UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGDEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICADISCIPLINA DE LABORATRIO BSICO II
RELATRIO DE AULA PRTICA
Cintica Enzimtica da Enzima Invertase
Acadmicos: Alex Toshio KassadaRA: 60772
Guilherme Chaves Souto BrancoRA: 60521
Letcia Maria SgobiRA: 85462
Paulo Otvio FiorotoRA: 60903
Professora:Lucinia Aparecida Cestaria Tonon
Maring, 12 de novembro de 20131. RESUMODe acordo com a proposta inicial do experimento, que a determinao da inibio da enzima invertase por efeito de concentrao de substrato, por efeito do sulfato de cobre e frutose, o experimento foi realizado atravs do mtodo do DNS, com leitura da absorbncia a 600 nm no espectrofotmetro, para dez diferentes valores de concentrao de inibidor e reagentes mantidos em temperatura ambiente, a fim de comparar os dez resultados obtidos para cada inibio, e determinar qual a velocidade mxima de reao (Vmx) e a constante Michaelis Menten (Km) durante a atividade dos inibidores. A partir do experimento realizado possvel concluir que como o mesmo foi feito em uma temperatura diferente da considerada ideal para a melhor atividade da enzima. A partir disto, pode-se afirmar que os perfis inibidores das substncias utilizadas se tornam equivocadas, sendo necessria a repetio do experimento, desta vez na temperatura favorvel, de 55C. Os erros podem ser resultado de manipulao inadequada e de equipamentos descalibrados.2. INTRODUOA invertase uma enzima utilizada na hidrlise de sacarose e xarope de glicose e frutose, o qual muito utilizado na indstria alimentcia. Por consumir menos energia do que os mtodos tradicionais de hidrlise cida com cido sulfrico e gerar um produto de melhor qualidade so considerados extremamente vantajoso.Este relatrio tem como base o estudo da cintica enzimtica da enzima invertase e os efeitos causados por inibidores sobre a reao da mesma.3. FUNDAMENTAO TERICACintica EnzimticaSegundo Pinto (2009), cintica enzimtica o estudo das reaes qumicas que so catalisadas por enzimas, e implica na determinao das velocidades de transformao dos reagentes em produtos, assim como no entendimento da influncia do meio reacional, envolvendo concentrao de reagentes e produtos, alm de fatores termodinmicos como temperatura e presso sobre as velocidades dessas transformaes. O conhecimento dessas propriedades de extrema importncia para a compreenso das transformaes que ocorrem no interior das clulas que esto envolvidas nos processos fermentativos e nos reatores enzimticos.Influncia do SubstratoUm dos fatores que afetam a velocidade de uma reao catalisada por enzimas a concentrao do substrato presente. A concentrao varia durante a ocorrncia da reao, visto que ele convertido em produto durante o processo. Sendo assim, a velocidade da reao varia em funo da quantidade de substrato ainda no convertido. Quanto maior a quantidade de substrato, maior a velocidade da enzima e a velocidade da reao atinge seu mximo quando a soluo est saturada de substrato (CSAR).Equao de Michaelis-MentenDe acordo com Moyes e Schulte (2010), a relao entre a concentrao de substrato e a velocidade foi descrita matematicamente pela primeira vez pelos bioqumicos Leonar Michaelis e Maud Menten como uma hiprbole retangular, sendo que ela leva em contra o valor da constante de Michaelis-Menten, chamada de Km, que a concentrao necessria de substrato para que se obtenha uma velocidade inicial que metade da velocidade mxima possvel. A constante Km indica a afinidade da enzima por um substrato. Um Km baixo indica alta afinidade, e o contrrio tambm vlido.A equao de Michaelis-Menten leva em conta, alm da constante Km, a concentrao de substrato ([S]) e a velocidade mxima de reao (Vmax), sendo ela descrita desta maneira:
Inibio EnzimticaExistem substncias que se associam a enzimas e alteram sua atividade enzimtica de uma forma que influencia a ligao do substrato. Esse o caso dos inibidores, que so substncias que reduzem a atividade de uma enzima. Segundo Voet (2001), inibio pode ser de forma competitiva, na qual uma substncia compete com o substrato pela ligao ao stio ativo da enzima, incompetitiva, na qual o inibidor liga-se ao complexo enzima-substrato, mista, em que o inibidor se liga enzima e ao complexo enzima-substrato, por produto, em que o produto que se acumula durante o curso da reao compete com o substrato pela ligao ao stio-ativo, e por contato, em que a as clulas encostam umas nas outras e impedem a proliferao.4. MATERIAIS E MTODOSAgitador Vortex;Espectrofotmetro;Soluo de invertase [0,1 g/L];
gua destilada;Estante para tubo de ensaio;Soluo de sacarose 5% p/v a pH 4,5;
Balo volumtrico;Pipeta;
Banho-maria;Ponteiras;Soluo DNS;
Becker;Reatores batelada;Sulfato de cobre [0,63mM];
Cronmetro;Rolhas;Termmetro de mercrio;
Dispensete;Soluo de frutose [22mM];Tubos de ensaio.
