Disciplina: Introdução à Biotecnologia
Estratégias Moleculares na Avaliação da Diversidade Microbiana em Amostras
AmbientaisAluna: Catarina Macedo de
Figueirêdo
Orientadora: Margarida Matos de Mendonça
7 - 100 Milhões 7 - 100 Milhões ⇨ ⇨ estima-seestima-se ser o número ser o número real de seres vivos;real de seres vivos;
1,5 Milhões de organismos vivos 1,5 Milhões de organismos vivos ⇨ ⇨ identificados. identificados.
Diversidade Diversidade MicrobianaMicrobiana
• Bactérias ⇨ 5 mil espécies ⇨ 100 mil a 1 milhão de espécies
• Fungos ⇨ 100 mil espécies ⇨ 200 patogênicas aos seres vivos
• Protozoários ⇨ 20 mil espécies ⇨ poucas são patogênicas. (TORTORA, et al., (TORTORA, et al.,
2005)2005)
Ambientes da Diversidade Ambientes da Diversidade MicrobianaMicrobiana
Ampla MicrobiotaAmpla Microbiota• Solo RizósféricosSolo Rizósféricos• Águas ResiduaisÁguas Residuais• Sistemas de Lodo Sistemas de Lodo
AtivadoAtivado
Baixa MicrobiotaBaixa Microbiota• ArAr• Ambientes MarinhosAmbientes Marinhos• Águas DocesÁguas Doces• SoloSolo
Avaliação da Diversidade Microbiana
• Diversidade Microbiana⇨ fracamente conhecida ⇒ culturabilidade.
CULTURABILIDADE
CULTURA PURA
TÉCNICAS MOLECULAR
ES
NOVAS TÉCNICAS
DE CULTIVO
www.bdt.fat.orwww.bdt.fat.org.brg.br
Estratégias de Estratégias de DetecçãoDetecção
Técnicas- Detecção- Detecção
- - IdentificaçãoIdentificação
- - QuantificaçãoQuantificação
Dependente de Cultivo
Independente de Cultivo
Técnicas dependentes de Técnicas dependentes de cultivocultivo
• Culturas PurasCulturas Puras
• Isolamento
• Cultivo
• Identificação
• Falha na detecção de microrganismos.
• Complexa formulação dos meios de cultura.
• Técnicas clássicas: bioquímica e microbiologia ➭baixa determinação da biomassa e da estrutura.
• Falsa representação da diversidade microbiana em amostras ambientais.
• Tempo.(HURST, et al., (HURST, et al., 1997)1997)
Técnicas independentes de Técnicas independentes de cultivo cultivo
• Descrição da diversidade microbiana;
• Definição da estrutura e dinâmica de comunidades complexas;
• Técnicas moleculares;
• Desenvolvimento de novos métodos moleculares de identificação de microrganismos não cultiváveis.
(WALNER, et al., 1997; LEE, et al., 1999; NILSEN, et al., 1999; (WALNER, et al., 1997; LEE, et al., 1999; NILSEN, et al., 1999; FOSTER, et al., 2003)FOSTER, et al., 2003)
Águas Águas ResiduaisResiduais
EsgotoEsgoto::
“ Líquido caracterizado pelos despejos provenientes das diversas modalidades de uso e de origem das águas, tais como as de uso doméstico, comercial, industrial, utilidade pública, de áreas agrícolas, de superfície, de infiltrações, pluviais e de outros efluentes sanitários.”
(JORDÃO & PESSOA, 1995)(JORDÃO & PESSOA, 1995)
Esgotos
•Domésticos – Despejos domésticos, pluviais, infiltrações e pequenas parcelas industriais•Industriais – provêm de qualquer utilização da água para fins industriais.
Características do Esgoto
- Físicas
• Matéria sólida
• Odor
• Cor e turbidez (JORDÃO & PESSOA, (JORDÃO & PESSOA,
1995)1995)
- Químicas
•Matéria Orgânica: proteínas, carboidratos, gorduras e óleos, uréia, surfactantes, fenóis, pesticidas
•Matéria inorgânica: areia, substâncias minerais dissolvidas.
- Microbiológicas
• Bactérias• Fungos•Vírus•Algas•Protozoários
(JORDÃO & PESSOA, 1995)
Tratamento de Esgoto
Objetivo: “ Separar a água dos componentes sólidos, com a
intenção de purificar a água, tornando-a livre de patógenos e poluentes, podendo ser liberada ao meio ambiente.”
