Paula Ramos Pinto
Restrição intensa de sódio alimentar altera espécies de
glicerofosfolipídeos e ácidos graxos no gastrocnêmio, favorece
resistência insulínica e elevação de triacilgliceróis plasmáticos
em camundongos
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências
Programa de Endocrinologia
Orientadora: Profa. Dra. Marisa Passarelli
São Paulo
2020
Paula Ramos Pinto
Restrição intensa de sódio alimentar altera espécies de
glicerofosfolipídeos e ácidos graxos no gastrocnêmio, favorece
resistência insulínica e elevação de triacilgliceróis plasmáticos
em camundongos
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências
Programa de Endocrinologia
Orientadora: Profa. Dra. Marisa Passarelli
São Paulo
2020
Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Lípides (LIM-10) da Faculdade
de Medicina da Universidade de São Paulo (USP) com a colaboração do
Laboratório de Carboidratos do Instituto de Ciências Biomédicas da USP e do
Laboratório de Lipídeos Modificados do Instituto de Química da USP.
DEDICATÓRIA
Dedico esta tese à minha mãe Heloisa e à minha irmã Márcia, minhas grandes incentivadoras. Amo vocês incondicionalmente.
EPÍGRAFE
“Que nada nos limite. Que nada nos defina. Que nada nos sujeite. Que a liberdade seja a nossa própria substância, já que viver é ser livre”. Simone de Beauvoir
AGRADECIMENTOS
Dra. Marisa Passarelli, a vida me presenteou com a sua orientação. Na sua
exigência, sede de conhecimento e instinto questionador me vi amadurecer na
pesquisa. Aprendemos e amadurecemos juntas com as nossas diferenças.
Minha gratidão a você é infinita.
Dr. Sérgio Catanozi, agradeço antes de tudo, pelo convite a participar do
projeto sobre restrição dietética de sódio, linha de estudo que introduziu no
laboratório de lípides há muitos anos. Agradeço também pelos ensinamentos
que me proporcionou direta e indiretamente tanto no campo acadêmico como
em meu desenvolvimento pessoal.
Meus amigos-colaboradores de projeto Ana Paula Bochi, Me Guilherme
Ferreira da Silva, Vanessa Del Bianco, Mayara Trevisani e Letícia Gomes,
partilhar este estudo com vocês trouxe o dobro de trabalho, mas multiplicou de
maneira inenarrável as minhas possibilidades de aprendizado. A vocês os
meus mais sinceros agradecimentos pela constante parceria e ajuda. Gui,
obrigada pelas discussões acadêmicas, pelos conselhos e pelas conversas
filosóficas e políticas durante os experimentos e almoços no bandejão. Ana, de
uma maneira que nunca imaginei que aconteceria, nossas diferenças nos
uniram, na ciência e na nossa amizade, obrigada por me ensinar sempre um
jeito diferente de ver as coisas e por estar sempre presente. À Van agradeço a
companhia e as conversas malucas nos experimentos de western blotting e por
dividir as marmitas do seu Chico comigo. Letícia, obrigada por me ajudar em
diversos momentos de aperto. Mayara obrigada por me ensinar a lidar com
meus erros.
À Dra. Edna Regina Nakandakare agradeço imensamente por fazer o LIM-10
acolhedor e parecer uma família. Agradeço ainda todo suporte, carinho e
paciência no dia-a-dia do laboratório, a companhia e orientação nos
congressos que participamos juntas e pelo inesquecível pavê de amendoim.
Ao Dr Éder Quintão agradeço cada momento de discussão e cada história
compartilhada, as separatas mensais e os divertidos encontros anuais de
confraternização de final de ano. É sempre inspirador compartilhar alguns
minutos de conversa com o senhor.
Ao Dr. Ubiratan Fabres Machado e à Dra. Sayuri Miyamoto agradeço por
abrirem as portas dos seus respectivos laboratórios. Agradeço a ajuda dos
colaboradores envolvidos neste projeto, em especial a Dra. Maristela Okamoto
e Dr. Marcos Yoshigana, por toda orientação, ensinamento e socorro durante
os ensaios, tratamento e discussão de resultados.
Dra. Valéria Sutti Nunes, Dra. Patrícia Cazita, Fabiana Ferreira e Kelly Gomes,
obrigada por toda a ajuda do dia-a-dia, por me tirarem infinitas dúvidas, pelas
conversas prazerosas, as terapias em grupo e por compartilhar um pouco da
vida de vocês comigo.
À Dra. Ana Maria Lottenberg obrigada pelo carinho, pelas palavras acolhedoras
em diversos momentos do doutorado, e do amor que compartilha com a gente
na forma de torta de ricota e bolo de chocolate com coco.
À Dra. Lígia Shimabukuro Okuda, presente na minha trajetória antes ainda de
ingressar no mestrado. Dos protocolos as conversas reflexivas sobre a vida
não consigo dizer o quanto aprendi e aprendo com você a cada dia. Muito
obrigada por tudo.
Ao Dr. Raphael de Souza Pinto agradeço à amizade, companhia e pelas
cervejas quando as nossas padronizações de RNA deram errado. Pelas
discussões científicas e sobre os temas mais polêmicos.
À Me Monique F. Mello Santana foi incrível sermos laureadas com o Young
Investigator Fellowship do EAS no mesmo ano e compartilharmos a
experiência de viajarmos juntas, ficarmos nervosas juntas para fazer uma
apresentação oral, de caminharmos infinitamente até ficarmos cansadas.
Obrigada por dividir essa experiência comigo, por me permitir te conhecer
melhor, por conversar comigo sobre reality shows.
A minha eterna gratidão aos melhores secretários do mundo Claudia Souza,
Rubens J. da Silva e Maria Aparecida da Silva, estes queridos que sempre
estiveram à disposição para me ajudar com as questões administrativas e
burocráticas da pós-graduação e com quem compartilhei momentos de alegria
e descontração ao longo do processo.
Ao professor Dr. Chin Jia Lin, Dra. Natália Gomes Gonçalves e Dra. Aritania
Santos muito obrigada pelo espaço cedido para ensaios de PCR e por toda
disposição em discutir as minhas dúvidas sobre a técnica e padronizações.
Francisca Elda B. Dantas, Guilherme André Marcelino, Mariana Ribeiro e
Sayonara Assis, obrigada pelas conversas descontraídas nos intervalos dos
experimentos, pela companhia no almoço, pelos bolos e doces trazidos para
alegrar nossos dias e pela ajuda nos protocolos. Um futuro acadêmico lindo
para vocês
Aos médicos Aécio Lira e Carlos Minanni muito obriga pelas orientações que
carinhosamente me dedicaram nesses anos, pelas conversas na bancada e no
escritório sobre cerveja, shows de rock, comida e corrida.
À querida Rosibel, obrigada pelo cuidado com os nossos materiais, pela
companhia nos experimentos, pelas dicas sobre plantinhas e pelo café que
sempre me deixava pronta para trabalhar todos os dias.
Agradeço a um time de amigos, doutores e mestres, que tive o prazer de
conhecer no LIM-10, Adriana M. S. de Lima, Diego J. Gomes, Gabriela
Castilho, Juliana Tironi, Karolline S. da Silva, Maria Silvia F. Lavrador, Milessa
Afonso, Rodrigo Tallada Iborra e Tatiana Venâncio. Com vocês, compartilhei as
bancadas do laboratório, discussões sobre experimentos, participações em
congressos e momentos de alegria em churrascos e mesas de bar. Não se faz
ciência sozinho, vocês me ensinaram muito e tornaram minha jornada
acadêmica muito especial.
Aos meus tios Ronaldo, Carmelita, Boaventura e Rose agradeço o carinho,
incentivo e apoio. Amo vocês.
Aos amigos Alessandro, Aline Marques e Nozima, Bruna, Daniele, Elis, Juliana,
Luanny, Miriam, Natália, Patrícia e Rita agradeço a paciência com meus
desabafos sobre a vida acadêmica, a ajuda com figuras e planilhas, por
entenderem a minha ausência em alguns momentos e por comemorarem
comigo as minhas conquistas.
À minha irmã Márcia, agradeço todo aprendizado fruto das nossas
semelhanças e diferenças. Aprecio e valorizo o seu jeito único de torcer pela
minha trajetória acadêmica e pessoal e agradeço por comemorar comigo
minhas conquistas.
À minha mãe, Heloisa, agradeço imensamente pelo apoio e amor incondicional.
Da sua simplicidade nasceram as lições mais valiosas da minha vida. Te amo,
admiro e respeito mais que qualquer outro ser neste mundo.
Agradeço ao apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior, Brasil – Capes (Código de Financiamento 001).
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA
EPÍGRAFE
AGRADECIMENTOS
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1
1.1. Restrição de sódio e risco cardiovascular ............................................. 1
1.2. Conteúdo intramuscular e intramiocelular de lipídeos e sensibilidade
insulínica ......................................................................................................... 8
2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 12
3. OBJETIVO ................................................................................................. 13
4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 14
4.1. Modelo Animal .................................................................................... 14
4.2. Protocolo experimental ........................................................................ 15
4.3. Dietas normossódica e hipossódica .................................................... 16
4.4. Dosagens bioquímicas ........................................................................ 17
4.5. Excreção urinária de sódio .................................................................. 18
4.6. Mensuração da pressão arterial caudal .............................................. 18
4.7. Perfil plasmático de lipoproteínas ....................................................... 19
4.8. Teste de tolerância à insulina .............................................................. 20
4.9. Obtenção do gastrocnêmio ................................................................. 20
4.10. Análise da expressão gênica por reação de polimerase em cadeia
quantitativa em tempo real (RT-qPCR). ........................................................ 20
4.11. Determinação do conteúdo proteico de AKT e GLUT4 .................... 23
4.12. Análise de espécies lipídicas no gastrocnêmio ................................ 24
Extração lipídica do tecido muscular ............................................................. 24
Lipidômica ..................................................................................................... 24
4.13. Análise Estatística ............................................................................ 27
5. RESULTADOS .......................................................................................... 28
6. DISCUSSÃO .............................................................................................. 51
7. CONCLUSÃO ............................................................................................ 60
8. ANEXOS .................................................................................................... 61
9. REFERÊNCIAS ......................................................................................... 70
LISTA DE ABREVIATURAS
AC acilcarnitina
Acacb acetil CoA carboxilase beta
Actb beta actina
AGL ácidos graxos livres
AKT1 proteína cinase B
Akt1 gene que codifica para proteína cinase B
ANG angiotensina
apo E apolipoproteína E
AT-1 receptor de angiotensina tipo 1
B2m beta 2 microglobulina
Cd36 gene que codifica para proteína de transporte de ácidos graxos CD36
CE colesterol esterificado
Cer ceramida
CL cardiolipina
Cpt1b carnitina palmitoil transferase 1b
CT colesterol total plasmático
DAG diacilglicerol
DCV doenças cardiovasculares
DM diabetes mellitus
ECA enzima conversora de angiotensina
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
Fabp3 proteína de ligação de ácidos graxos
FPLC cromatografia líquida para separação rápida de proteínas
Gapdh gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
GLUT4 transportador de glicose 4
HAS hipertensão arterial sistêmica
HDL lipoproteína de densidade alta
HDLc colesterol na lipoproteína de densidade alta
Hprt hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase
HS grupo do protocolo experimental alimentado com dieta hipossódica
ICAM-1 molécula de adesão intercelular
IGF-1 fator 1 de crescimento semelhante à insulina
IL-6 interleucina 6
IRS1 substrato do receptor de insulina
Irs1 gene que codifica para o substrato do receptor de insulina
ITT teste de tolerância à insulina
LC cromatografia líquida
LDL lipoproteína de densidade baixa
LDLc colesterol na lipoproteína de densidade baixa
LDLR KO camundongo knockout para a o receptor de LDL
Lpl lipoproteína lipase
LysoPC lisofosfatidilcolina
LysoPE lisofosfatidiletanolamina
MAPK proteína cinase ativada por mitogênio
MCP-1 proteína quimoatraente de monócitos 1
mEq miliequivalente
NF-KB fator de transcrição nuclear
NS grupo do protocolo experimental alimentado normossódica
PS fosfatidilserina
PA pressão arterial
PBS solução salina tamponada de fosfato
PC fosfatidilcolina
PC fosfatidilcolina
PKC Proteína cinase C
PCR proteína C reativa
PE fosfatidiletanolamina
PE fostatidiletanolamina
PI fosfatidilinositol
PG fosfatidilglicerol
Ppargc1a coativador 1-alpha do receptor ativador da proliferação de peroxissomos gama
Prkaa1 subunidade alfa 1 da proteína cinase tivada pelo AMP (
RI resistência à insulina
ROS espécies reativas de oxigênio
Rplp0 proteína ribossomal P0
RT-qPCR reação de polimerase em cadeia quantitativa em tempo real
Slc2a4 gene que codifica para o transportador de glicose 4, GLUT4
SM esfingomielina
SNS sistema nervoso simpático
SOD superóxido dismutase
SRAA sistema renina-angiotensina-aldosterona
TAG triacilglicerol
TNF-alfa fator de necrose tumoral alfa
VCAM-1 molécula de adesão vascular 1
VLDL lipoproteína de densidade muito baixa
RESUMO
Pinto PR. Restrição intensa de sódio alimentar altera espécies de
glicerofosfolipídeos e ácidos graxos no gastrocnêmio, favorece resistência
insulínica e elevação de triacilgliceróis plasmáticos em camundongos. [tese].
São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2020.
A restrição alimentar de sódio reduz a pressão arterial (PA) e a
morbimortalidade por doenças cardiovasculares. Entretanto, quando intensa e
crônica, favorece resistência insulínica (RI), alteração nos lipídeos plasmáticos
e sua infiltração no arco aórtico em modelos animais de dislipidemia. Avaliou-
se o efeito da restrição dietética intensa e crônica de sódio sobre o perfil de
espécies lipídicas e a expressão de genes e proteínas envolvidas na
homeostase de lipídeos e glicose no gastrocnêmio de camundongos knockout
para o receptor de lipoproteínas de densidade baixa (LDLR KO) como possível
determinante para o aumento da concentração plasmática de lipídeos e RI.
