APLICAÇÃO DE PROTEASES E AMILASES PRODUZIDAS POR
Bacillus sp. SMIA-2 NA REMOÇÃO DE MANCHAS DE TECIDOS
ERIKA FRAGA DE SOUZA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
AGOSTO- 2012
APLICAÇÃO DE PROTEASES E AMILASES PRODUZIDAS POR
Bacillus sp. SMIA-2 NA REMOÇÃO DE MANCHAS DE TECIDOS
ERIKA FRAGA DE SOUZA
“Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal”.
Orientador: Profa. Meire Lelis Leal Martins
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
AGOSTO- 2012
iii
Dedico a todos aqueles que torceram, incentivaram e
reconheceram o meu empenho em cumprir mais esta etapa.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus. Tenho certeza que esteve comigo me abençoando em todos os momentos e tudo ocorreu conforme a providência divina; Aos meus pais, Luiz Fernando e Silvana por tanto amor. Obrigada por não medirem esforços em me ajudar em todos os momentos e estarem ao meu lado sempre; Ao Léo, meu namorado, amigo e parceiro em todos os momentos que precisei, por me incentivar sempre e me compreender nos momentos de ausência e preocupação; Ao meu irmão Luiz Vítor, aos demais familiares e amigos por torcerem pelo meu crescimento e felicidade. Obrigada pelo carinho; Às minhas avós, Elza e Elza e à minha madrinha Sílvia pelas orações e pela torcida; Aos meus avôs Alcimar, Vítor (in memoriam) e meu padrinho Ronaldo (in memoriam) por serem meus ídolos e meus exemplos de caráter; À Professora Meire pela orientação, ensinamentos e por me possibilitar fazer parte desse grande projeto; A FAPERJ pela concessão da bolsa de mestrado; Aos meus queridos amigos mineiros, João e Simone, que estiveram ao meu lado durante toda essa jornada, sempre dispostos a me ajudar e com os quais eu muito aprendi e conversei. Teria sido mais difícil sem ajuda de vocês; Aos demais companheiros de bancada: Nati, Andréia, Silvania, Vanessa e em especial a Priscila que muito me ajudou na realização das fermentações. Obrigada pelos momentos de descontração, pelo apoio e pela ajuda no meu crescimento profissional; Aos amigos do LTA: Suelen, Geraldo, Natália, Clara, Nayara, Manoel, Carmô, Jeffinho e tantos outros que torceram por mim;
v
Às técnicas Aninha e Val por estarem sempre dispostas a contribuir, pelo carinho e amizade; A Sílvia pela amizade, por me transmitir otimismo, fé e pelos conselhos; Ao Laboratório de Fisiologia Vegetal, em especial ao Prof. Ricardo Bressam, por permitir o uso da centrífuga e à aluna Juliana por auxiliar no uso; Ao Prof. Eder Dutra por disponibilizar o uso do colorímetro; A Elaine do LQFPP pelo apoio na liofilização das amostras; A todos os Professores do LTA pelos ensinamentos nas disciplinas e pela amizade; Aos amigos da Bio 2005 por serem e terem sido fundamentais na minha formação e pela força que representa a nossa amizade; Aos amigos da Embrapa (Gabi, Marcela, Kátia, Andressa, Melícia, Maíra, Lud, Regi, Lívia, Selma e os pesquisadores Leda, Janine e Edmar) pelo apoio e incentivo; Aos profissionais que passaram pela minha caminhada e contribuíram para a minha formação pessoal e profissional: Profa. Denise Dagnino (orientadora da Graduação), Profa. Marília Berbert (Profa. Microbiologia Industrial), Diogo Meirelles (amigo da Iniciação científica), Stnio Oliveira e Jorge Dias (Usina Paraíso).
vi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS........................................................................................................ 3
3. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 4
3.1. Aplicação industrial de enzimas ...................................................................... 4
3.2. Produção de enzimas....................................................................................... 6
3.3. Processos de concentração de enzimas.......................................................... 8
3.3.1. Precipitação fracionada com sulfato de amônio........................................... 8
3.3.2. Liofilização..................................................................................................... 10
3.4. Proteases......................................................................................................... 11
3.5. Amilases........................................................................................................... 13
3.6. Fontes de obtenção de amilases e proteases.................................................. 15
3.7. Aplicação de enzimas na indústria de detergentes.......................................... 17
3.8. Medida de detergência em laboratório............................................................. 19
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 21
4.1. Microrganismo................................................................................................. 21
4.2. Manutenção do microrganismo........................................................................ 21
4.3. Meio de crescimento........................................................................................ 21
4.4. Preparo do pré-inóculo..................................................................................... 22
4.5. Crescimento do microrganismo........................................................................ 23
4.6. Medida do crescimento e pH............................................................................ 23
4.7. Determinação da atividade enzimática............................................................. 23
4.7.1. Determinação da atividade da α- amilase..................................................... 23
4.7.2. Determinação da atividade da Protease....................................................... 24
vii
4.7.3. Determinação de proteínas........................................................................... 24
4.8. Produção e purificação parcial das enzimas.................................................... 25
4.9. Liofilização........................................................................................................ 25
4.10. Caracterização parcial da α- amilase e protease no extrato
dialisado...................................................................................................................
26
4.10.1. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade da α- amilase e
protease...................................................................................................................
26
4.10.2. Efeito do pH na atividade e estabilidade da α- amilase e protease............. 26
4.11. Estabilidade de extratos dialisados das enzimas protease e α- amilase nas
temperaturas usadas nas lavagens dos tecidos.....................................................
27
4.12. Desempenho das enzimas produzidas por Bacillus sp. SMIA-2 na lavagem
do EMPA 112...........................................................................................................
26
4.12.1. Lavagem usando extrato liofilizado............................................................. 27
4.12.2. Lavagem usando extrato dialisado.............................................................. 28
4.13. Avaliação de detergência............................................................................... 29
4.14. Análise Estatística.......................................................................................... 30
4.15. Preparo das manchas nos tecidos................................................................. 30
4.16. Desempenho das enzimas na lavagem de tecidos manchados com gema
de ovo, molho de tomate e Toddynho®..................................................................
30
4.17. Estabilidade ao armazenamento do extrato dialisado congelado.................. 31
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 32
5.1. Perfil de crescimento do microrganismo........................................................... 32
5.2. Produção e purificação parcial das enzimas.................................................... 33
5.3. Liofilização........................................................................................................ 34
5.4. Caracterização parcial da ɑ-amilase e protease no extrato dialisado.............. 36
5.5. Estabilidade de extratos dialisados contendo enzimas proteases e ɑ-
amilases usadas nas lavagens dos tecidos............................................................
38
5.6. Desempenho de proteases e ɑ-amilases produzidas por Bacillus sp. SMIA-2
na lavagem de tecidos padrão EMPA 112..............................................................
40
5.6.1. Lavagem de tecidos padrão EMPA 112 utilizando extratos
liofilizados.................................................................................................................
40
5.6.2. Lavagem de tecidos padrão EMPA 112 utilizando extratos dialisados das
enzimas proteases e ɑ-amilases............................................................................. 41
viii
5.7. Desempenho das enzimas proteases e ɑ-amilases dialisadas de Bacillus sp.
SMIA-2 na lavagem de tecidos manchados com diferentes alimentos...................
44
5.8. Estabilidade ao armazenamento de extratos dialisados congelados............... 46
6. RESUMO E CONCLUSÕES............................................................................... 48
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 50
ix
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química da amilose (a) e amilopectina (b)................
13
Figura 2. Crescimento (■), pH(●) e atividade de protease (▼) e ɑ-
amilase (▲) de Bacillus sp. SMIA-2..........................................................
32
Figura 3. Atividade (■) e estabilidade (●) de extratos dialisados contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2, em diferentes pHs...................
36
Figura 4. Temperatura ótima para atividade de extratos dialisados contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2.................................................
38
Figura 5. Estabilidade térmica de extratos dialisados contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2.................................................................................................
38
Figura 6. Estabilidade de extratos dialisados contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp SMIA-2, incubados em diferentes temperaturas...................................
39
Figura 7. Estabilidade de extratos dialisados das enzimas proteases (a)
e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2 incubados em diferentes temperaturas na presença do detergente Tixan®.........................................................................................................
39
x
Figura 8. Efeito da solução “detergente-enzimas” na remoção de sujidades dos tecidos sujos padrão (EMPA 112) utilizando diferentes condições de lavagem a 55ºC...................................................................
44
Figura 9. Remoção de manchas de tecidos sujos com molho de tomate utilizando diferentes condições de lavagem a 40ºC...................................
44
Figura 10. Remoção de manchas de tecidos sujos com Toddynho®
utilizando diferentes condições de lavagem a 40ºC..................................
45
Figura 11. Remoção de manchas de tecidos sujos com gema de ovo utilizando diferentes condições de lavagem a 40ºC..................................
45
Figura 12. Remoção de manchas de tecidos sujos com gema de ovo
utilizando diferentes condições de lavagem a 55ºC..................................
46
Figura 13. Estabilidade de extratos dialisados congelados das enzimas proteases (a) e ɑ-amilases produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2........................................................................................................
47
xi
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Aplicação das enzimas de uso industrial..................................
6
Tabela 2: Composição do meio de crescimento g.L-1............................. 22
Tabela 3. Purificação Parcial da α-amilase..............................................
34
Tabela 4. Purificação Parcial da protease..............................................
34
Tabela 5. Influência da liofilização na atividade da amilase.................... 35
Tabela 6. Influência da liofilização na atividade da protease...................
35
Tabela 7. Medidas da refletância de tecidos EMPA 112 submetidos a diferentes condições de lavagem usando enzimas liofilizadas..................
40
Tabela 8. Medidas de refletância de tecidos EMPA 112 obtidas após a lavagem a 40°C utilizando o detergente Tixan® e extrato dialisado de proteases e α-amilases de Bacillus sp. SMIA-2 ........................................
41
Tabela 9. Medidas de refletância de tecidos EMPA 112 submetidos a diferentes condições de lavagem a 40°C utilizando as enzimas proteases e ɑ-amilases dialisadas de Bacillus sp. SMIA-2 ....................... Tabela 10. Medidas de refletância de tecidos EMPA 112 submetidos a diferentes condições de lavagem a 25°C utilizando as enzimas proteases e ɑ-amilases dialisadas de Bacillus sp. SMIA-2 .......................
42 43
Tabela 11. Medidas de refletância de tecidos EMPA 112 submetidos a diferentes condições de lavagem a 55°C utilizando as enzimas proteases e ɑ-amilases dialisadas de Bacillus sp. SMIA-2 .......................
43
xii
RESUMO
SOUZA, Erika Fraga de; M.S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Agosto de 2012. Aplicação de proteases e amilases produzidas por Bacillus sp. SMIA-2 na remoção de manchas de tecidos. Orientadora Profa: Meire Lelis Leal Martins. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de estudar o potencial de
aplicação de α-amilases e proteases produzidas simultaneamente por Bacillus sp.