(HURST, et al., 1997) Etapas:
• Processo físico
• Processo químico
• Processo biológico (JORDÃO & PESSOA, (JORDÃO & PESSOA,
1995)1995)
Tratamento de Tratamento de EsgotoEsgoto
TratameTratamento nto
PrimárioPrimário
TratameTratamento nto
SecundárSecundárioio
TratameTratamento nto
TerciáriTerciárioo
ProcesProcesso so
QuímiQuímicoco
ProcessProcesso o
BiológiBiológicoco
ProcesProcesso so
FísicoFísico
Tratamento de Tratamento de EsgotoEsgoto
Processo biológico•Oxidação do lodo (aeróbia)
•Digestão do lodo (anaeróbia) Lodo
ativado É uma fase essencialmente biológica no sistema de tratamento de esgoto doméstico e industrial, realizada aerobicamente.“ O lodo ativado é composto por materiais sedimentados provenientes das seqüências de águas residuais e de sólidos gerados pelo processo de tratamento de esgoto” (DAVIS & CORNWELL,
1998)
Lodo Lodo AtivadoAtivado
• MicrorganismosMicrorganismos
Forma Forma livrelivre
Agregada - Agregada - flocosflocos
• AeraçãAeraçãoo
- Agitação- Agitação
- Suplemento de - Suplemento de OO22
- Dispersão - Dispersão microbianamicrobiana
• SedimentaçSedimentaçãoão
- Biomassa floculadaBiomassa floculada
-Sólidos Sólidos ⇨⇨ retornam ao retornam ao compartimento aeróbicocompartimento aeróbico
Lodo Ativado
Compostos orgânicos
[ O2 ]
Compostos inorgânicos
Multiplicação Crescimento celular
Produção de energia
Produção de CO2, NO3, O2, SO4, PO 4, H2O.
Lodo Ativado
• Características Físico-Químicas: Matéria orgânica, nutrientes, metais pesados, compostos inorgânicos potencialmente tóxicos.
• Finalização inadequada do tratamento:
Riscos à saúde, acúmulo de metais pesados ou compostos orgânicos no solo ou no efluente.
• Microbiologia do Lodo Ativado
(GONÇALVES, et al., 1999)
- Diversidade microbiana- Dinâmica das populações- Predomínio bacteriano
(GRAY, 1990)
Lodo Lodo AtivadoAtivado
Bactérias• Dispersas na fase líquida• Associadas ao floco e participando de sua
estrutura• Associadas ao floco, mas não participando da sua
formação• Bactérias do afluente ≠ bactérias do lodo
• Fatores
- pH- Temperatura- O2
- Nutrientes- Agitação- Carga afluente- Idade.
(HURST, et al., 1999; GRAY, (HURST, et al., 1999; GRAY, 1990)1990)
Lodo Ativado
Acinetobacter Hyphomicrobium
Alcaligenes Microbacterium
Bacillus Pseudomonas
Brevibacillus Sphaerotilus
Canlobacter Debaromyces
Comomonas Flavobacterium
Cytophaga
Gêneros envolvidos no consumo da matéria orgânica
(GRAY, 1990)
Lodo Lodo AtivadoAtivado
Nitrificantes DesnitrificantesUréia ⇨ NH4⇨ NO3 NO3 ⇨
N2Nitrosomonas Pseudomonas
Nitrospira Denitrobacillus
Nitrocystis Spirillum
Nitroglea Micrococcus
Nitrobacter Xanthomonas
Nitrococcus
Nitrospina
(GRAY, 1990)(GRAY, 1990)
Fungos• Pequena incidência;• Estão associados à estrutura do floco• Associado a Idade• pH < 6,0 ⇨ dominância fúngica
Protozoários• Componente comum;• Gêneros resistentes ⇨ Giardia e
Cryptosporidium
Lodo Ativado
Lodo Lodo AtivadoAtivado
Vírus• Organismos aquáticos ou patógenos ao
homem.• Grupos Presentes: Enterovirus Orthoreovirus Rotavirus Mastaadenovirus• Bacteriófagos ⇨ material fecal
Doenças entéricas
Técnicas Moleculares Utilizadas na Identificação Microbiana no
Lodo Ativado
Métodos Tradicionais
• Isolamento;
•Identificação: morfologia e bioquímica. (LIU, et al.,
2005)
Métodos Moleculares: Estudo das sequências de rRNA.
