UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
PREPARO DE HIDROLISADOS PROTÉICOS E
ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS POR DUAS
METODOLOGIAS
CARLOS ROBERTO BERNARDI
FLORIANÓPOLIS
2000
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
PREPARO DE HIDROLISADOS PROTÉICOS E
ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS POR DUAS
METODOLOGIAS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos doCentro de Ciências Agrárias daUniversidade Federal de Santa Catarinacomo requisito final para obtenção do títulode Mestre em Ciência dos Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Marilde Terezinha Bordignon Luiz
CARLOS ROBERTO BERNARDI
FLORIANÓPOLIS
2000
III
À minha esposa Jenecir e aos meus
filhos Julian Roberto e Caroline.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos os que colaboraram direta ou indiretamente para a
realização deste curso, e em especial para:
1. À Profa. Dra. Marilde Terezinha Bordignon Luiz, pela orientação, apoio e estímulo
durante a realização do curso.
2. Ao pesquisador MS Dirceu Luiz Zanotto, conselheiro acadêmico, pelo apoio durante
a realização do curso.
3. Ao pesquisador Dr. Antônio Lourenço Guidoni pelos conselhos e análise estatística.
4. Aos professores do CCA pelo apoio e atenção.
5. Aos pesquisadores Dr. Cláudio Bellaver, Dr. Élsio A. P. de Figueiredo, Dr. Gustavo
M. M. Lima e Dr. Paulo A. R de Brum pela ajuda para dirimir dúvidas.
6. Aos pesquisadores Dr. Flávio Bello Fialho, Dr. Gustavo M. M. Lima e Dr. Laurimar
Fiorentin, pela ajuda para escrever o Abstract.
7. Aos colegas do Laboratório de Análises Físico-Químicas da Embrapa Suínos e
Aves, Claudete H. Klein, Iraí P. de Mello, Lindamar A. Gonçalves, Lucimara
Suzin, Maria C. V. Carlotto, Nilse A. Vanzo, Rosemari Martini, Rosilei S. Klein e
Terezinha B. Cestonaro,, pelo apoio e ajuda na realização das análises laboratoriais.
8. Aos colegas dos laboratórios de Química de Proteínas e Bioquímica do CCA-UFSC
pelo apoio e amizade.
V
9. Aos colegas de curso pela amizade e companheirismo.
10. Ao pesquisador Dr. Paulo Roberto S. da Silveira, pelo apoio oferecido.
11. À Irene Câmera, bibliotecária da Embrapa Suínos e Aves, e Ivana Vicente pela
ajuda na obtenção de referências bibliográficas.
12. À equipe de nutrição da Embrapa Suínos e Aves pelo apoio oferecido.
13. À Embrapa Suínos e Aves em nome da Chefia e equipe técnica pela oportunidade de
realização deste treinamento.
14. Aos membros da banca examinadora, Profa. Dra. Marilde T. B. Luiz, Profa. Dra.
Úrsula M. Lanfer Marquez, Prof. Dr. Moacir G. Pizzolati, Profa. Dra. Roseane Fett
e Profa. Dra. Edna R. Amante.
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS IX
LISTA DE QUADROS XV
LISTA DE FIGURAS XIX
RESUMO XXIV
ABSTRACT XXV
1 INTRODUÇÃO 01
2 REVISÃO DE LITERATURA 04
2.1 Proteínas 04
2.2 Aminoácidos 07
2.3 A análise de aminoácidos 08
2.3.1 Importância 08
2.3.2 O método cromatográfico 09
2.3.3 A hidrólise de proteínas 13
2.3.4 A hidrólise ácida utilizando equipamentos de microondas 17
2.4 O preparo dos hidrolisados protéicos 20
3 MATERIAL E MÉTODOS 23
3.1 Amostras 23
3.2 Equipamentos 24
VII
3.3 Soluções e reagentes 24
3.3.1 Reagentes 24
3.3.2 Soluções 25
3.4 Métodos 27
3.4.1 Preparo das amostras 27
3.4.2 Hidrólise e preparo dos hidrolisados 28
3.4.2.1 Método 1 – evaporação em evaporador rotativo 28
3.4.2.2 Método 2 – evaporação em dessecador a vácuo 29
3.4.2.3 Método 3 – Evaporação em fluxo de argônio 29
3.4.2.4 Método 4 – Neutralização 29
3.4.2.5 Método 5 - Microondas 30
3.4.3 Experimento 1 30
3.4.4 Experimento 2 31
3.4.5 Experimento 3 31
3.4.6 Experimento 4 32
3.4.7 Condições cromatográficas 32
3.4.7.1 Analisador de aminoácidos Beckman System 6300 32
3.4.7.2 CLAE 33
3.5 Determinação do teor de aminoácidos 35
3.6 Análise estatística 36
3.6.1 Experimentos 1 e 2 36
3.6.2 Experimentos 3 e 4 39
VIII
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 40
4.1 Análise de composição química 40
4.2 Experimentos 1 e 2 44
4.3 Experimento 3 67
4.4 Experimento 4 73
5 CONCLUSÕES 75
6 RECOMENDAÇÕES 76
7 ANEXOS 77
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 123
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 - Teores de matéria seca total (MS), proteína bruta (PB), extrato etéreo
(EE) e matéria mineral (Cinzas), nas amostras de milho, farelo de
soja e hidrolisado ácido de caseína, em g/100g da amostra com base
na matéria natural.
40
Tabela 02 - Nível mínimo de significância, envolvendo os métodos, amostras e
a interação métodos x amostras, analisados independentemente de
amostra, no analisador de aminoácidos Beckman e CLAE.
47
Tabela 03 - Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses
multivariadas sobre os métodos, para a amostra milho, no analisador
de aminoácidos Beckman e CLAE.
48
Tabela 04 - Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses
multivariadas sobre os métodos, para a amostra farelo de soja, no
analisador de aminoácidos Beckman.
52
Tabela 05 - Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses
multivariadas sobre os métodos, para a amostra hidrolisado ácido de
caseína, no analisador de aminoácidos Beckman.
54
X
Tabela 06 - Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses
multivariadas sobre os métodos, independente de amostra, para o
analisador de aminoácidos Beckman e CLAE.
92
Tabela 07 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido ácido aspártico (Asp), no analisador de aminoácidos
Beckman, para os dados censurados.
93
Tabela 08 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido ácido aspártico
(Asp) obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados.
94
Tabela 09 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido treonina (Tre), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
95
Tabela 10 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido treonina (Tre)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
96
Tabela 11 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido serina (Ser), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
97
Tabela 12 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido serina (Ser)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
98
XI
Tabela 13 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido ácido glutâmico (Glu), no analisador de aminoácidos
Beckman, para os dados censurados.
99
Tabela 14 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido ácido glutâmico
(Glu) obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
100
Tabela 15 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido prolina (Pro), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
101
Tabela 16 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido prolina (Pro)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
102
Tabela 17 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido glicina (Gli), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
103
Tabela 18 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido glicina (Gli)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
104
Tabela 19 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido alanina (Ala), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
105
XII
Tabela 20 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido alanina (Ala)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
106
Tabela 21 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido valina (Val), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
107
Tabela 22 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido valina (Val)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
108
Tabela 23 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido isoleucina (Ile), no analisador de aminoácidos
Beckman, para os dados censurados.
109
Tabela 24 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido isoleucina (Ile)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
110
Tabela 25 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido leucina (Leu), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
111
XIII
Tabela 26 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido leucina (Leu)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
112
Tabela 27 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido tirosina (Tir), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
113
Tabela 28 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido tirosina (Tir)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
114
Tabela 29 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido fenilalanina (Fen), no analisador de aminoácidos
Beckman, para os dados censurados.
115
Tabela 30 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido fenilalanina (Fen)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
116
Tabela 31 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido histidina (His), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
117
XIV
Tabela 32 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido histidina (His)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
118
Tabela 33 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido lisina (Lis), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
119
Tabela 34 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido Lisina (Lis)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
120
Tabela 35 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido arginina (Arg), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
121
Tabela 36 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido arginina (Arg)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
122
LISTA DE QUADROS
Quadro 01 - Composição em aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e
hidrolisado ácido de caseína, obtidas em analisador específico
Beckman e CLAE, nos dados não censurados, em g/100g da
amostra com base na matéria natural.
41
Quadro 02 - Perfil de aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e
hidrolisado ácido de caseína, obtidas em analisador específico
Beckman e CLAE, nos dados não censurados, em g/100g de
proteína com base na matéria natural.
42
Quadro 03 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido,
independente de método, nos dados não censurados, para as
amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína, em
g/100g da amostra com base na matéria natural, para o analisador
de aminoácidos Beckman System 6300.
43
Quadro 04 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada amostra,
independente de método, nos dados não censurados, em g/100g da
amostra com base na matéria natural, para CLAE.
44
XVI
Quadro 05 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na
amostra milho, nos dados não censurados, em g/100g da amostra
com base na matéria natural, para o analisador de aminoácidos
Beckman System 6300.
78
Quadro 06 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na
amostra milho, nos dados não censurados, em g/100g da amostra
com base na matéria natural, para CLAE.
79
Quadro 07 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na
amostra farelo de soja, nos dados não censurados, em g/100g da
amostra com base na matéria natural, para o analisador de
aminoácidos Beckman System 6300.
80
Quadro 08 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na
amostra farelo de soja, nos dados não censurados, em g/100g da
amostra com base na matéria natural, para CLAE.
81
Quadro 09 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na
amostra hidrolisado ácido de caseína, nos dados não censurados, em
g/100g da amostra com base na matéria natural, para o analisador
de aminoácidos Beckman System 6300.
82
Quadro 10 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na
amostra hidrolisado ácido de caseína, nos dados não censurados, em
g/100g da amostra com base na matéria natural, para CLAE.
83
XVII
Quadro 11 - Composição em aminoácidos para cada método, independentemente
de amostra, através do analisador específico Beckman, e
comparação do vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas
em conjunto, para os dados não censurados, em g/100g da amostra
com base na matéria natural.
84
Quadro 12 – Composição em aminoácidos para cada método, independentemente
de amostra, através de CLAE, e comparação do vetor de médias
envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados não
censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.
85
Quadro 13 – Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra
milho, através de analisador específico Beckman, e comparação do
vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto,
para os dados não censurados, em g/100g da amostra com base na
matéria natural.
86
Quadro 14 – Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra
milho, através de CLAE, e comparação do vetor de médias
envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados não
censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.
87
Quadro 15 – Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra
farelo de soja, através de analisador específico Beckman, e
comparação do vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas
em conjunto, para os dados não censurados, em g/100g da amostra
com base na matéria natural.
88
XVIII
Quadro 16 – Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra
farelo de soja, através de CLAE, e comparação do vetor de médias
envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados não
censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.
89
Quadro 17 – Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra
hidrolisado ácido de caseína, através de analisador específico
Beckman, e comparação do vetor de médias envolvendo as
variáveis analisadas em conjunto, para os dados não censurados, em
g/100g da amostra com base na matéria natural.
90
Quadro 18 – Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra
hidrolisado ácido de caseína, através de CLAE, e comparação do
vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto,
para os dados não censurados, em g/100g da amostra com base na
matéria natural.
91
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 - Aminograma do padrão de aminoácidos, obtido em analisador
Beckman System 6300.
48
Figura 02 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas
Can1 e Can2, da amostra milho, para o analisador de aminoácidos
Beckman.
49
Figura 03 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas
Can1 e Can2, da amostra milho, para CLAE.
49
Figura 04 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas
Can1 e Can2, da amostra farelo de soja, para o analisador de
aminoácidos Beckman.
50
Figura 05 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas
Can1 e Can2, da amostra farelo de soja, para CLAE.
50
Figura 06 - Aminograma do padrão de aminoácidos, obtido em CLAE 51
Figura 07 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas
Can1 e Can2, da amostra hidrolisado ácido de caseína, para o
analisador de aminoácidos Beckman.
53
Figura 08 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas
Can1 e Can2, da amostra hidrolisado ácido de caseína, para CLAE.
53
XX
Figura 09 - Aminograma da amostra milho, obtido em analisador Beckman
System 6300.
55
Figura 10 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas
Can1 e Can2, independente de amostra, para o analisador de
aminoácidos Beckman.
56
Figura 11 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas
Can1 e Can2, independente de amostra, para CLAE.
56
Figura 12 - Aminograma da amostra milho, obtido em CLAE. 57
Figura 13 - Aminograma da amostra farelo de soja, obtido em analisador
Beckman System 6300.
57
Figura 14 - Aminograma da amostra farelo de soja, obtido em CLAE. 58
Figura 15 - Aminograma da amostra hidrolisado ácido de caseína, obtido em
analisador Beckman System 6300.
58
Figura 16 - Aminograma da amostra hidrolisado ácido de caseína, obtido em
CLAE.
59
Figura 17 - Visualização gráfica da comparação entre os métodos para o
aminoácido treonina, na amostra farelo de soja, utilizando o
analisador de aminoácidos Beckman.
60
Figura 18 - Visualização gráfica da comparação entre os métodos para o
aminoácido serina, na amostra farelo de soja, utilizando o analisador
de aminoácidos Beckman.
61
Figura 19 - Visualização gráfica da comparação entre os métodos para o
aminoácido treonina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,
utilizando o analisador de aminoácidos Beckman.
61
XXI
Figura 20 - Visualização gráfica da comparação entre os métodos para o
aminoácido serina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,
utilizando o analisador de aminoácidos Beckman.
62
Figura 21 - Visualização gráfica da comparação entre os métodos para o
aminoácido tirosina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,
utilizando o analisador de aminoácidos Beckman.
62
Figura 22 - Visualização gráfica da comparação entre os métodos para o
aminoácido fenilalanina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,
utilizando o analisador de aminoácidos Beckman.
63
Figura 23 - Visualização gráfica da comparação entre os métodos para o
aminoácido lisina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,
utilizando o analisador de aminoácidos Beckman.
63
Figura 24 - Visualização gráfica da comparação através de valores relativos à
média entre os métodos para a amostra hidrolisado ácido de caseína,
no analisador de aminoácidos Beckman.
65
Figura 25 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 2, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32
minutos, em valores percentuais relativos à recuperação obtida pela
hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
69
Figura 26 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 2, nos tempos de 15, 20, 25, 30, 35 e 40
minutos (média de duas repetições), em valores percentuais relativos
à recuperação obtida pela hidrólise em estufa através do método 4,
para a amostra milho.
69
XXII
Figura 27 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 4, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32
minutos, em valores percentuais relativos à recuperação obtida pela
hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
70
Figura 28 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 4, nos tempos de 15, 20, 25, 30, 35 e 40
minutos (média de duas repetições), em valores percentuais relativos
à recuperação obtida pela hidrólise em estufa através do método 4,
para a amostra milho.
70
Figura 29 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 6, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32
minutos, em valores percentuais relativos à recuperação obtida pela
hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
71
Figura 30 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 6, nos tempos de 2, 4, 5, 6, 7 e 8 minutos
(média de duas repetições), em valores percentuais relativos à
recuperação obtida pela hidrólise em estufa através do método 4, para
a amostra milho.
71
Figura 31 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 8, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32
minutos, em valores percentuais relativos à recuperação obtida pela
hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
72
XXIII
Figura 32 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 10, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32
minutos, em valores percentuais relativos à recuperação obtida pela
hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
72
Figura 33 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise
em microondas na potência 12, nos tempos de 05, 10, 15, 25 e 60
minutos (média de duas repetições), em valores percentuais relativos
à recuperação obtida pela hidrólise em estufa através do método 4,
para a amostra milho.
73
Figura 34 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos obtidos por
analisador específico Beckman e CLAE, em valores relativizados,
independentemente de amostra.
74
RESUMO
Amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína foram submetidas à
hidrólise ácida em estufa (110 ± 5 °C, durante 22 horas) com ácido clorídrico 6 N, em
ampolas de vidro seladas sob vácuo e microondas. Os hidrolisados foram preparados
por quatro métodos: 1) evaporação em evaporador rotativo sob vácuo, 2) evaporação em
câmaras a vácuo em presença de pastilhas de NaOH, 3) evaporação em bloco de
aquecimento sob fluxo de argônio e 4) neutralização com solução padrão de
citrato/NaOH. Os aminoácidos foram separados e quantificados em analisador
específico Beckman System 6300 e CLAE Shimadzu LC-10AD, com derivatização pós-
coluna por ninidrina e OPA, respectivamente. O método de neutralização dos reagentes
da hidrólise apresentou o maior teor para a maioria dos aminoácidos. Permite boa
produtividade, atendendo às necessidades de trabalhar com grandes quantidades de
amostras. A evaporação em evaporador rotativo apresentou perdas significativas apenas
para treonina e serina na amostra farelo de soja, sob fluxo de argônio observou-se
baixos teores para treonina, fenilalanina e lisina e em câmaras sob vácuo apresentou
perdas significativas para treonina, serina e tirosina. A utilização da solução de
redissolução de amostras recomendada para o analisador Beckman apresentou
resultados superestimados, quando utilizada em CLAE com detecção por fluorescência.
O uso do microondas Pressurized Microwave Decomposition System PAAR não
apresentou resultados equivalentes aos obtidos pela hidrólise em estufa.
Palavras chave: aminoácidos, análise de aminoácidos, hidrólise de proteínas, preparo de
amostras, hidrólise por microondas.
ABSTRACT
Comparative Study of Sample Preparation Methodologies for Amino Acid
Analysis. Samples of maize, soybean and casein (acid hydrolysate) were submitted to
acid hydrolysis in oven (110 ± 5 °C, for 22 hours) with 6 N HCl, in evacuated and
sealed ampoules under vacuum. Four methods of hydrolysate preparation were used:
1) evaporation to dryness in rotary evaporator under vacuum, 2) evacuated desiccator
under vacuum and NaOH, 3) flushing the open vial with argon and 4) neutralization
with standard citrate/NaOH solution. The amino acids were isolated and quantified in
specific amino acid analyser Beckman System 6300 and HPLC Shimadzu LC-10AD,
with post column derivatization with ninhidrin and OPA, respectively. Hydrolysates
were prepared, for both equipments, by a method for the Beckman analyser. The
neutralization method presented the best result considering all amino acids. Besides, it is
more practical for rapid processing of a large number of samples. In the case of
evaporation method, in the rotary evaporator, significant losses were verified only for
threonine and serine in the soybean sample. There was low recovery of threonine,
phenylalanine and lysine using heat and flushing with argon. The evacuated desiccator
method presented significative losses of threonine, serine and tyrosine. The sample
dillution buffer recommended for Beckman analyser presented superestimate results in
HPLC with fluorescence detector. Pressurized Microwave Decomposition System
PAAR did not present equivalent results with oven hydrolysis.
Key words: amino acid, amino acid analysis, protein hydrolysis, sample preparation,
microwave hydrolysis.
1 INTRODUÇÃO
A hidrólise de proteínas é uma atividade fundamental e indispensável nos
procedimentos de análise e determinação de aminoácidos. Nos últimos anos foram
obtidos avanços importantes, quanto a equipamentos e reagentes, entretanto, muitos
problemas ainda persistem, relacionados principalmente ao preparo dos hidrolisados e à
constituição da amostra.
O método tradicional de hidrólise, com o uso de ácido clorídrico 6 N a
110 ºC, ainda é reconhecido como padrão e o mais utilizado, apesar de promover a
destruição parcial ou total dos aminoácidos sulfurados (cistina e metionina) e do
triptofano.
A completa recuperação de todos os aminoácidos em um único
procedimento de hidrólise, bem como para a redução do tempo de preparo e sua
determinação analítica são objetivos de estudos. Reduções substanciais em tempo de
análise, com aumento da precisão, foram observados com a introdução da
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
Os métodos de hidrólise e preparo de amostras atualmente disponíveis não
possibilitam a completa recuperação de todos os aminoácidos em um único
procedimento, sendo necessário a utilização de métodos alternativos para a
2
determinação de alguns aminoácidos, mais especificamente, de cistina, metionina e
triptofano.
A redução do tempo de hidrólise de proteínas foi objeto de vários estudos,
direcionados principalmente para o aumento da temperatura de hidrólise, onde obteve-
se ganhos significativos de tempo, especialmente após a introdução de equipamentos de
microondas. Esses avanços, embora sinalizados em diversos estudos científicos, não
estão recomendados pelos órgãos oficiais de metodologia analítica, tais como a AOAC
(Association of Official Analitical Chemists). Apesar disso, a maioria dos laboratórios
vêm regularmente adotando métodos alternativos, embora não oficiais, em busca de
ganhos em qualidade, tempo e custos de processamento. Os laboratórios oficiais,
voltados para a produção científica, já não podem fazer o mesmo, pois necessitam de
parâmetros de comparação e de validação das novas técnicas.
Assim, uma proposta de trabalho colaborativo interlaboratorial teria muitas
dificuldades a superar. Se variações em torno do reagente de derivatização e as
condições de derivatização pré ou pós-coluna já dificultam a comparação dos
resultados, variações em torno da metodologia de preparo das amostras tornam quase
impossível a sua realização.
