Infecção por arbovírus e doença crônica neurodegenerativa: influências do ambiente e
envelhecimento na progressão da doença
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: 01/08/2014 a 01/08/2015
( ) PARCIAL
( x ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Infecção por arbovírus e doença crônica neurodegenerativa: influências do ambiente e envelhecimento na progressão da doença
Nome do Orientador: CRISTOVAM WANDERLEY PICANÇO DINIZ
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade: Medicina
Unidade: Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório: Laboratório de Investigações em Neurodegeneração e Infecção.
Título do Plano de Trabalho: Cinética da infecção pelo arbovírus Oropouche em modelo murino:
a resposta do hospedeiro adulto.
Nome do Bolsista: Danilo Marinho Pereira
Tipo de Bolsa : ( x ) PIBIC/CNPq
( ) PIBIC/UFPA
( ) PIBIC/INTERIOR
( ) PIBIC/FAPESPA
( ) PRODOUTOR
( ) PARD - renovação
( ) PIBIC/PIAD
( ) PIBIC/AF-CNPq
( ) PIBIC/AF-UFPA
( ) PIBITI
( ) PADRC
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INTRODUÇÃO
As infecções são um grande problema nas agendas de saúde mundiais tanto em países
desenvolvidos quanto em países subdesenvolvidos. As doenças infecciosas são a
segunda maior causa de mortes no mundo e a contínua evolução de doenças
emergentes e re-emergentes, particularmente em países em desenvolvimento, irá
aumentar o impacto global dessas doenças no século atual (Fauci. 2001). Exemplo da
grande escala desse problema no Brasil é o caso das infecções por vírus da dengue,
que quantifica mais de 53.000 casos por ano no país (Fauci. 2001) e por vírus
Oropouche, a segunda maior causa de arboviroses na Amazônia, com mais de 350.000
casos já registrados (Vasconcelos et al. 2009).
As doenças do envelhecimento também se tornaram uma preocupação importante dos
Sistemas Nacionais de Saúde em todos os lugares no mundo moderno, devido ao
aumento da expectativa de vida. A Organização Mundial da Saúde (OMS) indica
projeções estatísticas com aumento na porcentagem de idosos (com mais de 65 anos
de idade) na população, devido à transição demográfica no Brasil, passando de 7,3%
em 1991 para 15% em 2025. O novo século já começou com a população mais velha
crescendo no Brasil a uma taxa duas vezes superior à do conjunto da população.
Neste contexto, vale colocarmos que o declínio cognitivo ou demência é uma doença
típica do envelhecimento, afentando o sistema nervoso central, onde 50% dos idosos
de 80 anos ou mais de idade. O documento “Saúde do Idoso”, do Ministério da Saúde
do Brasil estima que o número de pacientes com demência no país hoje é cerca de 450-
600 mil, com 15.000 a 20.000 mortes devido à doença de Alzheimer a cada ano. O
mesmo documento informa que as estatísticas do Sistema Único de Saúde (SUS) têm
mostrado 115.000 hospitalizações devido à demência em um único ano (1996).
Não é difícil, a partir desses números, prever que as doenças infecciosas e doenças
neurodegenerativas crônicas em idosos, agindo em conjunto, serão a preocupação
central na saúde pública no novo século.
JUSTIFICATIVA
Na Região Amazônica, onde há anos ocorre o manejo inadequado de
ecossistemas naturais, arboviroses emergentes e re-emergentes têm se tornado um
problema dominante nos assuntos que concerne à saúde pública regional e nacional
(Vasconcelos et al. 2001). Há no total 187 diferentes espécies de arbovírus, com mais
de 10.000 cepas isoladas em humanos, insetos hematófagos, além de vertebrados
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silvestres, tendo como resultado do manejo inadequado dos ecossistemas naturais na
região amazônica brasileira a manifestação de arboviroses emergentes e re-
emergentes.