SMIA-2, como aditivo em detergentes. Bacillus sp. SMIA-2 secretou e protease
quando cultivado em meio líquido contendo proteínas do soro de leite, amido e
água de maceração de milho. A maior atividade da protease e α-amilase ocorreu
após 36 horas de fermentação, alcançando níveis de 14,91U/mL e 2,47 U/mL
respectivamente. Os extratos enzimáticos foram parcialmente purificados por
precipitação com sulfato de amônio e diálise. As frações ativas das várias
fermentações foram unificadas e apresentaram atividade enzimática de 17,92
U/mg e 80,60 U/mg para α-amilase e protease, respectivamente. Estudos sobre a
caracterização das enzimas dialisadas revelaram que a temperatura para
atividade ótima e melhor estabilidade da ɑ-amilase foi 90ºC e para protease foi a
70ºC. O pH para atividade ótima de ambas as enzimas foi 8,5. Após a incubação
dessas enzimas por 2 h a pH 8,5 foi observado um decréscimo de 23% e 11% da
atividade inicial da protease e amilase, respectivamente. A estabilidade das
enzimas com detergente Tixan® após 30 minutos de incubação a 25ºC, 40ºC e
55ºC também foi estudada. Tecidos manchados com Ketchup, gema de ovo e
xiii
chocolate (EMPA 112 e Toddynho®) foram submetidos a tratamentos de lavagem
com água, detergente e detergente contendo protease e amilases de Bacillus sp.
SMIA-2. A adição das enzimas α-amilase e proteases produzidas
simultaneamente pela cepa Bacillus sp. SMIA-2 melhorou o desempenho do
detergente na remoção de manchas de tecidos.
xiv
ABSTRACT
SOUZA, Erika Fraga de; M.S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. August, 2012. Use of proteases and amylases produced by Bacillus sp. SMIA-2 to remove stains in clothes pieces. Prof. Advisor: Meire Lelis Leal Martins.
This work was carried out with the objective of studying the potential application of
ɑ-amylase and protease produced simultaneously by thermophilic Bacillus sp.
SMIA-2, as detergents additives. Bacillus sp. SMIA-2 secreted α-amylase and
protease when cultivated in liquid culture containing whey protein concentrate,
starch and corn steep liquor. The highest activity of the protease and α-amylase
was found after 36h of culture incubation reaching levels of 14,91 U/mL and 2,47
U/mL respectively. The crude enzymes were partially purified by combination of
ammonium sulfate precipitation and dialysis. The active fractions from several
fermentations, were pooled and showed enzyme activity of 17,92 U/mg and 80,60
U/mg for α-amylase and protease, respectively. Studies on the crude dialyzed
enzymes characterization revealed that the optimum temperature and the best
thermostability of the ɑ-amilase was 90 ºC and the protease was 70 ºC. The
optimum pH of both enzymes was found to be 8,5. After incubation of these
enzymes for 2 h at pH 8,5 was observed a decrease of about 23% and 11% of the
protease and amylase original activity, respectively. The stability of these enzymes
with the detergent Tixan® after 30 min of incubation at 25ºC, 40ºC e 55ºC was also
xv
studied. Stained cloth pieces soiled with Ketchup, egg yolk and chocolate (EMPA
112 and Toddynho®) were subjected to wash treatments with water, detergent and
detergent containing Bacillus sp. SMIA-2 protease and amylases. The addition of
enzymes α-amylase and protease produced simultaneously by Bacillus sp. SMIA-
2 strain improved the cleaning performance of detergent for removing stains
clothes.
1
1. INTRODUÇÃO
A importância da sustentabilidade nas atividades produtivas tem sido
amplamente reconhecida, havendo a necessidade da substituição de processos
químicos baseados em insumos não renováveis por processos químicos ou
bioquímicos que utilizem insumos renováveis. Reconhece-se também a
necessidade da substituição das múltiplas etapas de processos químicos por
processos biotecnológicos mais eficientes.
Os processos químicos tradicionalmente adotados pela engenharia
química utilizam compostos químicos muitas vezes tóxicos, como matérias-primas
ou insumos da sua cadeia produtiva. Dentro deste contexto, destaca-se a
tecnologia enzimática, que é um dos campos mais promissores dentro das novas
tecnologias para síntese de compostos de alto valor agregado (Bon et al., 2008).
Em decorrência destas necessidades e tendências, prevê-se um aumento
significativo no consumo de enzimas em nível internacional. Este cenário é
particularmente importante para o Brasil, país que necessita inserir-se de forma
representativa como usuário de Tecnologia Enzimática, que concilia
desenvolvimento tecnológico com a utilização de matérias-primas renováveis e a
preservação ambiental.
O mercado mundial de enzimas industriais é estimado em US$ 2,3
bilhões anuais e tem três segmentos: enzimas técnicas (destinadas a indústrias
de tecidos e de produtos de limpeza), enzimas para alimentos e bebidas e
enzimas para ração animal. As principais enzimas de aplicação industrial são
proteases, amilases, lipases, celulases, xilanases e fitases, e as maiores
2
empresas produtoras são europeias: Gist-Brocades (Holanda), Genencor
International (Finlândia) e Novo Nordisk (Dinamarca). A última detém sozinha,
cerca de metade do mercado mundial de enzimas industriais (Mussatto et al.,
2007).
De forma geral, as proteases e amilases podem ser extraídas de
diferentes fontes, microrganismos, animais e vegetais. As fontes microbianas são
as mais utilizadas, e dentre os microrganismos mais citados para a produção
destas enzimas se encontram as bactérias do gênero Bacillus (Gupta et al.,
2002). Microrganismos de uma mesma linhagem possuem o potencial de produzir
enzimas com características completamente ou parcialmente diferenciadas, e por
este motivo a busca por novas fontes microbianas continua sendo foco de vários
pesquisadores. Dentre as espécies, o gênero Bacillus possui atrativo industrial por
diversas características vantajosas, tais como: alta taxa de crescimento, levando
a um curto tempo para a fermentação, e a capacidade de secretar proteínas para
o meio extracelular.
Indústrias de detergentes são os principais consumidores de enzimas,
tanto em termos de volume quanto em valor. O uso das enzimas em detergentes
possibilita a substituição de componentes prejudiciais ao meio ambiente. Elas
também são obtidas de fontes renováveis, são biodegradáveis e não oferecem
riscos à vida marinha. Proteases são as principais enzimas usadas na formulação
de detergentes enzimáticos e as amilases o segundo tipo de enzimas mais
empregadas.
Bacillus sp. estirpe SMIA-2, uma bactéria termofílica, isolada de amostras
de solo da região norte fluminense do estado do Rio de Janeiro (Souza e Martins,
2001) foi capaz de produzir α-amilases e proteases quando cultivada em um meio
de baixo custo (Carvalho et al., 2008; Nascimento e Martins, 2004). Correa (2009)
otimizou a produção simultânea de proteases e amilases a partir de resíduos
agroindustriais e caracterizou parcialmente ambas as enzimas. A boa atividade e
estabilidade apresentada pelas enzimas em altos valores de pH tornam possível a
aplicação das mesmas na indústria de detergentes, já que os mesmos costumam
apresentar pH alcalino.
No presente trabalho foi avaliada a ação destas enzimas juntamente com
um detergente comercial na remoção de manchas de gema de ovo, molho de
tomate e chocolate em tecidos.
3
2. OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho das enzimas, α-
amilase e protease, produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2, na
remoção de manchas em tecidos.
4
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Aplicação industrial de enzimas
Enzimas são proteínas que apresentam atividade catalítica com elevada
seletividade e especificidade. As enzimas estão presentes em todas as células
vivas, onde exercem a função de catalisadores das reações que compõem as vias
catabólicas e anabólicas do metabolismo celular (Lima et al., 2001). Além da
importância fisiológica, ao longo dos anos, algumas enzimas vêm sendo usadas
em diversos processos industriais (Maurer, 2004). As enzimas constituem o
principal alvo da pesquisa em biotecnologia, não apenas por seu papel crucial nos
mecanismos celulares, mas também por seu potencial de aplicação na
substituição de processos químicos convencionais (Do Canto e Menezes, 1995).
A importância da sustentabilidade nas atividades produtivas tem sido
amplamente reconhecida, havendo a necessidade de substituir processos
químicos baseados em insumos não renováveis por processos químicos ou
bioquímicos que utilizem insumos renováveis. Além disso, alguns processos
químicos tradicionalmente adotados pela engenharia química utilizam compostos
químicos muitas vezes tóxicos ao meio ambiente. Dentro deste contexto, destaca-
se a tecnologia enzimática, que é hoje um dos campos mais promissores dentro
das novas tecnologias para síntese de compostos de alto valor agregado (Bon et
al., 2008).
5
Há necessidade da substituição das múltiplas etapas de processos
químicos por processos biotecnológicos mais eficientes. As enzimas na indústria
apresentam menor custo, menor geração de resíduos poluentes e desempenho
superior quando comparadas ao uso de produtos químicos (Comyns, 2009). Um
exemplo a ser citado é o das amilases microbianas que substituíram com sucesso
a hidrólise química nas indústrias do amido (Najafi et al., 2005).
Em decorrência destas necessidades e tendências, prevê-se um aumento
significativo no consumo de enzimas em nível internacional. Estados Unidos e
Europa Ocidental, seguidos de Japão e Canadá, dominam o mercado de
enzimas, enquanto em países em desenvolvimento da Ásia-Pacífico, Europa
Oriental e África, esse mercado tem se apresentado emergente (Sarrouh et al.,
2012).
Os Estados Unidos respondem por 34% do mercado de enzimas,
configurando-se como o maior consumidor (Bon et al., 2008). O mercado de
enzimas industriais nos Estados Unidos, obteve receita de US$ 394,1 milhões em
2006 e estima-se que este possa chegar a US$ 748,9 milhões em 2013 (Comyns,
2009). Os três maiores fornecedores de enzimas industriais são: Novozymes S/A
(sede situada na Dinamarca), Genencor International Inc (sede nos Estados
Unidos), e DSM NV (sede na Holanda). Os seus principais segmentos do
mercado são: alimentos (produtos lácteos, fermento de cerveja, bebidas), rações
animais e aplicações técnicas. A Novozymes é o principal fornecedor de cada um
destes três setores, com uma quota estimada em 47% do mercado de enzimas
industriais em 2009 (Comyns, 2009).
Em 2005 as importações de enzimas no Brasil chegaram a US$ 31
milhões e as exportações a US$ 3 milhões (Mussato et al., 2007). O mercado
brasileiro é essencialmente importador, indicando desvantagem tecnológica e
estratégica em termos de produção e uso das enzimas no país. No entanto, o
Brasil é o país de maior destaque da América latina, absorvendo 60% da
demanda de enzimas, dentre os países mais industrializados. A importação de
enzimas é feita principalmente de países europeus, Estados Unidos e Japão,
enquanto a exportação é feita para a maioria dos países latino-americanos (Bon
et al.,2008).
O Brasil apresenta um enorme potencial para produzir enzimas por dois
motivos em especial: abundância de matéria orgânica (resíduos agrícolas: palha
6
de arroz, soro de leite, bagaço de cana), que constitui substrato de baixo custo
para fermentações, e a enorme diversidade biológica, ainda pouco explorada para
a descoberta de novos organismos produtores de enzimas de interesse industrial
(Mussatto et al., 2007). O incentivo à tecnologia enzimática no Brasil aumentaria a
representatividade comercial e econômica brasileira no cenário internacional,
além de trazer benefícios econômicos, ambientais e industriais (Bon et al.,2008).
As principais enzimas de uso industrial são as proteases, amilases,
lactases, pectinases, celulases, pectinases, oxidorredutases, lipases e xilanases
(Hasan et al., 2006; Haki e Rakshit, 2003). As proteases representam 60% do
mercado de enzimas de uso industrial (Merheb et al., 2007), as amilases vêm em
seguida movimentando 30% deste mercado (Asoodeh et al., 2010).