4.1. Metodologia da inibio enzimtica pelo efeito da concentrao de substrato Primeiramente preparou-se vrias concentraes de sacarose de acordo com o quadro 01.Quadro 01. Reagentes e quantidades para o estudo do efeito da concentrao de substrato.Tubos12345678910
Sacarose (0,5M) (mL)00,20,40,60,811,31,51,72
gua destilada (mL)98,88,68,48,287,77,57,37
Aps a preparao dos tubos, estes foram agitados em um agitador. Em seguida foi feito a diluio da enzima na proporo 1:10, em um balo volumtrico de 25 mL colocou-se 2,5mL de enzima (concentrao de 0,1g/L), e completou o volume com gua destilada. Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com maior exatido possvel, para isso, foi adicionado 1mL de enzima (0,01g/L) em cada um dos tubos em intervalos de 30 segundos. Agitou-se e deixou-se reagir temperatura ambiente por dez minutos (anotando a temperatura). Os tubos foram levados a um banho contendo gua em ebulio e deixado por 10 minutos, a fim de inativar a enzima. Tamparam-se os tubos para minimizar a evaporao. O teor de glicose e frutose, nas amostras, foi determinado pelo mtodo de dosagem do DNS Berkeley-modificado: Aps todas as amostras de solues nos tubos de ensaio terem passado pelo banho em gua fervente e sido devidamente resfriadas, pipetou-se 0,5 mL da soluo de cada tubo de ensaio e transferiu-se para novos tubos de ensaio previamente numerados. Com auxlio de um dispensete, adicionou-se 2,5 mL de soluo de DNS em cada tubo, os quais foram tampados com rolhas e levados para um banho em gua fervente por dez minutos. Aps o banho, os tubos foram colocados em banho com gua a temperatura ambiente durante cinco minutos, adicionando em seguida, com auxlio do dispensete, 3 mL de gua destilada em cada tubo de ensaio, agitando-os rapidamente em agitador Vortex, com posterior leitura no espectrofotmetro da absorbncia a 600 nm, sendo este zerado previamente com o branco.