Camundongos LDLR KO, machos com 3 meses de idade, foram tratados com
dieta normossódica (0,5% Na; n = 13 - 19) ou hipossódica (0,06% Na; n = 14 -
20), por 90 dias. Massa corporal (MC), PA, colesterol total (CT) e triacilglicerol
(TAG) plasmáticos, glicose, hematócrito, sensibilidade à insulina e excreção
urinária de sódio foram determinados. No gastrocnêmio foi avaliada a
expressão gênica (RT-qPCR) e proteica (imunoblot) de mediadores da via de
sinalização da insulina e fluxo de lipídeos e o conteúdo de espécies lipídicas
(lipidômica global). A dieta hipossódica, em comparação à normossódica,
elevou a MC (9%), TAG (51%), glicemia (19%) e RI (46%). No gastrocnêmio,
aumentou as espécies de fosfatidilcolinas (68%), fosfatidilinositol (90%) e
ácidos graxos (59%), e reduziu cardiolipinas (41%) e acilcarnitinas (9%). A
expressão de genes envolvidos na captação e oxidação muscular de lipídeos
foi aumentada pela dieta hipossódica (Fabp3,106%; Prkaa1, 46% e Cpt1,
74%). Em conclusão, a redução intensa de sódio alimentar em camundongos
altera espécies de glicerofosfolipídeos e ácidos graxos no gastrocnêmio, o que
pode se vincular à elevação da RI e triacilgliceróis plasmáticos nestes animais.
Descritores: Dieta hipossódica; Resistência à insulina; Músculo esquelético,
Metabolismo dos lipídeos; Ácidos graxos, Lipidômica.
ABSTRACT
Pinto PR. Severe sodium diet restriction alters glycerophospholipid and free
fatty acid species in gastrocnemius and induces insulin resistance and plasma
triacylglycerol increase in mice. [thesis]. São Paulo: Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo; 2020.
Dietary sodium restriction reduces blood pressure (BP) and cardiovascular
disease morbidity and mortality. However, when intense and chronic, it favors
insulin resistance (IR), changes in plasma lipids and infiltration of lipids in the
aortic arch in animal models of dyslipidemia. The effect of intense and chronic
sodium restriction on the profile of lipid species and the expression of genes
and proteins involved in lipid and glucose homeostasis in the gastrocnemius of
knockout mice for the low-density lipoprotein receptor (LDLR KO) was
evaluated as a possible determinant for the increase in plasma lipids and IR.
Three-months old male LDLR KO mice were fed a normal diet (0.5% Na; n = 13
- 19) or low-sodium diet (0.06% Na; n = 14 - 20), for 90 days. Body mass (BM),
BP, plasma total cholesterol (TC) and triacylglycerol (TAG), glucose,
hematocrit, insulin sensitivity and urinary sodium excretion were determined.
Gene (RT-qPCR) and protein (immunoblot) expression of the insulin signaling
pathway and lipid flow mediators, as well as lipid species (global lipidomics)
were evaluated in the gastrocnemius. Low-sodium diet as compared to the
normal-sodium diet increased BM (9%), TAG (51%), blood glucose (19%) and
IR (46%). In the gastrocnemius species of phosphatidylcholines (68%),
phosphatidylinositol (90%) and fatty acids (59%) were increased, and
cardiolipins (41%) and acylcarnitines (9%) reduced. The expression of genes
involved in lipid uptake and oxidation was increased by the low-sodium diet
(Fabp3,106%; Prkaa1, 46% and Cpt1, 74%). In conclusion, severe sodium diet
restriction in mice alters glycerophospholipid and fatty acid species in the
gastrocnemius, which can be linked to the elevation of IR and plasma
triacylglycerols in these animals.
Descriptors: Sodium-restricted diet; Insulin resistance; Skeletal muscle; Lipid
metabolism; Fatty acids, Lipidomics.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Restrição de sódio e risco cardiovascular
As doenças cardiovasculares (DCV) e cerebrovasculares estão entre as
principais causas de mortalidade no cenário mundial. As doenças isquêmicas
do coração e os acidentes vasculares encefálicos ocupam a primeira e a
terceira posição, respectivamente, na classificação das principais causas de
morte (GBD 2017 Mortality and Causes of Death Collaborators, 2018). No
Brasil, um panorama semelhante foi observado por França et al. (2017), em
2015, onde 31,2% dos óbitos foram atribuídos as DCV.
Contribuem para tais doenças fatores de risco primários, como: idade,
sexo, histórico familiar prévio de DCV, hipertensão arterial sistêmica (HAS),
dislipidemia, diabetes mellitus (DM) e tabagismo, além de fatores de risco
secundários, como obesidade e sedentarismo (Lim et al., 2012; Hajifathalian et
al., 2015).
A HAS é o principal fator de risco para mortes por DCV, doença renal
crônica e DM e foi responsável por mais de 40% das mortes por estas doenças
no mundo, em 2010 (Global Burden of Metabolic Risk Factors for Chronic
Diseases Collaboration, 2014). A HAS, caracterizada por valores de pressão
sistólica ≥ 140 mmHg ou pressão diastólica ≥ 90 mmHg, se apresenta em
24,1% dos homens e 20,1% das mulheres da população global (James et al.,
2014; WHO, 2013; NCD-RisC, 2017). Por se tratar de uma doença altamente
prevalente e associada à morbidade e mortalidade, abordagens para a redução
2
da HAS amplamente são recomendadas, o que se reflete na prevenção das
DCV (Oparil, 2014).
O elevado consumo de sódio é considerado o principal fator ambiental
para o desenvolvimento da HAS (Stamler et al., 1991). Observa-se uma
relação direta entre a alta ingestão de sódio e o aumento crônico de pressão
arterial, tanto em indivíduos hipertensos como em normotensos (Weinberger et
al., 1996; Orlov et al., 2007, Mente et al., 2016).
Em 2010, 1,65 milhão de mortes por causas cardiovasculares foram
atribuídas ao consumo de sódio acima do valor de referência (2 g de sódio/dia),
sendo que a ingestão média de sódio estimada na população mundial foi de
3,95 g/dia (Mozaffarian et al., 2014; Powles et al., 2013). De acordo com a
Organização Mundial de Saúde (OMS), a recomendação para consumo diário
de sódio não deve ultrapassar 2 g (5 g de sal - NaCl) (WHO, 2019). A
Associação Americana do Coração (American Heart Association) sugere
consumo inferior a 1,5 g de sódio (3,8 g de sal) para portadores de HAS, DM,
doença renal crônica, negros e adultos com mais de 51 anos, e 2,3 g de sódio
(5,8 g de sal) para o restante da população (Lloyd-Jones et al., 2020). Isto
porque a alta ingestão de sódio é apontada como fator de risco independente
para modificações patológicas como, remodelamento vascular, hipertrofia
cardíaca, acidente cerebrovascular e risco de mortalidade por todas as causas
(Meneton et al., 2005; Muntzel et al., 1992; Katayama et al., 2014; Cook et al.,
2016).
Juntamente com a intervenção medicamentosa, alterações do estilo de
vida, como a redução da ingestão de sódio, interrupção de tabagismo e a
prática regular de exercício físico conferem êxito no tratamento não-
3
farmacológico da HAS (Brook et al., 2013). No estudo epidemiológico DASH
(Dietary Approaches to Stop Hypertension) que preconizou a adoção de
hábitos alimentares com ingestão de frutas e vegetais, menor quantidade de
gordura e redução de aproximadamente 30% do consumo de sal, observou-se
redução de pressão arterial em pacientes hipertensos e normotensos (Sacks et
al., 2001). He, Li e Macgregor (2013), em uma metanálise que avaliou 35
estudos (3.230 participantes), descreveram que a redução moderada da
ingestão de sal levou a importante redução da pressão arterial. Além deste
benefício, a redução do consumo de sódio reflete-se na redução de custos
médicos e prevenção de morbidades associadas à HAS (Tuomilehto et al.,
2001; Krikken et al., 2009; Bibbins-Domingo et al., 2010; Del Rio et al., 1993).
Neste sentido, programas de incentivo à redução do consumo de sódio
dietético foram apresentados por diversas organizações. Como por exemplo, o
plano de ação global para prevenção e controle de doenças crônicas não-
transmissíveis, implementado pela OMS, no qual estimula-se a redução relativa
de 30% da ingestão média de sal e sódio (WHO, 2013; Cappuccio et al., 2019).
De modo semelhante, o programa europeu de implementação de redução de
sal, abrangeu campanhas de políticas sociais e de saúde, sugerindo menor
consumo de sal, além de priorizar ações de reformulação da composição de
nutrientes nos alimentos industrializados (European Commission, 2013).
Em contrapartida, estudos de coorte que examinaram a associação
entre a excreção urinária de sódio de 24 h (que reflete o consumo dietético
diário de sódio) e desfechos cardiovasculares e mortalidade, em mais de 100
mil participantes, demonstraram, de forma surpreendente, que o consumo de
sódio inferior a 3 g por dia também se associou com o aumento de risco de
4
eventos cardiovasculares para indivíduos com ou sem HAS (Mente et al., 2016;
O’Donnell, 2014 e 2019). Em ambos os estudos, o consumo estimado de sódio
entre 3 e 6 g ao dia foi associado com menor risco de morte por eventos
cardiovasculares em comparação ao consumo maior ou menor que esta faixa,
sugerindo uma associação em forma de jota (J-shaped) entre o consumo de
sódio e desfechos cardiovasculares.
Apesar do seu importante efeito hipotensor, a restrição alimentar intensa
de sódio promove efeitos metabólicos adversos, como o estímulo à atividade
do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), do sistema nervoso
simpático (SNS) e hiperlipidemia. Esses efeitos foram confirmados por Graudal
et al. (2017), em um levantamento de 125 ensaios clínicos randomizados até
2016 que incluiu indivíduos normotensos e hipertensos. Tais estudos
empregaram redução dietética média de sódio de 201 mmol (4,6 g) para 66
mmol (1,5 g) e os indivíduos com baixo consumo de sódio apresentaram
concentrações plasmáticas mais altas de renina (55%), aldosterona (127%),
epinefrina (14%), norepinefrina (27%), colesterol total (CT; 2,9%) e triacilglicerol
(TAG; 6,3%) em comparação aos indivíduos que ingeriram dieta com alto teor
de sódio.
Homens jovens e saudáveis que participaram de protocolo de restrição
de sódio na dieta, com duração de uma semana, apresentaram modesta
redução da concentração de colesterol na lipoproteína de densidade alta
(HDLc) e apolipoproteina A-I (apo A-I), principal constituinte das HDL (Krikken
et al., 2012). No entanto, as alterações mais proeminentes, em modelos
animais e humanos hipertensos, foram relacionadas ao aumento da
colesterolemia, colesterol na lipoproteína de densidade baixa (LDLc) e
5
trigliceridemia (Catanozi et al., 2001, 2003; Nakandakare et al., 2008). A
elevação das concentrações plasmáticas de colesterol, principalmente, nas
LDL e a redução da concentração de HDLc são os componentes da
dislipidemia, diretamente associados à gênese da lesão aterosclerótica
(Tanabe et al., 2010 e Wilson et al., 1988).
Em ratos Wistar alimentados com dieta pobre em cloreto de sódio
observou-se maior concentração plasmática de ácidos graxos livres (AGL) e
TAG, em comparação aos animais que receberam dieta normossódica (NS -
0,5% de sódio) (Catanozi et al., 2001). Este evento foi atribuído à diminuição da
remoção plasmática de lipoproteínas ricas em TAG (quilomícrons e
lipoproteínas de densidade muito baixa, VLDL), independentemente de
alterações na síntese hepática de TAG.
Em camundongos knockout para o receptor de LDL ou para
apolipoproteína E (apo E), além do aumento da trigliceridemia, observou-se
maior concentração circulante de AGL nos animais que receberam dieta pobre
em sódio em comparação aos alimentados com dieta normossódica (Catanozi
et al., 2003). Neste estudo, apenas os animais knockout para o receptor de
LDL sob restrição de sódio apresentaram elevação da colesterolemia e maior
infiltrado lipídico no arco aórtico, em comparação aos animais em dieta
normossódica. Todavia, em outros protocolos experimentais com
camundongos knockout para apo E que receberam dieta pobre em sal também
se observou maior desenvolvimento de aterosclerose em comparação aos
grupos alimentados com dieta normo ou hiperssódica (Ivanovski et al., 2005;
Tikellis et al., 2012).
6
Em camundongos dislipidêmicos, com hipertensão renovascular,
caracterizada por aumento crônico de angiotensina (ANG) II circulante, a
restrição de sódio na dieta, a partir do desmame, aumentou o infiltrado de
lipídeos arteriais. Este evento foi prevenido pela losartana, bloqueador seletivo
do receptor de ANG II (receptor de ANG tipo 1, AT1) a qual,
independentemente da redução pressórica, diminuiu a concentração de
carboximetil-lisina, marcador de glicoxidação (Fusco et al., 2017).
Em humanos hipertensos, a dieta com concentração reduzida de sódio,
apesar da ativação do SRAA, não alterou parâmetros inflamatórios, como
interleucina 6 (IL-6) e proteína C reativa (PCR) no plasma (Chamarthi et al.,
2011). Em contraste, estudos que utilizaram animais knockout para apo E ou
duplo knockout para apo E e enzima conversora de ANG (ECA) 2, a restrição
de sódio na dieta promoveu aumento tecido-específico da expressão gênica e
conteúdo da molécula de adesão vascular 1 (VCAM-1), molécula de adesão
intercelular (ICAM-1), IL-6, fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e proteína
quimoatraente de monócitos 1 (MCP-1) (Tikellis et al., 2012; Thomas et al.,
2010). A restrição alimentar crônica de cloreto de sódio em indivíduos com
HAS moderada favoreceu o aumento de citocinas inflamatórias, concentrações
plasmáticas de TAG, renina e aldosterona, insulina de jejum e o HOMA-IR
(Nakandakare et al., 2008).
Ao lado das alterações provocadas na circulação, evidenciam-se efeitos
deletérios em diversos órgãos como, rim, cérebro, pâncreas, musculatura
esquelética, órgãos reprodutivos, tecido adiposo e vascular, resultantes da
ativação sustentada do SRAA (Benigni et al., 2010).
7
Modelos experimentais demonstram relação entre a restrição de sal e o
prejuízo da sinalização insulínica. A dieta pobre em sal levou ao aumento da
massa corpórea, adiposidade e percentual de gordura na carcaça de ratos, e
tais alterações se correlacionaram diretamente à RI (Okamoto et al., 2004;
Prada et al., 2005). Prada et al. (2005) verificaram redução da fosforilação do
receptor de insulina e do substrato do receptor de insulina 1 (IRS1) no músculo
e fígado destes animais em comparação aos tratados com dieta normossódica.