Indústria Enzimas usadas
Têxtil amilase, celulase, pectinase, oxidorredutase
Detergentes protease, amilase, celulase, lipase
Alimentícia celulase, lactase, lipase, pectinase, protease
Papel lipase, oxidorredutase, xilanase
Couro lipase, protease
Tabela 1: Aplicação das enzimas de uso industrial (Fonte: Kirk et al., 2002;
Nielsen e Oxenboll, 1998).
3.2. Produção de enzimas
Embora tradicionalmente as enzimas mais estudadas sejam de origem
animal ou vegetal, as enzimas microbianas apresentam maior interesse do ponto
de vista industrial por ser mais facilmente produzidas em larga escala via
fermentação (Haki e Rakshit, 2003). Assim, os microrganismos surgem como uma
alternativa simples e barata para a produção dessas enzimas. Na maioria das
vezes, os microrganismos são fáceis de manipular, requerem condições mínimas
de nutrição e de manutenção e apresentam alta eficiência na produção de
7
enzimas, que ainda assim pode vir a ser aumentada por meio do uso de técnicas
de melhoria genética (Sajedi et al., 2005).
Os processos industriais de produção de enzimas são desenvolvidos
majoritariamente em cultivos submersos aerados, que permitem maior controle
dos parâmetros operacionais. O cultivo em estado sólido é também utilizado,
principalmente nos países orientais, por apresentar vantagens para a produção de
algumas enzimas, principalmente as produzidas por fungos filamentosos (Bon et
al., 2008).
A matéria-prima é um dos componentes mais importantes no custo de
produção de enzimas (Bon et al., 2008). A fonte de carbono utilizada para o
crescimento do microrganismo responde por cerca de 30-40% do custo de
produção destas enzimas (Joo e Chang, 2005). A adição de reagentes ricos em
moléculas de alto valor biológico e de baixo custo ao meio de cultivo torna-se
interessante. Sendo assim, esta é uma das razões para o crescente interesse no
aproveitamento de resíduos agroindustriais gerados pelas atividades
agropecuárias e de processamento de produtos agropecuários (Villas-Bôas e
Esposito, 2000).
Os resíduos agroindústriais são provenientes de usinas sucroalcooleiras,
indústrias do processamento de carnes, laticínios, grãos, frutas e hortaliças
(Dantas e Aquino, 2010). Vários autores reportam a utilização de resíduos da
agroindústria, como as proteínas do soro de queijo e água de maceração de
milho, visando obtenção de produtos de interesse comercial como as enzimas,
com resultados satisfatórios (Carvalho et al., 2008; Azeredo et al., 2006).
O soro gerado na produção do queijo é um líquido amarelo-esverdeado
composto principalmente de proteínas, lactose e minerais, constituindo assim um
subproduto rico em nutrientes (Smithers et al., 1996). A água de maceração de
milho, resultante da moagem úmida deste cereal, é rica em aminoácidos e
polipeptídeos. Trata-se de uma fonte de nitrogênio de baixo custo, substituindo o
extrato de levedura e peptona nos processos fermentativos (Liggett e Koffler,
1948).
A produção de enzimas amilases e proteases por bactérias do gênero
Bacillus sp. é bastante citada na literatura. No entanto, a produção simultânea das
mesmas não é muito discutida. Um meio de cultivo utilizando resíduos
8
agroindustriais que propicie a obtenção destas duas enzimas significa
simplificação, rapidez e economia do processo de produção de enzimas.
3.3 Processos de concentração de enzimas
As operações que se seguem ao processo fermentativo são importantes
devido ao custo substancial dos processos de separação, concentração e
purificação das enzimas (Queiroz et al., 2001). Os critérios usados para a
separação e purificação de uma enzima dependem da sua aplicação. Em
indústrias de alimentos e detergentes, geralmente não é necessário um alto grau
de pureza para a enzima produzida (Madamwar e Shah, 2005).
A primeira etapa do processo de concentração enzimático, no caso de
enzimas extracelulares, é a separação das células do meio de cultura fermentado.
Geralmente, a separação da enzima das células pode ser feita simplesmente por
centrifugação ou filtração. Após essa etapa, a enzima está presente no
sobrenadante, mas em baixa concentração (Bon et al., 2008). A etapa de
concentração pode ser feita por ultrafiltração, liofilização ou precipitação, desde
que estas técnicas não promovam a inativação da enzima. Além da capacidade
de concentração, os métodos de precipitação e ultrafiltração também podem
proporcionar, em alguns casos, uma purificação parcial da preparação enzimática
de baixa-resolução na amostra (Habert et al., 2006).
3.3.1. Precipitação fracionada com sulfato de amônio
A precipitação por adição de sal ocorre devido a um decréscimo de
solubilidade resultante de um efeito salting-out (hidrofóbico) ou da combinação de
um efeito salting-in (eletrostático) com um efeito salting-out. O efeito salting-in
causa o aumento da solubilidade do soluto com o aumento da concentração de
sal, enquanto o salting-out causa um decréscimo de solubilidade com o aumento
da concentração do mesmo (Ladish, 2001).
O mecanismo de precipitação de proteínas com sais decorre de um
aumento da força iônica de um sistema. Quando pequenas quantidades de sal
são adicionadas à solução contendo proteínas, ocorre uma interação destas com
as cargas provenientes da dissociação do sal e diminuição da interação
9
interproteínas, aumentando a solubilidade no meio aquoso. Porém, em condições
de elevada força iônica, decorrente da adição de grandes quantidades de sal,
verifica-se um efeito oposto. As moléculas de água interagem mais fortemente
com os íons provenientes da dissociação do sal, promovendo desta forma, a
desidratação das proteínas. Durante este processo a interação interproteínas se
torna mais forte, diminuindo a solubilidade das mesmas em meio aquoso e
consequentemente ocorre a precipitação de proteínas pelo efeito salting-out (Lima
et al.,2008).
A precipitação de proteínas pelo gradativo aumento da concentração de
sais é um processo muito importante para a separação de misturas complexas de
proteínas, uma vez que a concentração de sal necessária para a precipitação é
diferente para cada proteína (Lima et al.,2008).
Os sais neutros têm efeito pronunciado sobre a solubilidade de proteínas,
desta forma, os sais de íons divalentes, tais como cloreto de magnésio (MgCl2) e
sulfato de amônio ((NH4)2SO4), são muito mais eficientes na solubilização do que
os sais de íons monovalentes como o cloreto de sódio (NaCl)(Nelson e Cox,
2004).
O sulfato de amônio é o sal mais utilizado em salting-out devido à sua alta
solubilidade em água, à baixa densidade de suas soluções, à ausência de efeitos
desnaturantes e ao fato de prevenir o crescimento de bactérias na solução, além
de ser de baixo custo mesmo em alta pureza (Ladish, 2001).
Uma desvantagem desse processo é a existência de sal em ambas as
fases formadas. O sistema bifásico formado é constituído de uma fase líquida
concentrada em eletrólito e uma fase composta que contém a proteína precipitada
com grande proporção da fase líquida salina, podendo também conter sal na fase
sólida intrinsecamente ligada a ela. Assim, são necessárias operações como
diálise ou diafiltração para a eliminação do sal da fase precipitada e
processamento da fase líquida para sua reutilização ou descarte final (Ladish,
2001).
A precipitação com sulfato de amônio é comumente usada na primeira
etapa de purificação para retirar as proteínas que precipitam em concentrações
diferentes da proteína de interesse e ainda para concentrá-la (Slivinski, 2007).
Entretanto, esse procedimento pode levar muito tempo até que as partículas
precipitadas decantem, e pode ocasionar a inativação da enzima. As proteínas
10
precipitadas têm sua estrutura tridimensional modificada. Trata-se, portanto, de
um modo agressivo para essas moléculas, pois sua função bioquímica depende
de sua estrutura. A aplicação desse método só é viável, portanto, quando a
adequada conformação da proteína é recuperada após a precipitação (Lucarini et
al., 2005).
A adição do sal na quantidade correta pode seletivamente precipitar
algumas proteínas, enquanto outras permanecem em solução. O fracionamento
salino de enzimas ocorre a uma faixa limitada, pelo uso de diferentes
concentrações de sais, em que baixas concentrações precipitam algumas
proteínas não desejadas, que são descartadas, e a adição em altas
concentrações precipitam a proteína desejada (Gerhartz, 1990).
3.3.2. Liofilização
O processo de liofilização pode ser definido como um processo no qual a
maior parte da água contida em um produto congelado é removida por
sublimação, ou seja, a água passa diretamente do estado sólido para vapor sem
passar pelo estado líquido. O processo de secagem é realizado em temperatura
baixa e sob pressão reduzida (Pitombo, 2005).
O processo de liofilização tem sido descrito como método a ser utilizado
após a purificação enzimática, para manutenção da atividade durante
armazenamento (Tatini et al., 2006). Aplica-se à remoção de qualquer solvente,
mas em biotecnologia, o interesse fundamental é a água (Pitombo, 2005).
A liofilização divide-se em três etapas: na primeira, o material é
congelado, a seguir a água é sublimada sob pressão reduzida e na terceira etapa
ela é removida por dessorção, ou seja, uma secagem a vácuo (pressão reduzida)
(Pitombo, 2005).
Esse processo de secagem possui uma série de vantagens que torna o
método preferido para a conservação de materiais biológicos. O material
permanece congelado até estar completamente seco e, portanto elimina-se o
encolhimento e a migração dos constituintes dissolvidos, ou seja, o processo
retém a forma original do material. As modificações físico-químicas são inibidas e
são minimizadas as perdas dos constituintes voláteis, ou a perda de atividade
biológica, ou outra atividade na preservação da estrutura da molécula. O produto
11
liofilizado possui estrutura porosa, sendo prontamente reconstituído aos seus
respectivos tamanhos e formas originais, quando imersos em água. Possuem boa
estabilidade durante o armazenamento, resultando em longo tempo de vida de
prateleira. Produtos liofilizados são altamente higroscópicos e de fácil dissolução
em água (Pitombo, 2005).
Entretanto, estudos com espectroscopia por infravermelho têm
documentado que os problemas relacionados com o congelamento e a
desidratação induzidos pela liofilização podem levar ao desdobramento molecular
da proteína. O desdobramento não somente pode levar à desnaturação
irreversível da proteína, mesmo se a amostra é reidratada imediatamente, mas
também pode reduzir a estabilidade durante o armazenamento da proteína
liofilizada (Carpenter et al.,1999).
3.4. Proteases
A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular classifica as
enzimas de acordo com o seu modo de ação sobre o substrato em: oxirredutases
(classe 1), transferases (classe 2), hidrolases (classe 3), liases (classe 4),
isomerases (classe 5) e ligases (classe 6). As proteases são enzimas da classe 3,
as hidrolases, e subclasse 4, as peptideo-hidrolases ou peptidases, pois por uma
reação de hidrólise, elas clivam a proteína em peptídeos e aminoácidos,
adicionando uma molécula de água à ligação peptídica. As proteases são
classificadas em dois grupos principais, que são as exopeptidases (EC 3.4.11-19)
e endopeptidases (EC 3.4.21-99), dependendo do sítio de ação dessas enzimas
(Rao et al.,1998).
