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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E11
RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS
Docente a cargo: Mariano GRASSELLI
CEBI_E11_5 : Precipitación de proteínas
• La precipitación es una operación que convierte a un producto solubilizado en un producto sólido por acción de algún agente precipitante.
• La precipitación es uno de los métodos más antiguos de recuperación y purificación de proteínas y todavía hoy es muy usado.
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Características de precipitación
• Reduce la solubilidad
=> no es 100% eficiente
depende de :
• temperatura• pH• Fuerza iónica• Constante dieléctrica
Primera clasificación de las
proteínas
Fue según su solubilidad:
• Globulinas
– Proteínas insolubles a baja fuerza iónica
• Albúminas
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Su aplicación a nivel de laboratorio como industrial es muy amplia
debido a los siguientes factores:
– es una operación fácilmente escalable
– requiere de poco equipamiento
– en gral. los precipitantes son económicos.
– Puede hacerse en continuo
– Producto estable por largo tiempo
– Tolera impurezas como lípidos y AN
Según los principios por el cual se obtiene el producto en estado sólido:
– Por disminución de la solubilidad
– Por desnaturalización selectiva(destrucción de estructura terciaria)
– Por interacciones de afinidad(formación de un agregado)
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Precipitación negativa
• Precipitan los contaminantes • La proteína de interés queda en el sobrenadante
• llamada comúnmente “1er corte”
Precipitación positiva
• Precipita la proteína de interés, • Efecto concentrador además de fraccionador• llamada comúnmente “2do corte”
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Proteína en solución
Agua ordenada
Agentes precipitantes
1) Precipitación salina
2) Precipitación por solventes orgánicos
3) Precipitación isoeléctrica
4) Precipitación por polímeros no iónicos
5) Precipitación por polielectrolitos
6) Crioprecipitación
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Consiste en la adición de sales a la solución que contiene la proteína de interés, reduciendo su solubilidad
Mecanismo:
Reducción la capa de hidratación (hydration shell) afectando el balance entre las fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas
Precipitacion salina (Salting out)
Concentración salina
Solubilidad
“Salting in” “Salting out”
Curva de solubilidad de una proteína
A un pH, temperatura y tipo de sal determinados
0,15-0,2 M
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Expresión matemática empírica que describe el salting-out de las proteínas:
log S = log S0 - k.C
S = solubilidad de la proteínaS0 = solubilidad extrapolada de la proteína a concentración cero de sal.k = pendiente de la curva log S = f (C). C = concentración de sal.
Log S
Conc. salina
Log So k dependerá deLa proteína
La sal utilizada
S0 dependerá de La temperatura pH del sistema.
Cada proteína tendrá un S0 característico.
Precipitación con sulfato de amonio
Enzima pura
En una mezcla
Muestra: aldolasa de músculo de conejo
% saturación
M
Sulfato Amonio
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La concentración salina también puede expresar como
Molaridad
% respecto de la saturación
(de la sal en agua a la temperatura indicada)
Fuerza iónica (Γ) que se calcula según:
Γ= ½ * Σ (cci * qi2)
Donde cci es la concentración de cada ión iqi es la carga de cada ión i.
Características de las sales
•Solubilidad•Efectividad para precipitación•Múltiples cargas (anión mas importante que catión)
•No complejar la proteína (descartar los cationes divalentes)
•Costo de sal pura•Calor de disolución•Densidad de soluciones concentradas
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Serie de Hofmeister
Producen deshidratación de regiones hidrofóbicasNo interactúan directamente con la proteína
Sulfato de amonio
VentajasAlta solubilidad (~4 M entre 0 y 30 °C)Barato (el de grado técnico)Densidad solución saturada 1,235 g/mlConserva la integridad de proteínas termolábiles.Previene proteólisis y contaminación bacteriana
Inconvenientes
Contamina el precipitado
Corroe el metal y el cementoNo se puede usar por encima de pH 8 (efecto buffer)Problemas de eliminación (efluente no biodegradable)
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Precipitación de un extracto crudo
Precipitación de un extracto crudo
1ra prueba
Conclusión: Mejor fracción entre 40-60 %. Probar 45-70 %
Conclusión: Buena recuperación, pero peor factor purif que 1ra
prueba. Si la pureza es importante probar 48-65 %
2da prueba
3ra prueba
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Sulfato de sodio
Ventajas
Recuperable
Inconvenientes
Caro
Equipamiento termostatizado (35oC-40oC)
Problemas de degradación enzimática
Mecanismo: Disminución de la constante dieléctrica, generando una atracción entre áreas de carga opuesta.