Além disso, os novos procedimentos de hidrólise e preparo das amostras
propostos recentemente, com o uso de equipamentos de microondas, precisam ser
consolidados e adotados, haja visto que, a utilização da metodologia oficialmente
reconhecida necessita de tempo significativo, o que já não pode mais ser aceito quando
a demanda de amostras é elevada.
Com o propósito de colaborar para a superação dessas dificuldades, o
presente trabalho objetivou estudar metodologias de preparo dos hidrolisados protéicos
3
para a análise de aminoácidos, pelo uso do método tradicional de hidrólise em estufa a
110 ºC durante 22 horas, comparando métodos de evaporação e neutralização dos
reagentes da hidrólise, através da determinação dos aminoácidos por analisador
específico e cromatografia líquida de alta eficiência e estudo da viabilidade de utilização
de equipamento de microondas pressurizado PMD System da Anton Paar (Anton Paar
KG, Áustria) como alternativa ao método tradicional.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Proteínas
As proteínas (do grego proteos = primeiro) são compostos orgânicos
extremamente complexos, de natureza coloidal, formados fundamentalmente por
carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio. O termo proteína foi criado por Mulder, em
1840, citado por Andriguetto et al. (1983), para designar a substância fundamental da
albumina da clara de ovo.
Todas as proteínas são polímeros formados de um grande número de
unidades fundamentais chamadas de aminoácidos (Sienko & Plane, 1976). Mas,
somente L-α-aminoácidos estão presentes nas proteínas (Rodwell , 1996).
Representam uma classe variada e heterogênea de macromoléculas,
formadas por polipeptídeos de alto peso molecular. Quimicamente, dividem-se em
proteínas simples, constituídas apenas de polipeptídeos, e complexas, que contém
grupamentos adicionais, como carboidratos, lipídeos e ácidos nucléicos. Com relação à
sua forma, dividem-se em duas grandes classes: proteínas globulares, caracterizadas
pela presença de cadeias polipeptídicas dobradas ou envolvidas de maneira muito
compacta, e a das proteínas fibrosas, altamente assimétricas e consistem de longas
cadeias ou grupos de cadeias peptídicas (Harper et al., 1982).
5
Segundo Rodwell (1996), as estruturas protéicas são estabilizadas por várias
forças, que incluem: pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, interações
eletrostáticas e forças de van der Waals. Para Harper et al. (1982), as estruturas
protéicas são estabilizadas por duas categorias de ligações fortes (peptídica e dissulfeto)
e duas de ligações fracas (pontes de hidrogênio e hidrofóbicas).
A estrutura primária das proteínas é derivada de ligações α-peptídicas entre
L-α-aminoácidos. As ligações de dissulfeto podem interconectar duas cadeias paralelas
por intermédio de resíduos de cisteína. Essas ligações são relativamente estáveis, sendo
difícil seu rompimento em condições usuais de desnaturação. As pontes de hidrogênio
resultam de ligações de átomos de hidrogênio com o nitrogênio e o oxigênio carbonílico
de ligações peptídicas diversas. Podem ser originárias de resíduos de aminoácidos da
mesma cadeia polipeptídica ou de outras cadeias. Sua importância na cadeia peptídica
resulta da grande quantidade de pontes de hidrogênio que podem formar-se. As
interações hidrofóbicas envolvem as cadeias laterais não polares, desempenhando um
importante papel na manutenção da estrutura protéica. As ligações eletrostáticas são
ligações salinas formadas entre grupos com cargas opostas, presentes nas cadeias
laterais dos aminoácidos constituintes da proteína (Harper et al., 1982; Rodwell, 1996).
Quanto à ordem de organização da estrutura protéica, divide-se em primária,
secundária, terciária e quaternária. A estrutura primária refere-se à ordem das
seqüências de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas que formam as proteínas. As
estruturas secundárias e terciárias estão relacionadas com a conformação das cadeias, ou
seja, com as posições relativas, no espaço, em que cada um dos átomos constituintes da
molécula se encontram. A estrutura quaternária refere-se a um quarto nível de
organização, através do qual várias unidades monoméricas, cada uma com suas
6
estruturas primárias, secundárias e terciárias apropriadas, podem se combinar, através
de ligações e interações iguais às da estrutura terciária, originados principalmente
naqueles resíduos que ficaram orientados em direção à sua superfície (Harper et al.,
1982; Farfán, 1994).
Segundo Means & Feeney (1971), a estrutura tridimensional da proteína é
governada pela estrutura primária. Modificações na estrutura tridimensional podem
produzir efeitos importantes nas propriedades da proteína. Modificações nos resíduos de
aminoácidos necessariamente modificam a estrutura primária.
As estruturas secundárias, terciárias e quaternárias são mantidas por forças
relativamente fracas e são facilmente rompidas por diversas manipulações, com perda
da atividade biológica. Essa perda da atividade é chamada de desnaturação
(Harper et al., 1982).
Para Farfán (1994), usa-se a palavra desnaturação para denotar qualquer
alteração nas estruturas quaternária, terciária e secundária das proteínas, considerando
que essas estruturas são resultado de um número relativamente grande de interações
fisico-químicas e até, ligações peptídicas, e que, por isso, não é possível definir com
brevidade e precisão qualquer mudança de estado da estrutura superior.
Means & Feeney (1971), citam que durante muitos anos o fator de
motivação para o estudo de modificações químicas de proteínas foi para sua
determinação quantitativa ou da sua composição em aminoácidos, sendo que, os
métodos utilizados não preservam a sua integridade.
Fallon et al. (1987), citam que os interesses recentes em cromatografia de
proteínas estão voltados para o desenvolvimento de tecnologia de recombinação de
DNA, que pode facilitar o estudo detalhado da estrutura de proteínas (com alto potencial
7
terapêutico), com a possibilidade de redesenhar a estrutura para alterar a atividade
biológica.
Dependendo dos objetivos pretendidos, a desnaturação pode ser empregada
em vários graus. Enquanto na bioquímica e na biofísica a proteína é desnaturada apenas
para estudar a sua forma nativa e o seu funcionamento, na ciência e tecnologia de
alimentos a estrutura nativa tem importância relativa, conforme a necessidade do
tecnólogo ou consumidor. Graus diferenciados de desnaturação podem ser alcançados
utilizando-se de meios mecânicos, físicos ou químicos, sendo que, a combinação desses
agentes produz sempre efeitos mais drásticos e violentos do que quando usados
individualmente (Farfán, 1994).
Para a determinação da composição em aminoácidos, o método mais
utilizado é a hidrólise completa de proteínas (ruptura da ligação covalente com adição
dos elementos da água) por ação de ácidos, bases ou catalisadas por enzimas
(Harper et al., 1982).
2.2 Aminoácidos
O estudo dos aminoácidos é fundamental na nutrição humana e animal pois
estes não podem, como os vegetais, sintetizar proteínas a partir de elementos mais
simples, necessitando assim da ingestão de aminoácidos para formar suas próprias
proteínas (Andriguetto et al., 1983).
Nas proteínas são encontrados, normalmente, 20 α-aminoácidos, que
formam sua espinha dorsal. São eles: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico,
cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina,
8
metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina
(Rodwell, 1996).
Os aminoácidos são definidos como compostos orgânicos que contém grupo
ácido (carboxílico) e amínico. Constituem as unidades fundamentais das moléculas
protéicas, unindo-se pelos grupos amino e carboxílico ou a outros grupos reagentes que
contenham, e são obtidos através da hidrólise dessas moléculas. Como possuem
grupamentos COOH e NH2, apresentam propriedades ácidas e básicas ao mesmo tempo
(Andriguetto et al., 1983).
O conhecimento das propriedades ácido-básicas dos aminoácidos é muito
importante na compreensão e análise das propriedades das proteínas. Além disso,
grande parte da arte de separar, identificar e quantificar os diferentes aminoácidos, e a
determinação da sua seqüência nas proteínas, é baseada em seu comportamento ácido-
básico (Lehninger et al., 1995).
As reações orgânicas características dos aminoácidos são aquelas de seus
grupamentos funcionais, isto é, os grupos carboxílicos, os α-aminogrupos, e os grupos
funcionais presentes nas diversas cadeias laterais. Entre outros aspectos importantes da
química de proteínas, o conhecimento dessas reações é muito útil para a identificação e
análise dos aminoácidos nos hidrolisados protéicos (Lehninger et al., 1995).
2.3 A análise de aminoácidos
2.3.1 Importância
A completa recuperação dos aminoácidos hidrolisados é essencial para
validar estudos de seqüência de aminoácidos, confirmar a identidade de proteínas
9
biossintéticas e oferecer dados sobre a pureza das proteínas (Lanfer Marquez, 1996;
Sales, 1994), importante na investigação de distúrbios ocasionados pela alteração dos
aminoácidos em fluídos fisiológicos (Padovan, 1994), e fundamental na nutrição
animal, onde o conhecimento exato da composição dos nutrientes contidos nas matérias
primas usadas para a fabricação das rações é de importância vital para utilizar todo o
potencial genético dos animais (Nery, 1994).
Na nutrição humana apresenta importância nas dietas especializadas, em
suporte nutricional (Petrucci, 1994), e em protocolos para rotulagem dos produtos
alimentícios destinados a crianças maiores de 1 ano e adultos (Sales, 1994).
Segundo Benson et al. (1981), a determinação acurada dos aminoácidos
presentes nas amostras é um dos tipos de análise mais importantes no catálogo
metodológico da pesquisa biológica. Para Ambler (1981), a análise de aminoácidos é
importante em diversas atividades, tais como: na nutrição, na composição e
metabolismo de alimentos; na medicina, na detecção e controle de desordens
metabólicas e investigação de fisiologia celular; na química de proteínas, na
determinação da estrutura de proteínas, no mecanismo de ação de enzimas e na
investigação da evolução celular e, ainda, em outras atividades, tais como datar sítios
arqueológicos e geológicos.
2.3.2 O método cromatográfico
A análise quantitativa e a determinação de cada aminoácido em uma mistura
complexa como o hidrolisado de uma proteína era um problema complexo, que poderia
tomar até seis meses de trabalho. Com o desenvolvimento do método cromatográfico e
sua aplicação às análises de misturas de aminoácidos foi obtido um progresso
10
significativo. Desde então, métodos analíticos baseados nesses princípios foram sendo
refinados e automatizados, permitindo, atualmente, grande velocidade, precisão e
sensibilidade (Fallon et al, 1987; Rodwell, 1996).
O método cromatográfico consiste em um sistema dinâmico de separação,
composto por dois meios: uma fase estacionária, formada por partículas sólidas ou
líquidas e uma fase móvel, que pode ser gasosa ou líquida, com a função de transportar
as moléculas componentes da amostra através do sistema cromatográfico
(Braithwaite & Smith, 1985). O suporte sólido da fase estacionária é, normalmente,
empacotado em uma coluna de vidro ou aço inoxidável, denominada de coluna
cromatográfica (Fallon et al., 1987). Durante a passagem pela coluna cromatográfica, a
mistura de componentes dissolvidos na fase móvel entra em contato com as partículas
da fase estacionária. Nesse momento ocorre uma competição entre as duas fases pelos
componentes da amostra que, dependendo das suas propriedades físicas e afinidade pela
fase estacionária, produz uma distribuição, sendo cada componente da mistura
distribuído através da fase estacionária e da fase móvel, passando assim pelo sistema
(Braithwaite & Smith, 1985).
As forças físicas e químicas que atuam sobre a mistura de componentes da
amostra e as duas fases são responsáveis pela retenção desses componentes na coluna
cromatográfica. As diferenças e a magnitude dessas forças determinam a resolução e a
separação de cada componente individual (Fallon et al., 1987).
Para Fallon et al. (1987), as forças elementares que atuam nas moléculas são
de cinco tipos: (1) Forças de dispersão ou de van der Waals atuam sobre as moléculas
causando uma distorção momentânea na sua configuração eletrostática; (2) Interações
dipolares surgem nas moléculas temporariamente distorcidas e resultam numa atração
11
eletrostática entre essas moléculas; (3) Pontes de hidrogênio ocorrem entre doadores de
prótons e receptores de prótons; (4) As interações dielétricas resultantes da atração
eletrostática entre as moléculas do soluto e solvente são constantes; (5) As interações
são eletrostáticas ou de coulomb.
O método cromatográfico foi aperfeiçoado na cromatografia de troca iônica,
que, segundo Fallon et al. (1987), foi a primeira forma de cromatografia desenvolvida
sob o novo termo de cromatografia liquida de alta eficiência.
A cromatografia de troca iônica depende da interação entre moléculas
eletricamente carregadas na fase estacionária e solutos também carregados e íons
presentes na fase móvel. Assim, as moléculas do soluto são diferenciadas em função da
diversidade de seu comportamento ácido-básico. Para esse processo, a coluna é
recheada com uma fase estacionária constituída por uma resina sintética contendo
grupos carregados positiva ou negativamente, ou seja, grupos aniônicos ou catiônicos,
respectivamente. Os aminoácidos são geralmente separados em colunas de troca de
cátions, usando como fase estacionária uma resina poliestirênica sulfonada, previamente
equilibrada com solução de hidróxido de sódio (Fallon et al., 1987; Rodwell, 1996).
Segundo Fallon et al. (1987), os principais avanços no método cromatográfico na
década de 50 foram devido às necessidades de aperfeiçoamentos nas técnicas de análise
de aminoácidos.
A automação do processo de determinação dos aminoácidos deve-se aos
trabalhos de Spackmann et al., em 1958, que desenvolveram o primeiro equipamento
com o qual era possível separar e quantificar por reação com ninidrina todos os
aminoácidos (Bazílio, 1994; Sales, 1994). Desde então, grandes avanços foram
alcançados com relação à sensibilidade, resolução, versatilidade e segurança para a
12
determinação de aminoácidos em amostras biológicas (Gehrke et al., 1985 e Zumwalt
et al., 1987).
Os principais métodos automatizados para a análise de aminoácidos da
atualidade utilizam a cromatografia de troca iônica, onde a completa separação,
identificação e quantificação requer menos de três horas (Rodwell, 1996). Os métodos
automatizados utilizam preferencialmente a reação com a ninidrina, que produz forte
coloração azul e permite a sua detecção e quantificação por colorimetria a 570 nm.
Também podem ser utilizadas reações de fluorescência, como por exemplo, a reação
com a fluorescamina (Fallon et al., 1987; Rodwell, 1996).
Um grande esforço foi feito para o desenvolvimento de metodologias para a
análise de aminoácidos por cromatografia gasosa, com a promessa de maior
sensibilidade, tempos de análise menores e a utilização de equipamentos mais versáteis,
compactos e baratos, além da possibilidade de usar a cromatografia gasosa combinada
com a espectrometria de massa, favorecendo a identificação dos compostos. A principal
desvantagem dessa metodologia, é a necessidade de transformar os aminoácidos em
derivados voláteis, através de derivatização química, o que é difícil e trabalhoso (Blau,
1981). Jennings (1980), cita que a determinação quantitativa de aminoácidos é uma das
análises mais difíceis da cromatografia gasosa, e que, um dos principais problemas são
as severas perdas que os derivados de aminoácidos termicamente lábeis sofrem durante
a etapa de volatilização.
Devido ao alto custo de manutenção dos sistemas específicos para a análise
de aminoácidos, os métodos foram modificados e adaptados para a cromatografia
líquida (CLAE) com derivatização pós-coluna com ortoftaldeído (OPA) e detecção por
fluorescência que, segundo Ashworth (1987), apresenta uma série de vantagens sobre
13
os equipamentos específicos, tais como: (1) Condições de injeção de amostras mais
simples e confiáveis; (2) o equipamento não é dedicado exclusivamente para a análise
de aminoácidos; (3) o gradiente para a separação por troca iônica requer apenas duas
soluções, que podem ser preparadas no próprio laboratório; (4) reagentes de
derivatização pós-coluna são mais baratos e mais fáceis de preparar; (5) sensibilidade de
detecção muito maior.
Apesar das vantagens atribuídas à CLAE, os analistas ainda preferem o uso
do analisador específico, pelo fato de que as amostras contendo aminoácidos livres
podem ser aplicadas direta e imediatamente, enquanto que os equipamentos de
cromatografia gasosa e CLAE freqüentemente estão ocupados com outras análises
(Blau, 1981). Kellner et al. (1994) e Fountoulakis & Lahm (1998), aprofundam a
discussão sobre as metodologias de hidrólise, técnicas de separação e outras aplicações
sobre a análise de aminoácidos, bem como sobre as suas vantagens e desvantagens.
2.3.3 A hidrólise de proteínas
Antes de separar e quantificar os aminoácidos pelos métodos
cromatográficos, necessita-se extraí-los da estrutura protéica de forma rápida e eficiente.
Para romper as pontes de peptídios das proteínas e preparar os hidrolisados para a
análise de aminoácidos são indicados três métodos principais: a hidrólise enzimática, a
hidrólise alcalina e a hidrólise ácida. Cada um deles apresenta vantagens e
desvantagens, dependendo a sua utilização dos objetivos a serem alcançados.
A utilização de enzimas para hidrolisar peptídios e proteínas apresenta
várias vantagens: 1) a atuação das enzimas é específica e quebra ligações que são
resistentes a catalisadores não específicos; 2) o método é não destrutivo, não apenas
14
para os aminoácidos comuns, mas também para os grupos lábeis; 3) Agem rapidamente
e, teoricamente, completam a hidrólise em apenas alguns minutos. Na prática, essas
vantagens são neutralizadas pelo fato de que a hidrólise catalisada por enzimas não ser,
essencialmente, tão rápida quanto outros catalisadores e, mais importante,
freqüentemente não hidrolisar completamente a proteína (Benson et al., 1981).
Em vista disso, esse método tem a sua utilização reduzida para fins
específicos, como a identificação de derivados de aminoácidos lábeis, ou outros casos
especiais (Benson et al., 1981; Kellner et al., 1994; Fountoulakis & Lahm, 1998).
A principal utilização da hidrólise alcalina para a análise de aminoácidos é
para a determinação de triptofano, sendo também empregada para o estudo de
fosfoproteínas (Kellner et al., 1994; Fountoulakis & Lahm, 1998). Esse método
apresenta como desvantagem a destruição da maioria dos aminoácidos, além de requerer
um manuseio extremamente cuidadoso pela utilização de reagentes perigosos
(Benson et al., 1981; Kellner et al., 1994).
A utilização da hidrólise ácida para a análise de aminoácidos é bastante
antiga, proveniente dos trabalhos de Braconnot em 1820, com a utilização de ácido
sulfúrico (Roach & Gehrke, 1970; Davies & Thomas, 1973; Benson et al., 1981;
Gehrke et al., 1985). Roach & Gehrke (1970) e Gehrke et al. (1985), citam que o uso do
ácido clorídrico foi introduzido por Bopp, em 1849, sendo que, a partir de então este
passou a ser o agente hidrolítico mais utilizado para a determinação da maioria dos
aminoácidos.
Ácidos minerais fortes e soluções alcalinas atacam e/ou desestabilizam as
ligações peptídicas produzindo a hidrólise da proteína, e consequentemente a liberação
dos aminoácidos (Farfán, 1994).
15
Glicina e leucina foram os primeiros aminoácidos puros obtidos através da
hidrólise ácida de proteínas, em 1820, com a utilização de ácido sulfúrico (Tristram &
Rattenbury, 1981; Benson et al., 1981). A partir de então, muitos outros agentes
hidrolíticos foram estudados, sendo que, o método de hidrólise ácida mais comumente
utilizado e reconhecido como padrão ou “método tradicional” para a análise de
aminoácidos é o método de Moore et al., de 1958, citados por Savoy et al. (1975),
Zumwalt et al. (1987), Nakazawa & Manabe (1992), Kellner et al. (1994) e
Marconi et al. (1995). Também são citadas como padrão ou clássico as modificações
acrescentadas por Moore & Stein, em 1963, citados por Phillips (1983), o trabalho de
Schram et al., de 1953, citados por Van Der Meer (1990) e Llames & Fontaine (1994),
e o método de Hirs et al., de 1954, citados por Chen et al. (1987) e Chiou &
Wang (1989), sendo que todos propõem a utilização de ácido clorídrico 6 N a 110-
120 °C durante 24 a 72 horas. A partir desses trabalhos, muitos artigos de revisão sobre
a hidrólise de proteínas foram publicados discutindo fatores tais como: a concentração e
a pureza do ácido, o tempo e a temperatura de hidrólise, a presença de carboidratos na
matriz, a presença de aldeídos e impurezas de metais, a cinética da hidrólise da proteína
e a destruição de aminoácidos (Gehrke et al., 1985; Zumwalt et al., 1987; Fountoulakis
& Lahm, 1998).
Com o intuito de acelerar o processo de hidrólise das ligações peptídicas e
liberar rapidamente os aminoácidos, estudos foram realizados utilizando enzimas
(Davies & Thomas, 1973; Benson et al., 1981), aumentando o poder do agente
hidrolítico (Tsugita & Scheiffler, 1982), utilizando aditivos e protetores (Csapó, 1983;
Phillips, 1983; Inglis, 1983; Spindler et al., 1984; Wong et al., 1984; Csapó et al., 1986;
Nakazawa & Manabe, 1992; Kellner et al., 1994; Csapó et al., 1994) e aumentando a
16
temperatura (Roach & Gehrke, 1970; Phillips, 1983; Gehrke et al., 1985; Csapó et al.,
1986; Zumwalt et al., 1987).
