência de interferências. Assim, por

aplicação dos critérios em vigor, conclui-se que o método é selectivo, sem interferências e com

0% de falsos resultados positivos ou negativos. A sensibilidade do método foi também

evidenciada (LOD de 1 ng/mL), permitindo a detecção destes compostos em sangue total,

utilizando um volume de amostra reduzido (500 µL). Adicionalmente, não foram observados

fenómenos de arrastamento significativos, sendo o método robusto para a identificação de

todos os ATS estudados.

Considerações finais o

82

Já os resultados referentes à quantificação de ATS revelam que o método desenvolvido era

adequado aos seus propósitos para todos os analitos, excepto para a metcatinona, cujos

critérios estabelecidos no estudo da linearidade e precisão não foram verificados. A linearidade

do método foi evidenciada entre 5 e 500 ng/mL; no entanto, verificou-se uma distribuição

heterocedástica dos resíduos, pelo que se recorreu à utilização de uma regressão linear

ponderada. Sendo assim, os estudos apontaram para um factor de ponderação de 1/ para

todos os ATS. A determinação dos limiares analíticos, através de diferentes metodologias e

curvas de calibração, permitiu concluir que estes não são estáticos, sofrem oscilações. Por

aplicação da definição de LOQ obtiveram-se, com precisão e exactidão adequadas, valores de

5 ng/mL para todos os ATS.

Exceptuando para a metcatinona, a precisão, exactidão e robustez do método analítico

revelaram-se apropriadas para a quantificação de todos os ATS, pois, para os níveis de

concentração estudados, os valores de CV% obtidos no estudo da precisão intermédia (≤

14%) são adequados, tal como os da repetibilidade (≤ 8%). Já os valores de EMR obtidos

estão dentro dos limites considerados adequados, com excepção da efedrina, a 450 ng/mL

(17%).

O estudo da eficiência de extracção, em diferentes níveis de concentração, revelou

recuperações médias entre 87% e 103%, valores bastante aceitáveis e dentro dos limites

impostos. Foi também avaliada, quantitativamente, a presença de arrastamento, observando-se

que os compostos PMA e efedrina não sofrem fenómenos de arrastamento; no entanto, este

fenómeno é observado nos outros ATS em estudo, especialmente no caso da norefedrina

(2,69%) para concentrações iguais ou superiores a 300 ng/mL. Assim, conclui-se que numa

sequência analítica onde várias amostras distintas são analisadas devem introduzir-se injecções

de lavagem, a fim de evitar possíveis contaminações entre amostras.

Foi ainda aplicada uma metodologia alternativa para a análise de ATS em amostras de urina.

Considerando que os compostos em estudo são polares, aplicou-se uma das mais recentes

técnicas proposta por Nogueira et al., nomeadamente, BAµE. Assim, por BAµE-GC-MS

constatou-se que, dos vários materiais adsorventes estudados (AC, PU, PDMS, material

polimérico provenientes de colunas MCX e StrataTM-X), os que de um modo geral alcançaram

maiores áreas dos picos cromatográficos dos ATS, foram os ACs, em especial o CA3.

Ao analisar os ATS por LC-MS/MS eliminou-se o passo analítico de derivatização. No

entanto, observaram-se perdas de analito por volatilização durante a etapa de evaporação dos

Considerações finais

83

extractos orgânicos, pelo que seria necessário adicionar um agente que impedisse esse

fenómeno. Concluiu-se então que a melhor alternativa seria adicionar uma solução de HCl 1%

em metanol, de forma a evitar as perdas de analitos.

O estudo da eficiência de extracção evidenciou resultados satisfatórios, com recuperações

entre 18% (norefedrina) e 48% (PMMA) e CV% entre 3,5 e 11,4%. Note-se que esta é a

primeira vez que se descreve a utilização de BAµE para a extracção destes compostos.

Adicionalmente, trata-se de dados obtidos em condições padrão.

Relativamente aos LOD, constatou-se que eram iguais a 2 ng/mL para todos os ATS em

estudo. No entanto, e atendendo ao sinal cromatográfico observado (razão S/N >> 3),

conclui-se que seria possível alcançar limites mais baixos, pelo que seria relevante levar adiante

o estudo desta metodologia aplicada aos ATS em causa.