As poucas informações disponíveis sobre esses arbovírus estão limitadas a
métodos de isolamento e capacidade de infectar animais de laboratório. Porém, a real
capacidade de grande parte desses arbovírus de causarem doença em humanos
permanece desconhecida, com exceção de 32 desses arbovírus que possuem sua
capacidade patogênica descrita. Quatro desses vírus (Dengue, Febre Amarela,
Oropouche, Mayaro) são muito importantes em termos de saúde pública, já que são
responsáveis por induzir doenças severas em humanos e, portanto possuem grande
impacto econômico e social (Vasconcelos et al. 2001).
Oropouche é um vírus da família Bunyaviridae, gênero Orthounyavirirus
(Pinheiro et al. 1994) que em humanos se manifesta principalmente por episódios febris
agudos, caracterizados por febre, dor de cabeça, calafrios, vertigem, dor muscular,
artralgia e fotofobia (Pinheiro et al. 1981). Um estudo in vivo feito em animal mostrou
letalidade de 85% nos animais que receberam inoculação subcutanea de OROV, sendo
que os sintomas aparentes foram imobilidade, tremor e apatia (Santos et al. 2012). O
mesmo estudo demonstrou alterações no SNC, com ativação microglial no córtex
cerebral e ativação astrocitária no cérebro e na medula espinhal. Rodrigues et al. (2011),
utilizando hamster como modelo experimental, observaram 55% de prevalência de
sintomas tais como redução da ingestão de água e comida e pelo eriçado, além de
sintomas mais severos e menos frequentes como letargia, imobilidade, aumento de
temperatura, tremor, perda de peso, paralisia e morte. Os achados histopatológicos
desse estudo sugerem alterações no SNC, com meningocefalite e inflitrado
mononuclear no parênquima, além de alterações no fígado - com infiltrado inflamatório
abundante-, porém sem alterações em pulmão, rins e baço. Apesar dessas descrições,
são poucos os estudos que envolvem modelos experimentais e infecção por OROV e
em nenhum avaliou-se o impacto do ambiente enriquecido sobre as consequências da
doença ou relacionou os aspectos do comportamento alterado pela infecção e as
alterações neuropatológicas quantitativas.
Em estudo anterior demonstramos que um dos arbovírus da família
Rhabdoviridae, o arbovírus Piry, foi capaz de induzir encefalite em animals adultos e
que o ambiente enriquecido, onde foram mantidos, estava associado à redução das
alterações neuropatológicas levando a eliminação mais rápida do vírus no sistema
nervoso central, com aumento da atividade de células T (de Sousa et al. 2011).
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O ambiente enriquecido é definido como uma gaiola na qual há a combinação
de uma série de estímulos somatomotores, cognitivos e de interação social
(Rosenzweiget al. 1978). A estimulação de atividade exploratória e motora é induzida
com uma variedade de brinquedos, túneis, correntes, pontes e rodas de correr para
estimular o exercício físico voluntário dos animais tanto quanto sua natural tendência a
explorar objetos novos. Sabe-se também que este tipo de ambiente é capaz de induzir
aumento da citotoxidade de células NK (Banaroya-Milshteinet al. 2004). Além disso
Diniz et al (2012) demonstraram que o ambiente enriquecido é capaz de induzir o
aumento da resposta inflamatória na doença causada por vírus da dengue em um
modelo de infecção exacerbada por inoculação de anticorpo heterólogo e que isso
parece associado ao aumento de linfócitos T imunodisponíveis nos animais do ambiente
enriquecido. Esses resultados sugerem que diferentes patógenos podem ter sua
eliminação favorecida ou dificultada pela mobilização de linfócitos T dependendo da
natureza da resposta imune associada à doença e da estratégia de replicação viral.