As exopeptidases iniciam o processo de degradação a partir das
extremidades amino (N) ou carboxi-terminal (C) das proteínas, produzindo
pequenos peptídeos ou mesmo aminoácidos. As exopeptidases podem ser
subdivididas em aminopeptidases (quando clivam as ligações peptídicas próximas
ao grupamento amino terminal) ou carboxipeptidases (quando clivam as ligações
peptídicas próximas ao grupamento carboxílico terminal). Baseado no tipo do
grupo funcional presente no sítio catalítico da enzima, as carboxipeptidases foram
subdivididas em serina, metalo, e cisteína carboxipeptidases (Rao et al.,1998).
As endopeptidases são também chamadas proteinases, sendo, portanto,
muito comum a utilização do termo proteinase para se referir a uma protease. As
12
endopeptidases clivam a proteína alvo na sua parte interna, longe das
extremidades amino e carboxi-terminal, gerando dessa forma peptídeos maiores.
As endopeptidases são ainda classificadas em quatro relevantes grupos, que são:
serina, cisteína, aspártico e metaloproteases. As serina-peptidases possuem um
resíduo de serina em seu centro ativo, aspártico-peptidases têm duas unidades
de ácido aspártico no seu centro catalítico, cisteína-proteases apresentam um
aminoácido cisteína e as metaloproteases usam um íon metal no seu mecanismo
catalítico (Rao et al.,1998).
As proteases, também conhecidas como enzimas proteolíticas, são
constituintes essenciais em todas as formas de vida, incluindo os procariotos, os
fungos, as plantas e os animais (Kumar e Takagi, 1999). As enzimas proteases
estão envolvidas em processos biológicos essenciais, tais como a coagulação
sanguínea, morte celular, diferenciação de tecidos, catabolismo de proteínas,
processamento e transporte de proteínas secretoras através da membrana
(Maurer, 2004).
Além da sua importância fisiológica, as proteases têm importante
aplicabilidade biotecnológica. Elas constituem um dos mais importantes grupos de
enzimas industriais e representam mais que 60% do mercado mundial de enzimas
de uso industrial (Vishwanatha et al., 2010). As proteases têm aplicação em
diferentes processos industriais tais como no processamento de alimentos e
bebidas, formulação de detergentes, processamento de couro e pele,
amaciamento de carnes, formulação de medicamentos, indústria têxtil entre
outros (Reddy et al., 2008; Genckal e Tari, 2006; Haki e Rakshit, 2003).
A demanda industrial por enzimas proteolíticas que apresentem
estabilidade e especificidade a fatores como: pH, temperatura, íons metálicos,
surfactantes e solventes orgânicos; estimula a busca por novas enzimas (Kamoun
et al., 2008). As proteases são classificadas em ácidas, neutras e alcalinas, de
acordo com a faixa de pH em que apresentam atividade ótima (Mukherjee et al.,
2008). As proteases que apresentam alta atividade proteolítica e estabilidade
quando submetidas às condições alcalinas, as chamadas proteases alcalinas, são
importantes para as indústrias de laticínios, couro e principalmente para a
indústria de detergentes (Deng et al., 2010; Maurer, 2004). As proteases alcalinas
usadas na indústria de detergentes totalizam 35% do total de venda de enzimas
13
microbianas (Hadj-Ali et al., 2007) e 89% do total de proteases comercializadas
(Mukherjee et al., 2008).
3.5. Amilases
O amido é um polímero constituído por moléculas de glicose unidas por
ligações α-1,4 e α-1,6. Dois polissacarídeos compõem a estrutura do amido:
amilose e amilopectina. A primeira é uma molécula linear contendo mais de 6000
unidades de glicose conectadas por ligações glicosídicas α-1,4 e a segunda,
muito similar ao glicogênio (Myers et al., 2000), é altamente ramificada contendo
ligações α -1,4 entre os monômeros de glicose e α -1,6 nos pontos de ramificação
a cada 24-30 resíduos de glicose (Figura 1) (Brena et al., 1996).
Figura 1. Estrutura química da amilose (a) e amilopectina (b) (Corradini et
al.,2005).
Para que a hidrólise do amido seja completa faz-se necessária a atuação
de várias enzimas (Haki e Rakshit, 2003) pertencentes ao grupo das amilases. As
amilases são enzimas capazes de hidrolisar as moléculas de amido, resultando
em oligossacarídeos de diferentes tamanhos, como as dextrinas e maltoses. Por
14
catalisar reações de hidrólise, as amilases são classificadas como hidrolases
(Classe 3) segundo a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular
(Mitidieri et al.,2006; Gupta et al., 2003).
Conforme o seu modo de ação, as enzimas amilolíticas podem ser
divididas em duas grandes categorias: as endoamilases e exoamilases. As
endoamilases catalisam a hidrólise das ligações glicosídicas do tipo α-1,4, de uma
maneira aleatória, no interior da molécula de amido. Sua ação resulta na
formação de oligossacarídeos ramificados e lineares de vários comprimentos de
cadeias. Por outro lado, as exoamilases hidrolisam, sucessivamente, ligações
glicosídicas a partir da extremidade não redutora das mesmas, resultando em
produtos finais pequenos (Gupta et al., 2003). As principais amilases são: α-
Amilases, β-Amilases e glicoamilases.
As α-amilases (EC 3.2.1.1, α-1,4-D-glicano glicanoidrolase), também
chamadas de enzimas dextrinizantes, correspondem a endoamilases, que atuam
ao acaso ao longo da cadeia de amilose e amilopectina hidrolisando as ligações
α-1,4 e liberando maltose, glicose e dextrina. A α-amilase é a enzima amilolítica
mais importante e popular entre as amilases de uso industrial, é uma enzima
induzida na presença de amido ou maltose (Gupta et al., 2003).
As β-amilases (EC 3.2.1.2, α-1,4-D-glicano-maltoidrolase) são
exoamilases que hidrolisam a penúltima ligação α-1,4, a partir da extremidade não
redutora da molécula de amilose liberando maltose. Esse tipo de amilase está
distribuído nos tecidos das plantas onde hidrolisa amido em β-maltose, sendo
particularmente abundante em soja, trigo e cevada, principalmente durante a
germinação (Gupta et al., 2003).
As glicoamilases (EC 3.2.1.3, α-1,4-D-glicano-glicoidrolase) são
exoamilases que rompem as ligações α-1,4 e α-1,6 do amido; esta última em
menor velocidade, a partir da extremidade não redutora, levando à produção de
glicose. Além das frações amilose e amilopectina do amido, outras moléculas,
como maltose, dextrinas e glicogênio, são hidrolisadas pela enzima. Também
chamadas de enzimas de sacarificação, elas são capazes de hidrolisar
completamente o amido em incubações por longos períodos (Gupta et al., 2003).
As enzimas amilases são de grande importância biotecnológica, pois
apresentam aplicações nas áreas de alimentos (sacarificação do amido),
fermentação (cerveja), têxtil e de papéis (Pandey et al., 2000). Embora estas
15
enzimas possam ser obtidas de plantas, animais e microrganismos, as enzimas
de origem microbiana predominam no setor industrial (Gupta et al., 2003). Muitas
espécies de bactérias e fungos têm sido identificadas como boas produtoras de
amilase (Jin et al., 2001; Stamford et al., 2001; Yuguo et al., 2000; Coronado et
al., 2000; Murado et al., 1997; Sidhu et al., 1997; Babu e Satyanarayana, 1995;
Dey et al., 1991).
Existem amilases que além de serem termoestáveis, são estáveis a pH
alcalinos e outras que são estáveis a pH ácidos.Tanto as amilases alcalinas
quanto as amilases acidófilas possuem aplicabilidade industrial (Asoodeh et al.,
2010). Um dos usos das amilases alcalinas é como aditivo em detergentes
usados em processos de lavagem, uma vez que esses processos são geralmente
realizadas sob pH alcalino, em água quente ou fria (Asoodeh et al., 2010). As
amilases acidófilas são usadas na indústria de processamento de alimentos,
principalmente na indústria de amido, onde o pH natural da suspensão de amido é
geralmente em torno de 4,5 (Sivaramakrishnan et al., 2006; Goyal et al., 2005;
Sarikaya et al., 2000).
3.6. Fontes de obtenção de amilases e proteases
Os microrganismos representam uma excelente fonte de enzimas devido
à sua ampla diversidade bioquímica e susceptibilidade de manipulação genética.
Isto faz com que as enzimas microbianas sejam preferidas que as de animais ou
de plantas, por apresentar quase todas as características desejáveis para sua
aplicação biotecnológica (Rao et al., 1998; Kumar e Takagi, 1999).
As enzimas microbianas são mais utilizadas que as enzimas de plantas e
animais devido à grande variedade catalítica, além de ser obtidas em elevadas
quantidades, com preço relativamente reduzido, possuindo bastante
homogeneidade e qualidade. Além disso, são mais estáveis que seus homólogos
obtidos de plantas e animais e seu processo de produção é mais fácil e seguro
(Wiseman, 1985).
Dentre os microrganismos as bactérias são as principais fontes de
proteases e amilases. Entre as enzimas bacterianas, aquelas secretadas pelo
gênero Bacillus são as mais termoestáveis, aumentando ainda mais a sua
aplicabilidade industrial. As -amilases e proteases produzidas por várias
espécies de Bacillus diferem entre si quanto à faixa ótima de pH, temperatura,
16
estabilidade da enzima, além de outros fatores fisiológicos inerentes a cada
espécie. Portanto, as enzimas de diferentes origens têm aplicabilidades
específicas em diferentes setores (Haki e Rakshit, 2003).
Uma grande variedade de microrganismos produz amilases e proteases,
e sabe-se que as produzidas por microrganismos termofílicos apresentam
características mais termoestáveis do que as produzidas pelos microrganismos
mesofílicos (Niehaus et al., 1999). Essas enzimas termoestáveis apresentam
vantajosas aplicabilidades industriais, pois permitem que os processos
biotecnológicos sejam conduzidos em elevadas temperaturas (Hough e Danson,
1999).
Os microrganismos termófilos (ou termofílicos) podem ser classificados
em moderados, extremos e em hipertermófilos, de acordo com a sua temperatura
ótima de crescimento. Os procariotos dos Domínios Bacteria e Archaea e os
eucariotos (Domínio Eukarya - fungos filamentosos) com temperaturas ótimas de
crescimento entre 40 e 50 ºC são classificados como termófilos moderados. Os
termófilos extremos são os procariotos dos Domínios Bacteria e Archaea que
apresentam temperatura ótima de crescimento entre 65 a 85 °C. Os
microrganismos hipertermófilos são os procariotos do Domíno Archaea com
temperaturas ótimas de crescimento de 85 até 110 °C (Madigan e Oren, 1999).
A adaptação de um determinado microrganismo à termofilia envolve
adaptação da membrana citoplasmática, das proteínas e do DNA às temperaturas
acima da faixa mesofílica. As proteínas dos microrganismos termófilos
apresentam sequências de aminoácidos, estrutura tridimensional e mecanismos
catalíticos idênticos aos de suas similares mesofílicas, porém, geralmente
apresentam maior termoestabilidade intrínseca que sua equivalente mesofílica. A
maior termoestabilidade observada nessas moléculas tem sido foco de inúmeras
teorias e pesquisas, mas ainda não é completamente entendida (Gomes et al.,
2007).
O uso de temperaturas mais elevadas diminui o risco de contaminação
por microrganismos mesófilos (Haki e Rakshit, 2003), favorece a solubilidade de
substratos e produtos, além de aumentar as velocidades de reação devido à
redução da viscosidade e ao aumento do coeficiente de difusão dos substratos
(Egorova e Antranikian, 2005). Entre outras vantagens, as enzimas de
17
microrganismos termofílicos também têm se mostrado tolerantes a substâncias
desnaturantes como detergentes e solventes orgânicos (Atomi, 2005).