Dentre esses métodos, sobressaíram-se a hidrólise ácida com o uso de
aditivos e protetores, como o ácido mercaptoetanossulfônico, fenol e mercaptoetanol,
entre outros, e o aumento da temperatura de hidrólise, sendo que, apesar de obterem
relativo sucesso, inicialmente o aumento da temperatura acentuou as perdas na
recuperação de alguns aminoácidos. (Benson et al., 1981; Zumwalt et al., 1987;
Nakazawa & Manabe, 1992; Lanfer Marquez, 1996; Kellner et al., 1994; Csapó et al.,
1994).
O uso de ácido mercaptoetanossulfônico é recomendado para a
determinação de triptofano. Para a determinação dos demais aminoácidos, entretanto,
Csapó et al. (1994) citam que esse método apresenta como grande inconveniente a
redução de cistina para cisteína, que se sobrepõe à prolina no cromatograma,
produzindo resultados falsos de cistina e prolina. Fenol e/ou mercaptoetanol são
utilizados como agentes protetores para os aminoácidos lábeis, como a fenilalanina,
histidina e arginina, reduzindo, também, significativamente as perdas de tirosina
durante a hidrólise ácida (Gehrke et al., 1985; Zumwalt et al., 1987). Para a
determinação de cistina e metionina, Llames & Fontaine (1994) recomendam o uso de
pré-oxidação com ácido perfórmico e hidrólise ácida.
O aumento da temperatura de hidrólise para 145 ° C durante 4 horas
apresentou resultados comparáveis ao método de hidrólise clássica para a maioria das
amostras (Zumwalt et al., 1987). Deve-se observar que o efeito da variação do
tempo x temperatura manifesta-se nos aminoácidos mais susceptíveis à destruição
(treonina e serina), que apresentam redução em condições de 145 ° C por 6 horas,
17
enquanto que, naqueles envolvidos em ligações peptídicas mais resistentes à hidrólise,
como a valina e a isoleucina, a recuperação tem sido maior em temperaturas mais
elevadas (Lanfer Marquez, 1996).
Uma revisão atualizada sobre os agentes hidrolíticos, condições de hidrólise
e aditivos utilizados na hidrólise ácida é apresentada por Fountoulakis & Lahm em
artigo de revisão sobre a hidrólise e a análise de composição de proteínas (Fountoulakis
& Lahm, 1998).
Mas o fator decisivo na redução do tempo de hidrólise de proteínas foi a
introdução de equipamentos à base de microondas, a partir dos trabalhos de Chen et al.
(1987), possibilitando a realização em um tempo que varia desde 3 a 30 minutos (Chen
et al., 1987; Chiou & Wang, 1989; Pecavar et al., 1990; Péter et al., 1993; Gerhardt &
Maucher, 1993; Marconi et al., 1995), até 2 a 4 horas (Margolis et al., 1991). Apesar
dessa nova tecnologia apresentar, inicialmente, algumas dificuldades técnicas, como o
controle da potência e da temperatura, estudos posteriores sugeriram os ajustes
adequados e a comprovaram (Chiou & Wang, 1989; Engelhart, 1990; Margolis et al.,
1991; Péter et al., 1993; Kellner et al., 1994; Marconi et al., 1995).
2.3.4 A hidrólise ácida utilizando equipamentos de microondas
Microondas é a faixa de radiação eletromagnética que varia entre as
frequências de 300 MHz a 300 GHz. Os equipamentos de microondas domésticos,
industriais e de laboratório usualmente operam a uma freqüência de 2.450 MHz, que é
produzida pelo gerador de microondas, também chamado de “Magnetron” (Engelhart,
1990; Margolis et al., 1991; Anton Paar, 1992).
18
Os materiais que são expostos à radiação de microondas apresentam
diferentes efeitos, dependendo do seu coeficiente dielétrico. As microondas podem ser
refletidas, como nos metais, ou transpassar, como no vidro ou nos plásticos, sem
aquecer o material. Outras substância, como a água, absorvem a energia das
microondas: moléculas polares são excitadas, causando rotação e vibração molecular,
enquanto que os íons livres se movem através do campo eletromagnético. Esses
movimentos resultam em colisões, que causam o aquecimento da substância. Os dois
mecanismos (a rotação dipolar e a condução iônica) ocorrem simultaneamente e
contribuem para o aquecimento da solução. Esse efeito pode ser usado favoravelmente
para o aquecimento rápido de meios aquosos (Engelhart, 1990; Anton Paar, 1992).
A hidrólise ácida utilizando equipamentos de microondas para a análise de
aminoácidos foi proposta por Chen et al. (1987), que utilizando aquecimento por 3 a 5
minutos em microondas, obtiveram resultado similar ao procedimento convencional de
110 °C por 24 horas. Chiou & Wang (1989), evidenciaram que a irradiação por
microondas durante 2 a 8 minutos em presença de ácido clorídrico 6 M não causa
destruição da maioria dos aminoácidos, exceto alguma degradação menor de
aminoácidos lábeis, como a serina, treonina, metionina, tirosina e histidina. Pecavar et
al. (1990), confirmam que a destruição de aminoácidos no aquecimento por microondas
num período inferior a 15 minutos é comparável ao obtido pelo aquecimento clássico.
Margolis et al. (1991), relatam estudo comparativo de hidrólise por
microondas com potência controlada para obter uma temperatura de 125 °C, de forma a
completar a hidrólise em 4 horas, afim de poder comparar o uso de microondas nessas
condições com a hidrólise em estufa a 145 °C por 2 e 4 horas. Eles concluem que a
19
hidrólise por microondas é tão ou mais rápida que o método clássico, e produz menor
destruição dos aminoácidos lábeis.
Péter et al. (1993), citam que, a uma potência de 450 W, o rendimento de
cada aminoácido após 30 minutos de aquecimento por microondas é comparável ao
obtido após 24 horas pelo aquecimento convencional.
Marconi et al. (1995), confirmam que a hidrólise de proteínas por
microondas é uma ferramenta útil e importante na pesquisa de alimentos por ser fácil de
operar, minimiza erros do operador e reduz a possibilidade de contaminação das
amostras, permite o uso de protetores, tais como o fenol e o mercaptoetanol, os
resultados obtidos são consistentes e reprodutíveis, e os cromatogramas de aminoácidos
são limpos e livres de picos ambíguos.
Entretanto, para a utilização de equipamentos de microondas na hidrólise
de proteínas foi preciso superar alguns problemas técnicos, como o ajuste de
temperatura (Kellner et al., 1994), pois os equipamentos inicialmente disponíveis eram
exclusivamente para o preparo de amostras para a análise de minerais (Marconi et al.,
1995). Pickering & Newton (1990), relatam o uso de temperaturas a 178-180 °C.
Marconi et al. (1995), utilizaram em seu estudo um equipamento de microondas
especialmente desenhado para a hidrólise de proteínas, com controle para pressão e
temperatura, e mecanismos para a produção de vácuo e atmosfera de nitrogênio no
recipiente de amostra.
20
2.4 O preparo dos hidrolisados protéicos
Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de
aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método
cromatográfico (Gehrke et al., 1985 e Zumwalt et al., 1987).
A evaporação ou não dos agentes hidrolíticos, quando da hidrólise ácida
com HCl 6N, é importante fator de discussão. Bech-Andersen et al. (1990), não
recomendam a evaporação até a secagem, pois ela provoca erros e perdas nos
aminoácidos individuais, enquanto que Van Der Meer (1990), ressalta que o alto teor de
sal resultante da neutralização, levado para a coluna de troca iônica, provoca
alargamento dos picos e não pode ser aplicado a todas as resinas.
Llames & Fontaine (1994), em trabalho colaborativo adotado como método
oficial pela AOAC INTERNATIONAL (Association of Official Analitical Chemists
International) na sua 16ª edição de 1995, para a oxidação com ácido perfórmico e
hidrólise ácida pelo método de metabissulfito de sódio, recomendam a evaporação
apenas quando a saturação de cloreto de sódio na amostra pode comprometer a coluna
de troca iônica e, consequentemente, a separação dos aminoácidos, sugerindo para esse
método a neutralização dos reagentes, enquanto que, para o método de oxidação com
ácido perfórmico – ácido hidrobromídrico e hidrólise ácida, utilizam a evaporação em
evaporador rotativo como padrão.
O método mais comumente empregado para a eliminação dos reagentes da
hidrólise é o da utilização de evaporadores rotativos sob vácuo. (Roach & Gehrke,
1970; Savoy et al., 1975; Benson et al., 1981; Chen et al., 1987; Van Der Meer, 1990;
Péter et al., 1993; Lebet et al., 1994; Marconi et al., 1995) . Quando da necessidade de
21
trabalhar com grandes quantidades de amostras, passa a ser um ponto crítico pela
morosidade e necessidade de acompanhamento contínuo, tornando-se um ponto de
estrangulamento e demora na análise. Para aumentar a produção na evaporação de
amostras foram propostos procedimentos tais como o sistema de evaporação para 12
amostras simultâneas reportado por Phillips (1983) e Alegria Toran et al. (1996), ou
então, um multi-evaporador de amostras utilizando um bloco de aquecimento
semelhante ao utilizado para a digestão de nitrogênio/proteína para o método de
Kjeldahl, com um sistema sob fluxo de nitrogênio e aspiração a vácuo, como proposto
por Gehrke et al. (1985). Péter et al. (1993), propõe o uso de fluxo de argônio para
acelerar a evaporação do ácido clorídrico ao invés de nitrogênio.
Savoy et al. (1975), Ambler (1981) e Lanfer Marquez (1996), citam como
tratamento alternativo utilizado em muitos laboratórios, a remoção dos reagentes em
dessecadores ou câmaras a vácuo em presença de pastilhas de hidróxido de sódio e/ou
pentóxido de fósforo.
Benson et al. (1981), recomendam que deve-se evitar a evaporação em
câmaras a vácuo preferindo o uso de evaporador rotativo para evitar a formação de
compostos como reportados por Ikawa & Snell (citados por Benson et al. (1981) e
Ambler (1981)), que verificaram a transformação de ácido glutâmico e serina em O-γ-
glutamilserina. Ambler (1981), relata o uso do procedimento de evaporação em
dessecador a vácuo, à temperatura ambiente, não encontrando baixas recuperações
relacionadas à formação desses compostos. Lanfer Marquez (1996), cita ainda, que a
formação desses compostos não foi verificada posteriormente, sendo o uso de câmaras a
vácuo empregado rotineiramente em muitos laboratórios.
22
Devido a essa diversidade de procedimentos, os laboratórios geralmente
adotam métodos que melhor se adaptam à sua realidade, realizando, inclusive,
modificações para atender às suas particularidades. Assim, trabalhos colaborativos
interlaboratoriais têm encontrado dificuldade para comparar os resultados obtidos, que
normalmente apresentam grande variação, sendo uma das principais causas citadas
como fonte de erro o manuseio de amostras e preparo de hidrolisados (Lanfer Marquez,
1996).
Rodriguez-Amaya (1998), relata que autoridades internacionais sempre
recomendam o uso de métodos oficiais. O fato destes terem passado por rigorosos
estudos colaborativos interlaboratoriais é considerado atestado da sua exatidão e
precisão, portanto, da confiabilidade dos resultados. No entanto, esses métodos,
desenvolvidos e avaliados em estudos colaborativos nos países desenvolvidos, não são
facilmente adotados, e nem sempre atendem às necessidades dos países em
desenvolvimento. Cita ainda que, inevitavelmente, os métodos sofrem modificações ou
métodos alternativos são adotados. E também que, como os métodos oficiais devem ser
obrigatoriamente aprovados por estudos colaborativos trabalhosos e demorados, estes
estão sempre mais atrasados que o desenvolvimento das novas metodologias analíticas.
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os trabalhos experimentais de laboratório envolvendo os testes de
metodologias quanto a preparo das amostras, hidrólise de proteínas e separação e
quantificação dos aminoácidos foram realizados no Laboratório de Análises Físico
Químicas, do Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves da Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária (Embrapa Suínos e Aves), em Concórdia-SC.
3.1 Amostras
Foram utilizadas amostras de milho e farelo de soja, obtidas na fábrica de
rações da Embrapa Suínos e Aves, e de um hidrolisado ácido de caseína bovina, Sigma
referência A-2427, (SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO, USA).
As amostras de milho e farelo de soja são a base da produção de rações para
alimentação animal e, além disso, representam amostras com baixo e médio teor de
proteína, respectivamente. O hidrolisado ácido de caseína bovina foi utilizado para
representar amostras com alto teor de proteína.
24
3.2 Equipamentos
A hidrólise dos aminoácidos foi realizada em estufa tipo incubadora marca
FANEM Retilínea, (FANEM Ltda, São Paulo, SP, Brasil), e equipamento de
microondas PMD Pressurized Microwave Decomposition System PAAR (ANTON
PAAR KG, Áustria).
Para a evaporação dos reagentes foi utilizado dessecador de vidro sob
vácuo, evaporador rotativo Büchi (Büchi, Switzerland) e bloco digestor de
nitrogênio/proteína marca Tecnal (TECNAL Equipamentos para Laboratórios Ltda,
Piracicaba, SP, Brasil), com capacidade para 40 tubos de 100 mililitros (mL), sob fluxo
de argônio.
Os aminoácidos foram separados e quantificados em analisador de
aminoácidos Beckman System 6300 (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, USA),
equipado com integrador HP 3390A (Hewlett-Packard Avondale Division, Avondale,
PA, USA), e em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) Shimadzu modelo LC-
10AD (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan), equipado com coluna de troca iônica e
detetor de fluorescência.
3.3 Soluções e reagentes
3.3.1 Reagentes
Para a hidrólise e preparação dos hidrolisados foram utilizados os reagentes
ácido clorídrico – HCl - (Reagentes Analíticos Dinâmica, Brasil) e hidróxido de sódio –
NaOH - (Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro, Brasil), ambos grau analítico. Para a
25
evaporação dos hidrolisados em bloco digestor foi utilizado argônio 4.8, grau especial
(White Martins, Osasco-SP, Brasil).
Para a separação no analisador de aminoácidos Beckman System 6300,
foram utilizadas as soluções tamponadas comerciais Na-A, Na-B, Na-D, Na-R, Na-S e
Nin-RX (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, USA), conforme descrito por
Slocum et al. (1987).
Para a separação por CLAE, foram utilizadas as soluções tamponadas AA-
MA, AA-MB, AA-MC, AA-RA e AA-RB (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan),
conforme o manual de instruções para a análise de aminoácidos da Shimadzu
(Shimadzu Corporation, 1993).
Foram preparadas soluções padrão contendo os seguintes aminoácidos:
ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, prolina, glicina, alanina, valina, leucina,
tirosina, fenilalanina, lisina, arginina (E. Merck, Darmstadt, Germany), serina,
norleucina (INLAB, São Paulo, Brasil), isoleucina (SIGMA Chemical Company, St.
Louis, MO, USA) e histidina (Reagentes Analíticos ECIBRA, São Paulo, Brasil), a 2,5
micromol por mililitro (µMol/mL) em HCl a 0,1 %.
3.3.2 Soluções
Solução tampão Na-A Beckman (High Performance Amino Acid Analysis Buffer):
água 95 %, citrato de sódio 2 %, 2-metoxietanol 2% e ácido clorídrico 1 %.
Solução tampão Na-B Beckman (High Performance Amino Acid Analysis Buffer):
água 97,8 %, citrato de sódio 1,7 % e ácido clorídrico 0,5 %.
Solução tampão Na-D Beckman (High Performance Amino Acid Analysis Buffer):
água 93 %, cloreto de sódio 5 %, citrato de sódio 1,9 % e fenol 0,1%.
26
Solução tampão Na-R Beckman (High Performance Regeneration Reagent): hidróxido
de sódio e outros reagentes não especificados.
Solução tampão de diluição Na-S pH 2,0 Beckman (High Performance Amino Acid
Sample Dilution Buffer): água 96,4 %, citrato de sódio 2 %, ácido clorídrico
1 %, tiodiglicol 0,5 % e ácido benzóico 0,1 %.
Solução tampão Nin-RX Beckman (High Performance Ninhydrin Reagent):
dimetilsulfóxido 76,7 %, água 22,5 %, acetato de lítio 0,7%, ácido acético
0,1 %, ninidrina 18 g e hidrantina 0,7 g.
Solução padrão AA-MA Shimadzu: citrato de sódio 0,20 N (ajustado para pH 3,2 com
ácido perclórico) e 7 % de etanol.
Solução padrão AA-MB Shimadzu: citrato de sódio 0,60 N e ácido bórico 0,20 M
(ajustado para pH 10,0 com hidróxido de sódio 4 M).
Solução padrão AA-MC Shimadzu: hidróxido de sódio 0,20 M.
Solução tampão AA-RA Shimadzu: solução de ácido bórico – ácido carbônico
(pH 10,0).
Solução padrão AA-RB Shimadzu (Solução reagente de orto-ftaldeído - OPA): solução
de ácido bórico – ácido carbônico (pH 10,0), 0,08 % de OPA, 1,40 % de
etanol, 0,04 % de brij-35, 0,10 % de n-acetil-l-cisteína e 0,04% de hipoclorito
de sódio.
Solução de ácido bórico – ácido carbônico: 4,07 % de carbonato de sódio, 1,36 % de
ácido bórico e 1,88 % de sulfato de potássio em água destilada.
Solução padrão de neutralização: Em balão volumétrico de 100 mL foi dissolvido
10,5 gramas de hidróxido de sódio p.a. com 90 mL de solução tampão Na-S.
27
Após resfriar até a temperatura ambiente, o volume foi completado para
100 mL com a solução tampão Na-S.
Solução padrão de norleucina 2,5 µMol/mL: Em balão volumétrico de 100 mL foi
dissolvido 32,80 mg de norleucina (SIGMA Chemical Company, St. Louis,
MO, USA), com HCl 0,1 N.
Solução padrão de norleucina 1:25: Foi evaporado 1 mL da solução padrão de
norleucina 2,5 µMol/mL, filtrada em sistema de microfiltragem Millipore
(Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) de 13 mm, com membrana de
celulose regenerada a 0,2 mícrons, marca S & S (cortado e embalado por F.
Maia S/A, Brasil). Foi recuperado com 25 mL da solução tampão de Na-S.
3.4 Métodos
3.4.1 Preparo das amostras
Todas as amostras foram finamente moídas em moinho Tecator Cyclotec
(TECATOR AB, atualmente disponível pela Perstorp Analytical Inc., Silver Spring,
USA), utilizando peneira de 0,5 mm. Foram determinados os teores de Matéria Seca
(MS) pelo método de secagem em estufa a 105 °C durante 24 horas (Brasil, 1992),
Proteína Bruta (PB) segundo o método 4.2.06 da AOAC INTERNATIONAL (AOAC
International, 1995), utilizando digestor 2020 e unidade de destilação 1026 da Tecator,
Extrato Etéreo (EE) pelo método de Soxhlet utilizando unidade de extração Soxtec
System 1040 da Tecator, e aminoácidos, exceto metionina, cistina e triptofano para
todas as amostras.
28
3.4.2 Hidrólise e preparo dos hidrolisados
Para os métodos de evaporação dos reagentes da hidrólise, descrito nos itens
3.4.2.1, 3.4.2.2 e 3.4.2.3, quantidades das amostras de milho, farelo de soja e
hidrolisado ácido de caseína, contendo aproximadamente 4 mg de proteína, foram
hidrolisados, com 1 mL de HCl 6 N durante 22 horas em estufa a 110 ± 5 °C, em
ampolas de vidro de 10 mL.
Para o método de neutralização dos reagentes da hidrólise, descrito no item
3.4.2.4., foram utilizadas quantidades das amostras de milho, farelo de soja e
hidrolisado ácido de caseína, contendo aproximadamente 40 mg de proteína, e
hidrolisadas com 10 mL de HCl 6 N durante 22 horas em estufa a 110 ± 5 °C, em
ampolas de vidro de 10 mL.
O oxigênio foi retirado através de aspiração a vácuo e fluxo de nitrogênio
(três vezes), e as ampolas com a amostra e ácido foram seladas sob vácuo e submetidas
à hidrólise.
A proporção de amostra - HCl foi de 3 a 5 mg de proteína por mL de ácido
para todos os métodos (Spitz, 1973), sendo que, para o método de neutralização foi
utilizado uma quantidade dez vezes maior de ácido e amostra para evitar perdas de
diluição.
Os métodos de preparo dos hidrolisados protéicos foram desenvolvidos da
seguinte forma:
3.4.2.1 Método 1 - Evaporação em evaporador rotativo
O ácido utilizado na hidrólise foi evaporado em evaporador rotativo sob
29
vácuo a uma temperatura de 50 °C, conforme citado por Roach & Gehrke (1970),
Savoy et al. (1975), Benson et al. (1981), Chen et al. (1987), Van Der Meer (1990),
Péter et al. (1993), Lebet et al. (1994) e Marconi et al. (1995). O evaporado foi
recuperado em 5 mL da solução de diluição Na-S Beckman e filtrado, primeiro em
papel filtro de filtragem média JP 40 marca Quanty (J. Prolab, Curitiba, Brasil) e depois
com sistema de microfiltragem Millipore em membrana de celulose regenerada de
13mm a 0,2 mícron marca S&S. O filtrado foi diluído 1:1 com a solução padrão de
norleucina redissolvida 1:25.
