EVALUACIÓN DE LA CINETICA DE REMOCION DE Pentolita (2,4,6-trinitrotolueno y
pentaeritritol tetranitrato) EN MICROCOSMOS DE SUELOS PROVENIENTES DE UNA
PLANTA DE PRODUCCION DE EXPLOSIVOS
Kelly Hidalgo Martínez
Cindy Pardo Bojacá
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de
Microbióloga (s) Industrial(es)
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá D.C
17 de noviembre de 2009
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EVALUACIÓN DE LA CINETICA DE REMOCION DE Pentolita (2,4,6-trinitrotolueno y
pentaeritritol tetranitrato) EN MICROCOSMOS DE SUELOS PROVENIENTES DE UNA
PLANTA DE PRODUCCION DE EXPLOSIVOS
Kelly Hidalgo Martínez
Cindy Pardo Bojacá
APROBADO
Ingrid Schuller Ph. D Janeth Arias MsC
Decana Académica Directora Carrera
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NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
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TABLA DE CONTENIDO
Resumen .................................................................................................................................... 6 INTRODUCCION ........................................................................................................................ 6 1. Formulación del problema y justificación ................................................................................ 8 2. Marco teórico .......................................................................................................................... 9 2.1 Explosivos ........................................................................................................................... 9 2.2 TNT ....................................................................................................................................... 9 2.2.1 Características .................................................................................................................. 9 2.3 PETN………………………………………………………………………………………………… 10 2.3.1 Características ................................................................................................................. 10 2.4 Efectos de la contaminación por explosivos en combinación ............................................... 11 2.5 Destino e impacto ambiental de explosivos en ambientes acuaticos y terrestres ................ 11 2.5.1 Solubilidad y disolución ..................................................................................................... 12 2.5.2 Volatilización ..................................................................................................................... 12 2.5.3 Adsorción ......................................................................................................................... 12 2.5.4 Fotolisis ........................................................................................................................... 12 2.5.5 Hidrólisis .......................................................................................................................... 12 2.5.6 Reducción ........................................................................................................................ 13 2.5.7 Biotransformación ............................................................................................................ 13 2.5.7.1 Transformación aerobia de TNT por bacterias ............................................................... 13 2.5.7.2 Transformación aerobia de PETN por bacterias ............................................................ 14 2.6 Microcosmos ........................................................................................................................ 15 2.7 Bioestimulación .................................................................................................................... 15 3. Objetivo ................................................................................................................................. 16 3.1 Objetivo general ................................................................................................................... 16 3.2 Objetivos específicos ........................................................................................................... 16 4. Materiales y métodos ............................................................................................................. 16 4.1 Diseño de la investigación ................................................................................................... 16 4.1.1 Población de estudio y muestra ........................................................................................ 16 4.1.1.1 Población de estudio ...................................................................................................... 16 4.1.1.2 Muestras ........................................................................................................................ 16 4.1.2. Variables de estudio ........................................................................................................ 16 4.2 Métodos ............................................................................................................................... 17 4.2.1 Lugar de muestreo ............................................................................................................ 17 4.2.2 Curva de calibración ........................................................................................................ 17 4.2.3 Procesamiento de las muestras ....................................................................................... 17 4.2.3.1 Recuento inicial ............................................................................................................. 17 4.2.3.2 Determinación de la concentración inicial de TNT y PETN ............................................ 17 4.2.3.3 Incubación de los microcosmos .................................................................................... 18 4.2.3.4 Determinación de la cinética de degradación de TNT y PETN ...................................... 18 4.3 Recolección de la información ............................................................................................. 19 4.4 Análisis de la información .................................................................................................... 19 5 Resultados y discusión .......................................................................................................... 19 5.1 Curvas de calibración .......................................................................................................... 19 5.1.1 TNT ................................................................................................................................... 19 5.1.2 PETN ............................................................................................................................... 19 5.2 Recuento inicial ................................................................................................................... 19 5.3 Concentración inicial de explosivos ..................................................................................... 21 5.4 Controles ............................................................................................................................. 22 5.5 Cinéticas de degradación .................................................................................................... 23 5.6 Efecto en la degradación de TNT y el PETN en mezcla ...................................................... 24 6. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................................... 25 7. Bibliografía ............................................................................................................................. 26 ANEXOS
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Resumen
Para el estudio de la cinética de remoción de los explosivos, 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) y el
pentaeritritol tetranitrato (PETN), se usaron dos muestras provenientes de la fabrica de
producción, para su análisis en microcosmos, evaluando la remoción de éstos bajo condiciones
de bioestimulación (adición de fuentes de carbono) y biodegradación intrínseca, por medio de
la determinación de las concentraciones residuales de los explosivos en Cromatografía liquida
de alta eficiencia (HPLC). Posteriormente se compararon las cinéticas obtenidas entre los dos
tratamientos (Biodegradación intrínseca y bioestimulación) de cada una de las muestras. Así
mismo se realizaron comparaciones con los resultados obtenidos en los estudios de Peña y
Ramos y Velásquez (2009), en donde se evaluaron las cinéticas de remoción de TNT y PETN
respectivamente.
En cuanto a los resultados se obtuvo que los controles no tuvieron el comportamiento
esperado, pues la concentración de explosivos disminuyo casi en su totalidad al día 7, es por
esto que los datos presentados de las muestras no son validos para concluir acerca de la
remoción de estos compuestos por biodegradación intrínseca o bajo condiciones de
bioestimulación.