No presente trabalho pretendemos estender esses ensaios a um outro arbovírus
de interesse epidemiológico investigando o curso temporal da infecção experimental
induzida por vírus Oropouche, a segunda mais frequente arbovirose humana no Brasil,
com mais de 350.000 casos somente na Amazônia. Poucos trabalhos tem se dedicado
ao estudo dos aspetos neuropatológicos induzidos pelo vírus Oropouche em modelos
experimentais (Rodrigues e al., 2011) e nenhum desses estudos investiga a mudança
na resposta imune associada ao ambiente enriquecido correlacionando as alterações
comportamentais e a neuropatologia quantitativa utilizando-se de métodos
estereológicos.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Induzir encefalite experimental por arbovírus Oropouche em modelo murino mantidos em
ambiente padrão ou enriquecido.
Objetivos Específicos
a) Avaliar as alterações comportamentais associadas à infecção por Oropouche;
b) Avaliar as alterações neuropatológicas quantitativas por meio de métodos
estereológicos;
c) Identificar a sequência temporal da neuroinvasão promovida pelo vírus Oropouche
em modelo murino por imunohistoquímica para os antígenos virais nos tempos de
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sobrevida de 1dpi, 2 dpi, 3 dpi, 4 dpi, 5 dpi, 6 dpi, 7 dpi, 8 dpi, 9 dpi, 10 dpi e 11 dpi (dpi=
dias pós-inoculação).
d) Em definida a cinética temporal do vírus em termos de concentração e tempo de
sobrevida, estabelecer então, uma leitura por imunhistoquímica anti-GFAP e anti-Iba 1
em hipocampo propriamente dito, CA3, com estimativa da população astrocitária e
microglial na região.
MATERIAIS E MÉTODOS:
ANIMAIS
Foram utilizados 115 animals (Mus muscullus) da linhagem BL6/C57 selecionadas ao
nascimento,com idade de 3 meses. Os animals foram fornecidos pelo Instituto Evandro
Chagas e manipulados segundo os "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH) nas
instalações do Laboratório de Investigações em Neurodegeneração e Infecção no
Hospital Universitário João de Barros Barreto/Universidade Federal do Pará (LNI-
HUJBB/UFPA). Esses animais foram distribuídos em 11 grupos de 5 animais, sendo 11
grupos de animais de ambiente enriquecido e 11 grupos de animais de ambiente padrão.
DEFINIÇÃO DA CINÉTICA DA INFECÇÃO POR OROPOUCHE
O inóculo infectante foi fornecido pelo Departamento de Arbovirologia do Instituto
Evandro Chagas (IEC/PA), sendo que a infecção por OROV foi induzida por meio de
inoculação intraperitoneal de 50 µl de extrato de cultura infectado com vírus Oropouche.
Os animais utilizados como controle receberam o mesmo volume de solução salina
estéril. As inoculações no grupo piloto foram feitas de formas sucessivas, determinando-
se a concentração em função da mortalidade e tempo de sobrevida adequados para a
manutenção dos animais em 3 meses de alojamento em biotério, nas condições de
ambientes padrão e enriquecido e então realização dos testes comportamentais e
ensaios imunohistoquímicos.
ALOJAMENTO
Os animais foram mantidos em uma gaiola de laboratório para animals, de dimensões
padronizadas (32x39x16,5 cm) e que corresponde a um ambiente empobrecido ou
padrão (AP) limitado a interações sociais entre os animais.
Os animais foram mantidos em uma sala com temperatura ambiente controlada
(23±1oC) sob regime de ciclo claro-escuro de 12 horas. O acesso à água e à
alimentação será sempre livre.
TESTES COMPORTAMENTAIS
Em função da completa ausência de sintomas no grupo piloto, os testes
comportamentais prévios às inoculações foram suspensos e aguardam a chegada do
novo modelo experimental em Hamsters (Mesocricetus auratus) a ser fornecido pela
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Instituto Evandro Chagas. Os ensaios comportamentais a serem utilizados com o novo
modelo são descritos a seguir:
Teste de retirada e estocagem de ração: Será realizado por duas horas por dia. Durante
uma semana antes da inoculação o animal fará treinamento e durante os dias pós-
inoculação. Os animais serão colocados em uma gaiola plástica (32 cm × 39 cm × 16.5
cm) contendo um tubo PVC com 100 g de ração.
