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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS

Docente a cargo: Mariano GRASSELLI

CEBI_E11_5 : Precipitación de proteínas

• La precipitación es una operación que convierte a un producto solubilizado en un producto sólido por acción de algún agente precipitante.

• La precipitación es uno de los métodos más antiguos de recuperación y purificación de proteínas y todavía hoy es muy usado.

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Características de precipitación

• Reduce la solubilidad

=> no es 100% eficiente

depende de :

• temperatura• pH• Fuerza iónica• Constante dieléctrica

Primera clasificación de las

proteínas

Fue según su solubilidad:

• Globulinas

– Proteínas insolubles a baja fuerza iónica

• Albúminas

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Su aplicación a nivel de laboratorio como industrial es muy amplia

debido a los siguientes factores:

– es una operación fácilmente escalable

– requiere de poco equipamiento

– en gral. los precipitantes son económicos.

– Puede hacerse en continuo

– Producto estable por largo tiempo

– Tolera impurezas como lípidos y AN

Según los principios por el cual se obtiene el producto en estado sólido:

– Por disminución de la solubilidad

– Por desnaturalización selectiva(destrucción de estructura terciaria)

– Por interacciones de afinidad(formación de un agregado)

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Precipitación negativa

• Precipitan los contaminantes • La proteína de interés queda en el sobrenadante

• llamada comúnmente “1er corte”

Precipitación positiva

• Precipita la proteína de interés, • Efecto concentrador además de fraccionador• llamada comúnmente “2do corte”

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Proteína en solución

Agua ordenada

Agentes precipitantes

1) Precipitación salina

2) Precipitación por solventes orgánicos

3) Precipitación isoeléctrica

4) Precipitación por polímeros no iónicos

5) Precipitación por polielectrolitos

6) Crioprecipitación

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Consiste en la adición de sales a la solución que contiene la proteína de interés, reduciendo su solubilidad

Mecanismo:

Reducción la capa de hidratación (hydration shell) afectando el balance entre las fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas

Precipitacion salina (Salting out)

Concentración salina

Solubilidad

“Salting in” “Salting out”

Curva de solubilidad de una proteína

A un pH, temperatura y tipo de sal determinados

0,15-0,2 M

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Expresión matemática empírica que describe el salting-out de las proteínas:

log S = log S0 - k.C

S = solubilidad de la proteínaS0 = solubilidad extrapolada de la proteína a concentración cero de sal.k = pendiente de la curva log S = f (C). C = concentración de sal.

Log S

Conc. salina

Log So k dependerá deLa proteína

La sal utilizada

S0 dependerá de La temperatura pH del sistema.

Cada proteína tendrá un S0 característico.

Precipitación con sulfato de amonio

Enzima pura

En una mezcla

Muestra: aldolasa de músculo de conejo

% saturación

M

Sulfato Amonio

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La concentración salina también puede expresar como

Molaridad

% respecto de la saturación

(de la sal en agua a la temperatura indicada)

Fuerza iónica (Γ) que se calcula según:

Γ= ½ * Σ (cci * qi2)

Donde cci es la concentración de cada ión iqi es la carga de cada ión i.

Características de las sales

•Solubilidad•Efectividad para precipitación•Múltiples cargas (anión mas importante que catión)

•No complejar la proteína (descartar los cationes divalentes)

•Costo de sal pura•Calor de disolución•Densidad de soluciones concentradas

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Serie de Hofmeister

Producen deshidratación de regiones hidrofóbicasNo interactúan directamente con la proteína

Sulfato de amonio

VentajasAlta solubilidad (~4 M entre 0 y 30 °C)Barato (el de grado técnico)Densidad solución saturada 1,235 g/mlConserva la integridad de proteínas termolábiles.Previene proteólisis y contaminación bacteriana

Inconvenientes

Contamina el precipitado

Corroe el metal y el cementoNo se puede usar por encima de pH 8 (efecto buffer)Problemas de eliminación (efluente no biodegradable)

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Precipitación de un extracto crudo

Precipitación de un extracto crudo

1ra prueba

Conclusión: Mejor fracción entre 40-60 %. Probar 45-70 %

Conclusión: Buena recuperación, pero peor factor purif que 1ra

prueba. Si la pureza es importante probar 48-65 %

2da prueba

3ra prueba

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Sulfato de sodio

Ventajas

Recuperable

Inconvenientes

Caro

Equipamiento termostatizado (35oC-40oC)

Problemas de degradación enzimática

Mecanismo: Disminución de la constante dieléctrica, generando una atracción entre áreas de carga opuesta.