INTRODUCCIÓN
A través del tiempo, se ha visto que las actividades de manufactura, uso, almacenamiento y
eliminación de explosivos, por parte de industrias como la minera, explotación de carbono,
petrolera y militar, ha generado contaminación en suelos y aguas, siendo esto una
problemática importante a nivel ambiental, debido a que explosivos como el 2,4,6-
Trinitrotolueno (TNT) y el Pentaeritritol tetranitrato (PETN) no se incorporan fácilmente en los
ciclos biogeoquímicos dificultando así su degradación.
Durante la detonación de los explosivos se pueden difundir restos de munición y pequeñas o
grandes cantidades de los constituyentes del explosivo como lo son las moléculas explosivas y
metales al ambiente, es por esto que se hace importante conocer los destinos ambientales de
los contaminantes, los cuales se ven afectados por procesos como la disolución, solubilidad,
sorción, volatilización, adsorción, transformación-degradación biótica y abiótica y
bioacumulación.
Es importante dar un paso hacia la búsqueda de alternativas que sean favorables en la
remediación de los ecosistemas contaminados, teniendo en cuenta el estudio y la relevancia de
los procesos anteriormente mencionados; para así llegar a implementar técnicas de
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biorremediación, es así que por medio del estudio de la evaluación de la remoción de TNT y
PETN en suelos provenientes de la planta de producción de los mismos, usando microcosmos
para simular la degradación natural de estos compuestos y aplicando fuente de carbono para
evaluar la posibilidad de estimular el proceso (bioestimulación), se quiso dar un primera
exploración hacia este tipo de estudios.
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1. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Con el fin de disminuir los efectos desfavorables causados por el empleo de los explosivos en
los ambientes impactados, se han llevado a cabo diferentes investigaciones para la búsqueda
de alternativas de degradación biológica, de bajo costo y fácil implementación, y a su vez una
verdadera disminución de los efectos tóxicos del contaminante. Sin embargo hasta la fecha no
se ha descrito la mineralización completa de TNT o PETN por microorganismos, y la
remediación de éstos compuestos es todavía un desafío. Además, el efecto de contaminación
de éstas dos moléculas en conjunto es aún desconocido, y no es claro cuales condiciones, son
más favorables para su remediación. Es por esto que con ésta investigación se quiere dar a
conocer la tasa natural de biodegradación de la pentolita y que efecto tiene la bioestimulación
con fuente de carbono, siendo ésta utilizada, debido a que en condiciones naturales (suelo,
sedimento etc.) el carbono se considera como el nutriente limitante, y por literatura reportada
se sabe que el TNT y PETN no son utilizados como fuente de carbono por parte de los
microorganismos, sobre la degradación de los dos compuestos.
Con esta investigación se pretende generar un primer acercamiento a las cinéticas de remoción
de TNT y PETN, necesario para el entendimiento de las condiciones que se requieren para
lograr una descontaminación de los ecosistemas afectados, y así, dar un paso más hacia la
implementación de estas alternativas en la remoción de estos contaminantes y en el futuro
pueda implementada la biorremediación. Así mismo los resultados de este trabajo (la tasa de
tasa de remoción de pentolita) se comparo con los resultados de dos trabajos de grado
realizado en paralelo (la tasa de degradación de cada explosivo, TNT o PETN, por separado).
Con esta comparación se busca determinar si la existencia de los dos explosivos juntos tiene
efecto sobre su degradación.
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2. MARCO TEORICO
2.1 EXPLOSIVOS
Los explosivos son compuestos o mezcla de compuestos químicos que bajo la influencia de un
choque químico o térmico, se descomponen rápidamente y de forma espontanea con la
liberación de grandes cantidades de gases y calor (Brannon y Pennington, 2002). Están
clasificados en tres grupos basados en su sensibilidad a la detonación:
Explosivos primarios: caracterizados por presentar una alta sensibilidad (Manitol
hexanitrato (MHN) y Diazodinitro fenol (DDNP)).
Explosivos secundarios: presentan sensibilidad media (2,4,6-Trinitrotolueno (TNT),
Pentaeritritol tetranitrato (PETN), Ciclotrimetileno trinitamina (RDX)).
Explosivos terciarios: compuestos cuya sensibilidad es muy baja (Mononitrotolueno
(MNT), Amonio perclorato (AP)) (Doble y Kumar, 2005).
Los explosivos secundarios son los más ampliamente usados por diferentes industrias como la
militar, petrolera, minera y explotación de carbón, durante estas actividades éstos explosivos
pueden entrar al ambiente difundiéndose en el suelo, sedimento y agua, contaminando y
generando impactos potenciales en el ambiente y en la salud humana (Juhasz y Naidu, 2007).
Dentro del grupo de los explosivos secundarios existen tres categorías según la composición
química: nitroaromáticos, nitraminas, y esteres de nitrato. Los explosivos nitroaromáticos son
aquellos que tienen grupos nitro unidos a los átomos de carbono de un anillo aromático como
es el caso del TNT y el Metil-2,4,6-Trinitrofenilnitramina; las nitraminas presentan grupos nitro
unidos al átomo de nitrógeno presente entre el anillo alicíclico tales como RDX y HMX; en el
caso de los esteres de nitrato contienen grupos nitro unidos al átomo de oxigeno , el cual esta
ligado a un carbono alifático, dentro de este grupo se encuentra el PETN (Juhasz y Naidu,
2007).
2.2 TNT
2.2.1 Características
El 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) es un explosivo nitroaromático (Fig.1), química y térmicamente
estable, presenta un bajo punto de fusión, es soluble en agua y con baja volatilidad. Éste
explosivo ha sido ampliamente utilizado en las actividades militares, minería y explotación de
carbono (Juhasz y Naidu, 2007).