Por exemplo, as amilases termoestáveis são de grande interesse na
indústria de processamento do amido, uma vez que a temperatura de
gelatinização do mesmo fica em torno dos 70°C (Sarikaya et al., 2000; Banerjee
et al., 1999). As vantagens da utilização de amilases termoestáveis neste tipo de
processo industrial incluem a diminuição do risco de contaminação e custos de
resfriamento externo, uma melhor solubilidade dos substratos e uma diminuição
da viscosidade, permitindo que a mistura e o bombeamento sejam acelerados (Lin
et al., 1998).
As bactérias termofílicas do gênero Bacillus se destacam pela capacidade
de produzir as principais enzimas de uso industrial: amilases, pectinases,
xilanases, celulases, quitinases, proteases e lipases (Haki e Rakshit, 2003). As
bactérias desse gênero são foco de atenção da biotecnologia, visto que esses
microrganismos podem ser isolados e cultivados com relativa facilidade
(Johnvesly e Naik, 2001).
O Gênero Bacillus (família Bacillaceae) é extremamente heterogêneo
tanto geneticamente quanto fenotipicamente (tipo respiratório, metabolismo dos
açúcares, composição da parede, etc). São bacilos gram-positivos aeróbicos e
capazes de produzir endósporos. Possuem grande diversidade quanto às
condições fisiológicas (temperatura, pH e salinidade), sendo capazes de crescer
sob condições extremas de temperatura e pH (Wang et al., 2007). Com exceção
do grupo Bacillus cereus (que inclui o Bacillus anthracis), são saprófitos
inofensivos, que não produzem toxinas e são incluídos no grupo de organismos
geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) (Mahmood et al., 1998).
3.7. Aplicação de enzimas na indústria de detergentes
Os detergentes, assim como os sabões, são substâncias sintéticas que
promovem a remoção, dispersão e estabilização de materiais de uma superfície.
O desempenho destas funções depende da composição da formulação, das
condições de uso (temperatura e técnica de lavagem), da natureza da superfície a
ser tratada, da natureza da substância a ser removida e ou dispersa e da
natureza da fase móvel (Luz, 2007; Kissa, 1981).
18
A indústria de detergentes da América do Norte, Europa, Japão e América
Latina tem feito acordos com o governo no sentido de descontinuar, substituir ou
reduzir o uso de componentes prejudiciais ao meio ambiente. Exemplos são a
descontinuidade do uso de surfactantes ramificados não biodegradáveis, redução
no uso do tripolifosfato de sódio (para evitar a eutrofização dos corpos d’água) e a
proliferação de produtos de limpeza doméstica baseados em ingredientes
biodegradáveis e considerados menos nocivos para a natureza (Andersen, 1998).
As formulações mais atuais substituíram por enzimas muitos dos
ingredientes que agrediam o meio ambiente, eram tóxicos e provocavam o
desgaste de materiais e de instrumentos. As enzimas são obtidas de fontes
renováveis, biodegradáveis e não oferecem riscos à vida marinha (Rodriguéz et
al., 2006) .
Os detergentes enzimáticos atuam de maneira mais eficiente sobre a
matéria orgânica do que os detergentes iônicos, porque agem de forma específica
(Bon et al., 2008). As enzimas têm a capacidade de agir sobre o sangue, a
gordura, o muco, a saliva, as proteínas em geral, produzindo um substrato mais
fácil de ser removido pelos agentes de limpeza, tornando mais efetiva a ação dos
mesmos (Hmidet et al., 2009). A principal vantagem do uso de enzimas em
detergentes para lavagem de roupas é que elas são capazes de remover
manchas sem agredir os tecidos e sem prejudicar as cores. Além disso, por ter
melhor desempenho na limpeza, consequentemente apresentam redução no
tempo de lavagem, consumo de energia e água (Gupta et al., 2003).
O primeiro detergente contendo enzimas foi introduzido no mercado em
1913, na Alemanha e era constituído de tripsina de pâncreas de porcos. Apenas
em 1963 a comercialização desses produtos passou a ser significativa, quando
ocorreu o desenvolvimento de um detergente contendo protease bacteriana. A
partir de 1980, as amilases, celulases e lipases começaram a ser utilizadas como
componentes na formulação de detergentes (Luz, 2007).
De acordo com Kumar e Takagi (1999), para a utilização de enzimas em
detergentes, as mesmas devem preencher alguns requisitos como possuir
elevada atividade e estabilidade em uma ampla faixa de pH e temperatura, ser
efetivas em baixas quantidades, compatíveis com os demais compostos do
detergente como surfactantes, perfumes e descorantes, apresentar estabilidade
19
durante o armazenamento e a lavagem, além de ser facilmente produzidas em
larga escala (Sellami-Kamoun et al., 2006; Joo e Chang, 2005).
A indústria de detergentes se tornou a maior consumidora das proteases
alcalinas porque elas são usadas como aditivos de detergentes, cujo pH varia de
9 a 12, para facilitar a remoção dos resíduos de proteínas (sangue, leite , molho)
(Kamoun et al., 2008). Detergentes de circulação internacional como Dynamo®,
Era plus® (Protecter & Gamble) e Tide® (colgate Palmolive) contêm enzimas
proteolíticas, produzidas por bactérias do gênero Bacillus (Joo e Chang, 2005;
Anwar e Saleemuddin, 1998; Rao et al., 1998). Proteases alcalinas de Bacillus
brevis (Banerjee et al.,1999), Bacillus sp. SSR1 (Singh et al., 2001) e Bacillus
stearothermophilus (Dhandapani e Vijayaragvan, 1994) têm sido usadas na
formulação de detergentes.
As amilases têm sido utilizadas em detergentes em pó de lavanderias
desde 1975 para remoção de manchas contendo amido, chocolate, comida de
bebê, entre outras (Gupta et al., 2003). As amilases presentes nos detergentes
hidrolisam este amido, transformando-o em oligômeros de cadeia curta, que são
solúveis em água (Kiran e Chandra, 2008; Mitidieri et al., 2006; Sarikaya et al.,
2000). Amilases alcalinas termoestáveis usadas em detergentes têm sido
purificadas das espécies Aspergillus oryzae (Konsula e Liakopoulou-Kyriakides,
2004), Bacillus sp. (Kiran e Chandra, 2008; Kim et al., 1995), Bacillus licheniformis
(Medda et al., 1980), Bacillus halodurans (Hmidet et al., 2008; Hashim et al.,
2004) e Bacillus amyloliquefaciens (Konsula e Liakopoulou-Kyriakides, 2004).
3.8. Medida de detergência em laboratório
A quantidade de sujeira sobre o tecido pode ser estimada por
comparação visual ou determinada por análises químicas, métodos radioativos e
espectrofotométricos (refletância ou transmissão da luz). Análises químicas ou
métodos radioativos determinam a exata quantidade de sujeira sobre o tecido,
enquanto métodos espectrofotométricos consomem menos tempo e se
correlacionam com a avaliação visual da remoção de sujeira (Kissa,1981).
O método mais utilizado, em laboratório, para determinação da
detergência, é o da lavagem de tecidos sujos padrão, onde a sujeira está
20
homogeneamente distribuída sob o tecido, sendo acompanhado por medidas de
refletância antes e após a lavagem (Krussmann,1978).
O colorímetro de Hunter atribui índices à coloração da amostra a partir de
uma escala de cor, sendo assim, é um instrumento útil na determinação da
refletância da amostra.
21
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Microrganismo
O microrganismo empregado neste estudo foi a bactéria termofílica
Bacillus sp. SMIA-2, isolada por Souza e Martins (2001), a partir de amostras do
solo do município de Campos dos Goytacazes-RJ, no Laboratório de Tecnologia
de Alimentos (LTA) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF).
Os resultados de comparação das sequências de 16S rRNA indicaram
que o isolado possui 94% de similaridade com Bacillus caldoxylolyticus e Bacillus
sp. espécie AK1 (Souza e Martins,2001)
4.2. Manutenção do microrganismo
O microrganismo foi mantido em tubos de ensaio contendo meio TSY
(triptona 20 g/L; NaCl 10 g/L; extrato de levedura 10 g/L; ágar 20 g/L e água 1 L),
sob temperatura de refrigeração.
4.3. Meio de crescimento
O meio de crescimento utilizado para a produção simultânea de α-amilase
e proteases foi definido por Correa et al. (2011) e sua composição é mostrada na
Tabela 2.
22
Tabela 2: Composição do meio de crescimento g.L-1
Constituintes: g.L-1
KCl 0,3
K2HPO4, 0,87
CaCl2, 0,29
MgSO4, 0,5
amido solúvel 2,5
proteínas do soro de leite 1,0
água de maceração de milho 3,0
Solução de traços de metais * 1,0
*Composição de solução de traços de metais (g.L-1): CaCl2 2.2 × 10–3, ZnO 2.5 × 10–3,
FeCl3.6H2O 2.7 × 10–2, MnCl2.4H2O 1.0 × 10–2, CuCl 2.2H2O 8.5 × 10–4, CoCl 2.6H2O 2.4 ×
10–3, NiCl3.6H2O 2.5 × 10–4, H3BO3 3.0 × 10–4,
O meio de cultivo foi preparado usando água destilada como diluente. O
pH do meio de cultivo foi ajustado para 7,5 com NaOH 2M. Após o ajuste do pH, o
meio de crescimento foi distribuído em erlenmeyers de 250mL (100mL de meio
por erlenmeyer). Os erlenmeyers contendo o meio foram esterilizados em
autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
4.4. Preparo do pré-inóculo
O inóculo foi preparado estriando o microrganismo em placas de petri
contendo o meio TSY. As placas foram incubadas em estufa QUIMIS, modelo Q
315 D26 a 50oC por 18 horas. Após este período, 5 mL do meio de crescimento
foram transferidos para as placas para ressuspender as células que foram
posteriormente sugadas com o auxílio de uma pipeta estéril. Estas células foram
inoculadas em frascos erlenmeyers de 250mL, contendo 100mL do respectivo
meio de crescimento, incubadas por mais 18 horas a 50oC em “shaker” rotatório
(Thermo forma Orbital Shaker, Ohio, USA), operando a 150 rpm e posteriormente
utilizadas para inocular o meio de crescimento. Este meio foi denominado pré-
inóculo.
23
4.5. Crescimento do microrganismo
O meio de cultura foi inoculado com 4 mL de uma cultura de véspera (pré-
inóculo) e incubado a 50oC em um “shaker” rotatório (Thermo forma Orbital
Shaker, Ohio, USA), operando a 150 rpm. Durante o estudo do perfil de
crescimento do microrganismo, em intervalos de tempos predeterminados foram
retiradas amostras em triplicata para determinação do crescimento, pH e da
atividade enzimática.
4.6. Medida do crescimento e pH
O crescimento do microrganismo foi determinado pela medida da turbidez
do meio de crescimento, medindo-se a Densidade Ótica a 600nm com a utilização
de um espectrofotômetro SHIMADZU UV-mini 1240.
A determinação do pH foi utilizando o pHmetro da TECNAL.