3.4.2.2 Método 2 - Evaporação em dessecador a vácuo
O ácido foi evaporado em dessecador a vácuo em presença de 15 g de
NaOH em pastilhas, até a completa evaporação dos reagentes da hidrólise, como citado
por Savoy et al. (1975), Ambler (1981) e Lanfer Marquez (1994). O evaporado foi
recuperado e filtrado da mesma forma do método 1, e diluído 1:1 com a solução padrão
de norleucina redissolvida 1:25.
3.4.2.3 Método 3 - Evaporação em fluxo de argônio
O ácido foi evaporado com fluxo de argônio em bloco de aquecimento a
65 °C, segundo os métodos propostos por Gehrke et al. (1985) e Péter et al. (1993). O
evaporado foi recuperado e filtrado da mesma forma do método 1, e diluído 1:1 com a
solução padrão de norleucina redissolvida 1:25.
3.4.2.4 Método 4 – Neutralização
Os hidrolisados foram filtrados, primeiro em papel filtro de filtragem média
30
JP 40 marca Quanty e, depois, em sistema de microfiltragem Millipore com membrana
de celulose regenerada a 0,2 mícron e neutralizados com a solução padrão de
neutralização (na proporção de 1:2 de hidrolisado:solução padrão de neutralização). As
amostras neutralizadas foram diluídas com solução tampão de diluição Na-S Beckman
na proporção de 1:1, conforme Spitz (1973) e depois, diluídas novamente 1:1 com a
solução padrão de norleucina redissolvida 1:25.
3.4.2.5 Método 5 – Microondas
Neste método, os hidrolisados foram filtrados, primeiro em papel de filtro
de filtragem média JP 40 marca Quanty e, depois, em sistema de microfiltragem
Millipore com membrana de celulose regenerada a 0,2 mícrons e neutralizados com a
solução padrão de neutralização (na proporção de 1:2 de hidrolisado:solução
neutralizante). As amostras neutralizadas foram diluídas com solução tampão de
diluição Na-S Beckman na proporção de 1:1, conforme Spitz (1973) e depois, diluídas
novamente 1:1 com a solução padrão de norleucina redissolvida 1:25.
3.4.3 Experimento 1
O experimento 1 consistiu da separação e quantificação dos aminoácidos
para todas as amostras através dos métodos 1 a 4, no analisador específico para
aminoácidos Beckman System 6300.
Foram realizadas cinco repetições para cada método e amostra, divididas em
cinco blocos, onde os blocos foram compostos por uma repetição de cada método e
amostra. Os blocos amostrais foram hidrolisados, preparados e submetidos à análise de
forma independente e em datas diferentes.
31
Os aminoácidos foram quantificados e os resultados comparados
estatisticamente, conforme descrito no item 3.6.
3.4.4 Experimento 2
O experimento 2 consistiu da separação e quantificação dos aminoácidos
para todas as amostras através dos métodos 1 a 4, por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE).
Para este teste, foram utilizadas as mesmas amostras na forma como
preparadas para o experimento 1.
3.4.5 Experimento 3
O experimento 3 consistiu em um teste experimental para verificar a
viabilidade da utilização do equipamento de microondas PMD Pressurized Microwave
Decomposition System PAAR para a hidrólise de proteínas para a análise de
aminoácidos.
Para este teste, foi utilizado apenas a amostra milho, por possuir menor teor
protéico e, teoricamente, apresentar maior dificuldade de hidrólise pela presença de
possíveis interferentes.
Desse modo, para cada análise, foram utilizadas quantidades de 30 a 50 mg
da amostra milho, que foram submetidos à hidrólise em 8 mL de ácido clorídrico (HCl)
6 N, conforme proposto por Marconi et al. (1995).
Este experimento foi desenvolvido em duas fases; a primeira consistiu de
um teste para determinar os tempos e potências em que a hidrólise foi completa,
utilizando-se as potências 2, 4, 6, 8 e 10 (de uma escala de 2 a 12), e tempos de 1, 2, 4,
32
8, 16 e 32 minutos para cada fator de potência. Na segunda fase, para os fatores de
potência que apresentaram maior eficiência, foram repetidas as análises em unidades de
tempo onde o teor total dos aminoácidos recuperados foi mais elevado, com o objetivo
de identificar o melhor tempo de hidrólise.
Os hidrolisados assim obtidos, foram filtrados em sistema de microfiltragem
Millipore, com membrana de celulose regenerada a 0,2 mícrons e diluídos em solução
padrão de neutralização, conforme Spitz (1973), e os aminoácidos separados e
quantificados em analisador de aminoácidos Beckman System 6300.
3.4.6 Experimento 4
O experimento 4 consistiu da comparação entre os resultados obtidos nos
experimentos 1 e 2.
3.4.7 Condições cromatográficas
Para todos os experimentos, as condições cromatográficas para a separação
e detecção dos aminoácidos foram as seguintes:
3.4.7.1 Analisador de aminoácidos Beckman System 6300
O analisador de aminoácidos Beckman System 6300 foi utilizado segundo o
método padrão Na-A, -B, -D, para coluna de troca iônica de sódio Beckman de 25 cm,
como descrito por Slocum et al. (1987), parcialmente modificado, como segue:
Parâmetros de análise:
Soluções:
B1 (Na-A) aos 52 minutos.
33
B2 (Na-B) aos 16,2 minutos.
B3 (Na-D) aos 27,4 minutos.
B6 (Na-R) aos 51 minutos.
Solvente (H2O) aos 50 minutos.
Reagente (Nin-RX) aos 53 minutos.
Temperatura da coluna:
T1 - 50 °C aos 36 minutos.
T2 - 65 °C aos 02 minutos.
T3 - 77 °C aos 15 minutos.
Outros parâmetros:
Leitura de dados (Rd) aos 52 minutos.
Final de análise (Rc) aos 57 minutos.
Gradiente de aquecimento da coluna = 1 °C/min.
Fluxo das soluções tamponadas = 20 mL/h.
Fluxo do reagente = 10 mL/h.
Volume de injeção = 50 µL.
3.4.7.2 CLAE
O cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) Shimadzu LC-10AD foi
utilizado segundo o manual para a análise de aminoácidos do equipamento
(SHIMADZU CORPORATION, 1993), para coluna de troca iônica de sódio Shimadzu
Shim-pack Amino-Na de 4,6 x 100 mm, como segue:
34
Parâmetros de análise:
Soluções:
A (AA-MA) pH 3,0.
B (AA-MB) pH 10,0.
C (AA-MC) NaOH 10M.
Reagente A - OPA - (AA-RA).
Reagente B (AA-RB).
Temperatura da coluna: 60 °C.
Fluxo: 0,6 mL/min.
Gradiente de pH:
100 % da solução A até 09 minutos.
7 % da solução B aos 13 minutos.
8 % da solução B aos 17,2 minutos.
11 % da solução B aos 17,21 minutos.
11 % da solução B aos 20,8 minutos.
50 % da solução B aos 20,81 minutos.
58 % da solução B aos 22 minutos.
100 % da solução B aos 22,01 minutos.
100 % da solução B aos 29 minutos.
100 % da solução C aos 29,01 minutos.
100 % da solução A aos 35 minutos.
Fim da análise aos 59 minutos.
Volume de injeção = 50 µL.
35
3.5 Determinação do teor de aminoácidos
O teor de cada aminoácido presente nas amostras foi calculado utilizando-se
a equação (1).
PM . Sa . a . V2 . V4 . 100
Aminoácido (%) = -------------------------------------------- . fc (1)
Sp . V1 . V3 . pa . 1000
Onde:
PM - Peso molecular do aminoácido.
Sa - Área do pico do aminoácido na amostra.
Sp - Área do pico do aminoácido no padrão.
a - Número de micromoles do aminoácido no padrão.
V1 - Volume injetado da amostra (0,05 mL).
V2 - Volume redissolvido da amostra em mL.
V3 - Volume evaporado da amostra em mL.
V4 - Volume hidrolizado da amostra em mL.
pa - peso da amostra em mg.
fc - fator de correção do padrão interno norleucina, calculado pela
equação (2).
Sp (Norleucina)
fc = ------------------------ (2)
Sa (Norleucina)
36
3.6 Análise estatística
Nas análises estatísticas foi utilizado o sistema estatístico SAS (Statistical
Analysis System), versão 6.12 para Microsoft Windows 95 (SAS Institute Inc., 1996).
3.6.1 Experimentos 1 e 2
O modelo utilizado para esses experimentos foi para a análise de um
experimento fatorial de 4 x 3, onde 4 são os níveis do fator métodos e 3 são os níveis do
fator amostras, de acordo com Steel & Torie (1981).
Esse modelo está caracterizado conforme a equação (3):
Yijk = µ + mi + aj + maij + eijk (3)
Onde:
i = 1, 2, 3 e 4 métodos;
j = 1, 2 e 3 amostras;
k = 1, ..., 5 repetições de cada combinação;
yijk = valor da resposta analisada na k-ésima repetição pertencente ao método
“i” e amostra “j”;
µ = média da resposta no experimento;
mi = efeito do método “i”;
aj = efeito da amostra “j”;
maij = efeito da interação método x amostra;
37
eijk = erro laboratorial não observável, suposto seguir a distribuição de
probabilidade normal, com média 0 (zero) e variância constante; isto
é: eijk ∼ N (0, σ2).
O modelo fatorial foi adotado com a finalidade de melhorar a precisão das
estimativas e dos testes das hipóteses, pois proporciona maior número de repetições,
nos casos em que não ocorre interação entre métodos e amostras.
Este modelo foi aplicado, inicialmente, a um vetor de respostas envolvendo
15 aminoácidos: ácido aspártico (Asp), treonina (Tre), serina (Ser), ácido glutâmico
(Glu), prolina (Pro), glicina (Gli), alanina (Ala), valina (Val), isoleucina (Ile), leucina
(Leu), tirosina (Tir), fenilalanina (Fen), histidina (His), lisina (Lis) e arginina (Arg),
para o qual foi realizado uma análise multivariada. Posteriormente, o mesmo modelo foi
aplicado para cada aminoácido individualmente, em uma análise univariada, cuja
finalidade é conhecer individualmente os resultados de cada aminoácido.
Na análise multivariada foi determinado, complementarmente, as duas
primeiras funções discriminantes canônicas de Fisher, formadas por:
Can1 = a1 x Asp + a2 x Tre + ... + a15 x Arg
Can2 = b1 x Asp + b2 x Tre + ... + b15 x Arg
Essas funções têm como finalidade permitir a transformação do vetor de
respostas da dimensão 15 para a dimensão 2, possibilitando uma visualização gráfica
para a comparação entre métodos e amostras envolvendo simultaneamente a análise de
todos os aminoácidos.
38
A determinação dessas funções é obtida de modo que a perda de informação
em relação ao total dos 15 aminoácidos seja mínima.
Nas análises estatísticas foram testadas as seguintes hipóteses:
1 – Comparação entre métodos, independente de amostras;
2 – Comparação de amostras, independente de métodos;
3 – Interação métodos x amostras;
4 – Comparação entre métodos de evaporação, independente de amostras;
5 – Teste de contraste entre métodos de evaporação versus método de neutralização,
independente de amostras;
6 – Comparações múltiplas entre métodos, independente de amostras;
7 – Em casos de interação métodos x amostras, foram testadas as hipóteses 1, 4, 5 e 6
dentro de cada amostra.
A análise multivariada das hipóteses foi realizada por 4 (quatro) testes
simultâneos, sobre os resultados analíticos sem qualquer censura:
1 – Teste de Wilks ou da máxima verossimilhança;
2 – Teste de Pillai;
3 – Teste de Hotteling-Lawley;
4 – Teste de Roy.
Guidoni (1997), descreve a conceituação elementar dos métodos, o
significado dos parâmetros estatísticos e as respectivas fórmulas de cálculo.
A hipótese foi considerada como rejeitada quando pelo menos um dos testes
mostrou significância (P < 0,05).
Nas análises univariadas, essas mesmas hipóteses foram submetidas ao teste
F. No caso de comparações múltiplas, foram submetidas ao teste T, protegido pela
39
significância do teste F global. Para essas análises os dados foram censurados, através
de dupla eliminação, adotando-se como regra um coeficiente de variação (CV) máximo
de 10 % para cada variável.
Embora o modelo leve em consideração o efeito de amostras, elas não foram
comparadas pelo fato de que são sabidamente diferentes. Mesmo assim, este modelo foi
adotado com o objetivo de maximizar a precisão experimental, sendo que, as
comparações das hipóteses 1, 4, 5 e 6 para cada amostra são desdobramentos do modelo
global (Cochram & Cox, 1979).
3.6.2 Experimentos 3 e 4
Para esse experimento foi realizada uma análise exploratória dos dados, que
foram relativizados, dividindo-se o teor recuperado de cada aminoácido com o valor
médio obtido pelo método 4 do experimento 1 para a amostra milho, o qual foi
considerado como 100 %.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análise de composição química
Nas amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína foram
determinados os teores de matéria seca total (MS), proteína bruta (PB), extrato etéreo
(EE) e matéria mineral (Cinzas), cujos resultados são apresentados na Tabela 01, em
g/100g da amostra com base na matéria natural. A composição em aminoácidos para
todas as amostras e métodos estudados, em valores médios, independentemente de
metodologia, são apresentados no Quadro 01, em g/100g da amostra com base na
matéria natural.
Tabela 01. Teores de matéria seca total (MS), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE) e
matéria mineral (Cinzas)(1) nas amostras utilizadas nos experimentos, em
g/100g da amostra com base na matéria natural.
Amostras
MS
(g/100g)
PB(2)
(g/100g)
EE
(g/100g)
Cinzas
(g/100g)
Milho 91,56 7,13 3,92 0,97
Farelo de Soja 91,03 42,11 1,33 6,00
Caseína 96,62 81,34 0,31 2,12
(1) Média de 3 repetições.(2) Valores calculados pelo fator de conversão de nitrogênio para proteína de 5,72 para o
milho, 5,70 para o farelo de soja e 6,38 para o hidrolisado ácido de caseína (Dintzis et
al., 1988; Sosulski & Imafidon, 1990; Yamaguchi, 1992).
41
Quadro 01. Composição em aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e
hidrolisado ácido de caseína, obtidas em analisador específico Beckman e
CLAE, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com base na
matéria natural.
Milho Farelo de Soja Caseína
Beckman
(g/100g)
CLAE
(g/100g)
Beckman
(g/100g)
CLAE
(g/100g)
Beckman
(g/100g)
CLAE
(g/100g)
Asp 0,45±0,01 0,48±0,01 4,85±0,04 6,22±0,10 3,47±0,06 3,77±0,11
Tre 0,24±0,00 0,26±0,01 1,64±0,01 1,75±0,03 2,36±0,04 2,51±0,07
Ser 0,31±0,00 0,35±0,01 2,07±0,02 2,41±0,04 1,58±0,03 1,74±0,05
Glu 1,23±0,01 1,59±0,04 7,60±0,06 10,01±0,19 16,07±0,26 23,48±1,01
Pro 0,49±0,01 0,66±0,02 1,84±0,05 2,29±0,04 9,32±0,21 11,21±0,29
Gli 0,26±0,00 0,30±0,01 1,80±0,01 2,14±0,04 1,70±0,03 1,80±0,05
Ala 0,48±0,01 0,53±0,02 1,75±0,02 1,79±0,07 5,15±0,08 6,20±0,26
Val 0,31±0,01 0,33±0,01 1,87±0,04 1,84±0,08 5,82±0,09 6,19±0,23
Ile 0,32±0,01 0,35±0,01 2,72±0,06 3,00±0,05 6,14±0,10 7,13±0,16
Leu 0,79±0,01 0,93±0,02 3,13±0,03 3,50±0,05 7,00±0,10 8,31±0,24
Tir 0,18±0,00 0,17±0,01 1,43±0,01 1,59±0,04 2,69±0,05 2,64±0,16
Fen 0,32±0,00 0,33±0,01 2,14±0,02 2,29±0,03 3,40±0,05 3,59±0,18
His 0,20±0,00 0,22±0,00 1,06±0,01 1,22±0,02 2,00±0,03 2,43±0,07
Lis 0,21±0,00 0,22±0,00 2,52±0,02 2,68±0,04 7,11±0,11 7,33±0,28
Arg 0,29±0,00 0,30±0,01 2,99±0,03 3,18±0,05 2,63±0,04 2,65±0,15
Total 6,08±0,01 7,02±0,01 39,41±0,03 45,89±0,06 76,44±0,09 90,98±0,22
O perfil de aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado
ácido de caseína, obtidas em analisador específico Beckman e CLAE, nos dados não
censurados, em g/100g de proteína com base na matéria natural é apresentado no
Quadro 02.
42
Quadro 02. Perfil de aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado
ácido de caseína, obtidas em analisador específico Beckman e CLAE, nos
dados não censurados, em g/100g de proteína com base na matéria natural.
Milho Farelo de Soja Caseína
Beckman
(g/100g)
CLAE
(g/100g)
Beckman
(g/100g)
CLAE
(g/100g)
Beckman
(g/100g)
CLAE
(g/100g)
Asp 6,31 6,73 11,52 14,77 4,27 4,63
Tre 3,37 3,65 3,89 4,16 2,90 3,09
Ser 4,35 4,91 4,92 5,72 1,94 2,14
Glu 17,25 22,30 18,05 23,77 19,76 28,87
Pro 6,87 9,26 4,37 5,44 11,46 13,78
Gli 3,65 4,21 4,27 5,08 2,09 2,21
Ala 6,73 7,43 1,16 4,25 6,33 7,62
Val 4,35 4,63 4,44 4,37 7,16 7,61
Ile 4,49 4,91 6,46 7.12 7,55 8,77
Leu 11,08 13,04 7,43 8,31 8,61 10,22
Tir 2,52 2,38 3,40 3,78 3,31 3,25
Fen 4,49 4,63 5,08 5,44 4,18 4,41
His 2,81 3,09 2,52 2,90 2,46 2,99
Lis 2,95 3,09 5,98 6,36 8,74 9,01
Arg 4,07 4,21 7,10 7,55 3,23 3,26
Total 85,29 98,47 90,59 120,90 93,99 111,86
Os valores mínimos e máximos para cada aminoácido, independente de
método, obtidos nas amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína,
em analisador específico Beckman e CLAE, nos dados não censurados, em g/100g da
amostra com base na matéria natural são apresentados nos Quadros 03 e 04,
43
respectivamente. Os valores mínimos e máximos obtidos em cada método nas mesmas
amostras e equipamentos são apresentados nos Anexos 01 a 06.
Quadro 03. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, independente
de método, nos dados não censurados, para as amostras de milho, farelo de
soja e hidrolisado ácido de caseína, em g/100g da amostra com base na
matéria natural, para o analisador de aminoácidos Beckman System 6300.
Milho Farelo de Soja Caseína
Mínimo
(g/100g)
Máximo
(g/100g)
Mínimo
(g/100g)
Máximo
(g/100g)
Mínimo
(g/100g)
Máximo
(g/100g)
Asp 0,39 0,48 4,47 5,24 2,51 3,80
Tre 0,23 0,27 1,56 1,76 1,72 2,51
Ser 0,28 0,34 1,97 2,19 1,09 1,72
Glu 1,11 1,37 7,08 8,22 11,55 17,64
Pro 0,42 0,59 1,46 2,32 6,70 11,04
Gli 0,24 0,30 1,69 1,95 1,23 1,83
Ala 0,44 0,53 1,55 1,88 3,94 5,61
Val 0,26 0,35 1,50 2,16 4,66 6,68
Ile 0,26 0,37 2,07 3,10 4,87 7,09
Leu 0,71 0,86 2,86 3,39 5,28 7,51
Tir 0,15 0,21 1,37 1,57 1,89 2,92
Fen 0,29 0,34 1,95 2,29 2,52 3,66
His 0,18 0,23 1,01 1,13 1,43 2,13
Lis 0,19 0,25 2,36 2,69 5,26 7,73
Arg 0,25 0,33 2,84 3,30 1,93 2,89
44
Quadro 04. Valores máximos e mínimos obtidos para cada amostra, independente de
método, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com base na
matéria natural, para CLAE.
Milho Farelo de Soja Caseína
Mínimo
(g/100g)
Máximo
(g/100g)
Mínimo
(g/100g)
Máximo
(g/100g)
Mínimo
(g/100g)
Máximo
(g/100g)
Asp 0,40 0,56 5,38 7,12 2,93 4,68
Tre 0,22 0,31 1,50 1,92 1,81 2,86
Ser 0,29 0,41 1,97 2,64 1,22 2,08
Glu 1,30 1,95 8,46 11,35 16,85 35,73
Pro 0,56 0,83 2,03 2,59 8,53 12,76
Gli 0,25 0,38 1,79 2,46 1,40 2,26
Ala 0,37 0,72 1,13 2,19 4,45 8,05
Val 0,26 0,40 1,23 2,37 4,68 7,99
Ile 0,26 0,42 2,56 3,43 5,68 7,94
Leu 0,78 1,09 2,98 3,81 6,25 10,07
Tir 0,13 0,21 1,26 1,83 0,00 3,28
Fen 0,30 0,39 2,09 2,49 0,81 4,21
His 0,19 0,25 1,06 1,34 1,72 2,82
Lis 0,19 0,25 2,41 3,06 3,39 8,52
Arg 0,25 0,36 2,81 3,67 0,34 3,16
4.2 Experimentos 1 e 2
Os resultados obtidos para o experimento 1 (separação e quantificação dos
aminoácidos para todos os métodos e amostras através de analisador de aminoácidos
Beckman) e para o experimento 2 (separação e quantificação através de CLAE), foram
45
analisados estatisticamente em duas etapas, na primeira através de uma análise
multivariada utilizando-se as informações sem qualquer censura e na segunda, por meio
de uma análise univariada, com os dados censurados através de dupla eliminação,
utilizando-se como regra a eliminação do valor discrepante quando o coeficiente de
variação entre as repetições de cada variável foi maior que 10 %.