Embora exista uma grande associação entre HAS e RI, alguns estudos
demonstraram que, mesmo na ausência de elevação da pressão arterial, a
ativação do SRAA, por si, pode promover alteração na via de sinalização da
insulina (Garg et al., 2010; Bentley-Lewis et al., 2007). Estresse oxidativo e
inflamatório e aumento da atividade simpática, gerados pela ativação do SRAA,
vinculam-se à gênese e perpetuação da RI (Wei et al., 2006; Diamond-Stanik et
al., 2010), na qual prevalecem alterações no metabolismo de lipídeos e
lipoproteínas que contribuem para um perfil aterogênico.
A ativação do SRAA vincula-se à redução da captação muscular de
glicose com redução da translocação do transportador de glicose, GLUT4
(Ogihara et al., 2002; Wei et al., 2006). A sinalização desencadeada a partir da
ligação da ANG II ao receptor AT-1 leva à geração de espécies reativas de
oxigênio (ROS) as quais, cronicamente, aumentam o estresse oxidativo
tecidual e ativam fator de transcrição nuclear (NF-KB) que pode agir como um
regulador negativo da sinalização insulínica (Cabello-Verrugio et al., 2015). O
aumento do estresse inflamatório crônico, promovido pela elevação de AGL e
pela maior geração de citocinas por macrófagos do subtipo M1 que infiltram o
8
tecido adiposo ou ativação do SRAA também perpetua a redução do sinal
insulínico (Waki et al., 2007).
O tratamento do músculo sóleo de ratos Zucker não-obesos com ANG II
reduziu a sinalização insulínica e a captação de glicose dependente de insulina
(Diamond-Stanic et al., 2010). Além disso, por aumento de atividade da via
proteolítica dependente de ubiquitina, a ANG II diminuiu a massa muscular
esquelética. Ratos Sprague-Dawley, infundidos com ANG II apresentaram
redução de musculatura esquelética (sóleo e gastrocnêmio) que foi atribuída ao
aumento de proteólise muscular (Brink et al., 2001). Estudo em ratos evidencia
que a infusão de ANG II aumenta a proteólise muscular, reduz a concentração
circulante e muscular do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1),
diminui a fosforilação da proteína cinase B (AKT) e ativa a caspase-3 na
musculatura esquelética, favorecendo a clivagem de actina e aumento de
apoptose. Tais achados indicam que uma possível downregulation na via de
sinalização da IGF-1 desempenhe importante função na proteólise muscular
induzida pela ANG II (Song et al., 2005).
1.2. Conteúdo intramuscular e intramiocelular de lipídeos e sensibilidade
insulínica
No final dos anos 90, diversos estudos investigaram a relação entre o
acúmulo ectópico de TAG e a sensibilidade insulínica avaliada por clamp
euglicêmico. Nestes estudos, uma forte associação foi observada entre o
conteúdo intramiocelular de TAG e a RI em indivíduos saudáveis, obesos e
9
portadores de DM do tipo 2 (Forouhi et al., 1997; Goodpaster et al., 1997;
Perseghin, 1999; Jacob et al., 1999).
Nessa perspectiva, o acúmulo inter e intramiocelular de TAG passou a
ser reconhecido como importante marcador de RI. Esta atribuição, no entanto,
foi revista diante dos achados de Goodpaster et al. (2001), nos quais indivíduos
com DM2 e atletas de endurance apresentaram conteúdo intramuscular de
TAG expressivamente maior que indivíduos sedentários saudáveis e magros.
Entretanto, apenas nos atletas observou-se maior capacidade oxidativa das
fibras musculares, determinada pela medida da succinato desidrogenase. As
características do tipo de lipídeo acumulado na musculatura dos atletas de
endurance, em comparação aos indivíduos obesos, foi outro importante achado
que se associou à sensibilidade insulínica (Amati et al., 2011).
Em meio a diversas alterações metabólicas, a hipertrigliceridemia é um
dos mecanismos promotores da menor sensibilidade insulínica tecidual em
indivíduos obesos e diabéticos. O maior aporte de AGL e o prejuízo em sua
oxidação resulta no acúmulo intramuscular de TAG e substratos metabólicos
dos AGL, como acil-Coa (ácidos graxos acilados) de cadeia longa, ceramidas
(Cer) e diacilglicerol (DAG) (Pan et al., 1999). Em modelos experimentais, a
relação entre o aumento de TAG e AGL circulantes e o acúmulo de tais
substratos na musculatura esquelética de animais diabéticos e obesos também
foi evidenciada (Zabielski et al., 2014; Kim et al., 2001; Lee et al., 2006).
Na musculatura esquelética, os DAG ativam a proteína cinase C (PKC)
teta que promove a fosforilação do substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1)
em resíduos de serina ao invés de tirosina, suprimindo a sinalização insulínica
e reduzindo a captação de glicose via insulina, pelo GLUT4 (Griffin et al., 1999;
10
Yu et al., 2002). As Cer, por sua vez, promovem a hiperglicemia pela ativação
da proteína fosfatase 2A, que desfosforila AKT e estimula outras proteínas da
família PKC, lambda e zeta, que também inibem a atividade da AKT (Bourbon
et al., 2002; Chalfant et al., 1999). Em outros estudos, a redução da
translocação de GLUT4 para a membrana das fibras musculares também se
associou com a redução da capacidade oxidativa e aumento de esfingolipídeos
totais, os quais se relacionam igualmente com RI (Collino et al., 2014; Coen et
al., 2013).
Além de lipídeos de depósito como os glicerolipídeos, TAG e DAG, e dos
esfingolipídeos, em especial as Cer, outras moléculas lipídicas envolvidas na
sinalização celular e nos componentes de membrana também têm sido
investigadas quanto ao seu papel na sensibilidade insulínica. Entre elas estão
os glicerofosfolipídeos.
Os lipídeos estruturais mais abundantes nas membranas eucarióticas
são os glicerofosfolipídeos, também descritos como fosfolipídeos, e suas
principais classes são fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE),
fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) e cardiolipinas (CL) (van Meer et al.,
2008). Os fosfolipídeos são componentes estruturais importantes das
membranas celulares e podem influenciar diversas propriedades relacionadas
a função das membranas como permeabilidade, fluidez e ancoragem de
proteínas relacionadas à membrana (Senoo et al., 2015). São importantes
ainda para o funcionamento mitocondrial, como PE e CL que desempenham
papel em manter o potencial da membrana interna e a atividade das cadeias
respiratórias, em especial da enzima citocromo c oxidase que, por sua vez,
diminui na depleção dos dois fosfolipídeos (Böttinger et al., 2012). Embora
11
exista evidências que fosfolipídeos do músculo esquelético sofram
remodelamento em resposta a vários estímulos metabólicos que incluem dieta
rica em gordura e exercício físico (Funai et al., 2013), pouco se sabe sobre o
papel da dieta hipossódica sobre os lipídeos musculares. Tais mudanças
podem influenciar a sensibilidade insulínica e a tolerância a glicose sistêmica.
12
2. JUSTIFICATIVA
A redução do consumo de sal é importante conduta não-farmacológica
para o controle da pressão arterial, contribuindo, desta forma, para a redução
de eventos cardio e cerebrovasculares. Não obstante, a restrição intensa e
crônica de sódio alimentar vincula-se à ativação do SRAA, piora da
sensibilidade hepática e muscular à insulina, perfil inflamatório, prejuízo no
metabolismo de lipoproteínas e acúmulo de lipídeos na parede arterial de
animais dislipidêmicos. Em humanos, a restrição intensa de sódio alimentar
também eleva a trigliceridemia e a concentração de marcadores inflamatórios
na circulação, com piora da sensibilidade insulínica. A elevação dos
triacilgliceróis plasmáticos se associa ao prejuízo da sinalização insulínica na
musculatura esquelética. Além disso, o conteúdo intramuscular de
triacilgliceróis e outras espécies lipídicas vinculam-se, diretamente, à redução
na cascata de sinalização do receptor de insulina. Não há estudos na literatura
que avaliem os efeitos da dieta hipossódica sobre a distribuição de lipídeos
musculares. A hipótese deste estudo é de que a restrição intensa e crônica de
sódio dietético altere o conteúdo de espécies lipídicas e a expressão de genes
envolvidos na captação de lipídeos e sinalização insulínica no gastrocnêmio,
contribuindo para a RI e elevação de triacilgliceróis plasmáticos induzidos pela
restrição intensa de sódio dietético.
13
3. OBJETIVO
Avaliar em camundongos knockout para o receptor de LDL (LDLR KO) o
perfil de subespécies lipídicas, por lipidômica global, e a expressão de
proteínas e genes envolvidos na sinalização insulínica, captação e oxidação de
lipídeos no gastrocnêmio, como elementos contribuintes à RI e elevação de
triacilgliceróis plasmáticos induzidos pela restrição intensa de sódio dietético.
14
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Modelo Animal
Para este estudo, foram utilizados camundongos com base genética
C57BL/6J, knockout para o receptor de LDL (LDLR KO) procedentes do The
Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, EUA). O receptor de LDL se localiza
na membrana plasmática de diversos tipos celulares e é responsável pela
endocitose de lipoproteínas que contêm apoB. A ausência deste receptor
favorece o acúmulo de LDL e VLDL na circulação (Ishibashi et al., 1993;
Ishibashi et al., 1994) e consequente elevação da colesterolemia. Os valores
séricos de colesterol total (CT) são de, aproximadamente, 200 a 275 mg/dL,
duas a três vezes maior que as concentrações observadas nos animais
selvagens.
Em camundongos selvagens, as principais lipoproteínas carreadoras de
colesterol são as HDL, enquanto no modelo LDLR KO, pelo defeito de
remoção, as LDL e VLDL passam a ser as principais transportadoras de
lipídeos. Sendo assim, sob este aspecto, os camundongos LDLR KO
assemelham-se aos humanos (Veseli et al., 2017; Goldstein e Brown, 2001),
sendo sensíveis ao desenvolvimento de aterosclerose, quando alimentados
com dieta rica em gordura saturada e/ou colesterol.
Ademais, a base genética C57BL6/J é muito utilizada para detecção de
alterações na composição e conteúdo de espécies lipídicas envolvidas no
metabolismo energético e atividade mitocondrial na musculatura esquelética
15
(Frangioudakis et al., 2010; Montgomery et al., 2013; Senoo et al., 2015; llo et
al., 2017).
Os animais foram criados em colônia homozigótica em biotério
convencional (Centro de Manutenção e Experimentação de Animais da Clínica
Médica – Disciplina de Reumatologia), em ciclo 12 h claro – 12 h escuro, em
temperatura de 22±2 ºC e receberam água filtrada e ração padrão ad libitum
até o início do protocolo experimental.
4.2. Protocolo experimental
Todos os protocolos deste estudo envolvendo o uso de animais foram
realizados de acordo com a “Diretriz Brasileira para o cuidado e utilização de
animais para fins científicos e didáticos” elaborada pelo Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal (CONCEA, 2013). Este projeto foi
aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo (nº 071/16). Documento de aprovação
encontra-se no anexo G.
Antes de iniciar o protocolo experimental, todos os animais foram
avaliados quanto à massa corporal, perfil plasmático de lipídeos (CT e TAG),
glicemia, hematócrito e pressão arterial. Destas variáveis, massa corporal, CT
e TAG plasmáticos foram utilizados para distribuir os camundongos LDLR KO,
com 12 semanas de idade, de maneira semelhante em dois grupos: um grupo
que passou a receber dieta normossódica (n = 19) e outro, dieta hipossódica (n
= 20).
16
O protocolo experimental teve duração de 90 dias. No período final, além
dos parâmetros citados anteriormente, foram determinados o perfil qualitativo
de lipoproteínas, excreção urinária de sódio de 24 h e teste de tolerância à
insulina (kITT) (Figura 1). Ao longo do protocolo, a massa corporal e o
consumo alimentar foram monitorados semanalmente.
Peso
PA
Glicose
CT
TAG
Hematócrito
Peso
PA
Glicose
CT
TAG
Hematócrito
Perfil de lipoproteínas
0 90 diasTratamento
ITT
Excreção urinária
de sódio
Remoção do
gastrocnêmio
Dieta
Normossódica
(n = 19)
Camundongos
LDLR KO
Machos
12 semanas de idade
Dieta
Hipossódica
(n = 20)
Figura 1. Protocolo experimental. PA = pressão arterial; CT = colesterol total; TAG = TAG; kITT = teste de tolerância à insulina.
O gastrocnêmio do lado direito e esquerdo foram extraídos e
armazenados em ultracongelador a -80º C até a realização das análises de
expressão gênica, conteúdo proteico, caracterização e quantificação lipídica.
4.3. Dietas normossódica e hipossódica
As dietas normossódica (0,5% Na) e hipossódica (0,06% Na) foram
obtidas da Teklad Custom Diet (Envigo, Estados Unidos). Ambas contêm 3,6
Kcal/g e a mesma composição em macronutrientes e demais ingredientes,
diferindo apenas em relação à quantidade de sódio (Tabela 1). A concentração
17
de sódio presente na dieta hipossódica é bastante restrita, porém suficiente
para garantir o desenvolvimento normal dos animais.
Tabela 1. Composição das dietas normossódica e hipossódica
Dieta Normossódica Dieta Hipossódica
Macronutrientes % por peso % kcal % por peso % kcal
Proteína 25,0 28,1 25,0 28,1
Carboidrato 49,8 56,0 49,8 56,0
Gordura 6,3 15,9 6,3 15,9
Fórmula
Caseína 287,0 g/kg 287,0 g/kg
Sucarose 313,4 g/kg 313,4 g/kg
Amido 200,0 g/kg 200,0 g/kg
Óleo de soja 60,0 g/kg 60,0 g/kg
Celulose 97,9 g/kg 97,9 g/kg
Mix de vitamina Teklad 10,0 g/kg 10,0 g/kg
Etoxiquina, antioxidante 15,0 g/kg 15,0 g/kg
Cloreto de Sódio 10,0 g/kg 1,27 g/kg
Cloreto de Sódio 0,50% 0,06%
Fonte: Teklad Custom Diet (Envigo, Estados Unidos).
4.4. Dosagens bioquímicas
Após 12 h de privação alimentar, sangue da veia caudal dos animais foi
coletado, utilizando-se capilares previamente heparinizados. Estas coletas
foram realizadas no início e final do estudo (após 90 dias de tratamento). A
determinação da concentração plasmática de CT e TAG foi realizada por kits
enzimáticos colorimétricos (Labtest, Brasil). A glicemia foi avaliada por
glicosímetro Accu Check Performa (Roche, Brasil).
18
4.5. Excreção urinária de sódio
Ao final do protocolo, os animais foram colocados em gaiolas
metabólicas individuais e mantidos, por 24 h, com livre acesso à água e ração.