4.7. Determinação da atividade enzimática 4.7.1. Determinação da atividade da α-amilase
A atividade da α-amilase foi determinada pelo incremento dos açúcares
redutores na solução como resultado da ação da α-amilase sobre amido. A
atividade foi determinada em amostras em triplicata, pela quantificação de
açúcares redutores (glicose) através do método de Miller (1959). Uma mistura
contendo 0,5 mL de extrato enzimático; 0,5 mL de uma solução de amido 0,5%
em tampão Tris-HCl 0,05M pH 8,5 e mais 0,2 mL do mesmo tampão foi incubada
a 90ºC por 10 minutos. Após este período foi adicionado 1,0 mL do reagente de
Miller (ácido 3,5- dinitrossalisílico) à reação. A mistura foi colocada em água em
ebulição por 10 minutos, em seguida, resfriados em banho de gelo por 5 minutos
e adicionados 4,8 mL de água destilada. A coloração desenvolvida foi medida
através de espectrofotômetro SHIMADZU UV-mini 1240, utilizando comprimento
de onda de 540nm.
O mesmo procedimento foi realizado com o controle, exceto que o
reagente de Miller (ácido 3,5- dinitrossalisílico) foi adicionado juntamente com a
24
enzima à solução de amido 0,5% e, esta mistura foi colocada em água em
ebulição como descrito anteriormente.
O teor de açúcares redutores foi determinado por meio de uma curva de
glicose. Uma unidade da atividade da enzima (U) foi definida como a quantidade
de enzima necessária para produzir 1 µmol de açúcar redutor por minuto por mL a
partir do amido solúvel nas condições do ensaio.
4.7.2. Determinação da atividade da protease
A atividade da protease foi determinada em triplicata pela quantificação
de peptídeos solúveis em ácido tricloroacético (TCA) 15% (Johnvesly e Naik,
2001). O substrato utilizado para essa determinação foi uma solução de
azocaseína 0,2% (p/v) preparada em tampão Tris/HCl 0,2M pH 8,5. Nesta análise,
0,5 ml do extrato enzimático foi colocado em 1,0 mL de substrato e incubado em
banho-maria a 70oC por 10 minutos. A reação foi paralisada pela adição de 0,5
mL de TCA, centrifugada (Hermele Z 382K) a 15.000g por 5 minutos a 4oC e a
mistura de reação colocada em tubos de ensaio contendo 0,5 mL de uma solução
de NaOH 1M (Janssem et al., 1994). Paralelamente, foi feito um controle
contendo todos os reagentes do ensaio, exceto que o TCA foi adicionado antes
do extrato enzimático.
A coloração desenvolvida foi medida através de espectrofotômetro
SHIMADZU UV-mini 1240, utilizando comprimento de onda de 420nm. Uma
unidade da enzima foi definida como a quantidade da enzima requerida para
produzir um aumento na absorbância a 420 nm igual a 0,1 em 60 minutos.
4.7.3. Determinação de proteínas
A dosagem de proteína no sobrenadante foi determinada pelo método de
Lowry, conforme modificações propostas por Peterson (1977), utilizando albumina
do soro bovino (BSA) como padrão. Os reagentes empregados foram os
seguintes: Reagente A (carbonato de sódio, 20 g/L; NaOH 2 M, 50 mL/L; tartarato
de sódio e potássio, 0,2 g/L), reagente B (CuSO4.H2O, 5 g/L) e reagente C (50
partes do Reagente A e uma parte do Reagente B). A mistura de reação era
constituída de 40 µL da amostra, 360 µL de água destilada e 2000 µL da solução
C. Esta mistura foi agitada vigorosamente. Após o repouso da mesma por 15
25
minutos, foi adicionado 200 µL do reagente de Folin. A mistura foi agitada
novamente e em seguida deixada em repouso por mais 30 minutos. O mesmo
procedimento foi realizado com o controle, exceto que a amostra foi substituída
por água destilada. A coloração desenvolvida foi medida através de
espectrofotômetro SHIMADZU UV-mini 1240, utilizando comprimento de onda de
750 nm.
4.8. Produção e purificação parcial das enzimas
O meio de crescimento (100 mL em erlenmeyer de 250 mL em triplicata)
foi inoculado com 4mL do pré-inóculo e incubado em um agitador Thermo Forma
Orbital Shaker (Ohio, USA) a 150 rpm e temperatura de 50oC. Após 36 horas de
crescimento do microrganismo, o meio foi centrifugado a 4500g por 15 minutos a
4ºC em centrífuga Heuzwet e as atividades enzimáticas da ɑ-amilase e protease
foram dosadas no sobrenadante livre de células. Posteriormente às dosagens, o
sobrenadante foi tratado com NH4SO4 a 60% de saturação. Após 18 horas de
repouso a 4oC, o caldo foi novamente centrifugado (9000g/30min.). Em seguida o
precipitado formado foi ressuspendido em tampão Fosfato 0,01M pH 7,5, e
dialisado em membranas de diálise (Sigma Aldrich D0530-100 FT) contra o
mesmo tampão a 4oC/18horas. Durante este período foi realizada a troca do
tampão de 4 em 4 horas. A diálise ocorreu em beckers de 2 L mantidos sob leve
agitação por agitador magnético TECNAL TE-0851. Ao final da diálise, as
atividades enzimáticas foram novamente dosadas.
4.9. Liofilização
O extrato dialisado submetido à liofilização foi liofilizado em liofilizador
LIOTOP L202. Após a liofilização, as atividades enzimáticas foram dosadas, para
isto o liofilizado foi reconstituído com tampão Tris/HCl pH 8,5 na concentração de
1mg/mL e as análises determinadas conforme item 4.7. O material liofilizado foi
mantido em congelador até o uso.
26
4.10. Caracterização parcial da α-amilase e protease no extrato dialisado
4.10.1. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade da α-amilase e
protease
O efeito da temperatura na atividade das enzimas foi determinado
incubando-se a mistura de reação em temperaturas entre 40 e 100oC, com
intervalos de 10ºC, em pH 8,5 para a protease e α-amilase. Após 10 minutos de
incubação em cada temperatura, a atividade enzimática foi determinada nas
condições padrões descritas nos itens 4.7.1 e 4.7.2.
A estabilidade térmica foi avaliada pela incubação do sobrenadante nas
temperaturas de 70 e 80ºC para protease e α-amilase por 1 hora em banho-maria.
Em intervalos de 10 minutos, a atividade residual foi analisada nas temperaturas
ótimas das enzimas. A atividade residual (%) foi obtida segundo descrito nos itens
4.7.1 e 4.7.2.
4.10.2. Efeito do pH na atividade e estabilidade da α-amilase e protease
O efeito do pH na atividade da amilase e proteases foi avaliado na faixa
de 6,0 a 10,0 com intervalos de 0,5 unidades. As soluções tamponantes utilizadas
foram tampão fosfato (pH 6,0-8,0), tampão Tris-HCl (pH 8,5-9,0) e tampão Bórax
(pH 9,5-10,0).
O pH ótimo foi determinado preparando-se o substrato, amido 0,5% (p/v)
e azocaseína 0,2% (p/v), nas soluções tampão com diferentes valores de pH. A
partir daí, a reação foi executada conforme descrito nos itens 4.7.1 e 4.7.2.
A estabilidade da enzima em diferentes valores de pH foi avaliada
incubando-se apenas o sobrenadante nas soluções tampão descritas
anteriormente por 2 horas em temperatura ambiente. Após este tratamento, a
atividade residual (%) da α-amilase e protease foi determinada conforme descrito
nos itens 4.7.1 e 4.7.2.
27
4.11. Estabilidade dos extratos dialisados das enzimas proteases e α-
amilases nas temperaturas usadas nas lavagens dos tecidos
Foi determinada e comparada a estabilidade do extrato dialisado e a
estabilidade do extrato dialisado na presença de detergente a 25ºC, 40ºC e 55ºC.
Para este experimento foi utilizado o detergente Tixan® diluído em água destilada
na concentração de 7 mg/mL para simular condições de lavagem (Banerjee et al.,
1999). A solução detergente foi fervida a 100ºC durante 15 minutos para
desnaturar quaisquer enzimas porventura presentes na formulação do detergente.
O extrato dialisado e o extrato dialisado adicionado à solução detergente
7mg/mL (na proporção de 1:1) foram incubados nas diferentes temperaturas
durante 30 min. Em intervalos de tempo regulares (5, 10, 15 e 30 minutos) foram
dosadas as atividades residuais da amilase e da protease. Foi considerada como
100% a atividade enzimática apresentada antes do período de incubação.
4.12. Desempenho das enzimas produzidas por Bacillus sp. SMIA-2 na
lavagem de EMPA 112
4.12.1. Lavagem usando extrato liofilizado
Para este experimento, pequenos tecidos (7 cm x 7 cm) sujos padrões
EMPA 112 (tecidos sujos com cacau, leite e açúcar) (TEXCONTROL) foram
utilizados. Os tecidos foram submetidos a diferentes tratamentos de lavagem
utilizando frascos erlenmeyers de 500 mL contendo a solução de detergente e o
extrato liofilizado das enzimas sob agitação de 150 rpm em “shaker” rotatório
TECNAL TE-420. O detergente Tixan® foi utilizado para os testes de lavagem. O
detergente foi diluído com água destilada a 7mg/mL e fervido por 15 minutos a fim
de inativar as enzimas já existentes em sua formulação. Foram realizados os
seguintes tratamentos de lavagem nos tecidos:
1. 50 mL de Água destilada
2. 50 mL de solução detergente
3. 50 mL de solução detergente + 1mg/mL do extrato liofilizado das
enzimas.
28
As lavagens foram realizadas em triplicata, a 30ºC e 50ºC durante 15
minutos. Após a lavagem os tecidos foram enxaguados com água destilada por 5
minutos e secos em estufa TECNAL TE 393/I a 50ºC por 40 minutos.
Comparativamente, a enzima protease comercial Savinase® (Sigma
Aldrich), proveniente de Bacillus sp., foi diluída de maneira a apresentar atividade
U/mL semelhante à atividade U/mL apresentada pela enzima protease de Bacillus
sp.SMIA-2. A enzima Savinase® diluída 400x foi usada na lavagem do tecido
EMPA 112 a 30ºC e 50ºC.
4.12.2. Lavagem usando extrato dialisado
Para este experimento, inicialmente, pequenos tecidos (7cm x 7cm) sujos
padrões EMPA 112 (tecidos sujos com cacau, leite e açúcar) (TEXCONTROL)
foram utilizados. Inicialmente a lavagem dos tecidos foi realizada em frascos
erlenmeyers de 500 mL contendo a solução de detergente e o extrato dialisado
das enzimas sob agitação de 150 rpm em “shaker” rotatório TECNAL TE-420. O
detergente Tixan® foi utilizado para os testes de lavagem. O detergente foi diluído
com água destilada a 7mg/mL e fervido por 15 minutos a fim de inativar as
enzimas já existentes em sua formulação. Os tecidos foram submetidos à
lavagem em triplicata por 15 minutos, enxaguados por 5 minutos e secos em
estufa TECNAL TE 393/I a 50ºC por 40 minutos.