Os resultados médios para os aminoácidos: ácido aspártico (Asp), treonina
(Tre), serina (Ser), ácido glutâmico (Glu), prolina (Pro), glicina (Gli), alanina (Ala),
valina (Val), isoleucina (Ile), leucina (Leu), tirosina (Tir), fenilalanina (Fen), histidina
(His), lisina (Lis) e arginina (Arg), encontrados para cada método, independentemente
de amostra, determinados em cada experimento são apresentados nos Anexos 07 e 08
para o analisador específico Beckman e CLAE, respectivamente.
Para a ilustração gráfica do vetor de médias, resultante da análise
multivariada, foram determinadas as duas primeiras funções discriminantes canônicas
de Fisher, formadas pelas equações (4) e (5), para o experimento 1, contendo 99,67 %
da quantidade total de informação:
Can1 = -8,186237 x Asp + 8,8200454 x Tre - 23,70557 x Ser + 4,6620632 x Glu (4)
+ 0,3757758 x Pro - 12,63843 x Gli - 0,127842 x Ala + 1,1759527 x Val
- 0,527894 x Ile + 7,6863718 x Leu - 6,375552 x Tir + 7,4549017 x Fen
- 1,005684 x His - 7,630186 x Lis - 3,222784 x Arg
Can2 = +7.3820202 x Asp + 15.562379 x Tre + 1.0268628 x Ser + 0.1226787 x Glu (5)
+ 1.4469548 x Pro - 35.27413 x Gli - 2.633601 x Ala + 9.8396676 x Val
- 7.311142 x Ile - 4.715367 x Leu - 6.643439 x Tir + 7.0742442 x Fen
- 10.14193 x His + 4.5161321 x Lis + 9.6178412 x Arg
46
e das equações (6) e (7), para o experimento 2, contendo 99,13 % da quantidade total de
informação:
Can1 = -3.668083 x Asp - 17.24707 x Tre + 4.7682632 x Ser + 0.5602176 x Glu (6)
- 0.466001 x Pro - 3.227726 x Gli - 1.525742 x Ala + 3.4895624 x Val
- 1.243465 x Ile + 2.8794588 x Leu + 3.7474366 x Tir - 6.621929 x Fen
+ 12.32277 x His + 3.7371878 x Lis - 5.016319 x Arg
Can2 = +1.8674307 x Asp - 18.98067 x Tre + 13.766842 x Ser + 0.3610235 x Glu (7)
- 2.110563 x Pro - 5.838949 x Gli - 0.919838 x Ala + 1.5003894 x Val
+ 13.892248 x Ile - 3.940527 x Leu - 0.112246 x Tir -2.099717 x Fen +
3.2800832 x His + 0.8069744 x Lis - 2.943403 x Arg
Independentemente de amostra, para os 15 aminoácidos citados, analisados
em conjunto, através do vetor de médias, os métodos mostraram-se diferentes para
ambos os experimentos, apresentando interação entre métodos e amostras (P < 0,05). Os
resultados estatísticos indicando o nível mínimo de significância envolvendo os
métodos, amostras e a interação métodos x amostras são apresentados na Tabela 02,
para o analisador de aminoácidos Beckman e CLAE.
Devido à presença de interação entre métodos e amostras, todas as hipóteses
foram testadas quanto ao seu comportamento para cada amostra, individualmente.
Para a amostra milho não foi evidenciada a presença de diferenças entre os
métodos, tanto para o analisador específico quanto para CLAE. Os resultados médios
para cada método são apresentados nos Anexos 09 e 10, para cada equipamento. As
Figuras 02 e 03 mostram a visualização gráfica dos vetores de médias entre as variáveis
canônicas Can1 e Can2, e os resultados estatísticos indicando o nível mínimo de
47
significância envolvendo as diferentes hipóteses multivariadas sobre os métodos, para a
amostra milho são apresentados na Tabela 03, para ambos os equipamentos.
Tabela 02. Nível mínimo de significância, envolvendo os métodos, amostras e a
interação métodos x amostras (P < 0,05), através dos testes de Wilks,
Pillai, Hotteling-Lawley e Roy, independente de amostra, no analisador de
aminoácidos Beckman e CLAE.
Fonte de variação GL Wilks Pillai Hotteling-
Lawley
Roy
Analisador Beckman
Métodos 3 0,0072 0,0368 0,0009 0,0001
Amostras 2 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Interação Métodos x Amostras 6 0,5378 0,5915 0,4998 0,0032
CLAE
Métodos 3 0,0001 0,0008 0,0001 0,0001
Amostras 2 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Interação Métodos x Amostras 6 0,0804 0,2584 0,0156 0,0001
Para a amostra farelo de soja verificou-se a existência de diferenças entre os
métodos (P < 0,05), para ambos os equipamentos. Os métodos de evaporação não
diferiram entre si, enquanto que, pela análise de contraste diferiram do método de
neutralização dos reagentes da hidrólise, com exceção do método 3, que não apresentou
diferenças. Os resultados médios para cada método são apresentados no Anexo 11 para
o analisador Beckman e Anexo 12 para CLAE. As Figuras 04 e 05 mostram a
visualização gráfica dos vetores de médias entre as variáveis canônicas Can1 e Can2
para esta amostra.
48
12
3
4
5
6
79
11
12
1314
15
16
17
19
8
10
18
1 – Asp 2 – Tre 3 – Ser 4 – Glu 5 – Pro 6 – Gli 7 – Ala 8 – Cis 9 – Val
10 – Met 11 – Ile 12 – Leu 13 – Nor 14 – Tir 15 – Fen 16 – His 17 – Lis 18 – Amn 19 - Arg
Figura 01. Aminograma do padrão de aminoácidos, obtido em analisador BeckmanSystem 6300. 1 – Ácido aspártico (Asp), 2 – Treonina (Tre), 3 – Serina(Ser), 4 – Ácido glutâmico (Glu), 5 – Prolina (Pro), 6 – Glicina (Gli), 7 -Alanina (Ala), 8 – Cistina (Cis), 9 – Valina (Val), 10 – Metionina (Met),11 – Isoleucina (Ile), 12 - Leucina (Leu), 13 – Norleucina (Nor), 14 –Tirosina (Tir), 15 – Fenilalanina (Fen), 16 – Histidina (His), 17 Lisina(Lis), 18 – Amônia (Amn) e 19 - Arginina (Arg).
Tabela 03. Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses
multivariadas sobre os métodos (P > 0,05), através dos testes de Wilks,
Pillai, Hotteling-Lawley e Roy, para a amostra milho, no analisador de
aminoácidos Beckman e CLAE.
Fonte de variação GL Wilks Pillai Hotteling-
Lawley
Roy
Métodos Beckman 3 1,0000 1,0000 1,0000 0,9994
Métodos CLAE 3 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000
49
-2,0
-1,5
-1,0
-3,0 -2,5 -2,0
Can2
Can
1
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 02. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra milho, para o analisador de aminoácidos Beckman(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3:fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
-2,5
-2,0
-1,5
-2,0 -1,5 -1,0
Can2
Can
1
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 03. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra milho, para CLAE (Método 1: evaporador rotativo;Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio; Método 4:neutralização).
50
-60,5
-60,0
-59,5
-59,0
16,8 17,3 17,8 18,3 18,8 19,3
Can2
Can
1
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 04. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra farelo de soja, para o analisador de aminoácidosBeckman (Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo;Método 3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
-37
-36
-35
-34
-33
-32
-31
16,5 17,5 18,5 19,5 20,5
Can2
Can
1
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 05. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra farelo de soja, para CLAE (Método 1: evaporadorrotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio;Método 4: neutralização).
51
Figura 06. Aminograma do padrão de aminoácidos, obtido em CLAE.
Os resultados estatísticos indicando o nível mínimo de significância
envolvendo as diferentes hipóteses multivariadas sobre os métodos, para a amostra
farelo de soja são apresentados na Tabela 04.
Para a amostra hidrolisado ácido de caseína os métodos mostraram-se
diferentes, em ambos os equipamentos, com exceção dos métodos 3 e 4, para o
analisador Beckman, que não diferiram entre si. Os resultados médios para cada método
são apresentados nos Anexos 13 e 14, para o analisador Beckman e CLAE,
respectivamente.
As Figuras 07 e 08 mostram a visualização gráfica dos vetores de médias
entre as variáveis canônicas Can1 e Can2 e os resultados estatísticos indicando o nível
mínimo de significância envolvendo as diferentes hipóteses multivariadas sobre os
52
métodos são apresentados na Tabela 05, para os resultados obtidos em ambos os
equipamentos.
Tabela 04. Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses
multivariadas sobre os métodos (P < 0,05), através dos testes de Wilks,
Pillai, Hotteling-Lawley e Roy, para a amostra farelo de soja, no analisador
de aminoácidos Beckman e CLAE.
Fonte de variação GL Wilks Pillai Hotteling-
Lawley
Roy
Analisador Beckman
Métodos 3 0,1501 0,3989 0,0342 0,0001
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,7187 0,7676 0,6709 0,1394
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0030 0,0030 0,0030 0,0030
Método 1 x 4 1 0,0094 0,0094 0,0094 0,0094
Método 2 x 4 1 0,0016 0,0016 0,0016 0,0016
Método 3 x 4 1 0,4095 0,4095 0,4095 0,4095
CLAE
Métodos 3 0,0869 0,2882 0,0140 0,0001
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,5276 0,5609 0,4984 0,1109
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0019 0,0019 0,0019 0,0019
Método 1 x 4 1 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003
Método 2 x 4 1 0,0217 0,0217 0,0217 0,0217
Método 3 x 4 1 0,4085 0,4085 0,4085 0,4085
53
11,4
11,9
12,4
12,9
26 27 28 29 30
Can2
Can
1
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 07. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra hidrolisado ácido de caseína, para o analisador deaminoácidos Beckman (Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmarassob vácuo; Método 3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
9,8
10,3
10,8
11,3
11,8
12,3
22 23 24 25 26 27 28
Can2
Can
1
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 08. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra hidrolisado ácido de caseína, para CLAE (Método 1:evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo deargônio; Método 4: neutralização).
54
Tabela 05. Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses
multivariadas sobre os métodos (P < 0,05), através dos testes de Wilks,
Pillai, Hotteling-Lawley e Roy, para a amostra hidrolisado ácido de caseína,
no analisador de aminoácidos Beckman e CLAE.
Fonte de variação GL Wilks Pillai Hotteling-
Lawley
Roy
Analisador Beckman
Métodos 3 0,0001 0,0002 0,0001 0,0002
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0002 0,0002 0,0003 0,0005
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0328 0,0328 0,0328 0,0328
Método 1 x 2 1 0,0017 0,0017 0,0017 0,0017
Método 1 x 3 1 0,0470 0,0470 0,0470 0,0470
Método 1 x 4 1 0,0310 0,0310 0,0310 0,0310
Método 2 x 3 1 0,0022 0,0022 0,0022 0,0022
Método 2 x 4 1 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004
Método 3 x 4 1 0,4493 0,4493 0,4493 0,4493
CLAE
Métodos 3 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0005 0,0026 0,0001 0,0001
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Método 1 x 2 1 0,0851 0,0851 0,0851 0,0851
Método 1 x 3 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Método 1 x 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Método 2 x 3 1 0,0220 0,0220 0,0220 0,0220
Método 2 x 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Método 3 x 4 1 0,0021 0,0021 0,0021 0,0021
55
9 – Ile 10 – Leu 11 – Nor 12 – Tir 13 – Fen 14 – His 15 – Lis 16 - Arg
1 – Asp 2 – Tre 3 – Ser 4 – Glu 5 – Pro 6 – Gli 7 – Ala 8 – Val
1
2
34
5
6 7
8 9
10
1112
13
14
15
16
Figura 09. Aminograma da amostra milho, obtido em analisador Beckman System
6300.
Embora exista interação entre métodos e amostras, quando analisados
independentemente de amostras os métodos 1 e 2 diferiram do método 4, para ambos os
equipamentos. O método 3 diferiu apenas do método 2 para o analisador Beckman. Para
CLAE, o método 3 não apresentou diferenças em relação ao método 2, diferindo dos
demais. Os resultados estatísticos indicando o nível mínimo de significância envolvendo
as diferentes hipóteses multivariadas sobre os métodos, independentemente de amostra
e da interação métodos x amostras são apresentados no Anexo 15. As Figuras 10 e 11
mostram a visualização gráfica dos vetores de médias entre as variáveis canônicas Can1
e Can2.
56
-16,7
-16,2
-15,7
13 14 15 16
Can2
Can
1
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 10. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, independente de amostra, para o analisador de aminoácidosBeckman (Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo;Método 3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
-10
-9
-8
-7
12 13 14 15 16
Can2
Can
1
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 11. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, independente de amostra, para CLAE (Método 1: evaporadorrotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio;Método 4: neutralização).
57
Figura 12. Aminograma da amostra milho, obtido em CLAE.
9 – Ile 10 – Leu 11 – Nor 12 – Tir 13 – Fen 14 – His 15 – Lis 16 - Arg
1 – Asp 2 – Tre 3 – Ser 4 – Glu 5 – Pro 6 – Gli 7 – Ala 8 – Val
101
2
3 4
5
6
7
8
9
1112
13
14
15
16
Figura 13. Aminograma da amostra farelo de soja, obtido em analisador Beckman
System 6300.
58
Figura 14. Aminograma da amostra farelo de soja, obtido em CLAE.
9 – Ile 10 – Leu 11 – Nor 12 – Tir 13 – Fen 14 – His 15 – Lis 16 - Arg
1 – Asp 2 – Tre 3 – Ser 4 – Glu 5 – Pro 6 – Gli 7 – Ala 8 – Val
16
1
2
3
4
5
6
7
89
10
1112
13
14
15
Figura 15. Aminograma da amostra hidrolisado ácido de caseína, obtido em
analisador Beckman System 6300.
59
Figura 16. Aminograma da amostra hidrolisado ácido de caseína, obtido em CLAE.
Para identificar os aminoácidos responsáveis por essas variações, foi
realizado uma análise univariada para cada variável, cujos resultados são discutidos a
seguir.
Devido à alta variabilidade encontrada nos resultados obtidos utilizando
CLAE, após a dupla eliminação, os dados remanescentes não foram suficientes para
realizar a análise univariada para o experimento 2. Assim, para essas informações foi
realizada apenas a análise estatística multivariada. As possíveis causas dessa
variabilidade são discutidas no item 4.4.
Para o analisador de aminoácidos Beckman, a análise univariada mostrou a presença de
interação métodos x amostras (P < 0,05) para a treonina, serina, tirosina, fenilalanina e
lisina, esta a um nível de 5,20 %, sendo que, para a treonina e a serina os métodos
também resultaram diferentes. Para todos os demais aminoácidos não foi evidenciado
diferenças.
60
Para a treonina e serina foi observado diferença entre os métodos para as amostras de
farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína, enquanto que, para a tirosina, fenilalanina
e lisina os métodos resultaram diferentes apenas para a amostra hidrolisado ácido de
caseína. Para a amostra milho não foram encontradas diferenças entre os métodos.
Os resultados estatísticos indicando o nível mínimo de significância
envolvendo as diferentes hipóteses sobre os métodos, e os teores médios para cada
aminoácido, nos dados censurados, são apresentados nos Anexos 16 à 45.
O teor dos aminoácidos treonina, serina, tirosina, fenilalanina e lisina, nas
amostras farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína em g/100g da amostra na matéria
natural, determinados para cada método, são apresentados graficamente nas Figuras 17
a 23, através de seus valores médios.
1,50
1,55
1,60
1,65
1,70
1,75
Metodo 1 Método 2 Método 3 Método 4
Métodos
Tre
onin
a (g
/100
g)
Figura 17: Visualização gráfica do teor de treonina, determinado para cada métodona amostra farelo de soja, utilizando o analisador de aminoácidosBeckman, em g/100g da amostra na matéria natural (Método 1:evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo deargônio; Método 4: neutralização).
61
1,90
1,95
2,00
2,05
2,10
2,15
2,20
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Métodos
Seri
na (g
/100
g)
Figura 18. Visualização gráfica do teor de serina, determinado para cada método naamostra farelo de soja, utilizando o analisador de aminoácidos Beckman,em g/100g da amostra na matéria natural (Método 1: evaporador rotativo;Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio; Método 4:neutralização).
2,20
2,25
2,30
2,35
2,40
2,45
2,50
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Métodos
Tre
onin
a (g
/100
g)
Figura 19. Visualização gráfica do teor de treonina, determinado para cada métodona amostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisador deaminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
62
1,45
1,50
1,55
1,60
1,65
1,70
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Métodos
Seri
na (g
/100
g)
Figura 20. Visualização gráfica do teor de serina, determinado para cada método naamostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisador deaminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
2,55
2,60
2,65
2,70
2,75
2,80
2,85
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Métodos
Tir
osin
a (g
/100
g)
Figura 21. Visualização gráfica do teor de tirosina, determinado para cada métodona amostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisador deaminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
63
3,25
3,30
3,35
3,40
3,45
3,50
3,55
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Métodos
Feni
lala
nina
(g/1
00g)
Figura 22. Visualização gráfica do teor de fenilalanina, determinado para cadamétodo na amostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisadorde aminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
6,80
6,90
7,00
7,10
7,20
7,30
7,40
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Métodos
Lis
ina
(g/1
00g)
Figura 23. Visualização gráfica do teor de lisina, determinado para cada método naamostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisador deaminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).
64
Para essas variáveis, o método de neutralização dos reagentes da hidrólise
(método 4) mostrou-se mais eficiente, apresentando a maior recuperação, com exceção
da lisina para a amostra hidrolisado ácido de caseína, onde foi mais eficiente o método
de evaporação em evaporador rotativo (método 1). Para a fenilalanina o método 1
também apresentou maior valor de recuperação, porém, estatisticamente não foi
diferente do método 4. O método de evaporação em câmaras a vácuo (método 2)
apresentou menor recuperação para os aminoácidos treonina, serina e tirosina, enquanto
que o método de evaporação por aquecimento sob fluxo de argônio (método 3)
apresentou menor recuperação para fenilalanina e lisina. Na Figura 24 essas diferenças
são visualizadas através dos valores relativos para a treonina, serina, tirosina,
fenilalanina e lisina, calculados a partir da média de cada método pela média geral para
a amostra hidrolisado ácido de caseína.
Baixas recuperações para esses aminoácidos também foi relatado por Lanfer
Marquez (1996), citando ainda, que os aminoácidos treonina e serina são os mais
susceptíveis à destruição por calor, e que a tirosina, fenilalanina, lisina e arginina
também apresentam problemas de recuperação. Essas perdas geralmente são associadas
ao tempo e temperatura da hidrólise, também citadas por Phillips (1983), Gehrke et al.
(1985), Bech-Andersen et al. (1990), Lanfer Marquez (1996) e Marconi et al. (1995).
Para este teste, as condições de tempo e temperatura de hidrólise
permaneceram constantes para todos os métodos e amostras, sugerindo outras
possibilidades de perdas, após a hidrólise ácida, quando os aminoácidos livres ainda
podem reagir, durante o preparo dos hidrolisados protéicos ou no armazenamento, como
observado por Ambler (1981).
65
0,95
0,97
0,99
1,01
1,03
1,05
Tre Ser Tir Fen Lis
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Figura 24. Visualização gráfica da comparação através de valores relativos à médiaentre os métodos para a amostra hidrolisado ácido de caseína, noanalisador de aminoácidos Beckman (Método 1: evaporador rotativo;Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio; Método 4:neutralização).
Para o método 1, foram observadas perdas significativas apenas para
treonina e serina na amostra farelo de soja, perdas essas que podem ter ocorrido por
aderência ao frasco quando da evaporação em evaporador rotativo, como relatado por
Bech-Andersen et al. (1990) e Lanfer Marquez (1996). Para evitar esse tipo de perdas,
Lanfer Marquez (1996) relata sugestão de adição de pequena quantidade de glicerol ao
frasco de hidrólise antes da evaporação.
No método 2, as perdas verificadas para os aminoácidos treonina, serina e
tirosina podem estar relacionadas à formação de compostos, como a transformação de
ácido glutâmico e serina em O-γ-glutamilserina, quando da evaporação em câmaras de
vácuo, como relatado por Ambler (1981), Benson et al. (1981), Bech-Andersen et al.