El TNT se caracteriza químicamente por que su anillo aromático presenta electrones π, que
son removidos gracias a la electronegatividad de los grupos nitro, haciendo que el núcleo se
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vuelva electrofílico. Los grupos nitro consisten en dos átomos de oxigeno y uno de nitrógeno, y
ambos son altamente electronegativos, pero el oxigeno es aun mas que el nitrógeno
polarizando el enlace. Estos grupos nitro se hacen fácilmente reducibles, debido a la alta
electronegatividad y a la carga parcialmente positiva del átomo de nitrógeno (Preuss y Rieger,
1995).
Fig.1 Estructura del 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT).
Esteve-Núñez et al., 2001
El TNT ha sido reportado por la EPA como un contaminante prioritario, debido a que se han
observado efectos carcinogénicos y citotóxicos, además de ello se reportado que para la salud
genera anormalidades en los eritrocitos, disfunción del hígado y cáncer en mamíferos (Symons
y Bruce, 2005).
2.3 PETN
El PETN es difundido a ambientes terrestres y acuáticos, debido a las actividades de
manufactura, almacenamiento, transporte y difusión, generando contaminación en estos
ecosistemas (Snape et al., 1997). La contaminación de compuestos como el PETN se debe a
que estos no se incorporan fácilmente en los ciclos biogeoquímicos, lo cual los hace a parte de
xenobióticos, recalcitrantes (Esteve-Núñez et al., 2001).
2.3.1 Características
El Pentaeritritol tetranitrato (PETN) es un explosivo secundario perteneciente al grupo de los
esteres de nitrato (Fig. 5), de baja solubilidad en agua y cuya síntesis esta dada por medio de
la nitración directa del pentaeritritol con ácido nítrico y ácido sulfúrico como catalizador de la
reacción.
Estructuralmente el PETN no ha sido encontrado de forma natural en el ambiente, por lo cual
se considera un compuesto xenobiotico (Li, 2007). Además de su uso como explosivo, éste es
también empleado en el tratamiento de enfermedades del corazón, gracias a su capacidad de
vasodilatador de arterias coronarias (Li, 2007).
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Fig. 5 Estructura química del Pentaeritritol tetranitrato (PETN)
Binks et al., 1996
Con el fin de conocer una posible ruta metabólica de degradación que sea llevada a cabo por
microorganismos, es de importancia tener en cuenta que dentro del proceso de biodegradación
de la molécula de PETN, es necesario la caracterización de intermediarios que están
involucrados en la transformación del compuesto, para que así sea mas fácil su identificación.
Se ha visto que según estudios reportados la molécula de PETN es transformada por la
utilización de los nitratos presentes en ella a través de los microorganismos, generando
compuestos como mono, di y trinitrato de pentaeritritol, indicando que la degradación del
compuesto puede ser entendida mediante la evaluación de la concentración de los nitratos
(White et al., 1996, Li, 2007).
2.4 Efecto de la contaminación por explosivos en combinación
En una investigación realizada por Moshe et al. (2009), en la que estudiaron la degradación de
una mezcla de explosivos, compuesta por TNT, RDX y HMX, evidenciaron que el TNT e
intermediarios de su degradación como el tetraazoxytolueno ejercían una inhibición en el
metabolismo de los otros dos explosivos, demostrado por las bajas tasas de degradación que
presentaron cuando estaban en la mezcla, en comparación de las tasas individuales. De igual
manera se demostró que la biomasa y la diversidad disminuían con el aumento de la
concentración de TNT. Los investigadores proponen que la investigación esta dada por un
efecto citotóxico sobre las comunidades microbianas capaces de degradar RDX y HMX. Por
otra parte, se ha encontrado que PETN y TNT pueden ser metabolizados por la misma enzima
(French et al., 1998). Sin embargo, la degradación de una combinación de TNT y PETN, los
cuales se encuentran en el producto comercial Pentolita, aun es desconocido.
2.5 Destino e impacto ambiental de explosivos en ambientes acuáticos y terrestres.
La exposición y el riesgo que generan los contaminantes en suelo, agua y sedimentos son de
importancia para conocer el efecto y destino de los compuestos y los productos de su
transformación en el ambiente. El efecto ambiental y el riesgo potencial de los compuestos
contaminantes como los explosivos, esta afectado por diferentes procesos naturales. A
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continuación se describen los procesos de transporte por los cuales los contaminantes pueden
llegar a incorporarse en el ambiente.
2.5.1 Solubilidad y disolución
La solubilidad, se presenta como un parámetro critico que determina el destino y el transporte
de los contaminantes en el ambiente, viéndose ésta afectada por factores ambientales como el
pH y la temperatura (Huang et al., 2000; Lynch et al., 2001); por otro lado la disolución en agua
de estos compuestos, es un mecanismo por el cual son diseminados al ambiente (Lynch,
2002).
2.5.2 Volatilización
Proceso mediante el cual se presenta la transformación de la fase solida a gaseosa.
2.5.3. Adsorción
Esta definida como el proceso por el cual moléculas son acumuladas o retenidas en la
superficie de un material solido (Alexander, 1999; Juhasz y Naidu, 2007). La adsorción
puede incluir fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrogeno e intercambio iónico (Alexander,
1999). Mientras que los procesos de absorción se refieren a la retención del soluto entre la
masa del solido y no en la superficie. En lo que refiere al termino de sorcion, este puede ser
usado como la combinación de procesos de adsorción y absorción (Alexander, 1999; Juhasz y
Naidu, 2007).
2.5.4. Fotolisis El proceso de fotolisis es considerado como el proceso mayor que afecta la transformación de
los contaminantes en corrientes de desechos y cuerpos de agua (Mc Grath, 1995), el término
de fotolisis se define como la alteración de un compuesto, que puede ser causado por efectos
indirectos o directos de luminosidad (Glover and Hoffsomer 1979). En el caso de compuestos
nitroaromáticos (TNT) el proceso de fotolisis puede ser dado por la oxidación de los grupos
metil, reducción de los grupo nitro (Juhasz y Naidu, 2007).