4.2. Metodologia da inibio enzimtica pelo sulfato de cobre e frutosePrimeiramente numeraram-se os 10 tubos de ensaio para cada tipo de inibidor e em seguida adicionou-se os reagentes segundo o quadro 02 e 03.Quadro 02. Efeito da inibio por sulfato de cobre na atividade da enzima.Tubos12345678910
Sacarose (0,5M) (mL)00,20,40,60,811,31,51,72
Sulfato de cobre (0,63 Mm) (mL)2222222222
gua destilada (mL)76,86,66,46,265,75,55,35
Quadro 03. Efeito da inibio da frutose na atividade da enzima.Tubos12345678910
Sacarose (0,5M) (mL)00,20,40,60,811,31,51,72
Frutose (22mM) (mL)1111111111
gua destilada (mL)87,87,67,47,276,76,56,36
Aps a preparao dos tubos, estes foram agitados em um agitador. Em seguida foi feito a diluio da enzima na proporo 1:10, em um balo volumtrico de 25 mL colocou-se 2,5mL de enzima (concentrao de 0,1g/L), e complete com gua destilada. Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com maior exatido possvel, para isso, foi adicionado 1mL de enzima (0,01g/L) em cada um dos tubos em intervalos de 30 segundos. Agitou-se e deixou-se reagir temperatura ambiente por dez minutos (anotando a temperatura). Os tubos foram levados a um banho contendo gua em ebulio e deixado por 10 minutos, a fim de inativar a enzima. Tamparam-se os tubos para minimizar a evaporao. O teor de glicose e frutose, nas amostras, foi determinado pelo mtodo de dosagem do DNS Berkeley-modificado: Aps todas as amostras de solues nos tubos de ensaio terem passado pelo banho em gua fervente e sido devidamente resfriadas, pipetou-se 0,5 mL da soluo de cada tubo de ensaio e transferiu-se para novos tubos de ensaio previamente numerados. Com auxlio de um dispensete, adicionou-se 2,5 mL de soluo de DNS em cada tubo, os quais foram tampados com rolhas e levados para um banho em gua fervente por dez minutos. Aps o banho, os tubos foram colocados em banho com gua a temperatura ambiente durante cinco minutos, adicionando em seguida, com auxlio do dispensete, 3 mL de gua destilada em cada tubo de ensaio, agitando-os rapidamente em agitador Vortex, com posterior leitura no espectrofotmetro da absorbncia a 600 nm, sendo este zerado previamente com o branco.5. RESULTADOS5.1. Efeito da Concentrao de SubstratoOs dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio de acordo com a concentrao inicial de sacarose nos tubos esto dispostos na tabela 1.Tabela 1 Leitura da absorbncia das amostras.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)Absorbncia
Branco00
111,11-0,012
222,220,007
333,330,008
444,440,009
555,550,026
672,220,027
783,330,037
894,440,072
9111,110,081
Utilizando-se a curva padro da glicose + frutose, pelo mtodo do DNS, onde a curva dada pela equao y = 0,5345x 0,0261, sendo do tipo y = a b.x. Ento, so obtidos os valores do coeficiente linear da reta obtida (a) e coeficiente angular da reta ajustada (b), que so, -0,0261 e 0,5345, respectivamente. A partir dos valores destes coeficientes e das absorbncias contidas na tabela 1, podemos calcular a quantidade de glicose + frutose presente (mg/mL), atravs da seguinte equao.
Onde: MG = quantidade de glicose + frutose formada na reao (mg/mL)d = diluio da amostra (1/6)Para cada valor de absorbncia de cada amostra, ou seja, de y, obtm-se um valor de MG, como pode ser visto na tabela 2. A partir dos dados de quantidades em mg/mL de glicose + frutose, constantes na tabela 2, calculou-se, atravs da equao abaixo, o nmero de moles de glicose + frutose presentes na amostra.
Onde: MG = quantidade de glicose + frutose formada na reao (mg/mL)MM = massa molar da glicose + frutose (0,360 mg/mol)Vr = volume de reao (10 mL).Os nmeros de moles de glicose + frutose calculados esto dispostos na tabela 2.A partir do nmero de micromoles de glicose + frutose gerado durante 10 minutos de reao, calculou-se a velocidade da mesma, dividindo-se essa quantidade de micromoles por 10, para se obter a velocidade em micromoles de glicose + frutose por minuto. Os dados esto dispostos, tambm, na tabela 2.Tabela 2 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)G+F presente (mg/mL) micromoles G+F (moles) Velocidade de reao (moles/min)
Branco0000
111,110,1584,3970,440
222,220,37210,3211,032
333,330,38310,6331,063
444,440,39410,9451,094
555,550,58516,2461,625
672,220,59616,5581,656
783,330,70819,6761,968
894,440,07230,5893,059
9111,110,08133,3963,340
A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V) da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos esto dispostos na tabela 3.Tabela 3 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.Tubo1/[S] (1/mM)1/V (min/micromoles)
Branco--
10,0902,274
20,0450,969
30,0300,940
40,0230,914
50,0180,616
60,0140,604
70,0120,508
80,0110,327
90,0090,299
A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de reao, dispostos na tabela 2, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de Michaelis-Menten), constante na figura 1. A partir dos dados constantes na tabela 3, elaborou-se o grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 2.