Após este período, o conteúdo total de urina foi coletado, centrifugado a 2500
rpm, por 15 min, para precipitação de partículas sólidas e armazenado a -80°
C. Para análise, as amostras de urina foram homogeneizadas e centrifugadas a
2500 rpm, por 5 min, em temperatura ambiente. Um volume de 50 µL de urina
acrescido com lítio, um padrão de reação, foi aspirado em aparelho acoplado
ao fotômetro de chama. A determinação da excreção de sódio foi realizada por
fotômetro de chama Celm FC280 (São Paulo, Brasil). Os valores foram
corrigidos pelo volume total de urina e as concentrações foram expressas em
mEq/24h.
4.6. Mensuração da pressão arterial caudal
A mensuração da pressão arterial foi realizada por fotopletismografia de
transmissão, a qual é baseada na detecção da distensão do vaso arterial
causada pelo pulso de sangue que flui na cauda. Os animais foram
previamente aquecidos e posicionados em contensor metálico sobre uma
plataforma em temperatura de 36ºC. A cauda foi posicionada em manguito de
oclusão e sobre um sensor óptico. Após a frequência de pulso ser determinada
pelo software BP-2000, automaticamente o manguito de oclusão foi inflado.
Assim que a pressão de oclusão se equipara, inicialmente, à pressão diastólica
e, posteriormente, à sistólica, a amplitude do traçado da onda pressórica
diminui, fornecendo a aferição diastólica e sistólica, respectivamente. O
19
software BP-2000 possui processadores de sinais extremamente sensíveis
para detectar e desconsiderar movimentação do animal. Desta maneira, o
equipamento considera somente medidas obtidas na ausência de
movimentação. O aparelho utilizado é da marca Visitech Systems, modelo BP-
2000-M2 Blood Pressure Analysis System (Carolina do Norte, EUA). Dois dias
antes das análises definitivas, os animais foram submetidos à adaptação de
contenção física e insuflação do manguito caudal por, aproximadamente, 15
min. Os valores de pressão arterial foram obtidos pela média de seis a oito
aferições.
4.7. Perfil plasmático de lipoproteínas
O perfil plasmático das lipoproteínas (VLDL, LDL e HDL) foi determinado
por cromatografia líquida para separação rápida de proteínas (FPLC), apenas
ao final do protocolo experimental. Uma alíquota de plasma (100 µL) foi
injetada em coluna Superose 6HR 10/30 (FPLC System, Pharmacia, Upsalla,
Suécia), com eluição em fluxo constante de 0,5 mL/min de tampão Tris (Tris 10
mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM e NaN3 0,03% - pH 7,4). As frações
separadas de lipoproteínas foram depositadas em placas de 96 poços. Para
determinação do conteúdo de CT e TAG, utilizaram-se ensaios enzimáticos
colorimétricos (Labtest, Brasil) e espectrofotômetro de microplaca SpectraMax
plus 384 (Molecular devices, Califórnia, Estados Unidos). A área sob a curva de
cada fração de lipoproteína foi utilizada para comparação.
20
4.8. Teste de tolerância à insulina
Após privação alimentar de 4 h, uma pequena amostra de sangue foi
coletada da veia caudal dos camundongos para determinação da concentração
de glicose, por meio da utilização de glicosímetro (Accu Check Performa -
Roche do Brasil). Em seguida, foi realizada administração intraperitoneal de
insulina (1 U/kg – Humulin, Lilly) e a concentração de glicose foi novamente
avaliada a cada 10 min, em período total de 30 min. A constante da taxa de
decaimento da glicose plasmática (kITT) foi calculada baseando-se no declínio
linear da curva de concentração de glicose entre 10 e 30 min após a injeção de
insulina (Goren et al., 2004).
4.9. Obtenção do gastrocnêmio
Os animais foram submetidos à eutanásia com injeção intraperitoneal
(150 mg/kg de massa corporal) de tiopental sódico (THIOPENTAX®). Após
este procedimento, o gastrocnêmio foi retirado de ambos os membros. A
massa dos tecidos musculares foi aferida em balança de precisão Metler
Toledo (Ohio, Estados Unidos), colocada em tubos de congelamento e imersa
em nitrogênio líquido, imediatamente, ou armazenada em Invitrogen
RNAlaterTM (Vilnius, Lituânia) e, posteriormente, conservada a -80°C.
4.10. Análise da expressão gênica por reação de polimerase em cadeia
quantitativa em tempo real (RT-qPCR).
Para a extração de RNA total dos gastrocnêmios, os tecidos foram
macerados com homogeneizador Tissue-Tearor modelo 985370 (Biospec,
21
Oklahoma, Estados Unidos) em 1 mL de TRIzol Invitrogen (Life Technologies
Corporation, Califórnia, EUA) e acrescidos de 200 µL de clorofórmio. Após
centrifugação a 13.000 g por 15 min, a fase aquosa superior foi retirada
cuidadosamente e transferida para coluna de extração do kit de isolamento de
RNA Qiagen RNeasy Mini Colums (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). As
etapas seguintes foram realizadas de acordo com o fabricante. A presença das
bandas correspondentes aos RNA ribossomais 18S e 28S e avaliação da
qualidade e integridade do RNA total foi determinada por 2100 Bioanalyzer
(Agilent Thecnologies, EUA) utilizando-se Agilent RNA 6000 Nano kit
(Waldbronn, Alemanha). Foram obtidos 200 ng de cDNA a partir do RNA total
dos tecidos musculares usando kit High Capacity RNA-to-cDNA da Applied
Biosystems (Vilnius, Lituânia). Utilizaram-se sondas marcadas com FAM (6-
carboxy-fluorescein) no formato TaqMan Gene Expression Assays (Applied
Biosystems, Califórnia, Estados Unidos) dos genes- alvo Fabp3, Cd36, Cpt1,
Acacb, Irs1, Akt1, Slc2a4, Lpl, Ppargc1a e Prkaa1 (Tabela 2). A escolha do
normalizador adequado para o tecido investigado foi determinada por meio de
ensaios com 5 genes endógenos descritos na literatura (Gapdh, Actb, B2m,
Rplp0 e Hprt), sendo que o B2m (Tabela 2) apresentou maior estabilidade, de
acordo com o programa geNorm. A reação de polimerase em cadeia em tempo
real foi efetuada com o sistema de amplificação TaqMan Two Step RT-qPCR
(Applied Biosystems, CA, EUA) na presença do cDNA de cada amostra, da
sonda do gene alvo e endógeno e de Taqman Gene expression Master Mix
(Applied Biosystems, CA, EUA).
22
Tabela 2. Lista de genes analisados no estudo, de acordo com símbolo e nomenclatura oficial e número de catálogo das sondas (Applied Biosystems) utilizadas para PCR.
Símbolo oficial
Nome completo oficial de acordo com banco de genes da NCBI
Número de cátalogo
Fabp3 Fatty acid binding protein 3, muscle and heart Mm02342495_m1
Cd36 CD36 antigen Mm00432403_m1
Cpt1b Carnitine palmitoyltransferase 1b, muscle Mm00487191_g1
Acacb Acetyl-Coenzyme A carboxylase beta Mm01204671_m1
Irs1 Insulin receptor substrate 1 Mm01278327_m1
Akt1 Thymoma viral proto-oncogene 1 Mm01331626_m1
Slc2a4 Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 4
Mm00436615_m1
Lpl Lipoprotein lipase Mm00434764_m1
Ppargc1a Peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha
Mm01208835_m1
Prkaa1 Protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 1
Mm01296700_m1
Gapdh Glyceraldehyde-3-phosphate dehidrogenase Mm99999915_g1
Actb Actin, beta Mm02619580_g1
B2m Beta-2 microglobulin Mm00437762_m1
Hprt hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase
Mm03024075_m1
Rplp0 ribosomal protein, large, P0 Mm00725448_s1
Os dados foram analisados utilizando-se o programa StepOne Software
2.0 (Applied Biosystems, CA, EUA). O programa fornece o ciclo em que o sinal
de fluorescência é significativo, denominado cycle threshold (Ct) (Kubista et al.,
2006). Para cada amostra de cDNA, o Ct do gene alvo é registrado e
comparado com o controle endógeno escolhido. Os valores de expressão
gênica foram calculados pela fórmula 2-ΔΔCt de acordo com Livak e Schmitgen
(2001).
23
4.11. Determinação do conteúdo proteico de AKT e GLUT4
A quantificação proteica de GLUT4, AKT1 total e AKT1 fosforilada foi
realizada por Western Blotting. As amostras foram maceradas em tampão
contendo Tris HCL 10 mM, EDTA 1 mM, sacarose 250 mM e inibidores de
protease e fosfatase, com auxílio de homogeneizador politron (1000 rpm). A
quantificação de proteína do homogenato foi determinada pelo método
Bradford (1976). Cinquenta microgramas das amostras preparadas em
Laemmly e β-mercaptoetanol foram submetidas à eletroforese em gel de
poliacrilamida 10%, seguindo-se transferência para membrana de nitrocelulose.
O carregamento das bandas foi avaliado por Ponceau e o gel corado com
Comassie blue. Após bloqueio de sítios inespecíficos, as membranas foram
incubadas, por 24 h, com anticorpos anti-Akt 1/2/3 (Sc-8312, Santa Cruz
Biotechnology, California, EUA) e anti-p-Ak1 1/2/3 – serina 473 (Sc-7985-R,
Santa Cruz Biotechnology, California, EUA) e anti-GLUT4 (07-1404, Milipore
Corporation, California, EUA), para os quais as diluições foram padronizadas
em experimentos piloto (AKT 1:1000 e GLUT4 1:3000). Seguiu-se incubação
com anticorpo secundário anti-rabbit IgG (horseradish peroxidase linked whole
anitbody - NA93A, Amershan, Buckinghamshire, Reino Unido), diluição 1:5000,
e reação de quimioluminescência (Mruk e Cheng, 2011). As bandas foram
obtidas em câmara de revelação utilizando-se filme, revelador e fixador. A
intensidade das bandas foi avaliada por densitometria em fotodocumentador
(software Image Quant TL, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SW). A
densidade óptica de cada banda foi normalizada pela densidade óptica da
24
marcação da membrana com Ponceau. O conteúdo proteico foi expresso em
unidades arbitrárias (UA) corrigidas por grama de tecido muscular.
4.12. Análise de espécies lipídicas no gastrocnêmio
Extração lipídica do tecido muscular
Os gastrocnêmios dos animais que receberam dieta normossódica ou
hipossódica foram macerados em solução de tampão fosfato (PBS, phosphate-
buffered saline) 10 mM (pH 7,4) com 100 µM de desferroxamina. O extrato
lipídico foi obtido de acordo com o método de Yoshida et al. (2008), no qual
500 µL do homogenato do gastrocnêmio (100 mg/1mL) foi acrescido com 500
µL metanol e hidroxitolueno butilado (0,1 mM), dos padrões internos de
espécies lipídicas (Tabela 3) e 1,5 mL de clorofórmio: acetato de etila
(proporção 4:1).
Após centrifugação (1500 g por 3 min a 4ºC), a fase orgânica foi retirada
e seca em fluxo de nitrogênio. As amostras foram ressuspendidas em 200 µL
de isopropanol, centrifugadas novamente e separadas para análise
cromatográfica.
Lipidômica
Para análise lipidômica global, o extrato lipídico total do tecido foi
analisado por cromatografia líquida (liquid cromatrography - LC) de alta
eficiência (Nexera, Shimadzu, Kyoto, Japan) acoplada à ESI-Q-TOF-MS
(TripleTOF 6600, Sciex, Concord, Estados Unidos). ESI (electrospray
ionozation), ionização por electrospray foi o método utilizado como fonte de
25
ionização para as espécies lipídicas. Em seguida, as moléculas ionizadas
foram processadas por espectrômetro de massa de alta resolução em método
de escaneamento de múltiplos íons precursores, com instrumento quádruplo
(Q) com tempo de voo (time off flight – TOF), que separa os íons por razão
massa-carga (m/z) e gera um espectro de massa, no qual é gerado um gráfico,
evidenciando a abundância relativa de íons na forma de picos.
Tabela 3. Lista de padrões internos das espécies lipídicas utilizados nas análises de lipidômica.
Padrões internos Concentração Empresa
Ceramida Cer d18:1/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Esfingomielina SM d18:1/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Cardiolipina CL 14:0/14:0/14:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Fosfatidilcolina PC 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Fosfatidiletanolamina PE 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Fosfatidilserina PS 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Fosfatidilglicerol PG 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Ácido fosfatídico PA 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Lisofosfatidilcolina Lyso PC 17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Lisofosfatidiletanolamina Lyso PE 17:1 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Triacilglicerol TAG 17:0/17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Ceramida Cer d18:1/10:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids
Fosfatidilcolina PC 14:0/14:0 10 (µg/mL) Sigma Aldrich
Fostatidiletanolamina PE 14:0/14:0 10 (µg/mL) Sigma Aldrich
Triacilglicerol TAG 14:0/14:0/14:0 10 (µg/mL) Sigma Aldrich
Colesterol esterificado CE 10:0 10 (µg/mL) Sigma Aldrich
Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA); Sigma Aldrich (St Louis, MO, EUA).
As amostras foram injetadas (1 µL) em coluna CORTECS® (coluna C18,
1.6 μm, 2.1 mm i.d. × 100 mm) com taxa de vazão de 0,2 mL min-1 a 35°C de
26
temperatura. A fase móvel A da cromatografia líquida reversa, consistiu em
água/acetonitrila (proporção 60:40), enquanto a fase móvel B, em
isopropanol/acetonitrila/água (88:10:2). Ambas as fases continham acetato de
amônio ou formato de amônio para os ensaios no modo ionização positivo ou
negativo, na concentração final de 10 mM. A separação dos lipídeos aconteceu
em gradiente linear (40 a 100%) durante 20 min. A espectrometria de massas
foi operada nos modos positivo e negativo, sendo o intervalo de varredura da
razão massa-para-carga de 200-2000 Da. A identificação e a quantificação das
espécies lipídicas foram realizadas por Information Dependent Acquisition
(IDA®). A aquisição por Analyst® 1.7.1 foi realizada com ciclo de 1,05 s com 10
ms de tempo de aquisição para escaneamento MS1 e 25 ms de tempo de
aquisição para obter os 36 primeiros ions precursores. Para as análises a
voltagem spray dos íons foi -4,5 kV e 5.5 kV (para modo negativo e positivo,
respectivamente) e a voltagem de cone é +/- 80 V.