2.5.5. Hidrólisis Termino que define la reacción en la que un grupo funcional de un compuesto organico
reacciona con el agua con la formación de nuevos enlaces carbono-oxigeno. En compuestos
como los nitroaromáticos que son generalmente resistentes no se presenta ésta reacción, sin
embargo puede ocurrir hidrólisis cuando se da un aumento en el pH (Juhasz y Naidu,
2007).
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2.5.6. Reducción
En la mayoría de los compuestos energéticos que presentan grupos funcionales nitro se
generan reacciones de reducción abiótica, en donde los grupo nitro por una serie de
reacciones son reducidos a grupos amino, con procesos de sensibilidad a pH y el potencial
redox (McGrath 1995). En este tipo de reacciones requiere la activación por catálisis por
compuestos de hierro, macromoléculas orgánicas y minerales arcillosos. Por otro parte, se ha
descrito que mediante procesos microbianos se aceleran las reacciones de reducción. Sin
embargo la reducción abiótica de los contaminantes puede estar dada por condiciones
ambientales, siendo difícilmente distinguir si se presentan transformaciones bióticas o abiótica
(Juhasz y Naidu, 2007).
2.5.7. Biotransformación En los procesos de biotranformación los compuestos contaminantes son modificados, por el
potencial de los microorganismos para degradarlos bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas,
la degradación del compuesto en ocasiones puede alcanzar su mineralización completa y el
destino y el transporte de la transformación microbiana de los productos puede estar sujeta a
un número de reacciones.
La degradación de los compuestos puede darse como resultado de distintos mecanismos en
los que especialmente se encuentra, a) la utilización del compuesto como una única fuente de
energía y carbono, b) cometabolismo, reacción en la que la transformación de un compuesto
orgánico por un microorganismo no es usado como sustrato o fuente de energía y que por lo
tanto requiere de la presencia de sustratos primarios para soportar su crecimiento (Alexander,
1999; Juhasz y Naidu, 2007) y c) utilización de el compuesto como fuente de nitrógeno
(Boopathy et al.,1998)
A continuación se describe la degradación microbiana de TNT y PETN bajo condiciones
aeróbicas.
2.5.7.1 Transformación aerobia de TNT por bacterias
El metabolismo aerobio bacteriano de compuestos nitroaromáticos ésta clasificado en tres
categorías: a) oxigenación del anillo, seguido por la liberación de nitrito, b) ataque nucleofílico
por un ion hidruro para la formación del complejo hidruro-Meisenheimer del cual hay una
liberación de nitritos, y c) reducción de nitritos a la forma hidroxilamina o amina, que en
ocasiones es metabolizada. Sin embargo en la primera categoría solo han sido descritos
procesos de transformación de mono y dinitrotoluenos, razón por la cual el TNT no puede ser
degradado por ésta vía, debido a su alto grado de sustitución que hace que el anillo aromático
sea deficiente en electrones, impidiendo que éste actué como sustrato para el mecanismo de la
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oxigenación electrofílica (Lewis et al., 1997). En algunas investigaciones se ha reportado que
bacterias aerobias tienen la capacidad de transformar la molécula de TNT por reducción de uno
o dos grupos nitro a grupos amino o hidroxilamino (Anexo 1 Fig. 2 b), los cuales normalmente
se acumulan en el medio de cultivo sin que se presente su metabolización; a su vez se ha
encontrado la producción de hidroxilamino-dinitrotoluenos generando mutaciones (Symons y
Bruce, 2005). De igual manera se ha demostrado en estudios que el TNT parcialmente
reducido puede reaccionar con él mismo formando compuestos recalcitrantes llamados
azoxitetranitrotoluenos (Anexo 1 Fig. 2 a), los cuales causan mas efectos mutagénicos que el
mismo compuesto (Haidour y Ramos, 1996; George et al., 2001).
Una segunda vía de transformación del TNT esta asociada a la formación del complejo hidruro
y dihidruro-Meisenheimer catalizado por un grupo de enzimas dentro de las que se encuentra
la PETN reductasa, los iones hidruro son donados por NAD(P)H (Anexo 2 Fig. 3) (French et al.,
1998; Haidour y Ramos, 1996). Gracias a que el anillo aromático es deficiente en electrones los
grupo nitro del TNT son suficientes para lograr el ataque reductivo, formando el complejo, quien
es el que pierde la característica de aromaticidad, y es químicamente inestable generando la
liberación de un grupo nitro, y la formación de dinitrotolueno. Esta molécula es menos toxica, y
puede ser metabolizada por mono y dioxigenasas y por tanto es menos recalcitrante que el
TNT y sus intermediarios parcialmente reducidos. (Symons y Bruce, 2005).
2.5.7.2 Transformación aerobia de PETN por bacterias
En lo que se refiere a la degradación de PETN, se conocen pocos estudios acerca de éste,
entre los que se encuentran las investigaciones realizadas por Li en 2007 y 2008, en el que
analizaron la biodegración del explosivo con la adición de diferentes aceptores de electrones
(nitrato y sulfato), determinando las vías de degradación. Otro estudio fue el realizado por
Jenkins y colaboradores en 2007, en el cual evalúan la vida media de PETN en el suelo usando
microcosmos.
Los átomos de carbono en compuestos de esteres de nitrato como el PETN, son derivados de
alcoholes polihídricos, y sus átomos de nitrógeno, logran ser asimilados por los
microorganismos, permitiendo el desarrollo de la biomasa, generando así que la
biodegradación del compuesto, sea una solución mas segura para su remediación (Anexo 3 Fig
6) (Ye et al,. 2004).