Assim, e atendendo à inexistência de métodos de triagem para este tipo de compostos, a

metodologia proposta parece ser viável para este fim, após respectiva validação.

Pelo exposto pode afirmar-se que os objectivos previamente delineados foram alcançados.

Perspectivas futuras

85

7. PERSPECTIVAS FUTURAS

Perspectivando trabalhos futuros, propõe-se a realização de estudos de avaliação da

estabilidade dos ATS, com especial foco na metcatinona.

Com a disponibilidade de uma nova técnica extractiva, BAµE, propor-se-ia alargar os estudos,

optimizando os parâmetros experimentais à extracção e dessorção, e posterior validação da

metodologia. Saliente-se que o micro-dispositivo usado em BAµE pode ser revestido com os

mais diversos materiais adsorventes, para além da possibildiade de modificar a propriedades

químicas e físicas dos ACs, tornando-os mais versáteis para a BAµE. Adicionalmente, é

possível testar a utilização de diferentes fases extractivas no mesmo micro-dispositivo de

BAµE, o que poderá possibilitar a extracção simultânea de compostos com diferentes

características.

Mais, poderá ser testado outro tipo de suporte físico para o AC, de forma a aumentar a

resistência mecânica, aumentando assim o número de extracções efectuadas por cada micro-

dispositivo.

Desta forma, perspectivam-se novas aplicações baseadas nesta nova metodologia para análises

das mais variadas classes de compostos.

Referências

87

8. Referências

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ANEXOS

III

ANEXO A: LISTA DE COMPOSTOS TESTADOS NO ESTUDO DA

SELECTIVIDADE

Tabela A.1 - Compostos testados como interferentes no estudo da selectividade.

clobazam estazolam lorazepam morfina

diazepam bromazepam clordiazepóxido 11-OH-THC

desmetilflunitrazepam oxazepam (+/-) - metadona cocaína

α-OH-alprazolam triazolam fentanil MDA

desalquilflurazepam flurazepam papaverina BZP

7-aminoclonazepam flunitrazepam mescalina ∆9-THC

7-aminoflunitram lormetazepam benzoilecgonina codeína

2-OH-etilflurazepam prazepam d-metanfetamina MDMA

brotizolam zolpidem THCCOOH mCPP

nordiazepam demoxepam 6-MAM TFMPP

α-OH-trizolam loprazolam EME d,I-HMMA

alprazolam midazolam d-anfetamina d,I-HMA

halazepam temazepam cis-tramadol MDEA

IV

ANEXO B: AVALIAÇÃO DA LINEARIDADE (TESTE DE MANDEL)

A avaliação da linearidade, por intermédio do teste de Mandel, permite avaliar qual dos modelos,

linear ou não linear (quadrático), origina o melhor ajuste dos pontos de calibração. Assim, é

necessário determinar a variância da correlação linear e a variância da correlação quadrática. A

diferença entre estas é expressa pela Equação B.1:

Equação B.1: DS N 2 S/ N 3 S

Onde:

N representa o número de amostras de calibração;

S/ a variância da correlação linear;

S a variância da correlação não linear (quadrática).

Calcula-se então o valor de teste (Fcal), de acordo com a equação B.2:

Equação B.2: F!"# DS

S

Submete-se agora o valor obtido a comparação com o valor tabelado da distribuição F de Snedecor

(N-1;N-1;α). Como critério de decisão tem-se:

se Fcal ≤ Fcrit as diferenças entre as variâncias não são estatisticamente significativas e

consequentemente a função de calibração é linear.

se Fcal > Fcrit as diferenças entre as variâncias são estatisticamente significativas e

consequentemente a função de calibração não é linear.

V

ANEXO C: TESTE DE HOMOGENEIDADE DE VARIÂNCIAS

Iniciou-se o teste da homogeneidade de variâncias com o cálculo das variâncias associadas ao

primeiro (S) e último (S$ ) calibradores, de acordo com a equação C.1:

Equação C.1: S% ∑ '%( )*+(,-% 1

Onde:

S% representa a variância;

i a amostra de calibração (i =1,2,3, …10);

j o número de réplicas efectuadas para cada amostra de calibração (para i=1 e i=10);

n o número de resultados obtidos;

yi o resultado obtido;

) a média dos resultados obtidos.