A espectrometria de massas foi analisada com Peak View®. As espécies
lipídicas foram identificadas manualmente, de acordo com sua massa exata,
fragmentos específicos e/ou perdas neutras com o auxílio de documentação
Excel fabricada internamente. Um erro máximo de 5 mDa foi definido para
atribuição do íon precursor. Após a identificação, a área das espécies lipídicas
foi obtida por MS utilizando-se MultiQuant®. A integração de cada pico foi
inspecionada cuidadosamente para a determinação correta e acurada da área.
A quantificação da razão de área foi calculada dividindo o pico de área de cada
lipídeo pelo padrão interno correspondente.
27
4.13. Análise Estatística
Os grupos alimentados com dieta normossódica e hipossódica foram
comparados com o teste não paramétrico de Mann Whitney ou por teste t de
Student, utilizando-se o programa estatístico Minitab® versão 18 (Mintab LLC,
Pensilvânia, EUA). Os dados foram apresentados como mediana e erro
padrão, considerando-se o nível descritivo de significância igual ou inferior a
5% (P ≤ 0,05).
28
5. RESULTADOS
Na tabela 4, estão apresentados os valores de massa corporal,
dosagens bioquímicas do plasma, pressão arterial, frequência cardíaca,
excreção urinária de sódio e consumo diário de ração dos animais alimentados
com dieta normossódica ou hipossódica.
Tabela 4. Massa corporal, perfil bioquímico, hematócrito, pressão arterial e frequência cardíaca dos animais que receberam dieta normossódica e hipossódica nos períodos basal e final (após 90 de dieta).
P
Massa corporal Basal 25,0 ± 0,4 24,8 ± 0,5 0,907
(g) Final 24,8 ± 0,4 26,6 ± 0,9 0,005
Colesterol total Basal 256 ± 8,1 257 ± 10,0 0,678
(mg/dL) Final 330 ± 49,0 345 ± 37,4 0,979
Triacilglicerol Basal 158 ± 8,6 159 ± 9,4 0,714
(mg/dL) Final 123 ± 8,0 148 ± 26,4 0,035
Glicose Basal 83 ± 2,9 85 ± 3,3 0,822
(mg/dL) Final 99 ± 3,5 117 ± 3,7 0,001
Hematocrito Basal 50 ± 1,3 50 ± 1,4 0,891
(%) Final 49 ± 0,5 49 ± 0,7 0,815
Pressão arterial sistólica Basal 112 ± 2,3 111 ± 2,6 0,482
(mmHg) Final 106 ± 1,7 102 ± 2,0 0,252
Pressão arterial diastólica Basal 43 ± 2,1 46 ± 3,5 0,528
(mmHg) Final 43 ± 2,2 45 ± 2,7 1,000
Frequência cardíaca Basal 481 ± 21,0 474 ± 16,9 0,808
(bpm) Final 529 ± 16,2 532 ± 15,4 0,961
Consumo de ração (g/24h) Final 2,94 ± 0,04 2,99 ± 0,04 0,535
Sódio urinário (mEq/24h) Final 0,17 ± 0,022 0,03 ± 0,004 0,000
Dieta
normossódica
Dieta
hipossódica
Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
No período basal, que antecedeu o consumo das dietas, ambos os
grupos experimentais foram semelhantes em relação à massa corporal,
29
colesterolemia, triacilglicerolemia, glicemia, hematócrito, pressão arterial
sistólica e diastólica e frequência cardíaca.
Após 90 dias do protocolo experimental, o grupo com dieta hipossódica
apresentou aumento da massa corporal, triacilglicerolemia e da glicemia de
jejum, em comparação ao que recebeu dieta normossódica (Tabela 4).
Conforme esperado, os camundongos que receberam dieta restrita em sal
apresentaram menor excreção urinária de sódio. O perfil plasmático de
lipoproteínas, no qual avaliou-se CT nas frações de VLDL, LDL e HDL, foi
similar entre os grupos que receberam dieta normossódica ou hipossódica
(Figura 2).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
VLDL LDL HDL
Co
les
tero
l T
ota
l
Ab
so
rbâ
nc
ia (
50
0n
m)
0 10 20 30 40 50 60
Frações
Dieta NormossódicaDieta Hipossódica
Figura 2. Perfil de distribuição de colesterol total entre as lipoproteínas plasmáticas dos camundongos alimentados cronicamente com dieta normossódica (n = 15) ou hipossódica (n = 16). O plasma de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos por 90 dias com ração normossódica ou hipossódica ad libitum, foi utilizado para determinar o perfil de lipoproteínas por cromatografia líquida para separação rápida de proteínas (FPLC) no período final do estudo. O percentual da área sob a curva de CT nas frações de VLDL, LDL e HDL foi utilizado para a comparação entre os grupos. As comparações foram realizadas pelo teste de Mann- Whitney.
30
Observou-se, no entanto, elevação do percentual de TAG na fração de
VLDL (dieta normossódica: 15 % ± 0,6 % vs dieta hipossódica: 19 % ± 0,7 %; P
= 0,003) e redução do percentual TAG na fração de HDL (dieta normossódica
34 % ± 0,9 % vs dieta hipossódica: 31 % ± 0,8 %; P = 0,02) nos animais
submetidos à restrição de sódio em comparação aos alimentados com dieta
normossódica (Figura 3).
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Tri
ac
ilg
lic
ero
l
Ab
so
rbâ
nc
ia (
50
0n
m)
0 10 20 30 40 50 60
Frações
VLDL LDL HDL
Dieta NormossódicaDieta Hipossódica
*
* *
Figura 3. Perfil de distribuição de triacilglicerol entre as lipoproteínas dos camundongos alimentados cronicamente com dieta normossódica (n = 15) ou hipossódica (n = 16). O plasma de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos por 90 dias com ração normossódica ou hipossódica ad libitum, foi utilizado para determinar o perfil de lipoproteínas por cromatografia líquida para separação rápida de proteínas (FPLC) no período final do estudo. O percentual da área sob a curva de TAG nas frações de VLDL, LDL e HDL foi utilizado para a comparação entre os grupos. *P = 0,003; **P = 0,02. As comparações foram realizadas pelo teste de Mann- Whitney.
Os animais do grupo hipossódico apresentaram menor taxa de
decaimento de glicose, evidenciada no kITT, o que caracteriza o
31
estabelecimento de RI induzida pela restrição crônica de sódio dietético
(Figura 4).
Dieta
Normossódica
Dieta
Hipossódica
kIT
T-%
min
P = 0,012
0
1
2
3
4
Figura 4. Teste de tolerância à insulina (kITT) dos camundongos alimentados cronicamente com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 6). Camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos por 90 dias com ração normossódica ou hipossódica ad libitum, foram submetidos ao kITT, realizado após 4 h de restrição alimentar. A constante da taxa de decaimento da glicose plasmática (kITT) foi calculada baseando-se no declínio linear da curva de concentração de glicose entre 10 e 30 min após injeção intraperitoneal de insulina (1 U/kg). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
A massa do gastrocnêmio foi menor nos animais alimentados com dieta
hipossódica em comparação aos que receberam a dieta normossódica (Figura
5).
32
P = 0,047
Mas
sa
gas
tro
cn
êm
io
(mg
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Dieta
Normossódica
Dieta
Hipossódica
Figura 5. Massa do gastrocnêmio isolado dos camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 18) ou hipossódica (n = 19). Camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade foram alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. O gastrocnêmio destes animais foi isolado de ambos os membros por dissecação e sua massa aferida em balança de precisão. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Expressão relativa
Irs1
Akt1
Slc2a4
0 1 2
Dieta Normossódica
Dieta Hipossódica
Figura 6. Expressão de genes envolvidos na sinalização insulínica no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 5-7) ou hipossódica (n = 5-7). Camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade foram alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. A RT-qPCR foi realizada utilizando-se sistema TaqMan Two Step na presença de 200 ng de cDNA (obtido do RNA total extraído do gastrocnêmio do membro esquerdo dos animais), da sonda dos genes alvo (Slc2a4, Akt1 e Irs1) e endógeno (B2m) e de Master Mix
33
(TaqMan Gene expression - Applied Biosystems, CA, EUA). A expressão dos genes foi calculada pela fórmula 2-ΔΔCt, na qual ΔCt = Ct gene alvo – Ct do controle endógeno. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Da mesma forma, não houve alteração no conteúdo proteico de AKT
total e fosforilada e GLUT4 entre os grupos normossódico e hipossódico. O
conteúdo proteico foi corrigido por grama de tecido muscular, visto que os
animais que receberam dieta hipossódica apresentaram menor massa do
gastrocnêmio em relação aos animais que receberam dieta normossódica
(Figura 7).
A expressão de genes envolvidos na captação e metabolização de
ácidos graxos também foi avaliada no tecido muscular. Evidenciou-se maior
expressão de Fabp3, que codifica para o transportador de ácidos graxos na
membrana plasmática, no grupo que recebeu ração pobre em sódio (Figura 8).
Por outro lado, a expressão do gene Cd36, outro receptor muscular de ácidos
graxos de cadeia longa, foi similar entre os grupos alimentados com dieta
hipossódica e normossódica (Figura 8). A restrição crônica de sódio dietético
modulou a expressão dos genes envolvidos na oxidação de ácidos graxos no
músculo esquelético. Prkaa1, o gene que codifica para AMPK, e Cpt1, que
codifica a carnitina palmitoil transferase 1, que foram elevados no grupo de
animais alimentados com dieta hipossódica A expressão dos genes Lpl,
Ppargc1a e Acacb foi similar nos dois grupos.
34
0,0
0,5
1,0
1,5
AK
T f
os
fori
lad
a
UA
/g p
rote
ína
0,0
0,5
1,0
1,5
AK
T t
ota
l
UA
/g p
rote
ína
0,0
0,5
1,0
1,5
GL
UT
4
UA
/g p
rote
ína
Dieta
Normossódica
Dieta
Hipossódica
Figura 7. Conteúdo proteico de GLUT4, AKT total, AKT fosforilada no gastrocnêmio de camundongos alimentados com dieta normossódica (n = 8-10) ou hipossódica (n = 8-10). O gastrocnêmio do membro direito foi extraído de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. Para análises de Western Blotting, 50 µg de proteína do homogenato muscular total foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida 10% e transferidos para membrana de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com anticorpos primários GLUT4 (diluição1:3000), AKT total e AKT fosfotilada (1:1000) e anticorpo secundário anti-rabbit (1:5000) e colocadas em reação de quimiluminescência (ECL). A densidade óptica de cada banda foi normalizada pela densidade óptica da marcação da membrana com Ponceau. Os resultados estão apresentados em unidades arbitrárias corrigidas por grama de tecido,
35
como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Acacb
Cpt1
Pparg1a
Lpl
Prkaa1
Cd36
Fabp3 P = 0,036
P = 0,002
P = 0,012
0 1 2 3
Expressão relativa
Dieta Normossódica
Dieta Hipossódica
Figura 8. Expressão de genes envolvidos na captação e metabolização de lipídeos no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com normossódica (n = 5-7) ou hipossódica (n = 5-7). Camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade foram alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. A RT-qPCR foi realizada utilizando-se sistema TaqMan Two Step na presença de 200 ng de cDNA (obtido do RNA total extraído do gastrocnêmio do membro esquerdo dos animais), da sonda dos genes alvo (Fabp3, Cd36, Prkaa1, Lpl, Ppargc1a, Cpt1 e Acacb) e endógeno (B2m) e de Master Mix (TaqMan Gene expression - Applied Biosystems, CA, EUA). A expressão dos genes foi calculada pela fórmula 2-ΔΔCt, na qual ΔCt = Ct gene alvo – Ct do controle endógeno. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
36
A análise da expressão de subespécies lipídicas foi realizada por
lipidômica global em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massa, a partir do extrato total do gastrocnêmio obtido de
ambos os grupos experimentais. Foram identificadas 298 espécies lipídicas
distribuídas nas seguintes categorias: glicerofosfolipídeos (145 espécies),
glicerolipídeos (79 espécies), esfingolipídeos (40 espécies), ácidos graxos
livres (33 espécies) e lipídeo de prenol (1 espécie). As espécies lipídicas
identificadas em cada categoria podem ser observadas na figura 9.
Figura 9. Espécies lipídicas identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Número de espécies lipídicas por categoria identificadas em análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS no extrato lipídico do gastrocnêmio de camundongos alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. Q-9: coenzima Q9; Cer: ceramida;
37
SM: esfingomielina; 1G-Cer: monoglicosil ceramida; AC: acilcarnitina; AGL: ácidos graxos livres; DAG: diacilglicerol; TAG: triacilglicerol; oPE: alquil fofsfatidiletanolamina; pPC: plasmenil fosfatidilcolina: PI: fosfatidilinositol; PG: fosfatidilglicerol; CL: cardiolipinas; pPE: plasmenil fosfaftidiletanolamina; PE: fosfatidiletanolamina; PC: fosfatidilcolina.
A análise discriminante por mínimos quadrados observada na figura 10,
demonstra a separação entre os grupos normossódico e hipossódico no perfil
de lipidômica realizado por LC-MS.
Figura 10. Análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) de lipídeos no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com normossódica (NS, n = 7) ou hipossódica (HS, n = 7). O extrato lipídico do gastrocnêmio foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. A análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA)
38
evidencia a separação das espécies lipídicas dos grupos dieta normossódica (círculos verdes) e dieta hipossódica (círculos vermelhos).
O agrupamento hierárquico em heatmap ou mapa de calor permite a
visualização dos dados lipidômicos de forma simplificada. A intensidade relativa
de cada subespécie lipídica é apresentada de acordo com a coloração indicada
na escala lateral, na qual valores entre 0 e 2 se apresentam em tonalidades de
vermelho e valores de -2 a 0 se apresentam em tonalidades de azul. Os
valores entre -2 e 2 correspondem a média normalizada para cada espécie
lipídica.
O mapa de calor, apresentado na Figura 11, exibe 39 espécies lipídicas
significativamente alteradas pela dieta hipossódica apresentadas em linhas. As
colunas mostram a separação dos aglomerados de animais alimentados com
dieta hipossódica e normossódica. O agrupamento das amostras neste gráfico
evidencia a maior expressão de acilcarnitina (AC) e CL no grupo de animais
que receberam dieta normossódica e maior expressão de espécies plasmenil
fosfatidiletanolamina pPE, PC, PI e AGL no grupo que recebeu dieta
hipossódica.