Figura 1 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da concentrao de substrato, obtidos neste experimento.
Figura 2 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da concentrao de substrato, obtidos neste experimento.A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 2, obtemos:eA partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a 4,957 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis Menten (Km) equivalente a 111,358.5.2. Inibio da invertase por sulfato de cobre e frutose5.2.1 Inibio da invertase por sulfato de cobreOs dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio, contendo soluo de sacarose e sulfato de cobre esto dispostos na tabela 4.Tabela 4 Leitura da absorbncia das amostras.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)Absorbncia
Branco00
111,11-0,005
222,220,009
333,330
444,440,007
555,550,011
672,220,008
783,330,008
894,440,015
9111,110,009
Seguindo a mesma metodologia de clculos utilizados no estudo do efeito da concentrao de substrato, calcularam-se os valores de glicose + frutose presente (mg/mL), micromoles de glicose + frutose presente (moles) e velocidade de reao (moles/min), esto dispostos na tabela 5.Tabela 5 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)G+F presente (mg/mL) micromoles G+F (moles) Velocidade de reao (moles/min)
Branco0000
111,110,2376,5790,658
222,220,39410,9451,094
333,330,2938,1380,814
444,440,37210,3211,032
555,550,41611,5681,157
672,220,38310,6331,063
783,330,38310,6331,063
894,440,46112,8161,282
9111,110,39410,9451,094
A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V) da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos esto dispostos na tabela 6.Tabela 6 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.Tubo1/[S] (1/mM)1/V (min/micromoles)
Branco--
10,0901,520
20,0450,914
30,0301,229
40,0230,969
50,0180,864
60,0140,940
70,0120,940
80,0110,780
90,0090,914
A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de reao, dispostos na tabela 5, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de Michaelis-Menten), constante na figura 3. A partir dos dados constantes na tabela 6, elaborou-se o grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 4.
Figura 3 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio por sulfato de cobre, obtidos neste experimento.
Figura 4 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio por sulfato de cobre, obtidos neste experimento.A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 4, obtemos:eA partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a 1,249 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis Menten (Km) equivalente a 9,276.5.2.2 Inibio da invertase por frutoseOs dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio, contendo soluo de sacarose e frutose, esto dispostos na tabela 7.Tabela 7 Leitura da absorbncia das amostras.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)Absorbncia
Branco00
111,110,025
222,220,041
333,330,028
444,440,059
555,550,095
672,220,11
783,330,14
894,440,139
9111,110,111
Seguindo a mesma metodologia de clculos utilizados no estudo do efeito da concentrao de substrato, calcularam-se os valores de glicose + frutose presente (mg/mL), micromoles de glicose + frutose presente (moles) e velocidade de reao (moles/min), esto dispostos na tabela 8.Tabela 8 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.TuboConcentrao inicial de sacarose (mM)G+F presente (mg/mL) micromoles G+F (moles) Velocidade de reao (moles/min)
Branco0000
111,110,57415,9341,593
222,220,75320,9232,092
333,330,60716,8691,687
444,440,95526,5362,654
555,551,35937,7613,776
672,221,52842,4384,244
783,331,86551,7935,179
894,441,85351,4815,148
9111,111,53942,7504,275
A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V) da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos esto dispostos na tabela 9.Tabela 9 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.Tubo1/[S] (1/mM)1/V (min/micromoles)
Branco
10,0900,628
20,0450,478
30,0300,593
40,0230,377
50,0180,265
60,0140,236
70,0120,193
80,0110,194
90,0090,234
A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de reao, dispostos na tabela 8, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de Michaelis-Menten), constante na figura 5. A partir dos dados constantes na tabela 9, elaborou-se o grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 6.
Figura 5 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio por frutose, obtidos neste experimento.