Por otra parte en la investigación realizada por Binks et al. (1997) se demostró que la enzima
producida por Enterobacter cloacae PB2, PETN reductasa es capaz de degradar PENT en
condiciones aeróbicas y limitantes de nitrógeno, con la aparición de subproductos como
pentaeritritol dinitrato, 3-hidroxi-2,2-bis[(nitrooxi)metil]propanal, 2,2-bis[(nitrooxi)
metill]propanodial
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En el estudio realizado por Christodoulatos et al. (1997) reportaron que el glicerol trinitrato
(compuesto análogo al PETN), se degrada por medio de la remoción sucesiva de los nitritos,
formando glicerol dinitrato y mononitrato como intermediarios. En otra investigación el GTN fue
reducido a 1,2 y 1,3-dinitroglicerina y después a 1- y 2-mononitroglicerina, para finalmente ser
transformado a glicerol (Oh et al., 2004).
2.6 Microcosmos
Un microcosmos es un sistema de laboratorio que simula una parte del ambiente, sin embargo
no pueden representar en su totalidad el ecosistema, solo porciones del ambiente. Son muy
usados para determinar efectos en estructura y funciones de ecosistemas específicos,
causados por diferentes factores, como es el caso de los contaminantes (Morris, 1992).
Comúnmente los ensayos en biodegradación suelen ser llevados bajo condiciones controladas
empleando microcosmos, en los cuales se pueden utilizar además de suspensiones de suelos
y sedimentos en un medio definido, suspensiones de cultivos puros, consorcios
metabólicamente estables o cultivos enriquecidos, teniendo éstos una gran ventaja por su
reproducibilidad (Neilson, 1996).
El uso de microcosmos para investigaciones con explosivos fue llevado a cabo para la
determinación de la vida media de éstos en el suelo. En dicho estudio determinaron que la vida
media del PETN en el suelo varia entre 0,45 a 2,4 días (Jenkins et al., 2007)
2.7 Bioestimulación
Una de las estrategias de biorremediación, término que define al proceso mediante el cual el
uso de microorganismos presentes en un sitio producen la transformación o degradación de un
contamínate (Kavamura y Esposito, 2009) es la bioestimulación, que consiste en la
estimulación de los microorganismos de un ambiente natural por medio de la adición de
nutrientes, incrementando su actividad metabólica, para así mejorar la eliminación de los
contaminantes (Kavamura y Esposito, 20009; Mulligan y Raimond, 2003)
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3. Objetivos
3.1 Objetivo general
Evaluar y comparar la cinética de remoción de 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) y el Pentaeritritol
tetranitrato (PETN) en microcosmos de suelos en condiciones de bioestimulación y de
biodegradación intrínseca.
3.2 Objetivos específicos
Comparar la cinética de remoción de TNT y de PETN de la muestra de fitorremediación y
campo de prueba.
Determinar la concentración inicial de TNT y PETN en las muestras.
Comparar el efecto en la biodegradación intrínseca y en la bioestimulacion en la cinética de
remoción de TNT y PETN.,
Comparar el efecto de la presencia de los dos compuestos en combinación o no, en la
cinética de remoción de ambos explosivos.
4. Materiales y métodos
4.1 Diseño de la investigación
El diseño experimental constó de dos muestras tomadas en una planta de producción de
explosivos, para cada una de las cuales se tuvieron 18 unidades experimentales, compuestas
por dos tratamientos (con carbono y sin carbono) y tres tiempos de muestreo (0, 3 y 7 días),
por triplicado, el muestreo se realizó por sacrificio. (9 mas fuente de carbono y 9 sin fuente de
carbono). A cada unidad experimental se le determino la concentración de explosivos en cada
tiempo de muestreo para evaluar la remoción de TNT y PETN, por biodegradación intrínseca y
bioestimulación.
4.1.1 Población de estudio y muestra
4.1.1.1 Población de estudio
Se definieron seis puntos de muestreo entre los que se encuentran sedimentos y suelos en la
planta de producción de explosivos ubicada en del vecindario de Bogotá D.C. de los cuales
fueron seleccionados dos, para todos los ensayos, siendo cada punto una población, la cual
esta representada por las comunidades microbianas.
4.1.1.2 Muestras
Se utilizo la muestra proveniente del área de Fitorremediación y de campo de prueba de
detonación de los explosivos en la planta de producción, siendo la muestra en estudio las
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comunidades microbianas presentes en la cantidad de suelo tomada. Se utilizo como control,
suelo estéril de la muestra de campo de prueba.
4.1.2 Variables del estudio
En el presente estudio se evaluará como variable dependiente el porcentaje de degradación de
TNT-PETN de cada unidad experimental, cuya medición se realizará por medio de
cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), por otro lado las variables independientes
serán, el tipo de muestra, ya que entre ellas se encuentran, sedimento y suelo, y la adición o
no de fuentes de carbono (bioestimulación) siendo esta la variable mas importante del estudio.
4.2 Métodos
4.2.1 Lugar de muestreo
El muestreo se realizó en la planta de fabricación de explosivos ubicada cerca a la ciudad de
Bogotá en el departamento de Cundinamarca (el lugar exacto es confidencial). Se muestrearon
seis puntos diferentes dentro de la fabrica, mediante el uso de barrenos (500 g) de suelo y con
muestreadores de agua (500 ml), las muestras fueron almacenadas en refrigeración a 4ºC
hasta su procesamiento.