39
Figura 11. Gráfico em mapa de calor mostrando as 39 espécies lipídicas alteradas pela dieta hipossódica no gastrocnêmio de camundongos animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (aglomerado verde, n = 7) ou hipossódica (aglomerado vermelho, n = 7). Lipídeos foram extraídos do gastrocnêmio de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. Análises estatísticas realizadas por teste t de Student com false Discovery rate (FDR) considerando P ≤ 0,05. AC: acilcarnitina; CL: cardiolipinas; pPE: plasmenil fosfaftidiletanolamina; PC: fosfatidilcolina; AGL: ácidos graxos livres; PI: fosfatidilinositol;
A análise lipidômica global revelou que as espécies mais abundantes
encontradas no músculo esquelético dos camundongos, em ordem
40
decrescente, foram as subclasses fosfatidiletanolamina (PE) e plasmenil
fosfatidiletanolamina (pPE), fosfatidilcolina (PC), ácidos graxos livres (AGL),
cardiolipinas (CL) e fosfatidilinositol (PI), representando 42%, 22%, 18%, 12%,
4% e 1% da massa média total dos lipídeos, respectivamente (Figura 12). A
expressão de PE e pPE foi semelhante nos grupos que receberam dieta
normossódica e hipossódica. A massa de PC, AGL e PI foi maior no grupo
alimentado com dieta hipossódica em comparação aos alimentados com dieta
normossódica. Em contrapartida, observou-se que a massa lipídica total de CL
foi menos expressa nos animais que receberam dieta hipossódica em
comparação à normossódica. Os valores referentes as espécies identificadas
similares nos grupos normossódico e hipossódico podem ser observadas nos
anexos A a F.
A razão PC:PE foi mais alta nos animais alimentados com dieta
hipossódica em comparação aos que foram alimentados com dieta
normossódica (Figura 13).
Ceramidas (Cer), DAG, TAG e esfingomielina (SM) apresentaram massa
lipídica total semelhante no gastrocnêmio dos animais de ambos os grupos
(Figura 14).
Das 59 espécies de fosfatidilcolinas identificadas no gastrocnêmio, 32
espécies foram mais abundantes nos animais HS em comparação aos NS
(Figura 15A) e 27 espécies foram semelhantes em ambos os grupos (Figura
15B).
41
Dieta Normossódica
Dieta Hipossódica
Percentual relativo
0 10 20 30 40 50
PI
CL
AGL
PC
pPE
PE
P = 0,011
P = 0,011
P = 0,003
P = 0,005
Figura 12. Percentual relativo das seis espécies mais abundantes identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). O extrato lipídico do gastrocnêmio foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. PE: fosfatidiletanolamina; pPE plasmenil fosfatidiletanolamina; PC: fosfatidilcolina, AGL: ácidos graxos livres, CL: cardiolipinas; PI: fosfatidilinositol. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
42
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Dieta
Normossódica
Dieta
Hipossódica
P = 0,005
Ra
zã
o P
C:P
E
Figura 13. Razão PC:PE no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). O extrato lipídico do gastrocnêmio foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. PE: fosfatidiletanolamina; PC: fosfatidilcolina. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Figura 14. Massa total de lipídeos de Cer, DAG, TAG e SM identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). O extrato lipídico do gastrocnêmio foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. Cer: ceramidas; DAG: diacilgliceróis; TAG: triacilgliceróis; SM: esfingomielina. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
43
44
45
Figura 15. Espécies de fosfatidilcolinas mais abundantes no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta hipossódica. Os lipídeos foram extraídos do gastrocnêmio de camundongos machos, LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7) ad libitum. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. A) PC modificadas pela dieta hipossódica. B) PC semelhantes em ambos grupos. pPC plasmenil fosfatidilcolina; PC: fosfatidilcolina. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Seis espécies de fosfatidilinositol, dentre as 7 identificadas, foram mais
expressas no grupo alimentado com dieta hipossódica (Figura 16).
Em contrapartida, quando comparado aos camundongos HS, o grupo
NS apresentou maior abundância de CL, em 16 espécies das 17 identificadas
na análise lipidômica global (Figura 17).
Oitenta e dois por cento das espécies de AGL observadas no
gastrocnêmio dos animais foram mais expressas nos animais do grupo
hipossódico e 18% dos AGL foram semelhantes nos animais de ambos os
grupos (Figura 18).
Onze espécies de acilcarnitinas (AC) foram identificadas no
gastrocnêmio. Seis destas foram mais abundantes em animais NS em
comparação aos HS (Figura 19). As demais espécies de AC foram similares
em ambos os grupos.
46
Figura 16. Espécies de fosfatidilinositol identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os lipídeos foram extraídos do gastrocnêmio de camundongos machos, LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7) ad libitum. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. PI fosfatidilinositol. As comparações foram realizadas pelo teste de Mann- Whitney.
47
Figura 17. Espécies de cardiolipinas identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Realizamos a extração de lipídeos do gastrocnêmio de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. CL: cardiolipinas; Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
48
49
Figura 18. Espécies de ácidos graxos livres identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Realizamos a extração de lipídeos do gastrocnêmio de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. AGL: ácidos graxos livres. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Figura 19. Espécies de acilcarnitinas identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Realizamos a extração de lipídeos do gastrocnêmio de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. AC: acilcarnitinas.
50
Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
As análises de regressão univariada evidenciaram correlação negativa
entre a taxa de decaimento de glicose (kITT) e as espécies de PC, AGL e PI e
correlação positiva com CL. No que diz respeito as concentrações plasmáticas
de TAG, destacou-se a correlação positiva com as espécies de PC, AGL e PI
(Tabela 5).
Tabela 5. Análise de regressão univariada entre kITT ou TAG plasmáticos com espécies lipídicas identificadas no gastrocnêmio de animais alimentados com dieta normossódica ou hipossódica por 90 dias.
kITT TAG Plasmático
r P r P
PC -0,665 0,013 0,569 0,034
AGL -0,604 0,029 0,578 0,030
CL 0,637 0,019 -0,323 0,260
PI -0,659 0,014 0,560 0,037
AC 0,533 0,061 -0,257 0,345
TAG -0,181 0,533 0,029 0,923
DAG -0,324 0,280 0,231 0,427
Cer -0,203 0,505 0,503 0,067
SM -0,126 0,681 0,156 0,594
Coeficiente de correlação de Spearman. kITT – teste de tolerância à insulina (n = 13); TAG (triacilglicerol) plasmático (n =14).
51
6. DISCUSSÃO
A restrição alimentar de sódio é utilizada como coadjuvante no
tratamento da HAS, contribuindo para a redução no desenvolvimento das DCV.
No entanto, a despeito de seu efeito hipotensor benéfico, a restrição crônica e
acentuada de sódio altera a sensibilidade periférica à insulina, a qual se vincula
à piora no metabolismo de lipídeos e lipoproteínas. No presente estudo,
avaliou-se o perfil de subespécies lipídicas no músculo esquelético
(gastrocnêmio) de camundongos hiperlipidêmicos submetidos à restrição
intensa de sódio alimentar por 90 dias. A escolha do gastrocnêmio para o
presente estudo deu-se por este apresentar composição de fibras musculares,
predominantemente glicolíticas de contração rápida (76%), semelhantes à
composição das fibras do músculo esquelético total de murinos (Dean et al.,
1998; Armstrong e Phelps, 1984). Ademais, as fibras glicolíticas parecem
desenvolver maior RI frente ao acúmulo lipídico, em comparação às fibras
oxidativas (Levin et al., 2007).
Conforme descrito previamente, em comparação aos animais NS, o
grupo HS apresentou aumento da massa corporal e prejuízo na homeostase de
carboidratos, evidenciada pela maior glicemia e redução da sensibilidade
periférica à insulina. Estes achados vão ao encontro daqueles reportados por
Coelho et al. (2006), Okamoto et al. (2004) e Prada et al. (2000), os quais
demonstraram redução de sensibilidade insulínica, aumento de glicose e
insulina de jejum, massa corporal, adiposidade e percentual de gordura na
carcaça de ratos Wistar tratados com dieta pobre em sal, do desmame até
52
atingirem 3 meses de idade. Naqueles animais, a sinalização insulínica foi
avaliada no tecido hepático e muscular, com prejuízo na fosforilação de IRS-1 e
AKT, além da menor fosforilação de IRS-2 no fígado (Prada et al., 2005).
Observou-se ainda o aumento da fosforilação JNK e IRS-1 em serina (307) o
que contribuiu para a RI no músculo e fígado. Surpreendentemente, no
presente estudo não foi observada alteração na expressão de genes (Irs1, Akt1
e Slc2a4) e conteúdo proteico (AKT total, pAKT e GLUT4) de marcadores
envolvidos na via clássica de sinalização insulínica no gastrocnêmio após 90
dias de tratamento com a restrição dietética de sódio. Vale ressaltar, que a
determinação da expressão desses sinalizadores foi realizada na ausência de
estímulo pela insulina.
A RI promovida pela restrição de cloreto de sódio alimentar vincula-se,
em parte, à ativação do SRAA. Este efeito foi observado após restrição aguda
(7 dias) de sódio dietético em indivíduos saudáveis, com idade de 39 anos.
Observou-se nestes indivíduos maior produção de aldosterona e ANG II, pela
ativação do SRAA, o que se associou à RI avaliada por HOMA-IR (Garg et al.,
2010b). Em ratos Sprague-Dawley e Wistar, a redução de sódio alimentar
proporcionou, igualmente, a ativação do SRAA, nos quais foram observados
aumento de atividade de renina, ANG II e aldosterona plasmáticas (Shao et al.,
2013; Nagata et al., 2010).
Os mecanismos pelos quais o prejuízo à sinalização insulínica clássica
acontece mediante a ativação do SRAA na musculatura esquelética foram
investigados em miotubos L6 e sóleo excisado de ratos Zucker tratados com
ANG II. Observou-se, em ambos os casos, inibição da translocação de GLUT4,
redução da fosforilação de AKT em serina (473) e treonina (308), assim como
53
de glicogênio sintase cinase 3, e, em consequência, diminuição da sua
atividade. Além disso, houve maior ativação do sistema NAD(P)H oxidase, com
estímulo à proteína cinase ativada por mitogênio (MAPK), culminando na maior
geração de ROS. A inibição de óxido nítrico sintase e da NAD(P)H oxidase,
eliminação de radicais livres com miricetina ou tratamento com mimético de
superóxido dismutase (SOD), restaurou a fosforilação de AKT e a translocação
do GLUT4, sugerindo que, no tecido muscular, a RI mediada pela ativação do
SRAA é, em parte, mediada pela geração de ROS (Diamond-Stanic e
Henriksen, 2010; Csibi et al., 2010). Resultados semelhantes foram verificados
por Surapongchai et al. (2017), no sóleo de ratos Sprague-Dawley que
receberam infusão constante de ANG II por bomba osmótica, durante 14 dias.
Apesar de o aumento de massa corporal promovido pela dieta
hipossódica, independente do consumo similar de ração nos dois grupos,
observou-se redução na massa do gastrocnêmio. O mecanismo que levou a
este evento não foi analisado na presente investigação, mas pode estar
relacionado à maior atividade proteolítica muscular, desencadeada pela
ativação do SRAA. A ativação deste sistema, pela infusão de ANG II em ratos
Sprague-Dawley, levou à redução de musculatura esquelética (sóleo e
gastrocnêmio), atribuída ao aumento da proteólise muscular e redução da
concentração circulante e muscular de fator de crescimento semelhante à
insulina (insulin-like growth factor-1; IGF-1) (Brink et al., 2001). Outro estudo
em ratos evidenciou que a infusão de ANG II aumentou a proteólise muscular,
reduziu a concentração circulante e muscular IGF-1, diminuiu a fosforilação da
AKT e ativou a caspase-3 na musculatura esquelética, favorecendo a clivagem
de actina e aumento de apoptose. Tais achados indicam que uma possível
54
inibição na via de sinalização da IGF-1 desempenhe importante função na
proteólise muscular induzida pela ANG II (Song et al., 2005).
A restrição dietética de sódio modulou a expressão dos genes
envolvidos na oxidação de ácidos graxos no músculo esquelético. Prkaa1, o
gene que codifica para AMPK, e Cpt1, que codifica a carnitina palmitoil
transferase 1, foram elevados no grupo de animais alimentados com dieta
hipossódica em comparação aos alimentados com dieta normossódica. A
AMPK é uma proteína que favorece a beta oxidação de ácidos graxos pela
inibição da acetil-CoA carboxilase - ACC (gene Acacb). A redução da atividade
da ACC se associa com redução das concentrações de malonil-CoA no citosol
e promove a ativação da carnitina palmitoil transferase 1(CPT-1), enzima que
transfere ácidos graxos de cadeia longa do citosol dos miócitos para dentro da
mitocôndria, promovendo a oxidação de ácido graxos. Em nosso estudo, o
aumento da expressão de Prkaa1 e Cpt1, genes relacionados com a oxidação
de AGL, pode estar associado ao aumento da captação desses lipídeos pelo
tecido muscular esquelético, visto que o mRNA de Fabp3, que codifica para o
transportador de AGL, aumentou duas vezes nos camundongos que receberam
dieta hipossódica em relação aos tratados com dieta normossódica. Estudos
prévios demonstraram que a dieta hipossódica promove o aumento das
concentrações de TAG circulantes em modelos experimentais de dislipidemia,
camundongo LDLR KO, o mesmo utilizado na presente investigação, além do
camundongo knockout para o receptor apo E (Catanozi et al., 2003). O
aumento da trigliceridemia pela restrição alimentar de sódio também foi
observado em ratos Wistar normolipidêmicos (Catanozi et al., 2001).
55
A composição de lipídeos no tecido muscular esquelético pode ser
influenciada por vários fatores, como envelhecimento, obesidade e outras
condições metabólicas, além da dieta e prática de exercícios físicos. Por outro
lado, os lipídeos musculares podem interferir na homeostase glicêmica, por
modular a sensibilidade insulínica. Sendo assim, avaliou-se a lipidômica do
extrato total do gastrocnêmio e sua associação com a taxa de decaimento de
glicose e lípides plasmáticos nos camundongos submetidos à dieta normo e
hipossódica.