Foram realizados os seguintes tratamentos de lavagem a 40ºC nos
tecidos:
1. 50 mL de água destilada
2. 50 mL de solução detergente
3. 50 mL de solução detergente + 1 mL de extrato enzimático (1,15 U/mL
protease e 0,23 U/mL amilase)
4. 50 mL de solução detergente + 5 mL de extrato enzimático (5,35 U/mL
protease e 1,15 U/mL α-amilase)
5. 50 mL de solução detergente + 10 mL de extrato enzimático (9,82
U/mL protease e 2,11 U/mL α-amilase)
Com objetivo de reduzir o volume de extrato usado nas lavagens dos
tecidos, as lavagens passaram a ser feitas com tecidos EMPA 112 menores (5 x 5
29
cm2), em frascos erlenmeyers menores (250 mL) contendo a solução de
detergente e o extrato dialisado das enzimas no volume total de 25 mL. Foram
realizados os seguintes tratamentos de lavagem nos tecidos a 40ºC:
1. 25 mL de água destilada
2. 25 mL de solução detergente
3. 20 mL de solução detergente + 5 mL de extrato enzimático (11,78
U/mL protease e 2,53 U/mL α-amilase)
4. 15 mL de solução detergente + 10 mL de extrato enzimático (23,56
U/mL protease e 5,03 U/mL α-amilase)
5. 10 mL de solução detergente + 15 mL de extrato enzimático (35,34
U/mL protease e 7,58 U/mL α-amilase)
6. 5 mL de solução detergente + 20 mL de extrato enzimático (47,12
U/mL protease e 10,11 U/mL α-amilase)
Os tecidos EMPA 112 (5 x 5 cm2) também foram lavados a 25 e 55º C por
15 minutos, em frascos erlenmeyers de 250 mL contendo a solução de detergente
e o extrato dialisado das enzimas nas seguintes condições:
1. 25 mL de Água destilada
2. 25 mL de solução detergente
3. 20 mL de solução detergente + 5 mL de extrato enzimático (11,78
U/mL protease e 2,53 U/mL α-amilase)
4. 10 mL de solução detergente + 15 mL de extrato enzimático (35,34
U/mL protease e 7,58 U/mL α-amilase)
4.13. Avaliação da detergência
Os tecidos EMPA 112 após a lavagem e secagem, foram submetidos à
medida de cor utilizando o colorímetro de Hunter Hunterlab Miniscan
Spectophotometer (HUNTER LAB).
Na escala de Hunter, o índice “L” mede a luminosidade variando de 0
(para amostra perfeitamente preta – mínima refletância) e 100 (para amostra
perfeitamente branca – máxima refletância). O parâmetro “a” mede variações na
faixa de cor verde (sinal negativo) ao vermelho (sinal positivo) e o parâmetro “b”
30
mede variações na faixa de cor azul (sinal negativo) ao amarelo (sinal positivo).
Valores de “a” e “b” iguais a zero e L = 50 equivalem à cor cinza. Quanto maior a
diferença das leituras do índice L entre os tecidos sujos padrão que foram lavados
e os tecidos não lavados, maior é a detergência.
4.14. Análise Estatística
A média da diferença dos valores de cor foi avaliada pela análise de
variância (ANOVA) utilizando o programa SAS versão 9.0. Os efeitos das médias
dos tratamentos foram comparados pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Foram utilizadas 3 repetições para cada teste. Os tecidos lavados e secos
também foram fotografados.
4.15. Preparo das manchas nos tecidos
Foram preparados 3 tipos de tecidos manchados com substâncias ricas
em amido e proteína. Tecidos de algodão medindo 5 x 5 cm2 foram mantidos
submersos em beckers contendo gema de ovo (proteína), molho de tomate
(amido) e Toddynho® (proteína e amido) por 2 minutos. Os tecidos manchados
ficaram estendidos em varal à temperatura ambiente para que as manchas
pudessem secar durante 24-36 horas.
4.16. Desempenho das enzimas na lavagem de tecidos manchados com
gema de ovo, molho de tomate e Toddynho®
Os tecidos manchados (5x5 cm2) com molho de tomate, gema de ovo e
Toddynho® foram lavados a 40ºC, em triplicata, sob agitação de 150 rpm em
shaker rotatório TECNAL TE-420, por 15 minutos em erlenmeyers de 250 mL
contendo a solução de detergente (diluído com água destilada a 7mg/mL e fervido
por 15 minutos) e o extrato dialisado das enzimas nas seguintes condições:
31
1. 25 mL de Água destilada
2. 25 mL de solução detergente
3. 20 mL de solução detergente + 5 mL de extrato enzimático (11,78
U/mL protease e 2,53 U/mL α-amilase)
Os tecidos manchados com gema de ovo também foram lavados a 55ºC
para melhorar o desempenho das enzimas na remoção da mancha.
Após as lavagens todos os tecidos foram secos em estufa TECNAL TE
393/I a 50ºC durante 40 minutos, comparados visualmente e fotografados.
4.17. Estabilidade ao armazenamento do extrato dialisado congelado
Paralelamente aos testes de lavagem, a estabilidade da atividade
enzimática do extrato dialisado congelado foi acompanhada durante 60 dias.
Durante este período, o extrato foi descongelado com 30 e 60 dias e as atividades
enzimáticas dosadas a fim de determinar se estava havendo perda de atividade
ao longo do tempo de armazenamento.
32
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Perfil de crescimento do microrganismo
O perfil do crescimento microbiano, pH do meio e atividade da α-amilase e
proteases secretadas por Bacillus sp. SMIA-2 em meio de cultivo contendo amido
solúvel (0,25%, p/v), proteínas do soro de leite (0,1%, p/v) e água de maceração
de milho (0, 3%, p/v) são mostrados na Figura 2.
0 12 24 36 48
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
Am
ilase
(U
/mL
)
Pro
tea
se
(U
/mL
)
pH
D.O
. 6
00
nm
Tempo(hs)
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Figura 2. Crescimento (■), pH(●), atividade da protease (▼) e α-amilase (▲) de Bacillus sp SMIA-2 em culturas submersas contendo amido solúvel (0,25%, p/v), proteínas do soro de leite (0,1%, p/v) e água de maceração de milho (0, 3%, p/v) a 50oC.
33
O crescimento do microrganismo foi notado até 24 horas de incubação.
Bacillus sp. SMIA-2 foi capaz de secretar proteases e α-amilase durante esta
fase. No entanto, a maior atividade destas enzimas ocorreu ao fim da fase
logarítmica e atingiu seu máximo com 36 horas de fermentação. Neste tempo, a
atividade da amilase e da protease atingiu respectivamente 2,47 U/mL e 14,91
U/mL. Estes resultados sugerem que a indução efetiva destas enzimas não ocorre
até que a fase estacionária seja alcançada e corroboram com os encontrados por
Asgher et al. (2007), Konsoula e Liakopoulou-Kyriakides (2004), para a síntese de
α-amilases e com Gupta et al. (2002) que relataram que espécies de Bacillus
produzem proteases extracelulares durante o final da fase logarítmica e início da
fase estacionária.
Em relação ao pH do meio, notou-se uma queda nos valores de pH da
cultura de 7,46 para 6,61 nas primeiras 12 horas de cultivo. Posteriormente, foi
observado um aumento nos valores para 8,32 em 48 horas. Esta oscilação reflete
quais reagentes são consumidos durante o professo fermentativo e fornece
informações acerca do início e término da indução da síntese das enzimas, já que
a secreção das mesmas está diretamente relacionada à concentração de
nitrogênio disponível no meio (Kumar e Takagi, 2003).
5.2. Produção e purificação parcial das enzimas
De acordo com os resultados obtidos no estudo do perfil de crescimento
do microrganismo, foi estabelecido o período de fermentação de 36 horas para a
produção das enzimas por Bacillus sp. SMIA-2. As atividades enzimáticas foram
dosadas ao final das 36 horas de fermentação, após a etapa de diálise e nas
amostras dialisadas submetidas à liofilização. Em todas as fermentações
realizadas, o processo da diálise possibilitou o aumento da atividade enzimática
tanto para a protease quanto para a α-amilase, conforme mostrado na Tabela 3 e
Tabela 4, respectivamente.
A atividade enzimática da amilase aumentou de 2,52 U/mL para 12,9
U/mL após a diálise, enquanto a atividade da protease aumentou de 12,02 U/mL
para 58,03 U/mL. Em relação à atividade específica (U/mg de proteína), a
atividade enzimática da amilase aumentou de 7,20 U/mg para 17,92 U/mg após a
diálise, enquanto a atividade da protease aumentou de 34,34 U/mg para 80,60
34
U/mg, representando assim incremento de aproximadamente 2,5 vezes para a
amilase e 2,3 vezes para a protease.
Porém, a atividade total da ɑ-amilase e da protease apresentada pelo
extrato dialisado correspondeu respectivamente a 34,16% e 32,22% da atividade
total, considerada 100%, apresentada pelas enzimas do extrato bruto. Estes
valores são inferiores aos encontrados por Ashwini et al., (2011), que relataram
uma purificação para a α-amilase de 5,8 vezes e rendimento de 60% após o
processo de diálise.
Tabela 3. Purificação parcial da α-amilase
Tratamento Vol. Total (mL)
Atividade Total (U)
Atividade Enzima (U/mL)
Proteina (mg/mL)
Proteina Total (mg)
Especifica atividade
(U/mg protein)
Rendimento Atividade total (%)
Purificação (U/mg
protein)
Extrato Bruto
3926 9893 2,5 0,35 1.374 7,20 100 1
Dialisado 262 3379 12,9 0,72 189 17,92 34,16 2,5
Tabela 4. Purificação parcial da protease
Tratamento Vol.
Total (mL)
Atividade Total (U)
Atividade Enzima (U/mL)
Proteina (mg/mL)
Proteina Total (mg)
Especifica atividade
(U/mg protein)
Rendimento Atividade total (%)
Purificação (U/mg
protein)
Extrato Bruto
3926 47190 12,0 0,35 1374 34,34 100 1
Dialisado 262 15203 58,0 0,72 189 80,60 32,22 2,3
5.3. Liofilização
Parte dos extratos dialisados provenientes das fermentações realizadas
foi submetida à liofilização. O material liofilizado obtido foi pesado e foi observado
uma relação de 230 mg de material liofilizado/ 100 mL de extrato dialisado. Foi
realizada a determinação da atividade enzimática na amostra liofilizada. Para
isso, o liofilizado foi reconstituído com tampão Tris/HCl pH 8,5 na concentração de
1mg/mL. As tabelas 5 e 6 apresentam a influência da liofilização na atividade
enzimática, considerando o volume de 100 mL do extrato dialisado submetido à
liofilização.
35
Tabela 5. Influência da liofilização na atividade da amilase
Tratamento Atividade Total (U)
Atividade Enzima (U/mL)
Proteina (mg/mL)
Proteina Total (mg)
Especifica atividade
(U/mg protein)
Rendimento Atividade total (%)
Antes liofilização
1290 12,9 0,72 72 17,91 100
Após liofilização
568 5,68 0,46 46 12,35 68,96
Tabela 6. Influência da liofilização na atividade da protease
Tratamento Atividade Total (U)
Atividade Enzima (U/mL)
Proteina (mg/mL)
Proteina Total (mg)
Especifica atividade
(U/mg protein)
Rendimento Atividade total (%)
Antes liofilização
5800 58,0 0,72 72 80,55 100
Após liofilização
3630 36,3 0,46 46 78,91 62,59
Em relação à atividade apresentada pelo extrato dialisado antes da
liofilização, a perda de atividade tanto para a amilase quanto para a protease
depois da liofilização foi de 32% e 38%, respectivamente, considerando a
atividade do extrato dialisado como 100%.
Embora o processo de secagem por liofilização seja um dos métodos
mais adequados para a conservação de materiais biológicos, as proteínas
raramente podem ser liofilizadas sem perda da atividade, geralmente associadas
a alterações em sua conformação (Wang, 2000). Segundo Murgatroid et al.