Posteriormente, através das equações C.2 e C.3, é possível calcular o valor teste (Fcal):

Equação C.2: F!"# S$

S , se S$ 1 S

Equação C.3: F!"# S

S$ , se S 1 S$

Submete-se agora o valor obtido a comparação com o valor tabelado da distribuição F de Snedecor

(N-1;N-1). Como critério de decisão tem-se:

se Fcal ≤ Fcrit as diferenças de variâncias não são estatisticamente significativas e

consequentemente a gama de trabalho está bem ajustada.

se Fcal > Fcrit as diferenças de variâncias são estatisticamente significativas e

consequentemente a gama de trabalho não está bem ajustada.

VI

ANEXO D: OUTRAS EQUAÇÕES USADAS

Equação D.1: LOD '3,3 S/*b

Onde:

LOD representa o limite de detecção;

Sy/x o desvio-padrão residual;

b o declive da curva de calibração.

Equação D.2: LOQ 10 S/b

Onde:

LOQ representa o limite de detecção;

Equação D.3 7% 89:;<=>?%@%8+

Onde:

Ri representa a recuperação para cada nível de concentração e para cada dia;

Cobserv o valor observado;

Cadicion o valor esperado.

VII

Equação D.4 7A ∑ 7%B%,C

Onde:

7A representa a recuperação média;

p o número de grupos (dias);

Ri a recuperação média de n replicados obtidos em condições de repetibilidade.

Equação D.5: ER % CHIJ C"KLIJC"KLIJ

100

Onde:

ER(%) representa o erro relativo percentual;

Cest a concentração estimada na amostra;

Camost a concentração real na amostra;

Equação D.6: EMR média das concentrações estimadas valor teórico valor teórico 100

Onde EMR representa o o erro médio relativo da concentração estimada.

VIII

Equação D.7 7YZ[CY\]çã^

_@; _B%;`

_@ _B%`

Onde:

Ace representa a área cromatográfica absoluta do composto obtida na amostra fortificada antes da

extracção;

Apie é a área cromatográfica absoluta do PI obtida na amostra fortificada antes da extracção;

Ac é a área cromatográfica absoluta do composto obtida na amostra fortificada após a extracção e

no mesmo nível de concentração;

Api é a área cromatográfica absoluta do PI obtida na amostra fortificada após a extracção e no

mesmo nível de concentração.

IX

ANEXO E: PRECISÃO E ANÁLISE ANOVA

Tabela E.1 – Análise de variância. Tabela ANOVA para o modelo experimental utilizado no estudo da repetibilidade e precisão intermédia.

Fonte de variação Somas dos Quadrados

(SS)

Graus de

Liberdade

Quadrados médios

(MS)

Inter grupos (run) aa<b+ -c'd) de*B

%, p-1 fa<b+ -∑ 'd) de*B

%,C 1

Intra grupos

(residual) aa< cc'd%( dA%*+

(,

B

%, p(p-1) fa<

∑ ∑ 'd%( dA%*+(,B%,

CC 1

Total SST pn-1 fag aag- 1

Onde: p representa o número de sequências analíticas (run) na qual a amostra é analisada; n o número de replicados efectuados em cada sequência analítica; Xij um resultado individual, de uma amostra, analisado no j-ésimo replicado e na i-ésima sequência; X i a média de j replicados obtidos na sequência i; de exprime a grande média, calculada como a média das médias dos resultados obtidos em p sequências diferentes. Tabela E.2 – Cálculo das estimativas das variâncias para o modelo experimental utilizado no estudo da repetibilidade e precisão intermédia.

Variância Expressão Graus de liberdade

Variância da repetibilidade a a fa< p(n-1)

Variância Between-run a<b+ a<b+ fa<b+ fa<-

Variância da precisão intermédia ah ah a< i a<b+

Variância da média a a fa<b+

- p-1

Onde: SR

2 ) representa a variância da repetibilidade; (SI

2) a precisão intermédia;

X

Equação E.1 adA 100

Onde:

representa o coeficiente de variação de repetibilidade, expresso em percentagem;

a o desvio-padrão de repetibilidade;

dA o valor médio.