(1990) e Lanfer Marquez (1996), a formação de O-sulfatos de serina e treonina com
ácido cisteico, observado por Bech-Andersen et al. (1990), a formação de 3-
66
clorotirosina ou 3-bromotirosina, citado por Gehrke et al. (1985) ou, também, por
aderência ao frasco de hidrólise.
As baixas recuperações de treonina, fenilalanina e lisina verificadas para o
método 3, também podem estar relacionadas à aderência ao frasco, como no método 1,
agravado pelo fato do fluxo de argônio pressionar a solução contra a parede do frasco.
Com exceção de treonina e serina para a amostra hidrolisado ácido de caseína, o método
3 foi semelhante ao método 4, como também foi observado por Csapó et al. (1986),
utilizando evaporação sob fluxo de nitrogênio.
Para os demais aminoácidos, menores recuperações observadas nos métodos
de evaporação (1, 2 e 3), em comparação com o método de neutralização (4), também
podem estar relacionadas à aderência ao frasco de hidrólise, porém, essas diferenças não
foram estatisticamente significativas.
Apesar de o método 4 estar em oposição ao método 1 quando comparados
pelo fator de respostas da análise multivariada, neste caso diferiram apenas para a
treonina na amostra farelo de soja e lisina na amostra hidrolisado ácido de caseína.
Entretanto, no conjunto, o método 4 apresentou maior recuperação para a maioria dos
aminoácidos (Anexo 01).
Nas condições deste experimento, o método de neutralização dos reagentes
da hidrólise (método 4), como proposto por Spitz (1973), Csapó et al. (1986), Bech-
Andersen et al. (1990), Pecavar et al (1990) e Csapó et al. (1994), não ocasionou
problemas de separação dos aminoácidos tanto para o analisador Beckman quanto para
CLAE. Além disso, o método de neutralização mostrou-se mais prático e rápido para o
processamento de grandes quantidades de amostras, como também observaram Csapó et
al (1986).
67
4.3 Experimento 3
Este experimento foi realizado em duas etapas. Uma, preliminar, para
verificar a eficiência da hidrólise nas potências 2, 4, 6, 8 e 10, em tempos de 1, 2, 4, 8,
16 e 32 minutos para cada fator de potência, sem repetições de análise, e outra, para
confirmar os resultados, em tempos próximos à maior recuperação obtida na primeira
etapa, com duas repetições para cada análise.
Foi utilizada apenas a amostra milho supondo-se que, por possuir maior teor
de material não protéico, estaria mais propensa a sofrer interferências e, portanto, o
método otimizado para essas condições poderia ser aplicado para qualquer amostra.
Para a potência 2, os resultados mais eficientes de hidrólise na primeira
etapa foram obtidos para os tempos de 16 e 32 minutos (Figura 25). Na Segunda etapa,
a hidrólise foi testada nos tempos de 15, 20, 25, 30, 35 e 40 minutos (Figura 26), não
confirmando os valores obtidos anteriormente, e bem abaixo daqueles obtidos pela
hidrólise em estufa (valor 100 % para todas as variáveis).
A hidrólise na potência 4 apresentou resultados semelhantes aos obtidos
para a potência 2 (Figuras 27 e 28).
Nas potências 6, 8 e 10, os teores encontrados para os aminoácidos treonina,
serina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina e arginina apresentaram valores
significativamente baixos em relação aos demais aminoácidos (Figuras 29 a 32). Como
complemento, foi testada a hidrólise na potência máxima (12), em tempos de 5, 10, 15,
25 e 60 minutos (Figura 33), repetindo valores insatisfatórios para os mesmos
aminoácidos.
Os baixos teores obtidos para esses aminoácidos nas potências 6, 8, 10 e 12,
que também são observados para as potências 2 e 4, embora em menor grau, mostram
68
uma situação contraditória, apresentando condições de perdas semelhantes para os
aminoácidos mais sensíveis ao calor, como a treonina e serina, ao mesmo tempo em que
para aqueles mais difíceis de separar, como a valina e a isoleucina. Teoricamente,
baixos valores de recuperação de valina e isoleucina estão relacionados à hidrólise
incompleta, causada por condições de tempo e/ou temperatura insuficientes, enquanto
que, para a treonina e a serina as perdas estão relacionadas à destruição parcial por
tempo e/ou temperatura excessivos (Lookhart et al., 1982; Gehrke et al., 1985; Zumwalt
et al., 1987; Carisano, 1992; Lanfer Marquez, 1996).
O equipamento de microondas PMD Pressurized Microwave Decomposition
System PAAR foi utilizado nas condições de pressão média, de até 34 bar e temperatura
em meio ácido de até 250 °C, como recomendado para a digestão de amostras para
absorção atômica (ANTON PAAR KG, 1992). Nessas condições, o aparelho não
oferece possibilidades de ajuste de pressão ou temperatura, sendo que, as diferentes
potências apenas influenciam no tempo para atingir a pressão e temperatura máximos.
O controle da temperatura da hidrólise por microondas é fator decisivo para
a obtenção de resultados satisfatórios, como mostram os trabalhos de Pickering &
Newton (1990), Margolis et al. (1991), Carisano (1992), Kellner et al. (1994) e Marconi
et al. (1995).
A temperatura recomendada para a hidrólise de proteínas por microondas
varia de 150 °C (Fountoulakis & Lahm, 1998) até 178-180 °C (Pickering & Newton,
1990), sendo que, a obtenção de maiores teores para todos os aminoácidos na menor
potência representa um indicativo de temperatura excessiva utilizada nestes testes,
sugerindo a utilização de equipamentos mais apropriados, tal como utilizado por
Marconi et al. (1995).
69
0
20
40
60
80
100
120
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
1 min 2 min 4 min 8 min 16 min 32 min
Figura 25. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 2, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 minutos, emvalores percentuais relativos à recuperação obtida pela hidrólise em estufaatravés do método 4, para a amostra milho.
0
20
40
60
80
100
120
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min
Figura 26: Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 2, nos tempos de 15, 20, 25, 30, 35 e 40 minutos(média de duas repetições), em valores percentuais relativos à recuperaçãoobtida pela hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
70
0
20
40
60
80
100
120
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
1 min 2 min 4 min 8 min 16 min 32 min
Figura 27. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 4, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 minutos, emvalores percentuais relativos à recuperação obtida pela hidrólise em estufaatravés do método 4, para a amostra milho.
0
20
40
60
80
100
120
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min
Figura 28. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 4, nos tempos de 15, 20, 25, 30, 35 e 40 minutos(média de duas repetições), em valores percentuais relativos à recuperaçãoobtida pela hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
71
0
20
40
60
80
100
120
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
1 min 2 min 4 min 8 min 16 min 32 min
Figura 29. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 6, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 minutos, emvalores percentuais relativos à recuperação obtida pela hidrólise em estufaatravés do método 4, para a amostra milho.
0
20
40
60
80
100
120
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
2 min 4 min 5 min 6 min 7 min 8 min
Figura 30. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 6, nos tempos de 2, 4, 5, 6, 7 e 8 minutos (médiade duas repetições), em valores percentuais relativos à recuperação obtidapela hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
72
0
20
40
60
80
100
120
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
1 min 2 min 4 min 8 min 16 min 32 min
Figura 31. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 8, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 minutos, emvalores percentuais relativos à recuperação obtida pela hidrólise em estufaatravés do método 4, para a amostra milho.
0
20
40
60
80
100
120
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
1 min 2 min 4 min 8 min 16 min 32 min
Figura 32. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 10, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 minutos, emvalores percentuais relativos à recuperação obtida pela hidrólise em estufaatravés do método 4, para a amostra milho.
73
0
20
40
60
80
100
120
140
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
5 min 10 min 15 min 25 min 60 min
Figura 33. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 12, nos tempos de 05, 10, 15, 25 e 60 minutos(média de duas repetições), em valores percentuais relativos à recuperaçãoobtida pela hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.
4.4 Experimento 4
O objetivo deste experimento foi verificar a viabilidade de separação e
quantificação dos aminoácidos nos hidrolisados protéicos redissolvidos ou neutralizados
sob as mesmas condições em analisador específico Beckman e CLAE.
Observou-se nos resultados obtidos por CLAE valores superestimados em
relação ao analisador Beckman para a maioria dos aminoácidos (Figura 34). Admite-se
como possível causa para esses resultados a utilização da solução de diluição de
amostras Na-S Beckman para a redissolução dos hidrolisados e preparo da solução de
neutralização para o método 4, que possui em sua fórmula os reagentes tiodiglicol e
ácido benzóico, não relacionados na fórmula recomendada pelo manual de instruções da
Shimadzu para a análise de aminoácidos (SHIMADZU CORPORATION, 1993), que
74
podem produzir emissão de fluorescência indesejada. Um indicador dessa possibilidade
pode ser observado nos resultados obtidos para o método 4b para CLAE (linha
vermelha na Figura 34), onde a solução Na-S foi diluída e os valores obtidos são
significativamente inferiores aos obtidos para os métodos 1b, 2b e 3b (linhas amarelas e
laranja na Figura 34).
0,80
0,90
1,00
1,10
1,20
1,30
Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg
Aminoácidos
Val
or re
lativ
o (%
)
Método 1a Método 2a Método 3a Método 4aMétodo 1b Método 2b Método 3b Método 4b
Figura 34. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos obtidos poranalisador específico Beckman e CLAE, em valores relativizados a partirdas respectivas médias, independentemente de amostra (Método 1:evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo deargônio; Método 4: neutralização; Métodos 1-4a: analisador específicoBeckman; Métodos 1-4b: CLAE)
5 CONCLUSÕES
Nas condições propostas para este estudo, conclui-se que:
1. O método de neutralização dos reagentes da hidrólise apresentou maior teor para a
maioria dos aminoácidos.
2. Permite boa produtividade, atendendo às necessidades de trabalhar com grandes
quantidades de amostras.
3. Os métodos de evaporação em evaporador rotativo e por aquecimento sob fluxo de
argônio necessitam de testes em condições de proteção dos aminoácidos contra a
aderência à parede do frasco de hidrólise.
4. O método de evaporação em câmaras sob vácuo em presença de NaOH apresentou
perdas significativas para treonina, serina e tirosina.
5. A hidrólise de proteínas pelo equipamento de microondas PMD Pressurized
Microwave Decomposition System PAAR não apresentou resultados equivalentes à
hidrólise em estufa.
6. A utilização da solução de redissolução de amostras recomendada para o analisador
Beckman apresentou resultados superestimados, quando utilizada em CLAE com
detecção por fluorescência.
6 RECOMENDAÇÕES
Tendo em vista os resultados obtidos neste trabalho, recomenda-se:
1. A utilização do método de neutralização dos reagentes da hidrólise como método
padrão para a análise de aminoácidos.
2. Desaconselhar a utilização do método de evaporação em câmaras sob vácuo em
presença de NaOH, quando da hidrólise ácida.
3. Repetir o experimento 4, utilizando as soluções para a redissolução dos hidrolisados
recomendadas pelos fabricantes dos equipamentos.
7 ANEXOS
78
12.1 Anexo 01
Quadro 05. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na amostra
milho, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com base na
matéria natural, para o analisador de aminoácidos Beckman System
6300.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Min. Max. Min. Max. Min. Max. Min. Max.
Asp 0,44 0,48 0,45 0,48 0,44 0,48 0,39 0,48
Tre 0,24 0,26 0,23 0,25 0,23 0,25 0,23 0,27
Ser 0,30 0,32 0,28 0,31 0,31 0,34 0,30 0,34
Glu 1,19 1,28 1,17 1,26 1,18 1,29 1,11 1,37
Pro 0,43 0,53 0,45 0,59 0,46 0,53 0,42 0,59
Gli 0,26 0,30 0,25 0,27 0,25 0,27 0,24 0,29
Ala 0,47 0,51 0,45 0,50 0,45 0,53 0,44 0,52
Val 0,30 0,33 0,28 0,35 0,26 0,34 0,26 0,34
Ile 0,31 0,36 0,30 0,37 0,26 0,36 0,27 0,34
Leu 0,77 0,83 0,75 0,83 0,76 0,86 0,71 0,86
Tir 0,17 0,21 0,15 0,21 0,15 0,21 0,15 0,19
Fen 0,31 0,33 0,30 0,33 0,31 0,34 0,29 0,34
His 0,19 0,23 0,18 0,20 0,19 0,21 0,18 0,22
Lis 0,19 0,22 0,19 0,21 0,19 0,21 0,19 0,25
Arg 0,28 0,33 0,25 0,30 0,26 0,32 0,25 0,29
79
12.2 Anexo 02
Quadro 06. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na amostra
milho, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com base na
matéria natural, para CLAE.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Min. Max. Min. Max. Min. Max. Min. Max.
Asp 0,44 0,56 0,44 0,51 0,43 0,52 0,40 0,48
Tre 0,23 0,31 0,23 0,29 0,23 0,29 0,22 0,27
Ser 0,30 0,41 0,29 0,37 0,30 0,40 0,29 0,37
Glu 1,45 1,95 1,49 1,70 1,37 1,74 1,30 1,77
Pro 0,56 0,83 0,58 0,72 0,57 0,73 0,57 0,76
Gli 0,28 0,38 0,29 0,35 0,27 0,33 0,25 0,32
Ala 0,41 0,69 0,43 0,72 0,38 0,65 0,37 0,68
Val 0,29 0,40 0,30 0,35 0,29 0,36 0,26 0,33
Ile 0,30 0,42 0,30 0,40 0,28 0,39 0,26 0,36
Leu 0,88 1,09 0,86 1,02 0,80 1,02 0,78 0,99
Tir 0,13 0,21 0,13 0,20 0,14 0,20 0,13 0,19
Fen 0,31 0,39 0,32 0,37 0,31 0,37 0,30 0,33
His 0,19 0,25 0,20 0,24 0,20 0,24 0,19 0,21
Lis 0,19 0,25 0,20 0,24 0,20 0,24 0,19 0,22
Arg 0,26 0,36 0,27 0,35 0,27 0,35 0,25 0,32
80
12.3 Anexo 03
Quadro 07. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na amostra
farelo de soja, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com
base na matéria natural, para o analisador de aminoácidos Beckman
System 6300.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Min. Max. Min. Max. Min. Max. Min. Max.
Asp 4,70 5,24 4,59 5,07 4,69 4,93 4,47 5,12
Tre 1,56 1,76 1,56 1,67 1,59 1,68 1,56 1,73
Ser 1,97 2,19 1,97 2,09 2,03 2,16 2,02 2,17
Glu 7,41 8,22 7,27 7,90 7,40 7,71 7,08 7,92
Pro 1,66 1,98 1,70 2,17 1,65 2,04 1,46 2,32
Gli 1,73 1,95 1,74 1,91 1,78 1,81 1,69 1,83
Ala 1,65 1,88 1,70 1,86 1,71 1,83 1,55 1,79
Val 1,68 2,16 1,70 2,16 1,66 2,02 1,50 2,06
Ile 2,42 3,10 2,51 3,02 2,32 2,83 2,07 2,97
Leu 2,88 3,39 3,06 3,27 3,07 3,23 2,86 3,27
Tir 1,39 1,57 1,42 1,50 1,37 1,46 1,39 1,44
Fen 1,98 2,29 2,10 2,22 2,10 2,22 1,95 2,23
His 1,01 1,13 1,03 1,13 1,01 1,10 1,01 1,09
Lis 2,36 2,68 2,36 2,69 2,43 2,61 2,38 2,66
Arg 2,84 3,30 2,84 3,21 2,86 3,04 2,89 3,06
81
12.4 Anexo 04
Quadro 08. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na amostra
farelo de soja, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com
base na matéria natural, para CLAE.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Min. Max. Min. Max. Min. Max. Min. Max.
Asp 6,30 6,80 5,96 7,12 5,74 6,45 5,38 6,25
Tre 1,63 1,92 1,71 1,86 1,51 1,81 1,50 1,76
Ser 2,18 2,64 2,34 2,62 1,98 2,60 1,97 2,55
Glu 10,07 10,96 9,51 11,35 8,81 10,58 8,46 10,85
Pro 2,13 2,56 2,10 2,59 2,07 2,52 2,03 2,52
Gli 2,09 2,46 2,07 2,29 1,95 2,27 1,79 2,15
Ala 1,60 2,19 1,57 2,04 1,13 2,03 1,38 1,98
Val 1,46 2,37 1,43 2,18 1,40 2,15 1,23 2,00
Ile 2,99 3,43 2,89 3,26 2,76 3,10 2,56 2,99
Leu 3,52 3,81 3,57 3,66 3,02 3,59 2,98 3,53
Tir 1,32 1,77 1,48 1,83 1,30 1,76 1,26 1,79
Fen 2,09 2,49 2,35 2,44 2,12 2,39 2,09 2,25
His 1,15 1,34 1,16 1,29 1,07 1,31 1,06 1,23
Lis 2,53 3,06 2,65 2,89 2,41 2,78 2,42 2,76
Arg 2,93 3,67 3,15 3,43 2,83 3,39 2,81 3,34
82
12.5 Anexo 05
Quadro 09. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na amostra
hidrolisado ácido de caseína, nos dados não censurados, em g/100g da
amostra com base na matéria natural, para o analisador de aminoácidos
Beckman System 6300.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Min. Max. Min. Max. Min. Max. Min. Max.
Asp 3,43 3,63 2,51 3,52 3,32 3,69 3,53 3,80
Tre 2,31 2,51 1,72 2,39 2,24 2,50 2,44 2,50
Ser 1,54 1,63 1,09 1,58 1,54 1,72 1,58 1,69
Glu 15,95 16,74 11,55 16,40 15,46 17,22 16,01 17,64
Pro 8,37 10,67 6,70 9,99 8,81 10,04 8,99 11,04
Gli 1,70 1,82 1,23 1,73 1,63 1,79 1,70 1,83
Ala 4,95 5,35 3,94 5,37 4,90 5,43 5,24 5,61
Val 5,69 6,10 4,66 6,01 5,31 6,25 5,70 6,68
Ile 5,88 6,39 4,87 6,50 5,50 6,62 5,98 7,09
Leu 6,96 7,24 5,28 7,16 6,63 7,41 7,03 7,51
Tir 2,52 2,88 1,89 2,71 2,55 2,92 2,73 2,85
Fen 3,32 3,54 2,52 3,53 3,20 3,66 3,40 3,55
His 2,01 2,11 1,43 2,07 1,88 2,13 1,99 2,12
Lis 7,05 7,49 5,26 7,44 6,64 7,69 6,83 7,73
Arg 2,59 2,77 1,93 2,72 2,47 2,89 2,62 2,77
83
12.6 Anexo 06
Quadro 10. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na amostra
hidrolisado ácido de caseína, nos dados não censurados, em g/100g da
amostra com base na matéria natural, para CLAE.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Min. Max. Min. Max. Min. Max. Min. Max.
Asp 2,93 4,23 2,94 4,28 3,29 4,68 3,46 3,77
Tre 1,99 2,82 1,81 2,78 2,07 2,86 2,51 2,73
Ser 1,37 2,00 1,22 1,89 1,40 2,08 1,72 1,90
Glu 16,87 28,24 16,85 27,17 20,98 35,73 19,55 27,12
Pro 8,92 12,46 8,53 12,16 9,35 12,21 10,86 12,76
Gli 1,40 1,98 1,53 2,14 1,53 2,26 1,51 1,79
Ala 4,79 6,55 5,28 8,05 4,45 7,93 4,48 7,38
Val 5,42 7,06 5,16 7,93 4,70 7,99 4,68 7,13
Ile 5,77 7,94 5,68 7,87 6,37 7,93 6,82 7,38
Leu 6,43 9,21 6,25 9,14 7,03 10,07 8,00 8,76
Tir 0,00 3,02 2,17 3,02 2,37 3,28 2,75 2,88
Fen 0,81 4,13 2,82 4,06 3,23 4,21 3,73 3,97
His 1,72 2,82 1,76 2,67 2,04 2,76 2,42 2,69
Lis 3,39 8,52 5,49 8,23 6,43 8,08 7,50 8,38
Arg 0,34 3,00 2,07 2,96 2,40 3,09 2,74 3,16
84
12.7 Anexo 07
Quadro 11. Composição em aminoácidos para cada método, independentemente de
amostra, através do analisador específico Beckman, e comparação do
vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para
os dados não censurados, em g/100g da amostra com base na matéria
natural.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Asp 2,96±0,50 2,86±0,49 2,91±0,49 2,96±0,50
Tre 1,43±0,24 1,35±0,22 1,42±0,24 1,46±0,25
Ser 1,31±0,20 1,27±0,20 1,35±0,20 1,36±0,20
Glu 8,40±1,65 7,99±1,55 8,36±1,65 8,45±1,69
Pro 3,91±1,06 3,71±0,97 3,91±1,06 4,02±1,09
Gli 1,28±0,19 1,22±0,19 1,25±0,19 1,26±0,19
Ala 2,46±0,53 2,40±0,51 2,47±0,53 2,51±0,55
Val 2,70±0,63 2,60±0,59 2,65±0,62 2,71±0,65
Ile 3,10±0,64 3,01±0,61 3,05±0,65 3,10±0,67
Leu 3,68±0,70 3,56±0,66 3,65±0,69 3,68±0,70
Tir 1,45±0,28 1,38±0,26 1,44±0,28 1,46±0,29
Fen 1,97±0,34 1,91±0,33 1,96±0,34 1,97±0,35
His 1,11±0,20 1,06±0,19 1,09±0,20 1,09±0,20
Lis 3,33±0,79 3,18±0,74 3,28±0,77 3,32±0,78
Arg 1,99±0,32 1,93±0,32 1,97±0,32 1,98±0,32
Comparação do
vetor de médias(1)
ab a bc c
(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis
conjuntas analisadas.