Dentre as espécies de fosfolipídeos identificadas neste estudo, as mais
profusas no gastrocnêmio foram PE e PC, respectivamente. Os PC são os
fosfolipídeos celulares mais abundantes representando 40 a 50% dos
fosfolipídeos totais, enquanto os PE, localizados nas membranas internas da
mitocôndria, são a segunda espécie mais abundante nas células (Yang et al.,
2018). Investigações em humanos e animais tem demonstrado relação entre a
RI e as alterações destes glicerofosfolipídeos, bem como da razão de ambos
(razão PC:PE). Funai et al. (2013; 2016), que submeteram camundongos com
base genética C57BL6/J à dieta rica em gordura, observaram aumento de PC e
PE e prejuízo na sinalização muscular à insulina, sem observar alteração na
razão PC:PE. Em miócitos isolados por biópsia do músculo esquelético de
indivíduos obesos que apresentavam aumento do índice HOMA-IR e insulina
plasmática em comparação a indivíduos magros, houve aumento das
concentrações de PC, da razão PC:PE, piora da sinalização insulínica e
redução da oxidação de AGL (Paran et al., 2015). Em protocolo de exercício
físico aeróbio agudo de 2 h ou durante 12 semanas de treinamento concorrente
que incluiu treinamento aeróbio e de força, observou-se redução da razão
56
PC:PE no músculo vasto lateral (5% e 16%, respectivamente) de indivíduos
normoglicêmicos e sem compensação glicêmica. No protocolo de 12 semanas
de exercício físico houve melhora de 33% da sensibilidade insulínica e, apesar
do aumento de 21% de PC no músculo esquelético, a razão PC:PE mostrou-se
elevada em condições de RI e reduzida com o aumento da sensibilidade à
insulina (Lee et al., 2018). Mediante dieta pobre em sódio, evidenciou-se no
presente estudo, aumento das espécies de PC e da razão PC:PE no extrato
lipídico total do gastrocnêmio, o que se associou com aumento da glicemia de
jejum e piora da sensibilidade insulínica sistêmica. O mecanismo pelo qual a
ativação do SRAA promoveu o aumento de PC nesta musculatura é
desconhecido.
O aumento das espécies de AGL no músculo esquelético dos animais
que foram alimentados com dieta hipossódica em comparação aos que
receberam dieta normossódica, revelado pela análise lipidômica, vão ao
encontro da hipertrigliceridemia verificada nestes animais, e de estudos prévios
de nosso laboratório nos quais foram observados o aumento dos AGL
circulantes em modelo de restrição dietética de sódio em animais
hiperlipidêmicos (Fusco et al., 2017; Catanozi et al., 2003). O aumento de AGL
circulantes se correlaciona com aumento de AGL de cadeia longa no músculo
de camundongos (Zabielski et al., 2014). Em contrapartida, as espécies
lipídicas de TAG, DAG, Cer e SM, descritas amplamente na literatura por sua
relação com a RI, obesidade e diabetes mellitus, não sofreram alterações na
intervenção com restrição de sódio. No sóleo de camundongos, o aumento de
espécies específicas de DAG (16:0/18:1, 16:0/18:2 e 18:1/18:1) e Cer
(d18:1/24:0 e d18:1/24:1), após tratamento com dieta com alto teor de
57
gorduras, se relacionou com a RI (Eum et al., 2020). Das espécies
supracitadas, identificou-se DAG 18:1/18:1 e Cer d18:1/24:0 e d18:1/24:1,
todavia nenhuma delas foi modificada pela dieta hipossódica.
Alterações teciduais de glicerofosfolipídeos também favorecem a
alteração da função mitocondrial no tecido muscular, visto que a mitocôndria
apresenta uma plasticidade extraordinária em resposta a estressores
metabólicos (Heden et al., 2016). O excesso de PC nas membranas, por
exemplo, prejudica a função mitocondrial e reduz a atividade dos complexos I,
II e IV do sistema de transporte de elétrons (Shaikh et al., 2014). No que diz
respeito as PE, investigações avaliando a inibição da sua síntese apresentam
resultados contraditórios. A deleção de CTP: fosfoetanolamina
citidililtransferase que inibiu a síntese de PE no músculo esquelético de
camundongos promoveu acúmulo de DAG, aumento do conteúdo mitocondrial
e da capacidade oxidativa, sem alterar a sinalização insulínica (Selathurai et
al., 2015). Em contrapartida, a inibição da síntese de PE mitocondrial no
diafragma promoveu atrofia robusta da musculatura devido a reduzida atividade
dos complexos I a IV, menor formação de supercomplexos e elevado
vazamento de elétrons (Heden et al., 2019).
As CL, fosfolipídeos tetra acil presentes unicamente nas mitocôndrias e
sintetizadas na membrana interna por cardiolipina sintase ou tafazzina, também
se relacionam diretamente com a função mitocondrial (Mejia e Hatch, 2016). O
aumento do conteúdo de CL na mitocôndria musculatura aumenta a função
respiratória e a atividade dos complexos do sistema de transferência de
elétrons (Das et al., 2015). Estas moléculas se fazem necessárias para
atividade adequada de diversos complexos da cadeia respiratória mitocondrial,
58
além de ancorar eletrostaticamente o citocromo c à membrana interna e
desempenhar papel na sua liberação. A importância da CL se deve à sua
habilidade de interagir com tais proteínas e seu papel na manutenção da
fluidez e estabilidade osmótica da membrana interna (Chicco e Sparagna et al.,
2007). A perda da formação de CL maduras causa desorganização da
estrutura da crista da membrana mitocondrial interna e a dissociação de
complexos, que são imprescindíveis para o transporte de elétrons mais
eficiente (Gogliati et al., 2016). A redução do conteúdo de CL no homogenato
total de tecidos pode refletir a redução de massa mitocondrial (Chicco e
Sparagna et al., 2007). No modelo de restrição dietética de sódio utilizado no
presente estudo, observou-se a redução de 16 das 17 espécies de CL
identificadas na lipidômica global, o que sugere que a dieta hipossódica pode
contribuir para o prejuízo da função mitocondrial no gastrocnêmio.
As espécies de PI identificadas na análise lipidômica foram mais
expressas nos animais que receberam dieta pobre em sódio. A espécie mais
abundante afetada pela dieta hipossódica no gastrocnêmio foi a PI 18:0/20:4.
Esta espécie foi descrita por Eum et al. (2020) como um dos lipídeos
envolvidos na RI no sóleo de camundongos alimentados com dieta enriquecida
com gordura. Além disso, o ácido araquidônico (20:4), um mediador lipídico de
inflamação, ao acumular-se em espécies de glicerofosfolipídeos como PI. PC e
PE foi associado a obesidade em ratos Wistar (Goto-Inoue et al., 2013).
Observou-se a redução de seis espécies de acilcarnitinas de cadeia
longa nos animais que receberam dieta hipossódica em comparação aos que
receberam dieta normossódica. Os mecanismos que levaram a esta redução
merecem investigação futura, visto que em modelos clássicos de RI, animais
59
obesos ou diabéticos que receberam dieta rica em gordura, foram evidenciadas
perturbações no metabolismo mitocondrial, que incluíram baixas taxas da
oxidação completa dos AGL e estresse oxidativo, como resultado do acúmulo
de acilcanitinas na musculatura esquelética (Aguer et al., 2015; Koves et al.,
2008).
A dieta hipossódica, nas condições experimentais analisadas, não
alterou a concentração de moduladores clássicos de sinalização insulínica em
humanos, como TAG, DAG e ceramidas, o que vai ao encontro da manutenção
da expressão e do conteúdo proteico de IRS-1, AKT e GLUT4. O tempo de
administração da dieta hipossódica e o modelo experimental utilizado podem
ter sido limitantes aos resultados obtidos. No entanto, a restrição crônica de
sódio aumentou a razão PC:PE, bem como as espécies de PC, PI e AGL as
quais se correlacionaram com a RI e as concentrações plasmáticas de TAG.
É possível que alterações nos lipídeos musculares, em função da
restrição intensa de sódio, possam ocorrer também em humanos e mais
estudos são necessários para estabelecer o papel das várias espécies lipídicas
na modulação do sinal insulínico. Essas investigações serão importantes para
detalhar a ação da restrição de sódio utilizada no manejo da hipertensão
arterial, especialmente naqueles indivíduos com dislipidemia, obesidade ou
componentes de síndrome metabólica, que seriam mais sensíveis à restrição
de sódio como potencializadora do risco cardiovascular.
60
7. CONCLUSÃO
Em conclusão, a restrição crônica de sódio alimentar (90 dias) promoveu
aumento da massa corporal e prejuízo na sensibilidade insulínica sistêmica.
Estes eventos vincularam-se à elevação da concentração circulante de
triacilglicerol e ao aumento das espécies lipídicas de fosfatidilcolina,
fosfatidilinositol e ácidos graxos livres e redução das cardiolipinas e
acilcarnitinas e maior expressão de genes envolvidos na captação e oxidação
de ácidos graxos (Fabp3, Prkaa1 e Cpt1) no gastrocnêmio de camundongos
LDLR KO.
61
8. ANEXOS
Espécies Dieta Normossódica Dieta Hipossódica P
pPE (p16:0/22:4) 0,4525 ± 0,078 0,3579 ± 0,014 0,523
pPE (p16:0/20:4) 0,8910 ± 0,178 0,7052 ± 0,037 0,898
pPE (p16:0/22:6) 13,2600 ± 2,560 10,9970 ± 0,834 1,000
pPE (p16:0/22:5) 1,9640 ± 0,377 1,7540 ± 0,113 0,609
pPE (p17:0/18:1) 0,1221 ± 0,024 0,1107 ± 0,009 0,523
pPE (p18:0/18:1) 1,0610 ± 0,477 3,2150 ± 0,264 0,011
pPE (p18:0/22:4) 0,5970 ± 0,128 0,4042 ± 0,023 0,443
pPE (p18:0/20:4) 0,7730 ± 0,142 0,6145 ± 0,034 1,000
pPE (p18:0/22:6) 4,4210 ± 0,830 3,9720 ± 0,223 0,443
pPE (p18:0/22:5) 0,7920 ± 0,153 0,7628 ± 0,040 0,371
pPE (p18:1/16:0) 0,8570 ± 0,159 0,6048 ± 0,045 0,250
pPE (p18:1/18:1) 4,0060 ± 0,653 3,6860 ± 0,299 0,701
pPE (p18:1/18:2) 0,2679 ± 0,053 0,2544 ± 0,016 0,523
pPE (p18:1/20:4) 0,0695 ± 0,015 0,0708 ± 0,013 0,523
pPE (p18:1/22:6) 3,1450 ± 0,574 2,7460 ± 0,201 1,000
pPE (p18:1/22:5) 0,3295 ± 0,056 0,3032 ± 0,020 0,701
pPE (p18:2/18:1) 0,4212 ± 0,090 0,3613 ± 0,029 0,609
pPE (p18:2/22:6) 0,6910 ± 0,157 0,5001 ± 0,047 1,000
pPE (p20:0/22:6) 0,1693 ± 0,042 0,1238 ± 0,009 0,898
oPE (o16:0/22:6) 0,9280 ± 0,206 0,6994 ± 0,075 0,898
Anexo A. Espécies de plasmenil e alquil fosfatidiletanolamina identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
62
Espécies Dieta Normossódica Dieta Hipossódica P
PE (16:0/18:1) 0,3197 ± 0,044 0,3529 ± 0,021 0,160
PE (16:0/18:2) 0,7260 ± 0,161 0,5738 ± 0,033 0,898
PE (16:0/20:3) 0,1343 ± 0,031 0,0822 ± 0,005 0,443
PE (16:0/22:4) 1,1120 ± 0,220 0,7312 ± 0,026 0,250
PE (16:0/20:4) 1,4250 ± 0,283 1,0725 ± 0,060 0,701