Após o teste, toda comida deixada no tubo será pesada e os animais devolvidos para
sua gaiola (Deacon et al. 2001). A diferença entre o peso da comida remanescente no
tubo e a inicial representa a quantidade de ração estocada.
Tarefa exploratória do campo aberto: O aparato consiste em uma caixa de madeira cinza
(30 cm × 30 cm × 40 cm) com o chão dividido em nove quadrantes. O teste ocorrerá
uma vez por semana, uma semana antes da inoculação e durante as semanas pós-
inoculação. O animal será posto no centro do aparato e deixado no campo aberto por 5
min. Um metro acima do aparato será colocado uma vídeocâmera
conectada a um computador e todos os testes serão gravados em vídeo, que
posteriormente serão analisados com auxílio do software Any-Maze (Stöelting). Os
seguintes parâmetros serão analisados: distância total percorrida e tempo de
imobilidade e tempo de permanência no quadrante central do aparato. Após cada
sessão o aparato deve ser limpo com álcool 70% para remover pistas olfatórias.
Labirinto em cruz elevado (LCE): o LCE é constituído por dois braços abertos e dois
fechados (30x5cm) colocados em posições opostas, e uma plataforma central (5x5cm)
(Lister 1987). Os braços fechados possuem paredes de 15 cm de altura, enquanto que
nos braços abertos não há paredes. Os braços e a plataforma central são feitos de
madeira e pintados de tinta preta e elevados a 45 cm o chão. O protocolo usado para
este teste é o mesmo utilizado por Carola et al. (2002). O animal é colocado na
plataforma central do LCE, solto com a face virada para um dos braços abertos
permitindo-se a exploração do ambiente por um período de 5 minutos. O teste é
realizado em dois dias consecutivos, sendo que cada animal realiza uma sessão de
treino por dia. As imagens de cada treino são capturadas por uma câmera de vídeo
instalada a 1 m de altura do LCE e conectada a um computador, com o objetivo de
armazenar os testes para posterior análise. Após cada sessão o LCE é limpo com uma
solução de etanol a 70%. Os seguintes parâmetros comportamentais são analisados:
distância percorrida (m), velocidade média (m/s), tempo de imobilidade (s), número de
entradas nos braços abertos, fechados e na plataforma central, tempo total nos braços
abertos, fechados e na plataforma central e distância percorrida nos braços abertos,
fechados e na plataforma central.
Memória episódica: o teste consiste, basicamente, na exposição de objetos para que as
memórias espaciais e de tempo sejam analisadas. Primeiramente, será realizada a
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adaptação dos animais ao campo aberto (aparato): o hamster será colocado no aparato,
livre de objetos, por 5 minutos para explorar o campo aberto. Adaptação ao objeto: o
animal será exposto a quatro objetos idênticos colocados nos cantos do aparato por 5
minutos, três vezes, com 50 minutos de intervalo de cada vez. Estes objetos não eram
usados nos dias de teste. Todos os objetos são de plástico, com formas, altura e cores
diferentes. Antes de cada animal entrar no aparato, a caixa e os objetos serão limpos
com solução de etanol a 75% para minimizar a distinção olfativa dos animais. O
diagrama ilustrando o teste de memória episódica pode ser visualizado na figura abaixo.
Este teste consiste de três entradas: duas sessões de exposição aos objetos, de 5
minutos de duração com intervalos de 50 minutos entre elas e uma sessão de teste. Na
primeira sessão, quatro objetos idênticos serão apresentados. Na segunda sessão,
mais quatro objetos idênticos, porém diferentes, dos da primeira sessão serão
apresentados. Na sessão de teste, dois objetos da primeira sessão (objetos “antigos”)
e dois objetos da segunda sessão (objetos “recentes”) serão apresentados.
Além disso, um objeto da primeira sessão é deslocado para uma nova posição (objetos
“deslocados”), porém os objetos da segunda sessão permanecem nos lugares originais
(objetos “estacionários”).