Equação E.2: jh ahdA 100

Onde:

jh representa o coeficiente de variação da precisão intermédia, expresso em percentagem;

ah é o desvio-padrão da precisão intermédia;

dA é a média dos resultados obtidos.

XI

ANEXO F: CROMATOGRAMAS E ESPECTROS DE MASSA

Figura F.1 – Cromatograma obtido por GC-MS de uma solução padrão de PMA (10 µg/mL) não

derivatizado (a) e respectivo espectro de massa, obtido em modo full scan (b).

Figura F.2 – Cromatograma obtido por GC-MS de uma solução padrão de PMA (10 µg/mL) derivatizado

com MBTFA (a) e respectivo espectro de massa, obtido em modo full scan (b).

(a)

(b)

(a)

(b)

XII

ANEXO G: PADRÃO INTERNO

Tabela G.1- Estudo da repetibilidade da área relativa (CV%) dos ATS mediante diferentes padrões internos.

Compostos PI CV% da área relativa

2C-T-2

Anfetamina d6 8,124

Metanfetamina d9 15,970

MDMA d5 15,719 MDE d5 10,853 MBDB d5 16,525

2C-T-7

Anfetamina d6 12,136


MDMA d5 17,721 MDE d5 12,350 MBDB d5 18,066

PMA

Anfetamina d6 3,766 Metanfetamina d9 17,797

MDMA d5 18,907

MDE d5 14,799 MBDB d5 20,037

PMMA Anfetamina d6 21,968


MDMA d5 8,687

MDE d5 7,914

MBDB d5 4,324

Metcatinona


MDMA d5 10,276 MDE d5 8,664

MBDB d5 10,726

Efedrina

Anfetamina d6 7,238


MDMA d5 16,271

MDE d5 12,501

MBDB d5 17,25475

Norefedrina


MDMA d5 20,213 MDE d5 16,109 MBDB d5 21,29166

XIII

ANEXO H: EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA - OASIS® HLB

Tabela H.1 - Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção, para cada um dos compostos

em estudo, calculada para um nível de concentração.


100 ng/mL

2C-T-2-N-TFA 19,9 ± 19,6

2C-T-7-N-TFA 105,4 ± 10,7

PMA-N-TFA 9,9 ± 18,0

PMMA-N-TFA 20,2 ± 19,4

Efedrina-N,O-TFA 14,9 ± 43,7

Norefedrina-N-TFA 5,7 ± 8,5

Metcatinona-N-TFA ---

XIV

ANEXO I: MACRO

Figura I.1 – Cromatogramas obtidos no estudo da linearidade do método SPE/GC-MS numa MACRO

desenvolvida: sangue branco fortificado com PI (100 ng/mL) e ATS (100 ng/mL).

XV

Figura I.1 (continuação) – Cromatogramas obtidos no estudo da linearidade do método SPE/GC-MS

numa MACRO desenvolvida: sangue branco fortificado com PI (100 ng/mL) e ATS (100 ng/mL).

XVI

Figura I.1 (continuação) – Cromatogramas obtidos no estudo da linearidade do método SPE/GC-MS

numa MACRO desenvolvida: sangue branco fortificado com PI (100 ng/mL) e ATS (100 ng/mL).

XVII

ANEXO J: TRATAMENTO ESTATÍSTICO NO ESTUDO DA LINEARIDADE


Área analito

Área P.I. Área

Relativa

5 2401 450349 0,005331

10 5631 498985 0,011285

20 10228 494608 0,020679

30 16422 540362 0,030391

40 22794 515867 0,044186

50 27456 463429 0,059245

100 44348 444171 0,099844

200 105235 483259 0,217761

400 248698 544818 0,456479

500 263389 482120 0,546314 Resultado residual

Observação Y previsto Residuais Residuais-

padrão

1 0,00409038 0,00124104 0,190466105 2 0,00964828 0,00163663 0,251177813 3 0,02076408 -8,5078E-05 -0,013057215 4 0,03187988 -0,00148914 -0,228542941 5 0,04299568 0,00119012 0,182651233 6 0,05411149 0,00513383 0,787902957 7 0,1096905 -0,00984607 -1,511101739 8 0,22084852 -0,00308744 -0,473837662 9 0,44316456 0,01331449 2,043408921