Figura 6 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio por frutose, obtidos neste experimento.A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 4, obtemos:eA partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a 4,953 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis Menten (Km) equivalente a 27,233.6. DISCUSSOCom base no prvio conhecimento de que um maior valor de Km indica uma menor afinidade da enzima com o substrato, e quanto maior o valor de Vmx, mais rpido ocorrer a reao desejada, tem-se a discusso dos resultados obtidos nas diferentes etapas do experimento e metodologia utilizada a seguir.A afirmao do perfil inibidor dos compostos utilizados no experimento (sulfato de cobre e frutose) pode ser equivocada, pois o mesmo foi alvo de fontes de erro que interferiram no resultado, principalmente nos dados de velocidade mxima de reao, pois como a mesma foi realizada a temperatura ambiente (25C), tem-se que a velocidade foi diretamente prejudicada, pois a temperatura tima para a enzima seria na faixa de 55C, como visto em experimentos anteriores. Alm dos demais erros experimentais, como por exemplo, no momento da pipetagem, erro na leitura de absorbncia, falta de preciso na cronometragem, entre outros.Com isso, e com os resultados de Km e Vmx encontrados, tem-se que para este experimento, nas condies descritas anteriormente, a concentrao de substrato provoca uma menor afinidade entre enzima e substrato, pois obteve o maior valor da constante de Michaelis Menten quando comparado aos demais. De acordo com o estudo de Dias et al (2009), os valores para a enzima invertase de Km e Vmx so respectivamente 16,5 mM e 1181 M/min. E a partir destes dados tem-se que o sulfato de cobre se mostrou um inibidor incompetitivo, pois diminuiu o valor de Km e Vmx, o que indica que ele se ligava somente quando se tinha a formao do complexo enzima-substrato, impedindo a reao de catlise.J no caso da frutose, a mesma demonstrou um perfil de inibidor competitivo, pois teve um aumento no valor de Km (27,233 mM), o que significa dizer que a frutose ir competir com as molculas do substrato.7. CONCLUSESA partir do experimento realizado possvel concluir que como o mesmo foi feito em uma temperatura diferente da considerada ideal para a melhor atividade da enzima. Portanto, concluses sobre o perfil inibidor das substncias utilizadas se tornam equivocadas, sendo necessria a repetio do experimento, desta vez na temperatura favorvel, de 55C. 8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS[1]. Apostila de Laboratrio Bsico II 2013. Universidade Estadual de Maring. Departamento de Engenharia Qumica. Engenharia de Alimentos. Maring Paran.
[2]. CSAR, Paulo. Introduo Cintica Qumica. In: Portal de Estudos em Qumica. Disponvel em: . Acesso em: 04 de novembro de 2013.[3]. DIAS, A.; SANTOS, M.; BRANCO, M. Caracterizao cintica da enzima invertase. Brasil, 2009. 16p.[4]. MOYES, C. D. & SCHULTE, P. M. Princpios de Fisiologia Animal. Disponvel em: < http://books.google.com.br/books?id=hRAE0y0yLKQC&pg=PA38&dq=artigos+michaelis-menten&hl=pt-BR&sa=X&ei=LKJ6UqvDMZPwkQewkIDQCw&ved=0CE4Q6AEwBQ#v=onepage&q=artigos%20michaelis-menten&f=false>. Acesso em: 06 de novembro de 2013.[5]. PINTO, G. F. Cintica Enzimtica, Brasil, 2009. Disponvel em: < http://books.google.com.br/books?hl=pt-BR&lr=&id=qLq2XI5ap6AC&oi=fnd&pg=PA7&dq=artigos+cin%C3%A9tica+enzim%C3%A1tica&ots=WsckSNzymZ&sig=NMiykBJAXS77YcjA5u0xxsaxvME#v=onepage&q=artigos%20cin%C3%A9tica%20enzim%C3%A1tica&f=false>. Acesso em 04 de novembro de 2013.[6]. VOET, D.; VOET, J. G. & PRATT, C. W. Fundamentos de Bioqumica A Vida em Nvel Molecular, pg. 1176. Disponvel em: Acesso em: 06 de novembro de 2013.
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