4.2.2 Curva de calibración
Se realizó la curva de calibración de TNT y PETN con concentraciones de 20, 50, 75, 100 y
150 ppm, en acetonitrilo como diluyente. Se analizaron por cromatografía liquida de alta
eficiencia (HPLC) para la obtención de la ecuación para la determinación de concentraciones
de los explosivos. Las condiciones de corrida en el HPLC fueron: columna Premier C18; fase
móvil metanol:agua:acetonitrilo 54:2:44; volumen de inyección 20 µl; flujo 1 ml/min.
4.2.3 Procesamiento de muestras
4.2.3.1 Recuento inicial
Se realizó un recuento de microorganismos viables aerobios por la técnica en placa, tomando
10 g de cada muestra y agregándola a 90 ml de solución salina 0.85%, posteriormente se
realizaron diluciones seriadas desde 10-2 hasta 10-8, luego se realizó la siembra en los medios
de cultivo R2A (anexo 4, Tabla 1) (diluciones 10-5 a 10-8) , agar TNT, PETN y pentolita (anexo
5, Tabla 2) (diluciones 10-2 a 10-5) por triplicado, por ultimo las placas fueron incubadas durante
5 días a temperatura ambiente (20 +/- 2ºC)
4.2.3.2 Determinación de la concentración inicial TNT y PETN
Se llevó a cabo la determinación de la concentración inicial de TNT y PETN en las muestras
por medio del método modificado de la EPA 8330B, el cual consistió en tomar 5 g de la
18
muestra, primeramente secada a temperatura ambiente hasta peso constante, macerada y
tamizada (10 mesh) y se agregaron 10 ml de acetonitrilo, se homogenizó mediante vortex por
un minuto, posteriormente se llevó a un baño de ultrasonido (KASAI-Emasonic 30H) durante 18
horas en refrigeración. Tras la sonicación y un periodo de reposo de 30 minutos, se filtraron 1,5
ml con filtros micropore PVDF, para su análisis por cromatografía liquida de alta eficiencia,
usando una columna premier C18, con una fase móvil metanol:agua:acetonitrilo (56:42:2), flujo
constante 1 ml/min, volumen de inyección 20 µl y tiempo de corrida de 15 min, la presencia de
los explosivos fue detectada por medio de un detector de arreglo de diodos, con un barrido de
longitudes de 210 y 254 nm, correspondientes a PETN y TNT respectivamente.
4.2.3.3 Incubación de los microcosmos
Fitorremediación: Se pesaron 5 g de muestra, a los cuales se les inocularon 200 µl de
solución stock de 2500 ppm TNT y PETN para llegar a una concentración final en el
microcosmos de 100 ppm y 200 µl de solución de fuente de carbono para una
concentración final de 1% p/v, se homogenizo mediante vortex durante un minuto.
Campo de prueba: Se pesaron y tamizaron 5 g de muestra, a los cuales se les inoculo 200
µl de TNT y PETN a partir de una solución stock de 2500 ppm TNT y PETN para llegar a
una concentración final en el microcosmos de 100 ppm y 200 µl de solución fuente de
carbono para una concentración final de 1% p/v.
Controles Estéril: Se esterilizo muestra de campo de prueba mediante autoclave 3 ciclos
de 15 min, 121ºC y 15 lbs de presión. Posteriormente se pesaron y tamizaron 5 g de
muestra, a los cuales se les agrego 200 µl de solución stock de 2500 ppm TNT y PETN
para llegar a una concentración final en el microcosmos de 100 ppm y 200 µl de solución
de fuente de carbono para una concentración final de 1% p/v, adicionalmente se realizaron
controles de esterilización después de haber agregado los explosivos y la fuente de
carbono.
Los microcosmos se incubaron a temperatura ambiente (20ºC+/-2ºC), durante 7 días.
Todo el montaje fue realizado por triplicado y el número de unidades experimentales fue
determinado para realizar los 3 eventos de muestreo por descarte.
4.2.3.4 Determinación de la cinetica de degradación de TNT y PETN
Se realizaron eventos de muestreo al tiempo cero, y en los días 3 y 7 de incubación. Para ello
se tomo las unidades experimentales y se les agrego 10 ml de acetonitrilo, se homogenizaron
con vortex durante un minuto y posteriormente se llevaron a baño de ultrasonido por 18 h en
refrigeración. Trascurrido este tiempo, se dejaron en reposo durante 30 min, y luego fueron
filtrados 1,5 ml de cada unidad usando filtros de PVDF, para su análisis en cromatografía
liquida de alta eficiencia, bajo las mismas condiciones anteriormente nombradas.
19
4.3 Recolección de la información
La obtención de los datos para esta investigación se harán mediante la realización de
cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), y el análisis de los cromatogramas
correspondientes de cada muestra a evaluar, correlacionándolos con una curva patrón de TNT
y PETN realizada para dicho estudio.
4.4 Análisis de la información
La comparación entre las cinéticas de degradación de cada tratamiento y cada muestra fue
analizada por estadística descriptiva utilizando la desviación estándar y el coeficiente de
variación, además del uso de porcentajes de degradación.
5. Resultados y discusión
5.1 Curvas de calibración
5.1.1 TNT
La curva de calibración para la cuantificación de TNT se encuentra en el Anexo 7, fig 7, con la
cual se obtuvo la siguiente ecuación y coeficiente de correlación.
Ec (1) Y = 69780,14x – 26726,6
R2 = 0,99
El TNT tiene un tiempo de retención de 6,32 0,01, correspondiendo al pico señalado en el
cromatograma No.2 del patrón de 100 ppm en el Anexo 9.