10 0,55432258 -0,00800838 -1,22906747

Estatística de regressão

R múltiplo 0,999451998 Quadrado de R 0,998904296 Quadrado de R ajustado 0,998767333 Erro-padrão 0,006911071

Observações 10

ANOVA gl SQ MQ F F de significância

Regressão 1 0,34834642 0,348346 7293,2413 3,94295E-13 Residual 8 0,0003821 4,78E-05

Total 9 0,34872852

Coeficientes Erro-padrão Stat t valor P

95% inferior

95% superior

Interceptar -0,00147 0,002808 -0,5226 0,6154 -0,00794 0,00501 Variável X 1 0,001112 1,3E-05 85,4005 4E-13 0,001082 0,00114

XVIII

Figura J.1 – Exemplificação do tratamento estatístico no estudo de avaliação da linearidade para o 2C-T-2-N-TFA.

ANEXO K: DADOS REFERENTES AO ESTUDO DO ARRASTAMENTO (CARRY

OVER)

Tabela K.1 – Estudo quantitativo do fenómeno de arrastamento. Dados obtidos por

SPE/GC-MS de amostra brancas (branco) após injecção de uma amostra fortificada a 500 ng/mL com os

ATS em estudo.

Composto Injecção Área Anal.

Tr Área P.I.

Área rel. %

2C-T-2

Amostra 316479 10,812 440089 0,719 100 Branco 1 214 10,814 416044 0,000 0,0715 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0

2C-T-7


PMA

Amostra 106529 7,89 440089 0,242 100 Branco 1 nd nd 0 Branco 2 nd nd 0 Branco 3 nd nd 0

PMMA

Amostra 258954 8,616 345994 0,748 100 Branco 1 5075 8,618 296202 0,017 2,289 Branco 2 1372 8,617 292221 0,005 0,627 Branco 3 nd nd 0

Efedrina


Norefedrina

Amostra 468614 6,477 440089 1,064 100 Branco 1 6443 6,484 416044 0,015 1,454 Branco 2 6054 6,477 381096 0,016 1,492 Branco 3 5469 6,489 362943 0,0150 1,415

nd - Não detectado

XIX

Tabela K.2 - Estudo quantitativo do fenómeno de arrastamento. Dados obtidos por


ATS em estudo.


Tr Área P.I.

Área rel. %

2C-T-2


2C-T-7


PMA


PMMA


Efedrina


Norefedrina


nd - Não detectado

XX

Tabela K.3 - Estudo quantitativo do fenómeno de arrastamento. Dados obtidos por


ATS em estudo.


Tr Área P.I.

Área rel. %

2C-T-2


2C-T-7


PMA


PMMA


Efedrina


Norefedrina


nd - Não detectado

ANEXO L: CROMATOGRAMA DE

Figura L.1 – Cromatograma obtido por BAµE(AC3)com os ATS em estudo (20 ng/mL).

ROMATOGRAMA DE LC-MS/MS

Cromatograma obtido por BAµE(AC3)-LD/LC-MS/MS de uma amostra de urina fortificada com os ATS em estudo (20 ng/mL).

XXI

MS/MS de uma amostra de urina fortificada

XXII

ANEXO M: RECUPERAÇÃO DO MÉTODO BAµE(AC 3)-LD/LC-MS/MS

Tabela M.1 - Recuperação média, em percentagem (%), da fase de extracção por BAµE(AC3), para cada um

dos compostos em estudo, calculada para um nível de concentração (n=3).


100 ng/mL

2C-T-2-N-TFA 37,2 ± 11,4

2C-T-7-N-TFA 45,9 ± 9,5

PMA-N-TFA 47,8 ± 4,8

PMMA-N-TFA 48,7 ± 9,4

Efedrina-N,O-TFA 31,7 ± 5,9

Norefedrina-N-TFA 18,7 ± 3,5

Metcatinona-N-TFA 25,9 ± 6,6

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