Espera-se que os hamsters explorem por mais tempo os objetos da primeira sessão
(objetos “antigos”) do que os da segunda sessão (objetos “recentes”) com preferência
maior pelos objetos “antigos” e “deslocados”, seguida da preferência por objetos
“antigos” e “estacionários” e finalmente por objetos idênticos “recentes”.
PERFUSÃO E MICROTOMIA
Após os testes comportamentais os animals serão anestesiados com avertina, 0,5ml/5g
de peso corporal, por via intra-peritonial e perfundidos por via intra-cardíaca com
solução salina heparinizada e paraformaldeído 4% utilizando-se uma bomba de infusão.
Após a craniotomia, os cérebros serão seccionados em plano axial na espessura de
70μm em vibrátomo (MICROM, modelo HM 650 V). As secções de cada animal serão
divididas em cinco amostras igualmente representativas de todo o cérebro para posterior
processamento por imuno- ou histoquímica.
IMUNOHISTOQUÍMICA
Os animals serão perfundidos por via intra-cardíaca com solução salina heparinizada
seguida de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7.2–7.4). Séries
alternadas de cortes cerebrais (70 μm de expessura) obtidos com Vibrátomo
(Microtomo) serão imunorreagidos para anti-IBA1 ou anti-GFAP. As secções de cérebro
serão pré-tratadas em ácido bórico (pH 9.0) a 65-70 C por 60 minutos para
recuperação antigênica, lavados em tampão fosfato salina (PBS), imersos por 20
minutos em soro de cabra (Vector Laboratories), e depois serão incubados em anti-IBA1
(WakoChemicals, USA; Anti iba1, Rabbit; diluição 2 μg/ml) ou anti-GFAP (Milipore, USA;
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anti-GFAP, clone GA5, monoclonal antibody; diluição 1:250),diluídos em PBS 0.1 M (pH
7.2 – 7.4) por 3 dias a 4 °C. Depois de lavadas, as secções serão incubadas “overnight”
em solução contendo anticorpo secundário (goatanti-habbit-anti-mouse, 1:250 em PBS,
Vector Laboratories). Para inativação da peroxidase endógena as secções serão
imersas em H2O2 a 3% em PBS, lavadas em PBS e depois transferidas para a solução
de complexo Avidina-Biotina (VECTASTAIN ABC kit; Vector Laboratories) por uma hora.
Os cortes serão lavados novamente antes da incubação em tampão acetato 0.1 M por
3 minutos, e expostos a uma solução de diamidobenzidina em concentração 0.6 mg/ml,
cloreto de amônia e níquel a 2.5 mg/ml e glicose oxidase a 0.1 mg/ml. A confirmação da
especificidade da reação será feita por experimento controle no qual os cortes não serão
expostos ao anticorpo primário.
FOTOMIOGRAFIA E PROCESSAMENTO DE IMAGENS
As fotomicrografias serão obtidas com uma câmera digital acoplada a um microscópio
Zeiss (AxioCamHRc, Zeiss, Jena, Germany). O brilho e o contraste das imagens serão
ajustados através do software Adobe Photoshop 7.0.1 (San Jose, CA, USA).
RESULTADOS INICIAIS EM CAMUNDONGOS
Foram recebidos 115 animais da espécie Mus musculus, linhagem C57BL6, pós-
desmame de 21 dias. Os roedores foram alojados e separados em dois ambientes
diferenciados – ambiente padrão ou ambiente enriquecido – pelo período de três meses,
a fim de que atingissem a idade necessária para início dos testes e infecção. Os animals
foram divididos em números iguais entre os ambientes, para que se obtivesse um “n”
satisfatório de animais para processamento de dados estatísticos. Sendo assim, 55
animais foram alocados no ambiente padrão e outros 55 em ambiente enriquecido (ver
figura abaixo).
(A) Animais submetidos ao ambiente padrão ou empobrecido e (B) animais
submetidos ao ambiente enriquecido.