5.1.2 PETN
La cuantificación de PETN fue evaluada mediante la curva de calibración (Anexo 7, fig 8), cuya
ecuación se encuentra a continuación:
Ec (2) Y = 31143,79x + 26143,81
R2 = 0,99
El PETN presenta un tiempo de retención de 8,82 0,01, el cual puede ser observado en el
cromatograma No. 1 del patrón de 100 ppm en el Anexo 9.
5.2 Recuento inicial
En el recuento en placa de bacterias aerobias realizado a las seis muestras seleccionadas para
el estudio (Campo de prueba y fitorremediación) se encontró que la concentración de bacterias
en ambas muestras, respecto a los medios utilizados no fueron muy diferentes (fig 9), de igual
20
manera al realizar una descripción macroscópica de las colonias obtenidas se observó
claramente un patrón de morfología en los medios suplementados con explosivos,
caracterizadas por presentar una apariencia de gotas de agua, pequeñas y grandes. Colonias
con estas características fueron también obtenidas en el estudio realizado por Villegas y
Fajardo (2009), en donde a partir de muestras de suelo provenientes de la misma fabrica de
producción de los explosivos realizaron un enriquecimiento por 10 días, encontrando que la
mayoría de estas presentaban las características anteriormente nombradas.
Fig. 9 Recuento de bacterias aerobias inicial de dos suelos contaminados en diferentes
medios.
Los recuentos obtenidos en medios suplementados con PETN de Velázquez (2009), se
observaron colonias que producían pigmentación amarilla y café difusible al medio. El segundo
grupo de colonias predominantes en todos los medios incluido R2A fueron de texturas
cremosas, blancas y grandes.
En la muestra denominada silvestre (No contaminada), se obtuvieron levaduras blancas y
pigmentadas, las cuales no fueron observadas en las muestras provenientes de la fábrica.
Las colonias que crecieron en los medios suplementados con explosivos no fueron contenían
fuente de nitrógeno, lo cual llevó a inferir que los microorganismos encontrados pueden ser a)
posiblemente degradadores pues podrían haber utilizado el TNT y el PETN como fuente de
nitrógeno (Duque et al 1993; Boopathy y Kulpa, 1994; Li, 2007), b) fijadores de nitrógeno
atmosférico c) o crecieron a expensas de las trazas de nitrógeno provenientes del suelo.
Muestra
Campo de prueba Fitorremediación
Log
UF
C/m
l
0
2
4
6
8R2A TNT PETN Pentolita
21
5.3 Concentración inicial de explosivos
Según la tabla 4 se muestra que los porcentajes de recuperación obtenidos para TNT y PETN
con éste método de extracción fue del 105% y 91,5% respectivamente. En las determinaciones
de la concentración inicial de TNT y PETN en los seis puntos muestreados se evidencio que la
muestra perteneciente a la caja de captación, que es el sitio por donde fluyen los vertimientos
de los explosivos provenientes del proceso de producción de los mismos, presento una
concentración de 1687,92 ppm de TNT y 2544,86 ppm de PETN; siendo esta la razón, por la
cual éstas muestras no fueron seleccionadas para ser usadas en los microcosmos.
Para el estudio realizado solamente fueron elegidos dos puntos de muestreo, campo de prueba
y Fitorremediación (suelos), debido a que presentan importancia por ser el lugar donde se
realizan las pruebas de detonación y donde se llevan a cabo procesos de remediación con una
plantas de una variedad de caña. Los valores de las concentraciones iníciales para la muestra
de campo de prueba fueron 1,75 ppm y 1,84 ppm de TNT y PENT, en cuanto al suelo de
Fitorremediación se encontró concentraciones correspondientes de 1,26 ppm de TNT y 17, 54
ppm de PETN.
Por otra parte es importante, resaltar que los valores presentados de las concentraciones
iníciales de las dos muestras para PENT, resultaron ser más altos en comparación de los
valores de TNT (Tabla 4), muy posiblemente por los procesos de manufactura generados en
planta para PETN, el cual es fabricado en dicha planta, mientras el TNT es importado.
Tabla 4. Concentración inicial de TNT y PETN
Muestra Concentración
TNT [mg/kg] CV
Concentración PETN [mg/kg]
CV
Fitorremediación 1,26 25,61 17,54 48,36
Campo de prueba 1,75 35,72 1,84 0,96
Caño PTAR 1,20 17,04 2,21 30,66
Exterior de la planta 1,93 6,07 98,96 18,36
Silvestre 2,59 41,04 0 -
Caja de Captación 1.687,92 5,68 2544,86 6,79
22
5.4 Controles
Fig. 10 Controles estériles de campo de prueba
En cuanto se refiere a los controles realizados, según como se observo en la figura 10, se
estableció que no son controles confiables que permitan sustentar los datos de los demás
resultados, debido a que se evidencio que hay un porcentaje de degradación (Anexo 9) de los
compuestos mayor, en referencia a los tratamientos descritos anteriormente. La figura 11
muestra claramente como a los siete días de medición hay una completa degradación del TNT
y PETN siendo esto lo no esperado, pues al ser un tratamiento abiótico se busca demostrar
que este presente en su totalidad la concentración del explosivo o que se vea a través del
tiempo pequeñas disminuciones del compuesto. De esta manera, lo ideal para no tener
interferentes en los controles se debe realizar de nuevo el montaje para poder tener una mayor
confiabilidad de los datos.
Tiempo (días)
0 2 4 6 8
Con
cent
raci
ón
[mg/
kg]
0
20
40
60
80
100
120
140
campo prueba +fc esteril antes TNT Campo de prueba +fc esteril despues TNT Campo de prueba +fc esteril despues PETN campo prueba +fc esteril antes PETN
23
5.5 Cinéticas de degradación
Fig. 11 Concentraciones de TNT y PETN en el tiempo durante incubaciones en a) campo
de prueba y b) fitorremediación en microcosmos con y sin adición de fuente de carbono.