Precipitación con solventes

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Expresión matemática empírica :log S = log S0 - k/D

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S = solubilidad de la proteína en la mezcla solvente orgánico-aguaS0 = solubilidad de la proteína en la solución acuosa originalk = constante que depende del

solvente

proteína

temperatura

pH

D = constante dieléctrica del solvente orgánico

D (agua)= 80D (alcoholes) < 35

Precipitación con solventes

La selección práctica de solventes para la precipitación en

gran escala está limitada:

• Metanol• Etanol •Isopropanol •Acetona•Dioxano y otros éteres (vapores tóxicos)

Problema: desnaturalización (a temp > 10 °C es importante)

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Precipitación en acetona a 0 °C, pH 6,5, I= 0,1

Relación entre PM y concentración

de solvente

Efecto de

desnaturalización

por solventes

orgánicos

Interacción y estabilización de regiones hidrofóbicas

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Cambio de la temperatura por

agregado de solvente

No hay cambios

Usar solvente enfriado a < 0 °C !!!!

Fraccionamiento de Cohn(1946)

Γ / 2 : corresponde a la fuerza iónica de las soluciones

Ventajas

• Fácil recuperación (destilación)• Efecto bactericida y viricidaInconvenientes

• Inflamabilidad• Desnaturalización del producto• Calor de disolución

Gammaglobulinas

Plasminógeno

Protrombina

Albúmina

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Precipitación isoeléctrica

Mecanismo

Disminución de la solubilidad por carga neta cero

Ventajas

• Se puede combinar con otras técnicas

Desventajas

• No es muy eficiente• Se requiere un estricto control del pH• Buen mezclado para no sobrepasar el pH crítico

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Precipitación por polímeros no iónicos

Mecanismo

(posiblemente) por la disminución del agua de solvatación Polietilenglicol es el mas utilizado por la baja viscosidad.(hay de diferentes PM)

Ventajas

• bajo calor de disolución• en gral no son tóxicos• se usa en concentraciones del 5 al 20%

Desventajas

Costo inicial del polímeroEliminaciónReciclado

Proteína de pI 4,5 y Zn2+ (cofactor)

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Tiroglobulina 670 kDaAldolasa 157 kDa

IgG 160 kDaFibrinógeno 340 kDa

Tiroglobulina no cumple

• Es difícil de eliminar, especialmente el

de mayor PM (20.000 Da)

• En baja concentración no interfiere en

otros procesos

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Precipitación por polielectrolitos

Mecanismo

cancelación de cargas.

Ventajas

• Muy bajas concentraciones (normalmente 0,05 a 0,1 %).• Los precipitados se forman bien y sedimentan rápido• Las operaciones a gran escala son económicas (con reciclado- puede llegar al 90 %)

Desventajas

Costo inicial del polielectrolitoInterferencias en pasos posteriores

•Ácido poli acrílico•Polisacáridos acidicos•Poli fosfatos•Polietilenimina•Quitosano

Precipitación por temperatura

Mecanismo

Desnaturalización selectiva.

La precipitación térmica es muy usada en la industria alimenticia

Las propiedades funcionales se ven seriamente afectadas por el proceso.

Sin embargo, la combinación con otros agentes precipitantes hace que estos tratamientos se realicen a menor temperatura mejorando la calidad de las proteínas precipitadas.

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Precipitación por temperatura de

proteínas del lactosuero

BSA

Desnaturalización térmica

Proteínas muy robustas y estables a condiciones extremas=> Realizar una precipitación negativa con temperatura

•Probar escalones de 5 °C•Incubaciones en la escala de minutos•Cuidado con la proteolisis•pH importante

(pH fisiológico es en gral mas estable)

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Precipitación por afinidad

STI= soybeam trypsin inhibitor

Precipitación de tripsina por afinidad

Precipitación por afinidad

La proteína y el ligando deben tener mas de un sitio de interacción

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Hemoglobina humana

Mioglobinade esperma de ballena

Precip.: Cu2SO4

Citocromo

Mioglobinade esperma de ballena

Hemoglobina humana

Precip.: Cu2EGTA

Contenido de HisHb: 26 HisMb: 6 HisCit: 0 His acc

Interacción His Cu2+

Complejo de coordinación

Nucleación

(pocos seg)

Floculación

(1 –100 um)

Cinética de precipitación

Crecim. Lim.

por difusión

(0.1 –10 um)

Mezclado inicial

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Otros precipitantes

• Ácido caprílico (ácido n-octanoico)– Purificación de Albúmina de suero

Aumenta la estabilidad térmica de la Albúmina

se mantiene soluble a 60 °C durante 30 min a pH 4,8

Tipo de procesos

Intermitente Continuo tubularContinuo

tanque agitado

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Problemas de escalado en BATCH

• Tiempo largo de mezclado– Parámetro clave del escalado

– Mantener la relación Potencia/Volumen

• Coprecipitación

• Desnaturalización térmica del producto