A B
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Outros cinco animais foram alocados em ambiente padrão e foram utilizados como
“animais-pilotos”, com a finalidade de serem utilizados para o estabelecimento da
dosagem ideal de vírus Oropouche necessária para que os animals infectados
sobrevivessem em uma janela temporal de onze dias pós-infecção (11 dpi).
O vírus utilizado foi produzido por cultivo no Departamento de Arboviroses do Instituto
Evandro Chagas (PA) e cedido para a experimentação sob a titulação de 108 PFU/mL e
concentração de 75% ECP.
Inicialmente, um animal piloto foi inoculado com 0,2 mL de vírus Oropouche, por via
intraperitoneal. Subsequentemente observou-se o animal piloto diariamente durante 11
dias e nenhum sinal clínico foi observado. Após os 11 dias, dobrou-se a dose para 0,4
mL, a fim de testar possível relação dose-efeito sem sucesso.
Em um segundo animal piloto, tentamos outra via que fora descrita em um artigo
recente, por Rodrigues et al. (2011), de infecção por vírus Oropouche em camundongos
neonatos. Utilizou-se a via intradérmica, com uma inoculação de 0,4 mL da suspensão
contendo vírus Oropouche, sob a mesma titulação e concentrações previamente
referidas. Nenhuma resposta clínico-patológica foi obtida durante os 11 dias de
observação. O aumento da dose resultou igualmente na ausência de sintomas.
Utilizamos um terceiro animal foi submetido a inoculações diárias. No primeiro dia, por
via intradérmica, utilizamos 0,4 mL; no segundo dia, mais 0,4 mL de vírus, e no terceiro
mais 0,4 mL. Nenhuma alteração sintomatológica descrita na literatura foi observada no
animal infectado. Finalmente utilizou-se macerado de cérebros de camundongos
neonatos infectados com o vírus aumentando a titulação viral. Para que se obtivesse o
macerado de encéfalos, foi necessário realizar inoculação intracerebral de 20 µL de
vírus Oropouche mantido em cultivo em 40 babies em amamentação, cedidos pelo
biotério do Instituto Evandro Chagas.
As inoculações foram realizadas sob fluxo laminar, para que se evitasse contaminação
por agentes externos. Após três dias da infecção (3 dpi), os babies infectados
começaram a apresentar sinais característicos da infecção viral como restrição à
amamentação, encurvamento da coluna vertebral e adução das articulações. O objetivo
da inoculação intracerebral foi aumentar a titulação viral e tentar provocar os sinais e
sintomas da doença no animal adulto (ver imagem abaixo).
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Animal nenonato após três dias de infecção (3 dpi)
Os encéfalos foram extraídos por craniotomia sob fluxo laminar, posteriormente foram
submetidos à maceração com diluição de Penicilina Streptomicina (Pen Strep), na
proporção de um encéfalo para cada 0,4 mL de Pen Strep, e colocados sob
centrifugação de 10.000 rpm em 15 minutos. O líquido sobrenadante foi colhido e
submetido ao congelamento imediato de – 80°C.
A partir disso, as amostras colhidas foram inoculadas nos animals pilotos.
Um quarto animal foi submetido a três inoculações de 0,4 mL durante três dias. Onze
dias após a última inoculação (11 dpi) o animal continuou sem apresentar nenhum tipo
de sintomatologia, evidenciando, mais uma vez, a ineficácia da infecção em animais
adultos nessa linhagem de camundongos.
Por conta desses resultados negativos faz-se necessária a mudança do modelo
experimental para a espécie Mesocricetus auratus reconhecidamente sensível à
infecção por Oropouche.
ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES:
Nos próximos meses serão iniciados as atividades de acordo com o cronograma abaixo:
ATIVIDADES Meses
2015 2016
7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6
Segregação de cada um desses grupos em dois outros:
ambiente enriquecido e padrão
x x x x
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Realização dos testes comportamentais (Baseline)
x
Inoculações e ensaios comportamentais x
Estatístitica, Corte e Reação Histoquímica x x
Análise histopatológica x
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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