Precipitación con solventes
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Expresión matemática empírica :log S = log S0 - k/D
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S = solubilidad de la proteína en la mezcla solvente orgánico-aguaS0 = solubilidad de la proteína en la solución acuosa originalk = constante que depende del
solvente
proteína
temperatura
pH
D = constante dieléctrica del solvente orgánico
D (agua)= 80D (alcoholes) < 35
Precipitación con solventes
La selección práctica de solventes para la precipitación en
gran escala está limitada:
• Metanol• Etanol •Isopropanol •Acetona•Dioxano y otros éteres (vapores tóxicos)
Problema: desnaturalización (a temp > 10 °C es importante)
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Precipitación en acetona a 0 °C, pH 6,5, I= 0,1
Relación entre PM y concentración
de solvente
Efecto de
desnaturalización
por solventes
orgánicos
Interacción y estabilización de regiones hidrofóbicas
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Cambio de la temperatura por
agregado de solvente
No hay cambios
Usar solvente enfriado a < 0 °C !!!!
Fraccionamiento de Cohn(1946)
Γ / 2 : corresponde a la fuerza iónica de las soluciones
Ventajas
• Fácil recuperación (destilación)• Efecto bactericida y viricidaInconvenientes
• Inflamabilidad• Desnaturalización del producto• Calor de disolución
Gammaglobulinas
Plasminógeno
Protrombina
Albúmina
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Precipitación isoeléctrica
Mecanismo
Disminución de la solubilidad por carga neta cero
Ventajas
• Se puede combinar con otras técnicas
Desventajas
• No es muy eficiente• Se requiere un estricto control del pH• Buen mezclado para no sobrepasar el pH crítico
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Precipitación por polímeros no iónicos
Mecanismo
(posiblemente) por la disminución del agua de solvatación Polietilenglicol es el mas utilizado por la baja viscosidad.(hay de diferentes PM)
Ventajas
• bajo calor de disolución• en gral no son tóxicos• se usa en concentraciones del 5 al 20%
Desventajas
Costo inicial del polímeroEliminaciónReciclado
Proteína de pI 4,5 y Zn2+ (cofactor)
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Tiroglobulina 670 kDaAldolasa 157 kDa
IgG 160 kDaFibrinógeno 340 kDa
Tiroglobulina no cumple
• Es difícil de eliminar, especialmente el
de mayor PM (20.000 Da)
• En baja concentración no interfiere en
otros procesos
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Precipitación por polielectrolitos
Mecanismo
cancelación de cargas.
Ventajas
• Muy bajas concentraciones (normalmente 0,05 a 0,1 %).• Los precipitados se forman bien y sedimentan rápido• Las operaciones a gran escala son económicas (con reciclado- puede llegar al 90 %)
Desventajas
Costo inicial del polielectrolitoInterferencias en pasos posteriores
•Ácido poli acrílico•Polisacáridos acidicos•Poli fosfatos•Polietilenimina•Quitosano
Precipitación por temperatura
Mecanismo
Desnaturalización selectiva.
La precipitación térmica es muy usada en la industria alimenticia
Las propiedades funcionales se ven seriamente afectadas por el proceso.
Sin embargo, la combinación con otros agentes precipitantes hace que estos tratamientos se realicen a menor temperatura mejorando la calidad de las proteínas precipitadas.
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Precipitación por temperatura de
proteínas del lactosuero
BSA
Desnaturalización térmica
Proteínas muy robustas y estables a condiciones extremas=> Realizar una precipitación negativa con temperatura
•Probar escalones de 5 °C•Incubaciones en la escala de minutos•Cuidado con la proteolisis•pH importante
(pH fisiológico es en gral mas estable)
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Precipitación por afinidad
STI= soybeam trypsin inhibitor
Precipitación de tripsina por afinidad
Precipitación por afinidad
La proteína y el ligando deben tener mas de un sitio de interacción
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Hemoglobina humana
Mioglobinade esperma de ballena
Precip.: Cu2SO4
Citocromo
Mioglobinade esperma de ballena
Hemoglobina humana
Precip.: Cu2EGTA
Contenido de HisHb: 26 HisMb: 6 HisCit: 0 His acc
Interacción His Cu2+
Complejo de coordinación
Nucleación
(pocos seg)
Floculación
(1 –100 um)
Cinética de precipitación
Crecim. Lim.
por difusión
(0.1 –10 um)
Mezclado inicial
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Otros precipitantes
• Ácido caprílico (ácido n-octanoico)– Purificación de Albúmina de suero
Aumenta la estabilidad térmica de la Albúmina
se mantiene soluble a 60 °C durante 30 min a pH 4,8
Tipo de procesos
Intermitente Continuo tubularContinuo
tanque agitado
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Problemas de escalado en BATCH
• Tiempo largo de mezclado– Parámetro clave del escalado
– Mantener la relación Potencia/Volumen
• Coprecipitación
• Desnaturalización térmica del producto
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