85
12.8 Anexo 08
Quadro 12. Composição em aminoácidos para cada método, independentemente de
amostra, através de CLAE, e comparação do vetor de médias
envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados não
censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Asp 3,57±±±±0,66 3,39±±±±0,67 3,52±±±±0,63 3,26±±±±0,63
Tre 1,50±±±±0,25 1,49±±±±0,27 1,52±±±±0,26 1,43±±±±0,27
Ser 1,51±±±±0,24 1,43±±±±0,24 1,51±±±±0,23 1,47±±±±0,24
Glu 11,41±±±±2,32 11,81±±±±2,61 12,38±±±±2,80 10,41±±±±2,40
Pro 4,61±±±±1,21 4,83±±±±1,31 4,71±±±±1,26 4,45±±±±1,33
Gli 1,47±±±±0,23 1,39±±±±0,23 1,43±±±±0,22 1,28±±±±0,21
Ala 2,75±±±±0,60 2,96±±±±0,73 2,97±±±±0,75 2,52±±±±0,64
Val 2,72±±±±0,63 2,89±±±±0,74 2,84±±±±0,72 2,52±±±±0,69
Ile 3,52±±±±0,74 3,58±±±±0,82 3,52±±±±0,77 3,13±±±±0,75
Leu 4,20±±±±0,80 4,34±±±±0,89 4,31±±±±0,87 3,89±±±±0,84
Tir 1,30±±±±0,28 1,52±±±±0,31 1,55±±±±0,30 1,40±±±±0,30
Fen 1,94±±±±0,37 2,12±±±±0,40 2,13±±±±0,38 1,98±±±±0,39
His 1,27±±±±0,24 1,29±±±±0,26 1,30±±±±0,25 1,22±±±±0,26
Lis 3,24±±±±0,77 3,49±±±±0,86 3,42±±±±0,81 3,27±±±±0,86
Arg 1,95±±±±0,36 2,00±±±±0,36 2,07±±±±0,34 2,04±±±±0,37
Comparação do
vetor de médias(1)
c bc b a
(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis
conjuntas analisadas.
86
12.9 Anexo 09
Quadro 13. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra milho,
através de analisador específico Beckman, e comparação do vetor de
médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados
não censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Asp 0,46±±±±0,01 0,46±±±±0,01 0,45±±±±0,01 0,43±±±±0,02
Tre 0,25±±±±0,00 0,24±±±±0,00 0,24±±±±0,01 0,24±±±±0,01
Ser 0,31±±±±0,00 0,30±±±±0,01 0,32±±±±0,01 0,31±±±±0,01
Glu 1,23±±±±0,02 1,22±±±±0,02 1,24±±±±0,02 1,22±±±±0,04
Pro 0,48±±±±0,02 0,51±±±±0,03 0,49±±±±0,01 0,50±±±±0,03
Gli 0,27±±±±0,01 0,26±±±±0,00 0,26±±±±0,00 0,26±±±±0,01
Ala 0,49±±±±0,01 0,48±±±±0,01 0,49±±±±0,01 0,47±±±±0,01
Val 0,31±±±±0,01 0,31±±±±0,01 0,31±±±±0,02 0,30±±±±0,01
Ile 0,33±±±±0,01 0,33±±±±0,01 0,32±±±±0,02 0,31±±±±0,02
Leu 0,80±±±±0,01 0,80±±±±0,01 0,80±±±±0,02 0,78±±±±0,02
Tir 0,18±±±±0,01 0,18±±±±0,01 0,18±±±±0,01 0,17±±±±0,01
Fen 0,32±±±±0,00 0,32±±±±0,00 0,32±±±±0,01 0,31±±±±0,01
His 0,20±±±±0,01 0,19±±±±0,00 0,20±±±±0,00 0,19±±±±0,01
Lis 0,21±±±±0,01 0,20±±±±0,00 0,20±±±±0,00 0,22±±±±0,01
Arg 0,30±±±±0,01 0,28±±±±0,01 0,29±±±±0,01 0,28±±±±0,01
Comparação do
vetor de médias(1)
a a a a
(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis
conjuntas analisadas.
87
12.10 Anexo 10
Quadro 14. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra milho,
através de CLAE, e comparação do vetor de médias envolvendo as
variáveis analisadas em conjunto, para os dados não censurados, em
g/100g da amostra com base na matéria natural.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Asp 0,50±±±±0,02 0,49±±±±0,01 0,48±±±±0,02 0,44±±±±0,01
Tre 0,27±±±±0,01 0,26±±±±0,01 0,26±±±±0,01 0,25±±±±0,01
Ser 0,36±±±±0,02 0,34±±±±0,02 0,35±±±±0,02 0,34±±±±0,01
Glu 1,66±±±±0,09 1,63±±±±0,04 1,58±±±±0,06 1,48±±±±0,08
Pro 0,68±±±±0,05 0,66±±±±0,03 0,64±±±±0,03 0,66±±±±0,04
Gli 0,31±±±±0,02 0,30±±±±0,01 0,30±±±±0,01 0,28±±±±0,01
Ala 0,55±±±±0,05 0,53±±±±0,05 0,52±±±±0,06 0,54±±±±0,05
Val 0,34±±±±0,02 0,34±±±±0,01 0,32±±±±0,01 0,30±±±±0,01
Ile 0,36±±±±0,02 0,36±±±±0,02 0,34±±±±0,02 0,32±±±±0,02
Leu 0,97±±±±0,05 0,95±±±±0,03 0,92±±±±0,04 0,88±±±±0,03
Tir 0,17±±±±0,01 0,16±±±±0,01 0,17±±±±0,01 0,16±±±±0,01
Fen 0,35±±±±0,02 0,34±±±±0,01 0,34±±±±0,01 0,31±±±±0,00
His 0,23±±±±0,01 0,22±±±±0,01 0,21±±±±0,01 0,21±±±±0,00
Lis 0,23±±±±0,01 0,22±±±±0,01 0,21±±±±0,01 0,21±±±±0,01
Arg 0,32±±±±0,02 0,32±±±±0,02 0,30±±±±0,02 0,28±±±±0,01
Comparação do
vetor de médias(1)
a a a a
(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis
conjuntas analisadas.
88
12.11 Anexo 11
Quadro 15. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra farelo
de soja, através de analisador específico Beckman, e comparação do
vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os
dados não censurados, em g/100g da amostra com base na matéria
natural.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Asp 4,93±±±±0,09 4,86±±±±0,08 4,79±±±±0,04 4,81±±±±0,12
Tre 1,62±±±±0,04 1,62±±±±0,02 1,64±±±±0,02 1,67±±±±0,03
Ser 2,03±±±±0,04 2,04±±±±0,02 2,11±±±±0,02 2,12±±±±0,03
Glu 7,71±±±±0,15 7,60±±±±0,13 7,54±±±±0,05 7,55±±±±0,14
Pro 1,82±±±±0,06 1,92±±±±0,07 1,78±±±±0,07 1,85±±±±0,15
Gli 1,82±±±±0,05 1,81±±±±0,03 1,79±±±±0,01 1,78±±±±0,02
Ala 1,73±±±±0,04 1,77±±±±0,03 1,77±±±±0,02 1,73±±±±0,05
Val 1,91±±±±0,09 1,93±±±±0,08 1,84±±±±0,06 1,81±±±±0,10
Ile 2,80±±±±0,12 2,81±±±±0,09 2,66±±±±0,09 2,62±±±±0,15
Leu 3,12±±±±0,09 3,16±±±±0,04 3,14±±±±0,04 3,10±±±±0,07
Tir 1,44±±±±0,03 1,46±±±±0,02 1,42±±±±0,02 1,42±±±±0,01
Fen 2,13±±±±0,06 2,15±±±±0,02 2,15±±±±0,02 2,12±±±±0,05
His 1,06±±±±0,02 1,07±±±±0,02 1,06±±±±0,02 1,05±±±±0,01
Lis 2,50±±±±0,07 2,52±±±±0,06 2,51±±±±0,03 2,53±±±±0,05
Arg 3,02±±±±0,09 3,02±±±±0,06 2,97±±±±0,03 2,97±±±±0,03
Comparação do
vetor de médias(1)
a a ab b
(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis
conjuntas analisadas.
89
12.12 Anexo 12
Quadro 16. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra farelo
de soja, através de CLAE, e comparação do vetor de médias envolvendo
as variáveis analisadas em conjunto, para os dados não censurados, em
g/100g da amostra com base na matéria natural.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Asp 6,54±±±±0,09 6,45±±±±0,25 6,16±±±±0,15 5,77±±±±0,18
Tre 1,81±±±±0,05 1,81±±±±0,03 1,73±±±±0,05 1,68±±±±0,05
Ser 2,47±±±±0,08 2,47±±±±0,06 2,40±±±±0,11 2,33±±±±0,10
Glu 10,46±±±±0,16 10,29±±±±0,40 9,87±±±±0,31 9,48±±±±0,49
Pro 2,31±±±±0,07 2,33±±±±0,12 2,24±±±±0,07 2,28±±±±0,09
Gli 2,33±±±±0,07 2,20±±±±0,05 2,10±±±±0,06 1,96±±±±0,06
Ala 1,94±±±±0,14 1,81±±±±0,11 1,68±±±±0,17 1,73±±±±0,11
Val 1,97±±±±0,20 1,85±±±±0,18 1,80±±±±0,16 1,75±±±±0,14
Ile 3,19±±±±0,08 3,10±±±±0,08 2,94±±±±0,07 2,80±±±±0,08
Leu 3,64±±±±0,06 3,62±±±±0,02 3,43±±±±0,10 3,32±±±±0,09
Tir 1,56±±±±0,09 1,69±±±±0,07 1,60±±±±0,10 1,53±±±±0,10
Fen 2,35±±±±0,08 2,39±±±±0,02 2,26±±±±0,05 2,16±±±±0,03
His 1,25±±±±0,03 1,25±±±±0,03 1,20±±±±0,04 1,17±±±±0,03
Lis 2,76±±±±0,09 2,74±±±±0,06 2,61±±±±0,06 2,61±±±±0,07
Arg 3,27±±±±0,12 3,26±±±±0,06 3,10±±±±0,10 3,12±±±±0,09
Comparação do
vetor de médias(1)
b b ab a
(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis
conjuntas analisadas.
90
12.13 Anexo 13
Quadro 17. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra
hidrolisado ácido de caseína, através de analisador específico Beckman, e
comparação do vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em
conjunto, para os dados não censurados, em g/100g da amostra com base
na matéria natural.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Asp 3,49±±±±0,04 3,25±±±±0,19 3,49±±±±0,06 3,63±±±±0,04
Tre 2,42±±±±0,03 2,19±±±±0,12 2,37±±±±0,05 2,47±±±±0,01
Ser 1,59±±±±0,02 1,46±±±±0,09 1,62±±±±0,04 1,65±±±±0,02
Glu 16,25±±±±0,17 15,15±±±±0,91 16,31±±±±0,31 16,59±±±±0,28
Pro 9,42±±±±0,40 8,69±±±±0,55 9,45±±±±0,26 9,71±±±±0,39
Gli 1,75±±±±0,02 1,60±±±±0,09 1,71±±±±0,03 1,75±±±±0,02
Ala 5,16±±±±0,08 4,94±±±±0,26 5,15±±±±0,12 5,33±±±±0,07
Val 5,88±±±±0,08 5,57±±±±0,23 5,80±±±±0,17 6,02±±±±0,17
Ile 6,17±±±±0,09 5,87±±±±0,28 6,16±±±±0,20 6,38±±±±0,20
Leu 7,12±±±±0,06 6,73±±±±0,36 7,01±±±±0,15 7,15±±±±0,09
Tir 2,73±±±±0,07 2,51±±±±0,16 2,74±±±±0,07 2,79±±±±0,02
Fen 3,46±±±±0,04 3,26±±±±0,19 3,40±±±±0,08 3,46±±±±0,03
His 2,06±±±±0,02 1,91±±±±0,12 2,01±±±±0,05 2,04±±±±0,03
Lis 7,28±±±±0,08 6,80±±±±0,39 7,13±±±±0,18 7,20±±±±0,15
Arg 2,65±±±±0,03 2,49±±±±0,14 2,67±±±±0,08 2,70±±±±0,02
Comparação do
vetor de médias(1)
b a c c
(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis
conjuntas analisadas.
91
12.14 Anexo 14
Quadro 18. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra
hidrolisado ácido de caseína, através de CLAE, e comparação do vetor de
médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados
não censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.
Método 1 Método 2 Método 3 Método 4
Asp 3,66±±±±0,25 3,84±±±±0,24 3,91±±±±0,27 3,63±±±±0,07
Tre 2,43±±±±0,18 2,47±±±±0,17 2,56±±±±0,14 2,60±±±±0,05
Ser 1,70±±±±0,14 1,69±±±±0,12 1,79±±±±0,12 1,81±±±±0,04
Glu 22,11±±±±1,96 23,21±±±±1,73 25,71±±±±2,67 22,74±±±±1,62
Pro 10,84±±±±0,69 11,00±±±±0,64 11,25±±±±0,55 11,89±±±±0,50
Gli 1,76±±±±0,10 1,84±±±±0,10 1,90±±±±0,15 1,67±±±±0,07
Ala 5,75±±±±0,29 6,32±±±±0,51 6,72±±±±0,65 5,98±±±±0,61
Val 5,86±±±±0,30 6,26±±±±0,51 6,39±±±±0,60 6,27±±±±0,56
Ile 7,00±±±±0,42 7,19±±±±0,39 7,27±±±±0,30 7,06±±±±0,14
Leu 8,00±±±±0,59 8,30±±±±0,53 8,59±±±±0,53 8,35±±±±0,16
Tir 2,17±±±±0,56 2,74±±±±0,15 2,89±±±±0,15 2,81±±±±0,03
Fen 3,12±±±±0,61 3,67±±±±0,22 3,78±±±±0,19 3,86±±±±0,05
His 2,32±±±±0,21 2,39±±±±0,17 2,47±±±±0,12 2,55±±±±0,06
Lis 6,73±±±±0,92 7,37±±±±0,50 7,43±±±±0,28 7,91±±±±0,20
Arg 2,26±±±±0,50 2,68±±±±0,17 2,82±±±±0,14 2,89±±±±0,09
Comparação do
vetor de médias(1)
c c b A
(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis
conjuntas analisadas.
92
12.15 Anexo 15
Tabela 06. Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses
multivariadas sobre os métodos, através dos testes de Wilks, Pillai,
Hotteling-Lawley e Roy, independente de amostra, para o analisador de
aminoácidos Beckman e CLAE.
Fonte de variação GL Wilks Pillai Hotteling-
Lawley
Roy
Analisador Beckman
Métodos 3 0,0072 0,0368 0,0009 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,5378 0,5915 0,4998 0,0032
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0355 0,0365 0,0350 0,0116
Métodos 1,2 e 3 vs Método 4 1 0,0026 0,0026 0,0026 0,0026
Método 1 vs 2 1 0,1370 0,1370 0,1370 0,1370
Método 1 vs 3 1 0,2617 0,2617 0,2617 0,2617
Método 1 vs 4 1 0,0231 0,0231 0,0231 0,0231
Método 2 vs 3 1 0,0152 0,0152 0,0152 0,0152
Método 2 vs 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Método 3 vs 4 1 0,5427 0,5427 0,5427 0,5427
CLAE
Métodos 3 0,0001 0,0008 0,0001 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,0804 0,2584 0,0156 0,0001
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0184 0,0315 0,0109 0,0016
Métodos 1,2 e 3 vs Método 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Método 1 vs 2 1 0,1783 0,1783 0,1783 0,1783
Método 1 vs 3 1 0,0022 0,0022 0,0022 0,0022
Método 1 vs 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
Método 2 vs 3 1 0,2275 0,2275 0,2275 0,2275
Método 2 vs 4 1 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003
Método 3 vs 4 1 0,0206 0,0206 0,0206 0,0206
93
12.16 Anexo 16
Tabela 07. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido ácido aspártico (Asp), no analisador de aminoácidos
Beckman, para os dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,048319 0,016106 2,05 0,1248
Amostras 2 163,304234 81,652117 10368,33 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,085677 0,014280 1,81 0,1241
Métodos – Milho 3 0,005239 0,001746 0,22 0,8806
Métodos - Farelo de Soja 3 0,070345 0,023448 2,98 0,0443
Métodos – Caseína 3 0,058411 0,019470 2,47 0,0773
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,024216 0,012108 1,54 0,2287
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,024103 0,024103 3,06 0,0887
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,001058 0,000529 0,07 0,9351
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,004181 0,004181 0,53 0,4709
Métodos 1, 2 e 3 - Farelo de Soja 2 0,061570 0,030785 3,91 0,0291
Métodos 1 a 3 x 4 - Farelo de Soja 1 0,008775 0,008775 1,11 0,2982
Métodos 1, 2 e 3 – Caseína 2 0,000865 0,000432 0,05 0,9467
Métodos 1 a 3 x 4 – Caseína 1 0,057547 0,057547 7,31 0,0104
Resíduo 36 0,283505 0,007875 - -
Total 47 163,721735 - - -
R2 = 99,83 % CV = 3,03 % Desvio Padrão residual = 0,09 Média Geral = 2,93 %
94
12.17 Anexo 17
Tabela 08. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido ácido aspártico
(Asp) obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,45 ± 0,04 4,86 ± 0,04 3,46 ± 0,04 2,92 ± 0,03a
2 0,47 ± 0,04 4,93 ± 0,04 3,44 ± 0,04 2,94 ± 0,03a
3 0,45 ± 0,04 4,75 ± 0,04 3,44 ± 0,04 2,88 ± 0,03a
4 0,42 ± 0,04 4,90 ± 0,04 3,58 ± 0,04 2,97 ± 0,03a
Média 0,44 ± 0,02 4,86 ± 0,02 3,48 ± 0,02
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
95
12.18 Anexo 18
Tabela 09. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido treonina (Tre), no analisador de aminoácidos Beckman, para
os dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,0488233 0,0162744 8,49 0,0002
Amostras 2 37,9416732 18,9708366 9893,31 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,0655847 0,0109308 5,70 0,0003
Métodos - Milho 3 0,0002563 0,0000854 0,04 0,9873
Métodos - Farelo de Soja 3 0,0295185 0,0098395 5,13 0,0047
Métodos - Caseína 3 0,0846333 0,0282111 14,71 0,0001
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0117029 0,0058514 3,05 0,0597
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0371204 0,0371204 19,36 0,0001
Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,0000875 0,0000438 0,02 0,9775
Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,0001687 0,0001687 0,09 0,7684
Métodos 1, 2 e 3 - Farelo de Soja 2 0,0093465 0,0046733 2,44 0,1017
Métodos 1 a 3 x 4 - Farelo de Soja 1 0,0201720 0,0201720 10,52 0,0026
Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,0427432 0,0213716 11,15 0,0002
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,0418901 0,0418901 21,85 0,0001
Resíduo 36 0,0690315 0,0019175 - -
Total 47 38,1251127 - - -
R2 = 99.82 % CV = 3,08 % Desvio Padrão residual = 0,04 Média Geral = 1,42 %
96
12.19 Anexo 19
Tabela 10. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido treonina (Tre)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho(1) Farelo de
Soja(1)
Caseína(1) Média
1 0,24±0,02a 1,59±0,02c 2,44±0,02a 1,43±0,01
2 0,24±0,02a 1,60±0,02bc 2,30±0,02b 1,38±0,01
3 0,25±0,02a 1,65±0,02ab 2,33±0,02b 1,41±0,01
4 0,24±0,02a 1,70±0,02a 2,48±0,02a 1,47±0,01
Média 0,24±0,01 1,64±0,01 2,39±0,01
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
97
12.20 Anexo 20
Tabela 11. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido serina (Ser), no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,0404427 0,0134809 13,33 0,0001
Amostras 2 26,8768693 13,4384346 13288,30 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,0409142 0,0068190 6,74 0,0001
Métodos - Milho 3 0,0003755 0,0001252 0,12 0,9455
Métodos - Farelo de Soja 3 0,0530882 0,0176961 17,50 0,0001
Métodos - Caseína 3 0,0278933 0,0092978 9,19 0,0001
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0124144 0,0062072 6,14 0,0051
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0280283 0,0280283 27,72 0,0001
Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,0003702 0,0001851 0,18 0,8335
Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,0000053 0,0000053 0,01 0,9425
Métodos 1, 2 e 3 - Farelo de Soja 2 0,0332835 0,0166418 16,46 0,0001
Métodos 1 a 3 x 4 - Farelo de Soja 1 0,0198047 0,0198047 19,58 0,0001
Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,0049245 0,0024623 2,43 0,1019
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,0229688 0,0229688 22,71 0,0001
Resíduo 36 0,0364067 0,0010113 - -
Total 47 26,9946330 - - -
R2 = 99.87 % CV = 2,39 % Desvio Padrão residual = 0,03 Média Geral = 1,33 %
98
12.21 Anexo 21
Tabela 12. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido serina (Ser) obtidos
no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados censurados.