Identificação da microbiota
Técnica independente de
cultivo
Determinação da
diversidade
(DAHLLOF, 2002)
CULTURA
FISHFISH AMOSTRAMOSTRASAS
PCR in situ
EXTRAÇÃEXTRAÇÃOO
PCR
SEQÜÊNCIAMENTO
CLONAGEM DGGE, TGGE
MICROARRANJOS
HIBRIDIZAÇÃHIBRIDIZAÇÃOO
(DAHLLOF, (DAHLLOF, 2002)2002)
Hibridização in situ e FISH
Metodologia• Hibridização de uma seqüência alvo de DNA ou
de RNA com uma sonda de oligonucleotídeos marcada quimicamente ou radioativamente.
• Sondas ➭ Específicas Identificação dos ➭microrganismos.
FISH• Técnica Molecular ➭ Independente de cultivo• Possibilidade de identificação da diversidade
microbiana, sem alteração da sua estrutura espacial.
(COOPER, 2002; ALBERTS, et al., 2006)
FISH na avaliação da diversidade microbiana no
Lodo Ativado
Inúmeros trabalhos relatam a utilização da técnica de FISH na avaliação da diversidade microbiana nos sistemas de Lodo Ativado.
FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado
Chen et al., 2003
Análise de seqüências específicas de 16S rRNA
Estudo as alterações na prevalência de organismos de acordo com a concentração de cloro:
•Concentração de Cl- ⇒ 10 - 30 mg/L
•Oxidantes de NH4 ⇒ Predominância de Nitrossomonas
•Oxidantes de NO2 ⇒ Nitrobacter
•Redução do floco ⇒ ↑ da [ Cl-]
•Até 10 mg/L ⇒ mesma predominância ⇒ ↑ 10 mg/L diferentes espécies de Nitrossomonas
• Nitrobacter ⇒ Predominância contínua.
Fonte: CHEN, et al., Fonte: CHEN, et al., 20032003
Fonte: Chen et al., 2003
Liu et al., 2005
FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado
Análise de seqüências específicas das subunidades 16S do rRNA. Estudo para identificação das EBPR (bactérias removedoras de P).
• Análise do PPs intracelulares (PAOs) ⇒ DAPI• Sondas: EUB 338, GAM 42ª, ACA 23• Protebacteria ⇒ Prevalência de 70 % ⇒ -Proteobacteria ⇒ 60 %
• Gênero Acinetobacter ⇒ 31 % ⇒ Não caracterizada como PAO (organismo acumulador de polifosfatos)
• PAOs não foram caracterizados ⇒ sequênciamento ⇒ pequena similaridade com Banco de Genes.
Wong et al., 2005
FISH na avaliação da diversidade FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativadomicrobiana no Lodo Ativado
Hibridização de seqüências – alvo de rRNA com sondas fluorescência (FISH)
Estudo para identificação de EBPRs ⇒ PAOs, GBs
• Sondas: EUB mix, PAO mix, actino_1011
• EUB mix ⇒ 9 % de PAOs
• Rhodocyclus ⇒ β- Proteobacteria
predominância dentre as PAOs ⇒ 10-30% das Eubacteria
•Tretrasphera ⇒ Actinobacteria ⇒ actino_1011 ⇒ 7-10%;
• β- Proteobacteria apresentaram-se predominantes com 25%
• 30-60% da população ⇒ EBPRs
Conclusões
Vantagens da Utilização da Técnica de FISH:
• FISH possibilita a avaliação da diversidade microbiana sem a necessidade de cultivo;
• Possibilita a quantificação e determinação da estrutura da comunidade microbiana;
• Permite a detecção das alterações da prevalência microbiana nas comunidades estudadas;
• Diversas metodologias que podem ser específicas às células a serem hibridizadas;
• Técnicas de metodologias relativamente rápidas e de fácil execução, em relação às técnicas dependentes de cultivo.
Desvantagens da utilização da Técnica de FISH:
• Identificação de microrganismos específicos;• Na determinação da microbiota de uma comunidade ⇨
utilização de muitas sondas diferentes; • Custo relativamente alto;• Sobreposição das sondas hibridizadas ⇨ Alteração das
cores emitidas pelas sondas ⇨ dificuldade na identificação do microrganismo;
• Metodologias dependentes da permeabilidade dos microrganismos em relação a entrada das sondas.
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