PE (16:0/22:6) 12,1900 ± 2,000 10,7250 ± 0,412 0,371
PE (16:0/22:5) 1,9190 ± 0,334 1,4034 ± 0,058 0,443
PE (16:1/18:0) 0,2880 ± 0,062 0,1657 ± 0,010 0,021
PE (16:1/22:6) 0,5932 ± 0,090 0,5407 ± 0,044 1,000
PE (17:0/22:6) 0,4266 ± 0,076 0,3741 ± 0,038 0,798
PE (18:0/18:1) 0,5670 ± 0,567 0,4841 ± 0,484 0,898
PE (18:0/18:2) 1,3670 ± 0,302 1,0578 ± 0,063 0,898
PE (18:0/20:3) 0,1893 ± 0,040 0,1525 ± 0,013 0,898
PE (18:0/22:4) 0,5930 ± 0,112 0,4338 ± 0,020 0,701
PE (18:0/20:4) 3,7250 ± 0,728 2,9470 ± 0,218 0,798
PE (18:0/22:6) 22,1500 ± 3,420 20,3400 ± 1,290 1,000
PE (18:0/22:5) 3,9580 ± 0,580 3,1560 ± 0,131 0,798
PE (18:1/18:1) 0,3297 ± 0,067 0,3229 ± 0,016 0,250
PE (18:1/18:2) 0,5380 ± 0,132 0,3905 ± 0,027 1,000
PE (18:1/24:0) 0,1069 ± 0,021 0,0844 ± 0,007 0,701
PE (18:1/20:4) 1,9620 ± 0,359 1,6943 ± 0,073 0,609
PE (18:1/22:6) 7,1200 ± 1,250 5,5580 ± 0,281 0,798
PE (18:1/22:5) 0,6353 ± 0,092 0,4649 ± 0,033 0,201
PE (18:2/18:2) 0,1921 ± 0,050 0,1349 ± 0,007 0,798
PE (18:2/20:4) 3,5500 ± 0,554 3,2010 ± 0,407 0,898
PE (18:2/22:6) 2,4410 ± 0,438 2,0360 ± 0,102 1,000
PE (18:2/22:5) 0,1080 ± 0,019 0,1007 ± 0,006 0,443
PE (19:0/22:6) 0,1407 ± 0,021 0,1495 ± 0,011 0,443
PE (20:1/22:6) 0,2010 ± 0,037 0,1647 ± 0,011 1,000
PE (22:4/22:6) 1,3650 ± 0,221 0,8639 ± 0,073 0,125
PE (20:4/22:6) 0,1864 ± 0,026 0,1387 ± 0,011 0,201
PE (22:5/22:6) 0,1619 ± 0,022 0,1507 ± 0,016 0,798
pPE (p16:0/18:1) 0,5039 ± 0,067 0,5838 ± 0,045 0,160
Anexo B. Espécies de fosfatidiletanolamina identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
63
Espécies Dieta Normossódica Dieta Hipossódica P
PG (16:0/18:1) 0,3504 0,063 0,3701 0,018 0,307
PG (16:0/18:2) 0,0608 0,013 0,0563 0,002 0,609
PG (16:0/20:4) 0,0173 0,004 0,0177 0,002 0,609
PG (16:1/18:1) 0,0056 0,001 0,0068 0,000 0,097
PG (18:0/18:1) 0,3822 0,066 0,3593 0,022 0,701
PG (18:0/18:2) 0,3593 0,359 0,2462 0,246 0,007
PG (18:1/18:2) 0,0602 0,014 0,0458 0,005 0,898
Anexo C. Espécies de e fosfatidilglicerinas identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Espécies Dieta
Normossódica Dieta Hipossódica P
SM (d18:0/16:0) 0,0334 ± 0,004 0,0372 ± 0,004 0,701
SM (d18:1/16:0) 0,3553 ± 0,047 0,4070 ± 0,045 0,443
SM (d18:1/18:0) 1,6510 ± 0,190 1,8780 ± 0,136 0,443
SM (d18:1/20:0) 0,2327 ± 0,035 0,2542 ± 0,026 0,701
SM (d18:1/22:0) 0,6710 ± 0,115 0,6473 ± 0,063 0,798
SM (d18:1/22:1) 0,0656 ± 0,010 0,0705 ± 0,007 0,523
SM (d18:1/23:0) 0,1605 ± 0,022 0,1716 ± 0,017 0,609
SM (d18:1/24:0) 0,8160 ± 0,132 0,8292 ± 0,088 0,701
SM (d18:1/24:1) 1,5650 ± 0,265 1,5210 ± 0,161 0,898
SM (d18:1/24:2) 0,2057 ± 0,034 0,2176 ± 0,028 0,701
Anexo D. Espécies de esfingomielinas identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
64
Espécies Dieta
Normossódica Dieta Hipossódica P
TAG (12:0/16:1/18:2) 0,0853 ± 0,026 0,0773 ± 0,013 1,000
TAG (14:0/16:0/16:1) 0,5100 ± 0,220 0,3323 ± 0,044 0,798
TAG (14:0/16:0/18:1) 0,6400 ± 0,319 0,4380 ± 0,122 0,898
TAG (14:0/16:1/18:1) 0,5600 ± 0,221 0,4697 ± 0,066 0,609
TAG (14:0/16:1/16:1) 0,7830 ± 0,264 0,7222 ± 0,085 0,443
TAG (14:0/18:1/18:1) 1,6540 ± 0,751 1,3730 ± 0,382 0,898
TAG (14:0/18:2/18:2) 0,8110 ± 0,212 0,8530 ± 0,130 0,943
TAG (14:1/16:0/16:1) 0,0678 ± 0,032 0,0549 ± 0,017 1,000
TAG (14:1/16:1/18:1) 0,4770 ± 0,166 0,5222 ± 0,060 0,371
TAG (14:1/16:1/18:2) 0,5140 ± 0,133 0,5978 ± 0,076 0,609
TAG (14:1/16:1/16:1) 0,2791 ± 0,079 0,3116 ± 0,044 0,523
TAG (14:1/18:2/18:2) 0,5950 ± 0,144 0,8210 ± 0,105 0,307
TAG (15:0/16:1/18:1) 0,0633 ± 0,019 0,0578 ± 0,007 0,898
TAG (15:0/16:1/18:2) 0,1405 ± 0,042 0,1273 ± 0,013 0,898
TAG (15:0/18:1/18:2) 0,3560 ± 0,103 0,3317 ± 0,043 0,701
TAG (15:0/18:1/18:1) 0,1236 ± 0,052 0,0973 ± 0,024 0,701
TAG (15:0/18:2/18:2) 0,0292 ± 0,006 0,0319 ± 0,006 1,000
TAG (16:0/16:1/17:1) 0,2317 ± 0,075 0,1900 ± 0,023 0,701
TAG (16:0/16:1/18:1) 6,5800 ± 2,120 6,2750 ± 0,833 0,609
TAG (16:0/16:1/22:6) 0,1707 ± 0,046 0,2000 ± 0,030 0,701
TAG (16:0/16:1/16:1) 2,3410 ± 0,748 2,2290 ± 0,247 0,523
TAG (16:0/17:1/18:1) 0,3830 ± 0,113 0,3434 ± 0,044 0,701
TAG (16:0/17:1/18:2) 0,1384 ± 0,034 0,1296 ± 0,014 0,898
TAG (16:0/18:0/18:1) 0,9270 ± 0,390 0,5511 ± 0,083 0,898
TAG (16:0/18:0/18:2) 2,3900 ± 1,010 2,0870 ± 0,531 0,701
TAG (16:0/18:1/18:2) 2,3900 ± 1,010 2,0870 ± 0,531 0,609
TAG (16:0/18:1/19:1) 0,1402 ± 0,060 0,1066 ± 0,022 0,701
TAG (16:0/18:1/20:1) 1,1480 ± 0,460 0,9530 ± 0,238 0,798
TAG (16:0/18:1/22:6) 0,1592 ± 0,047 0,1951 ± 0,032 0,443
TAG (16:0/18:1/18:1) 6,5300 ± 1,730 6,3190 ± 0,926 1,000
TAG (16:0/18:2/22:4) 0,1037 ± 0,041 0,1041 ± 0,025 0,609
TAG (16:0/18:2/22:6) 0,1037 ± 0,041 0,1041 ± 0,025 0,371
TAG (16:0/18:2/18:2) 1,1600 ± 0,474 1,1610 ± 0,303 0,701
Anexo E. Espécies de triacilglicerol (TAG) identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7).
65
Espécies Dieta
Normossódica Dieta Hipossódica P
TAG (16:0/16:0/16:1) 1,7990 ± 0,756 1,2650 ± 0,171 0,798
TAG (16:0/16:0/18:1) 4,1000 ± 1,670 2,7890 ± 0,400 1,000
TAG (16:0/16:0/16:0) 0,3030 ± 0,107 0,3360 ± 0,049 0,371
TAG (16:1/17:1/18:2) 0,2583 ± 0,070 0,2644 ± 0,034 0,898
TAG (16:1/18:1/18:2) 10,4100 ± 2,700 11,0600 ± 1,170 0,609
TAG (16:1/18:1/18:1) 3,1140 ± 0,778 3,2400 ± 0,393 0,609
TAG (16:1/18:2/18:3) 0,6790 ± 0,173 0,9630 ± 0,139 0,307
TAG (16:1/18:2/22:5) 0,0290 ± 0,011 0,0420 ± 0,011 0,443
TAG (16:1/18:2/18:2) 5,3000 ± 1,270 6,4130 ± 0,853 0,523
TAG (16:1/16:1/17:1) 0,0651 ± 0,017 0,0712 ± 0,011 0,798
TAG (16:1/16:1/18:1) 7,3700 ± 1,830 7,7770 ± 0,829 0,701
TAG (16:1/16:1/18:2) 3,6020 ± 0,840 4,4090 ± 0,515 0,609
TAG (16:1/16:1/18:3) 0,1419 ± 0,037 0,1797 ± 0,029 0,609
TAG (16:1/16:1/20:4) 0,4200 ± 0,102 0,5917 ± 0,082 0,201
TAG (16:1/16:1/16:1) 1,9790 ± 0,507 2,3070 ± 0,283 0,609
TAG (17:0/18:1/18:2) 0,1100 ± 0,044 0,0905 ± 0,021 0,701
TAG (17:1/18:1/18:2) 0,3428 ± 0,095 0,3364 ± 0,042 0,898
TAG (17:1/18:1/18:1) 0,3790 ± 0,104 0,3543 ± 0,043 0,701
TAG (17:1/18:2/18:2) 0,1410 ± 0,038 0,1464 ± 0,019 0,898
TAG (18:0/18:1/18:2) 0,0472 ± 0,012 0,0463 ± 0,007 1,000
TAG (18:0/18:1/18:1) 1,0160 ± 0,309 0,8320 ± 0,114 0,898
TAG (18:1/18:2/18:3) 0,8150 ± 0,199 0,9990 ± 0,125 0,250
TAG (18:1/18:2/19:1) 0,1143 ± 0,034 0,0944 ± 0,013 0,898
TAG (18:1/18:2/20:1) 0,4070 ± 0,137 0,3487 ± 0,052 0,798
TAG (18:1/18:2/20:2) 0,2163 ± 0,067 0,2460 ± 0,035 0,443
TAG (18:1/18:2/20:3) 0,2421 ± 0,074 0,2247 ± 0,036 0,798
TAG (18:1/18:2/22:4) 0,1231 ± 0,038 0,1287 ± 0,022 0,701
TAG (18:1/18:2/20:4) 0,4620 ± 0,127 0,5369 ± 0,076 0,701
TAG (18:1/18:2/22:6) 0,1084 ± 0,028 0,1561 ± 0,026 0,443
TAG (18:1/18:2/18:2) 5,9300 ± 1,500 6,3380 ± 0,708 0,523
TAG (18:1/18:1/17:0) 0,2068 ± 0,061 0,1769 ± 0,024 0,898
TAG (18:1/18:1/18:2) 6,4600 ± 1,570 7,0610 ± 0,836 0,701
TAG (18:1/18:1/20:1) 0,3840 ± 0,114 0,3272 ± 0,042 1,000
TAG (18:1/18:1/20:2) 0,1219 ± 0,044 0,0615 ± 0,016 0,443
Anexo E continuação. Espécies de triacilgliceróis (TAG) identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana
66
e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Espécies Dieta
Normossódica Dieta Hipossódica P
TAG (18:1/18:1/20:4) 0,2898 ± 0,075 0,3327 ± 0,047 0,523
TAG (18:1/18:1/22:5) 0,1038 ± 0,032 0,1099 ± 0,020 0,701
TAG (18:2/18:2/18:3) 0,8600 ± 0,232 1,2130 ± 0,181 0,201
TAG (18:2/18:2/20:1) 0,1462 ± 0,049 0,0883 ± 0,008 0,701
TAG (18:2/18:2/20:4) 0,1726 ± 0,044 0,2353 ± 0,035 0,523
TAG (18:2/18:2/22:6) 0,0538 ± 0,015 0,0921 ± 0,017 0,160
TAG (18:2/18:2/22:5) 0,0258 ± 0,009 0,0331 ± 0,006 0,250
TAG (18:2/18:2/18:2) 0,0258 ± 0,009 0,0331 ± 0,006 0,701
DAG (16:1/18:1) 2,9920 ± 0,339 3,5780 ± 0,366 0,250
DAG (18:2/18:2) 1,2210 ± 0,259 1,3850 ± 0,216 0,609
DAG (18:1/18:2) 4,0620 ± 0,524 4,5460 ± 0,490 0,371
DAG (18:1/18:1) 1,9750 ± 0,223 2,0650 ± 0,207 0,701
Anexo F. Espécies de trigliceróis e diacilgliceróis identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
Espécies Dieta
Normossódica Dieta Hipossódica P
Q-9 0,1789 ± 0,024 0,1950 ± 0,016 0,443
Anexo G. Espécie de coenzima Q-9 identificada no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
67
Espécies Dieta
Normossódica
Dieta
Hipossódica P
1G-Cer (d18:0/20:1-OH) 0,0302 ± 0,0045 0,0351 ± 0,0036 0,523
1G-cer (d18:0/22:0-OH) 0,0018 ± 0,0005 0,0014 ± 0,0003 0,307
1G-cer (d18:0/22:1-OH) 0,1722 ± 0,0270 0,1832 ± 0,0220 0,701
1G-cer (d18:0/23:1-OH) 0,0113 ± 0,0019 0,0112 ± 0,0012 0,798
1G-Cer (d18:0/24:0-OH) 0,0125 ± 0,0019 0,0147 ± 0,0018 0,371
1G-cer (d18:0/24:1-OH) 0,2869 ± 0,0433 0,3154 ± 0,0368 0,609
1G-cer (d18:0/24:2-OH) 0,0218 ± 0,0037 0,0235 ± 0,0027 0,609
1G-cer (d18:1/22:0-OH) 0,0018 ± 0,0005 0,0014 ± 0,0003 0,307
1G-cer (d18:1/23:0-OH) 0,0035 ± 0,0006 0,0038 ± 0,0005 0,609
1G-cer (d18:0/24:0) 0,0119 ± 0,0022 0,0123 ± 0,0017 0,701
1G-Cer (d18:1/20:0) 0,0100 ± 0,0017 0,0116 ± 0,0015 0,701
1G-cer (d18:1/22:0) 0,0342 ± 0,0058 0,0403 ± 0,0057 0,523
1G-cer (d18:1/23:0) 0,0132 ± 0,0022 0,0149 ± 0,0022 0,523
1G-cer (d18:1/24:0) 0,1972 ± 0,0328 0,2063 ± 0,0302 0,701
1G-cer (d18:1/24:1) 0,1060 ± 0,0175 0,1181 ± 0,0162 0,523
1G-Cer (d18:1/24:2) 0,0097 ± 0,0017 0,0107 ± 0,0015 0,798
Sulfatido Cer (d18:1/18:0) 0,0035 ± 0,0005 0,0046 ± 0,0006 0,125
Sulfatido Cer (d18:1/20:0) 0,0022 ± 0,0003 0,0034 ± 0,0005 0,097
Sulfatido Cer (d18:1/22:0) 0,0066 ± 0,0014 0,0069 ± 0,0008 0,701
Sulfatido Cer (d18:1/23:0) 0,0024 ± 0,0005 0,0025 ± 0,0002 0,443
Sulfatido Cer (d18:1/24:0) 0,0311 ± 0,0051 0,0370 ± 0,0053 0,701
Sulfatido Cer (d18:1/24:1) 0,0369 ± 0,0072 0,0383 ± 0,0051 0,798
Sulfatido Cer (d18:2/24:1) 0,0048 ± 0,0011 0,0056 ± 0,0008 0,307
Sulfatido Cer (d18:1/22:0-OH) 0,0042 ± 0,0008 0,0050 ± 0,0006 0,201
Sulfatido Cer (d18:1/24:0-OH) 0,0063 ± 0,0012 0,0070 ± 0,0007 0,250
Cer (d18:1/18:0) 0,2581 ± 0,0403 0,2621 ± 0,0156 0,443
Cer (d18:1/22:0) 0,0107 ± 0,0018 0,0115 ± 0,0007 0,250
Cer (d18:1/24:0) 0,0118 ± 0,0020 0,0131 ± 0,0010 0,160
Cer (d18:1/24:1) 0,0288 ± 0,0049 0,0272 ± 0,0022 0,609
Cer (d18:1/24:2) 0,0060 ± 0,0012 0,0058 ± 0,0007 0,201
Anexo H. Espécies de monoglicosil (1G) ceramidas, Sulfatido ceramidas e ceramidas identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO dos alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.
68
69
Anexo I. Documento de aprovação do estudo pela Comissão de Étida no Uso de Animais.
70
9. REFERÊNCIAS
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