Método Milho(1) Farelo de
Soja(1)
Caseína(1) Média
1 0,31±0,02a 2,00±0,02c 1,60±0,02b 1,30±0,01
2 0,30±0,02a 2,06±0,02b 1,55±0,02c 1,30±0,01
3 0,31±0,02a 2,13±0,02a 1,59±0,02bc 1,34±0,01
4 0,31±0,02a 2,14±0,02a 1,67±0,02a 1,37±0,01
Média 0,31±0,01 2,08±0,01 1,60±0,01
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
99
12.22 Anexo 22
Tabela 13. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido ácido glutâmico (Glu), no analisador de aminoácidos
Beckman, para os dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,08355 0,02785 0,46 0,7094
Amostras 2 1793,93470 896,96735 14935,84 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,19096 0,03183 0,53 0,7818
Métodos - Milho 3 0,01001 0,00334 0,06 0,9825
Métodos - Farelo de Soja 3 0,08335 0,02778 0,46 0,7101
Métodos - Caseína 3 0,18114 0,06038 1,01 0,4016
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,01332 0,00666 0,11 0,8953
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,07022 0,07022 1,17 0,2867
Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,00182 0,00091 0,02 0,9850
Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,00819 0,00819 0,14 0,7141
Métodos 1, 2 e 3 - Farelo de Soja 2 0,06419 0,03210 0,53 0,5906
Métodos 1 a 3 x 4 - Farelo de Soja 1 0,01916 0,01916 0,32 0,5757
Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,01216 0,00608 0,10 0,9040
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,16898 0,16898 2,81 0,1021
Resíduo 36 2,16197 0,06005 - -
Total 47 1796,37118 - - -
R2 = 99.88 % CV = 2,94 % Desvio Padrão residual = 0,25 Média Geral = 8,33 %
100
12.23 Anexo 23
Tabela 14. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido ácido glutâmico
(Glu) obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 1,22±0,12 7,59±0,12 16,13±0,12 8,31±0,07a
2 1,23±0,12 7,68±0,12 16,05±0,12 8,32±0,07a
3 1,25±0,12 7,50±0,12 16,08±0,12 8,28±0,07a
4 1,18±0,12 7,67±0,12 16,32±0,12 8,39±0,07a
Média 1,22±0,06 7,61±0,06 16,14±0,06
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
101
12.24 Anexo 24
Tabela 15. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido prolina (Pro), no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados não censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,139465 0,046488 0,41 0,7494
Amostras 2 711,075060 355,537530 3107,76 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,570442 0,095074 0,83 0,5543
Métodos – Milho 3 0,003406 0,001135 0,01 0,9986
Métodos - Farelo de Soja 3 0,082067 0,027356 0,24 0,8684
Métodos – Caseína 3 0,618785 0,206262 1,80 0,1652
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,113569 0,056784 0,50 0,6131
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,025896 0,025896 0,23 0,6373
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,003096 0,001548 0,01 0,9866
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,000310 0,000310 0,00 0,9588
Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,060403 0,030201 0,26 0,7695
Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,021664 0,021664 0,19 0,6662
Métodos 1, 2 e 3 – Caseína 2 0,600689 0,300344 2,63 0,0870
Métodos 1 a 3 x 4 – Caseína 1 0,018096 0,018096 0,16 0,6933
Resíduo 34 3,889704 0,114403 - -
Total 45 721,974030 - - -
R2 = 99.46 % CV = 8,53 % Desvio Padrão residual = 0,34 Média Geral = 3,97 %
102
12.25 Anexo 25
Tabela 16. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido prolina (Pro)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,46±0,17 1,86±0,17 9,11±0,17 3,81±0,10a
2 0,49±0,17 1,86±0,17 9,18±0,17 3,84±0,10a
3 0,50±0,17 1,71±0,17 9,62±0,17 3,94±0,10a
4 0,47±0,17 1,93±0,24 9,38±0,17 3,93±0,11a
Média 0,48±0,08 1,84±0,09 9,32±0,08
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
103
12.26 Anexo 26
Tabela 17. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido glicina (Gli), no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,0012329 0,0004110 0,28 0,8379
Amostras 2 23,5179332 11,7589666 8072,74 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,0041566 0,0006928 0,48 0,8218
Métodos - Milho 3 0,0003305 0,0001102 0,08 0,9727
Métodos - Farelo de Soja 3 0,0010738 0,0003579 0,25 0,8638
Métodos - Caseína 3 0,0039872 0,0013291 0,91 0,4449
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0007590 0,0003795 0,26 0,7721
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0004663 0,0004663 0,32 0,5751
Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,0000502 0,0000251 0,02 0,9829
Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,0002803 0,0002803 0,19 0,6636
Métodos 1, 2 e 3 - Farelo de Soja 2 0,0000772 0,0000386 0,03 0,9739
Métodos 1 a 3 x 4 - Farelo de Soja 1 0,0010292 0,0010292 0,71 0,4063
Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,0035122 0,0017561 1,21 0,3117
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,0004750 0,0004750 0,33 0,5716
Resíduo 35 0,0509819 0,0014566 - -
Total 46 23,6517319 - - -
R2 = 99.78 % CV = 3,07 % Desvio Padrão residual = 0,04 Média Geral = 1,25 %
104
12.27 Anexo 27
Tabela 18. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido glicina (Gli)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,26±0,02 1,78±0,02 1,73±0,02 1,26±0,01a
2 0,26±0,02 1,79±0,02 1,69±0,02 1,25±0,01a
3 0,26±0,02 1,78±0,02 1,73±0,02 1,26±0,01a
4 0,25±0,02 1,80±0,02 1,73±0,02 1,26±0,01a
Média 0,26±0,01 1,79±0,01 1,72±0,01
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
105
12.28 Anexo 28
Tabela 19. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido alanina (Ala), no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,020905 0,006968 0,77 0,5166
Amostras 2 189,487810 94,743905 10513,35 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,075560 0,012593 1,40 0,2424
Métodos – Milho 3 0,003956 0,001319 0,15 0,9314
Métodos - Farelo de Soja 3 0,016542 0,005514 0,61 0,6117
Métodos – Caseína 3 0,075967 0,025322 2,81 0,0532
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,006685 0,003342 0,37 0,6927
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,014221 0,014221 1,58 0,2171
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,000640 0,000320 0,04 0,9652
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,003317 0,003317 0,37 0,5479
Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,010009 0,005004 0,56 0,5787
Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,006533 0,006533 0,72 0,4001
Métodos 1, 2 e 3 – Caseína 2 0,042365 0,021183 2,35 0,1098
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,033602 0,033602 3,73 0,0614
Resíduo 36 0,324424 0,009012 - -
Total 47 189,908699 - - -
R2 = 99.83 % CV = 3,84 % Desvio Padrão residual = 0,09 Média Geral = 2,47 %
106
12.29 Anexo 29
Tabela 20. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido alanina (Ala)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,49±0,05 1,69±0,05 5,21±0,05 2,46±0,03a
2 0,49±0,05 1,75±0,05 5,19±0,05 2,48±0,03a
3 0,50±0,05 1,75±0,05 5,08±0,05 2,44±0,03a
4 0,46±0,05 1,78±0,05 5,26±0,05 2,50±0,03a
Média 0,49±0,02 1,74±0,02 5,19±0,02
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
107
12.30 Anexo 30
Tabela 21. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido valina (Val), no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,004197 0,001399 0,07 0,9770
Amostras 2 259,442568 129,721284 6230,42 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,067351 0,011225 0,54 0,7749
Métodos - Milho 3 0,000459 0,000153 0,01 0,9991
Métodos - Farelo de Soja 3 0,034381 0,011460 0,55 0,6511
Métodos - Caseína 3 0,036707 0,012236 0,59 0,6270
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,001190 0,000595 0,03 0,9718
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,003007 0,003007 0,14 0,7062
Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,000407 0,000204 0,01 0,9903
Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,000052 0,000052 0,00 0,9604
Métodos 1, 2 e 3 - Farelo de Soja 2 0,023581 0,011791 0,57 0,5726
Métodos 1 a 3 x 4 - Farelo de Soja 1 0,010800 0,010800 0,52 0,4760
Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,036704 0,018352 0,88 0,4229
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,000003 0,000003 0,00 0,9905
Resíduo 36 0,749543 0,020821 - -
Total 47 260,263659 - - -
R2 = 99.71 % CV = 5,35 % Desvio Padrão residual = 0,14 Média Geral = 2,70 %
108
12.31 Anexo 31
Tabela 22. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido valina (Val) obtidos
no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,31±0,07 1,97±0,07 5,83±0,07 2,70±0,04a
2 0,30±0,07 1,99±0,07 5,80±0,07 2,70±0,04a
3 0,32±0,07 1,89±0,07 5,93±0,07 2,71±0,04a
4 0,31±0,07 1,89±0,07 5,85±0,07 2,68±0,04a
Média 0,31±0,04 1,93±0,04 5,85±0,04
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
109
12.32 Anexo 32
Tabela 23. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido isoleucina (Ile), no analisador de aminoácidos Beckman, para
os dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,027039 0,009013 0,28 0,8381
Amostras 2 280,443981 140,221990 4385,70 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,136403 0,022734 0,71 0,6429
Métodos – Milho 3 0,000335 0,000112 0,00 0,9997
Métodos - Farelo de Soja 3 0,078908 0,026303 0,82 0,4900
Métodos – Caseína 3 0,084200 0,028067 0,88 0,4617
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,010009 0,005004 0,16 0,8557
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,017030 0,017030 0,53 0,4702
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,000020 0,000010 0,00 0,9997
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,000315 0,000315 0,01 0,9215
Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,054110 0,027055 0,85 0,4374
Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,024798 0,024798 0,78 0,3843
Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,081619 0,040809 1,28 0,2914
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,002581 0,002581 0,08 0,7779
Resíduo 36 1,151011 0,031973 - -
Total 47 281,758434 - - -
R2 = 99.59 % CV = 5,73 % Desvio Padrão residual = 0,18 Média Geral = 3,12 %
110
12.33 Anexo 33
Tabela 24. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido isoleucina (Ile)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,33±0,09 2,89±0,09 6,24±0,09 3,15±0,05a
2 0,33±0,09 2,89±0,09 6,12±0,09 3,11±0,05a
3 0,33±0,09 2,75±0,09 6,32±0,09 3,13±0,05a
4 0,32±0,09 2,75±0,09 6,20±0,09 3,09±0,05a
Média 0,32±0,04 2,82±0,04 6,22±0,04
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
111
12.34 Anexo 34
Tabela 25. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido leucina (Leu), no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,038811 0,012937 1,03 0,3907
Amostras 2 321,154730 160,577365 12790,64 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,121346 0,020224 1,61 0,1725
Métodos – Milho 3 0,005008 0,001669 0,13 0,9398
Métodos - Farelo de Soja 3 0,021236 0,007079 0,56 0,6424
Métodos – Caseína 3 0,133913 0,044638 3,56 0,0237
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,037926 0,018963 1,51 0,2345
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,000885 0,000885 0,07 0,7921
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,001245 0,000623 0,05 0,9517
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,003763 0,003763 0,30 0,5874
Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,013610 0,006805 0,54 0,5862
Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,007626 0,007626 0,61 0,4409
Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,133260 0,066630 5,31 0,0096
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,000653 0,000653 0,05 0,8209
Resíduo 36 0,451954 0,012554 - -
Total 47 321,766841 - - -
R2 = 99.86 % CV = 3,07 % Desvio Padrão residual = 0,11 Média Geral = 3,65 %
112
12.35 Anexo 35
Tabela 26. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido leucina (Leu)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,79±0,06 3,06±0,06 7,16±0,06 3,67±0,03a
2 0,81±0,06 3,14±0,06 7,09±0,06 3,68±0,03a
3 0,79±0,06 3,12±0,06 6,91±0,06 3,60±0,03a
4 0,76±0,06 3,15±0,06 7,07±0,06 3,66±0,03a
Média 0,79±0,03 3,12±0,03 7,05±0,03
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
113
12.36 Anexo 36
Tabela 27. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido tirosina (Tir), no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,0062769 0,0020923 0,66 0,5846
Amostras 2 43,9147514 21,9573757 6894,01 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,0525053 0,0087509 2,75 0,0287
Métodos – Milho 3 0,0006114 0,0002038 0,06 0,9785
Métodos - Farelo de Soja 3 0,0087075 0,0029025 0,91 0,4465
Métodos – Caseína 3 0,0518082 0,0172694 5,42 0,0039
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0048506 0,0024253 0,76 0,4753
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0015990 0,0015990 0,50 0,4837
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,0004854 0,0002427 0,08 0,9268
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,0000483 0,0000483 0,02 0,9028
Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,0082755 0,0041377 1,30 0,2868
Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,0004320 0,0004320 0,14 0,7151
Métodos 1, 2 e 3 – Caseína 2 0,0419182 0,0209591 6,58 0,0040
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,0098900 0,0098900 3,11 0,0876
Resíduo 32 0,1019198 0,0031850 - -
Total 43 46,7421765 - - -
R2 = 99.78 % CV = 3,59 % Desvio Padrão residual = 0,06 Média Geral = 1,57 %
114
12.37 Anexo 37
Tabela 28. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido tirosina (Tir)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho(1) Farelo de
Soja(1)
Caseína(1) Média
1 0,18±0,03a 1,41±0,03a 2,79±0,03a 1,46±0,02
2 0,16±0,04a 1,47±0,03a 2,66±0,03b 1,43±0,02
3 0,17±0,04a 1,43±0,03a 2,79±0,03a 1,46±0,02
4 0,16±0,03a 1,42±0,03a 2,80±0,03a 1,46±0,02
Média 0,17±0,02 1,43±0,01 2,76±0,01
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
115
12.38 Anexo 38
Tabela 29. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido fenilalanina (Fen), no analisador de aminoácidos Beckman,
para os dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,0161345 0,0053782 1,44 0,2480
Amostras 2 78,3575843 39,1787921 10469,74 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,0543814 0,0090636 2,42 0,0454
Métodos – Milho 3 0,0005885 0,0001962 0,05 0,9839
Métodos - Farelo de Soja 3 0,0128047 0,0042682 1,14 0,3458
Métodos – Caseína 3 0,0571227 0,0190409 5,09 0,0049
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0135335 0,0067668 1,81 0,1785
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0026010 0,0026010 0,70 0,4099
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,0001322 0,0000661 0,02 0,9825
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,0004563 0,0004563 0,12 0,7290
Métodos 1, 2 e 3 - Farelo de Soja 2 0,0063875 0,0031938 0,85 0,4344
Métodos 1 a 3 x 4 - Farelo de Soja 1 0,0064172 0,0064172 1,71 0,1987
Métodos 1, 2 e 3 – Caseína 2 0,0562472 0,0281236 7,52 0,0019
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,0008755 0,0008755 0,23 0,6315
Resíduo 36 0,1347155 0,0037421 - -
Total 47 78,5628157 - - -
R2 = 99.83 % CV = 3,12 % Desvio Padrão residual = 0,06 Média Geral = 1,96 %
116
12.39 Anexo 39
Tabela 30. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido fenilalanina (Fen)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho(1) Farelo de
Soja(1)
Caseína(1) Média
1 0,32±0,03a 2,09±0,03a 3,50±0,03a 1,97±0,02
2 0,32±0,03a 2,14±0,03a 3,45±0,03a 1,97±0,02
3 0,31±0,03a 2,13±0,03a 3,34±0,03b 1,93±0,02
4 0,31±0,03a 2,16±0,03a 3,44±0,03a 1,97±0,02
Média 0,32±0,02 2,13±0,02 3,43±0,02
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
117
12.40 Anexo 40
Tabela 31. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido histidina (His), no analisador de aminoácidos Beckman, para
os dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,0027517 0,0009172 0,54 0,6595
Amostras 2 27,1431382 13,5715691 7955,62 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,0009803 0,0001634 0,10 0,9964
Métodos – Milho 3 0,0004012 0,0001337 0,08 0,9713
Métodos - Farelo de Soja 3 0,0023697 0,0007899 0,46 0,7098
Métodos – Caseína 3 0,0009612 0,0003204 0,19 0,9040
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0002434 0,0001217 0,07 0,9313
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0025083 0,0025083 1,47 0,2332
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,0000215 0,0000107 0,01 0,9937
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,0003797 0,0003797 0,22 0,6399
Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,0007247 0,0003623 0,21 0,8096
Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,0016450 0,0016450 0,96 0,3327
Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,0002482 0,0001241 0,07 0,9300
Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,0007130 0,0007130 0,42 0,5221
Resíduo 36 0,0614128 0,0017059 - -
Total 47 27,2082830 - - -
R2 = 99.77 % CV = 3,78 % Desvio Padrão residual = 0,04 Média Geral = 1,09 %
118
12.41 Anexo 41
Tabela 32. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido histidina (His)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,20±0,02 1,05±0,02 2,04±0,02 1,10±0,01a
2 0,20±0,02 1,06±0,02 2,03±0,02 1,09±0,01a
3 0,19±0,02 1,07±0,02 2,04±0,02 1,10±0,01a
4 0,18±0,02 1,03±0,02 2,02±0,02 1,08±0,01a
Média 0,19±0,01 1,05±0,01 2,03±0,01
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
119
12.42 Anexo 42
Tabela 33. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido lisina (Lis), no analisador de aminoácidos Beckman, para os
dados censurados.
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,075446 0,025149 1,51 0,2286
Amostras 2 400,362732 200,181366 12014,14 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,233924 0,038987 2,34 0,0520
Métodos – Milho 3 0,000159 0,000053 0,00 0,9997
Métodos - Farelo de Soja 3 0,029393 0,009798 0,59 0,6268
Métodos – Caseína 3 0,279818 0,093273 5,60 0,0030
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,075428 0,037714 2,26 0,1186
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,000018 0,000018 0,00 0,9739
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,000152 0,000076 0,00 0,9954
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,000007 0,000007 0,00 0,9841
Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,001505 0,000752 0,05 0,9559
Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,027889 0,027889 1,67 0,2040
Métodos 1, 2 e 3 – Caseína 2 0,248504 0,124252 7,46 0,0020
Métodos 1 a 3 x 4 – Caseína 1 0,031314 0,031314 1,88 0,1789
Resíduo 36 0,599837 0,016662 - -
Total 47 401,271940 - - -
R2 = 99.85 % CV = 3,93 % Desvio Padrão residual = 0,13 Média Geral = 3,28 %
120
12.43 Anexo 43
Tabela 34. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido lisina (Lis) obtidos
no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados censurados.
Método Milho(1) Farelo de
Soja(1)
Caseína(1) Média
1 0,21±0,06a 2,46±0,06a 7,34±0,06a 3,34±0,04
2 0,20±0,06a 2,48±0,06a 7,19±0,06ab 3,29±0,04
3 0,20±0,06a 2,48±0,06a 6,99±0,06c 3,23±0,04
4 0,21±0,06a 2,57±0,06a 7,07±0,06bc 3,28±0,04
Média 0,21±0,03 2,50±0,03 7,15±0,03
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
121
12.44 Anexo 44
Tabela 35. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao
aminoácido arginina (Arg), no analisador de aminoácidos Beckman, para
os dados censurados..
Fonte de variação GL Soma de
quadrados
Quadrado
Médio
Teste F Prob >
F
Métodos 3 0,0042087 0,0014029 0,27 0,8463
Amostras 2 68,2630362 34,1315181 6578,79 0,0001
Interação Método x Amostras 6 0,0341483 0,0056914 1,10 0,3830
Métodos – Milho 3 0,0023812 0,0007937 0,15 0,9271
Métodos - Farelo de Soja 3 0,0061957 0,0020652 0,40 0,7552
Métodos – Caseína 3 0,0297802 0,0099267 1,91 0,1449
Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0001447 0,0000723 0,01 0,9862
Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0040641 0,0040641 0,78 0,3820
Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,0018935 0,0009467 0,18 0,8340
Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,0004877 0,0004877 0,09 0,7609
Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,0047105 0,0023552 0,45 0,6387
Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,0014852 0,0014852 0,29 0,5959
Métodos 1, 2 e 3 – Caseína 2 0,0005255 0,0002628 0,05 0,9507
Métodos 1 a 3 x 4 – Caseína 1 0,0292547 0,0292547 5,64 0,0230
Resíduo 36 0,1867723 0,0051881 - -
Total 47 68,4881655 - - -
R2 = 99.73 % CV = 3,66 % Desvio Padrão residual = 0,07 Média Geral = 1,97 %
122
12.45 Anexo 45
Tabela 36. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e
comparação entre os métodos para o aminoácido arginina (Arg)
obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados
censurados.
Método Milho Farelo de
Soja
Caseína Média(1)
1 0,31±0,04 2,95±0,04 2,62±0,04 1,96±0,02a
2 0,29±0,04 2,97±0,04 2,63±0,04 1,96±0,02a
3 0,28±0,04 2,99±0,04 2,61±0,04 1,96±0,02a
4 0,28±0,04 2,95±0,04 2,72±0,04 1,98±0,02a
Média 0,29±0,02 2,96±0,02 2,65±0,02
(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).
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