En este estudio se encontró que la concentración de TNT y PETN después de los siete días de
medición disminuyo observándose que en la muestra de fitorremediación (Fig 11 b) de TNT la
concentración del explosivo fue disminuyendo notablemente tanto para el tratamiento en
condiciones de bioestimulación y sin adición de fuente de carbono, en comparación con la
‐‐‐ ‐‐‐ PETN Campo de prueba
mas fuente de carbono
‐‐‐ ‐‐‐ PETN Campo de prueba
sin fuente de carbono
TNT Campo de prueba
mas fuente de carbono
TNT Campo de prueba
sin fuente de carbono
‐‐‐ ‐‐‐ PETN Fitorremediación
mas fuente de carbono
‐‐‐ ‐‐‐ PETN Fitorremediación
sin fuente de carbono
TNT Fitorremediación
mas fuente de carbono
TNT Fitorremediación
sin fuente de carbono
Tiempo (días)
0 2 4 6 8
Con
cent
raci
ón [
mg/
kg]
0
20
40
60
80
100
120a
Tiempo (días)
0 2 4 6 8
Con
cent
raci
ón [m
g/kg
]
0
20
40
60
80
100
120 b
24
muestra de campo de prueba (Fig 11 a) presentó una menor disminución de la concentración;
así mismo se logró evidenciar en la remoción de PETN un descenso rápido en la concentración
del compuesto a partir del tiempo 0 para la muestra de fitorremediación (Fig 11 b). Es
importante tener en cuenta la vida media del PETN en suelos que ha sido reportada entre 0,45
y 2,4 días (Jenkins, et al 2003). Sin embargo se debe aclarar que debido a los inconvenientes
con los controles, estos resultados carecen de validez, y deben ser confirmados con los
eventos de muestreo siguientes, pues se cree que en el muestreo en el día 7 pudo haber algún
problema con la extracción, o con el detector en el HPLC. En todo caso no puede descartarse
que debido a que la muestra de fitorremediación proviene de un área de la fabrica, en donde se
llevan a cabo procesos de remediación de suelos contaminados con la estrategia de
fitorremediación, se puede inferir que una de la razones por la cual ésta muestra presenta
mayor degradación en contraste con el otro suelo utilizado se deba posiblemente a
mecanismos de integración de metabolitos y/o el contaminante a la biomasa vegetal (Sens et
al., 1999).
Según como se observo en la figura 11 a y b) no se presento ningún efecto de la
bioestimulación en la disminución de la concentración de los explosivos para las dos muestras,
ya que las tendencias fueron muy similares para cada una de ellas. Sin embargo en estudios
realizaos por Clark, y Boopathy en el (2007) se evidencia claramente como la adición de
fuente de carbono, especialmente melazas, favorecen la remoción del TNT con un porcentaje
del 99% mediante la implementación de reactores de lodos; así mismo en otros investigaciones
la bioestimulación con fuentes de carbono como el succinato favorece la degradación del
compuesto, ya que por consorcios bacterianos el TNT puede ser degradado por
cometabolismo. (Boopathy et al., 1994)
Otra razón por la cual puedo verse influenciada la disminución de compuestos como TNT y
PETN, son los procesos asociados a fenómenos como la adsorción mediante el cual los
contaminantes pueden llegar a incorporarse al ambiente.
5.6 Efecto en la degradación del TNT y el PETN en mezcla
Este estudio se realizo en paralelo con dos investigaciones, las cuales evaluaron la tasa de
degradación de TNT y PETN por separado, reportando que bajo las mismas condiciones de
esta investigación no hubo degradación de PETN (Velázquez, 2009), en cuanto al TNT se
obtuvieron porcentajes de degradación del 40% en la muestra de campo de prueba sin fuente
de carbono (Peña y Ramos, 2009), similares a los obtenidos en TNT en mezcla, en lo que se
refiere a la muestra de fitorremediación bajo condiciones naturales Peña y Ramos obtuvieron
porcentajes de remoción del 25% comparados con 98% en el mismo tratamiento cuando el
explosivo se encuentra en mezcla.
25
Estos datos serán confirmados con la continuación de estos estudios, ya que hasta el momento
la investigación solo se ha llevado a cabo 3 eventos de muestreo, los cuales no son suficientes
para afirmar estos hallazgos, más aun con el problema que se tuvo en los controles.
6. Conclusiones y recomendaciones
En la muestra de fitorremediación se obtuvo mayor porcentaje de degradación de TNT y PETN
comparado con el obtenido en la muestra de campo de pruebas, sin embargo como se
mencionó anteriormente se deben comprobar estos datos con eventos de muestreo
posteriores, debido al comportamiento de los controles.
Por otra parte no se evidenciaron diferencias entre los tratamientos de bioestimulación y
atenuación natural, en lo referente a los porcentajes de degradación de TNT y PETN.
Aparentemente la degradación de TNT y PETN se ve favorecida cuando estos compuestos
están en combinación, pero se deben confirmar estos datos un número más alto de eventos de
muestreo y con sus respectivos controles.
Es importante que para estudios de este tipo de enfoque se realicen análisis físico-químicos a
las muestras a utilizar, para que de esta manera pueda haber confiabilidad y comparación de
los datos.
Es de relevancia aclarar que el método de extracción propuesto por la EPA (8330B) esta
diseñado para suelos secos, por lo tanto no es el ideal para este tipo de ensayos, pues no se
pueden cambiar las condiciones de las muestras para lograr la máxima similitud con las
condiciones naturales, es por esto que se recomienda establecer y estandarizar el método que
permita la extracción de explosivos bajo estas características de las muestras.
26
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