(1997), o congelamento é uma das etapas mais críticas de liofilização, já que a
estrutura do produto, o tamanho e a forma são determinados após o
congelamento. Esta estrutura não deve ser alterada durante o processo de
liofilização, correndo-se o risco de ocorrer danos ou mesmo a perda do produto.
Portanto, um agente estabilizante, por exemplo, um açúcar ou um poliálcool,
normalmente é exigido (Wang, 2000).
36
5.4. Caracterização parcial da α-amilase e protease no extrato dialisado
Na determinação do pH ótimo a atividade da α-amilase e da protease foi
maior em pH 8,5. Ambas as enzimas apresentaram os menores valores de
atividade em pH 6 e 10. Em relação à máxima atividade obtida em pH 8,5, a α-
amilase foi reduzida a 33 e 46% e a protease foi reduzida a 41 e 51%,
respectivamente em pH 6 e 10 (Figura 3).
A amilase e a protease também apresentaram maior estabilidade em pH
8,5. Ambas as enzimas apresentaram estabilidade crescente até o pH 8,5. A
amilase manteve 89% da sua atividade considerada ótima em pH 8,5, enquanto a
protease manteve 77% (Figura 3).
Amilase de Bacillus sp. apresentou atividade ótima em pH 7 (Teodoro e
Martins, 2000), enquanto a produzida por Bacillus sp. PN5 mostrou-se ativa e
estável em pH 10. Cerca de 80 e 60% da atividade amilolítica ainda foi notada
quando esta enzima foi incubada em tampão com pH 10 por 1 e 6 horas,
respectivamente (Saxena et al., 2007). Já Sajedi et al. (2005) concluíram que o
pH ótimo da α-amilase secretada por Bacillus sp. KR-8104 estava entre 4 e 6.
Proteases secretadas por Bacillus pantotheneticus em meio de cultivo contendo
melaço foi mais ativa em pH 8,4 e estável em valores entre 7 e 11 (Shikha et al.,
2007).
A boa atividade e estabilidade de ambas as enzimas em altos valores de
pH tornam possível a aplicação das mesmas na indústria de detergentes, já que
estes costumam apresentar pH alcalino (em torno de 8- 12) (Sellami-Kamoun et
al., 2006).
6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0
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Ati
vid
ad
e d
a p
rote
as
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%)
pH
6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0
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Ati
vid
ad
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a a
mil
as
e(%
)
pH Figura 3. Atividade (■) e estabilidade (●) de extratos dialisados, contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2, em
diferentes pHs.
(a) (b)
37
A influência da temperatura na atividade da α-amilase e protease
secretadas por Bacillus sp. SMIA-2 também foi investigada. As temperaturas que
proporcionaram as maiores atividades da α-amilase e proteases foram 90ºC e
70ºC, respectivamente (Figura 4), as quais são maiores ou similares às
temperaturas ótimas encontradas para outras amilases (Burhan et al., 2003;
Carvalho et al., 2008) e proteases (Genckal e Tari, 2006; Silva et al., 2007) de
cepas de Bacillus sp.
Além da temperatura ótima, a termoestabilidade das enzimas protease e
amilase produzidas por Bacillus sp. SMIA-2 foi analisada medindo-se a atividade
residual da amilase a 90ºC e das proteases a 70ºC após incubação das mesmas,
sem o substrato, durante 1 hora em temperaturas de 70 e 80ºC.
Em relação à atividade ótima apresentada a 90ºC, α-amilase manteve 52
% da sua atividade quando incubada a 80ºC e 48% da sua atividade quando
incubada a 70ºC. Já a protease não se manteve estável durante os 60 minutos
em que ficou incubada. Nos cinco primeiros minutos a enzima perdeu 94 e 84%
da atividade respectivamente a 80 e 70ºC (Figura 5).
Amilase de Bacillus sp. PN5 teve sua atividade evidenciada a 90ºC. Após
6 horas de incubação nesta mesma temperatura, a enzima ainda exibia 90% de
atividade (Saxena et al., 2007).
Em estudos com proteases de Bacillus subtilis as enzimas se mostraram
mais ativas entre 37 e 45ºC. No entanto, quando incubadas a 60ºC durante 15,
30, 45, 90 e 120 minutos, cerca de 67, 47, 37, 28 e 24% da atividade enzimática
ainda foi encontrada, respectivamente (Mukherjee , 2008).
Enzimas termotolerantes são aplicadas em variados setores industriais
por prevenir a contaminação microbiana por mesófilos, tornar os reagentes mais
solúveis facilitando a difusão dos mesmos e permitir que concentrações mais
altas destes compostos sejam utilizadas (Van den Burg, 2003; Haki e Rakshit,
2003).
38
40 50 60 70 80 90 100
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mil
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e(%
)
Temperatura(C)
Figura 4. Temperatura ótima para atividade de extratos dialisados contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2.
0 10 20 30 40 50 60
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al
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tea
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)
Tempo (minutos)
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0 10 20 30 40 50 60
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tiv
ida
de
re
sid
ua
l d
a a
mil
as
e (
%)
Tempo (minutos)
70
80
Figura 5. Estabilidade térmica de extratos dialisados contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp SMIA-2.
5.5. Estabilidade de extratos dialisados contendo enzimas proteases e α-
amilases nas temperaturas usadas nas lavagens dos tecidos
As enzimas proteases e amilases presentes no extrato dialisado foram
estáveis quando incubadas por 30 minutos nas temperaturas 25, 40 e 55ºC, como
mostrado na Figura 6. Quando incubadas nas mesmas condições, porém na
presença de um detergente comercial (Tixan®), a α-amilase manteve sua
atividade durante o todo o período de incubação nas temperaturas testadas,
entretanto a atividade da protease caiu drasticamente, quando incubada a 55ºC
(Figura 7).
(b) (b)
(a) (b)
40 50 60 70 80 90 100
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)
Temperatura(C)
(a)
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Tempo (minutos)
25C
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)
Tempo (minutos)
25C
40C
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Figura 6. Estabilidade de extratos dialisados contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2 incubados em diferentes temperaturas.
0 10 20 30
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Tempo (minutos)
25C
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am
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se
(%
)
Tempo (minutos)
25C
40C
55C
Figura 7. Estabilidade de extratos dialisados contendo enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2 incubados em diferentes temperaturas na presença do detergente Tixan®.
De acordo com os resultados relatados por Carvalho et al. (2008), a ɑ-
amilase produzida por Bacillus sp. SMIA-2 quando incubada a 50ºC sem a
presença de detergente foi estável durante 1 hora. A enzima manteve cerca de
86%, 85% e 75% da atividade, após 20 minutos de incubação a 50ºC, na
presença de detergentes em pó das marcas: Omo®, Campeiro® e Tide®,
respectivamente.
(a) (b)
(a) (b)
40
Correa (2009) também observou a perda de 32% da atividade da
protease produzida por Bacillus sp. SMIA-2 quando incubada a 50ºC durante 120
minutos com detergente Campeiro®. De acordo com Godfrey e West (1996) todas
as proteases adicionadas em detergentes podem ser estabilizadas com utilização
da glicina juntamente com íons cálcio. Nascimento e Martins (2006) mantiveram
85% da estabilidade da protease de Bacillus sp. SMIA-2 quando incubada a 60ºC
por 1 hora, na presença de glicina e íons cálcio, com o detergente Tide®.
5.6. Desempenho de proteases e α-amilases produzidas por Bacillus sp.
SMIA-2 na lavagem de tecidos padrão EMPA 112
5.6.1. Lavagem de tecidos padrão EMPA 112 utilizando extratos liofilizados
Os extratos dialisados das enzimas proteases e α-amilases obtidos de
culturas submersas de Bacillus sp. SMIA-2 foram concentrados por liofilização e
utilizados na lavagem de tecidos padrões EMPA 112, que são tecidos manchados
com leite e chocolate. Os extratos liofilizados foram reconstituídos na
concentração de 1mg/mL em tampão Tris HCl pH 8,5 e nestas condições
apresentaram atividades enzimáticas de 15,50 U/mL para a protease e 3,04 U/mL
para α-amilases. A média das refletâncias dos tecidos submetidos a diferentes
condições de lavagem está mostrada na Tabela 7.
Tabela 7. Medidas da refletância de tecidos EMPA 112 submetidos a diferentes condições de lavagem usando enzimas liofilizadas
CONDIÇÕES DE LAVAGEM PARÂMETRO L*
30ºC 50ºC
Água destilada 61,05c 63,24c
Água e detergente 65,56b 65,30b
Água, detergente e enzimas Bacillus sp. SMIA-2 68,48a 68,62a
Água, detergente e enzima Comercial 70,41a 70,54a
*Letras iguais (mesma coluna) não se diferem estatisticamente pelo teste Tukey em nível
5% de significância.
41
A medida do parâmetro L do tecido EMPA 112 sem lavar foi de 61,09. De
acordo com os resultados apresentados, a lavagem dos tecidos tanto a 30ºC
quanto a 50ºC, utilizando proteases e α-amilases dialisadas e liofilizadas de
Bacillus sp. SMIA2 adicionadas à solução do detergente Tixan® propiciou um
aumento da média das refletâncias emitidas pelos tecidos quando comparadas
aos tecidos lavados apenas com a solução detergente. Além disso, a refletância
emitida pelos tecidos lavados com solução detergente adicionada das enzimas de
Bacillus sp. SMIA-2 foi estatisticamente igual à refletância emitida pelos tecidos
lavados com solução detergente adicionados de uma protease comercial
Savinase®.
5.6.2 Lavagem de tecidos padrão EMPA 112 utilizando extratos dialisados
das enzimas proteases e α-amilases
Os resultados da refletância emitida pelos tecidos EMPA 112 após a
lavagem a 40ºC utilizando 50 mL de solução detergente adicionado de extratos
dialisados das enzimas proteases e α-amilases estão apresentados na Tabela 8.
As concentrações do extrato enzimático que foram testadas não foram suficientes
para que os tecidos EMPA 112, após a lavagem, diferissem estatisticamente dos
tecidos lavados com detergentes sem adição do extrato.
Tabela 8. Medidas de refletância de tecidos EMPA 112 obtidas após a lavagem a 40°C utilizando o detergente Tixan® e extrato dialisado de proteases e α-amilases de Bacillus sp. SMIA-2
Lavagens a 40ºC Refletância*
50 mL água 62,09 b
50 mL Detergente 64,52 a
50 mL Detergente + 1,15 U/mL protease e 0,25 U/mL α-amilase 64,52 a
50 mL Detergente + 5,35 U/mL protease e 1,15 U/mL α-amilase 64,49 a
50 mL Detergente + 9,82 U/mL protease e 2,10 U/mL α-amilase 64,91 a
*Letras iguais não diferem estatisticamente.
42
A lavagem a 40ºC dos tecidos EMPA 112 utilizando solução detergente
Tixan® 25 mL e concentrações crescentes e maiores das enzimas proteases e α-
amilases testadas anteriormente foi novamente realizada. De acordo com os
resultados mostrados na Tabela 9, a refletância emitida pelos tecidos após a
lavagem com o detergente e as concentrações das enzimas testadas foram
superiores e estatisticamente diferentes daquela apresentada pelos tecidos
lavados apenas com o detergente. Portanto, todas as concentrações testadas
contribuíram positivamente para a limpeza dos tecidos EMPA 112.
Tabela 9. Medidas da refletância de tecidos EMPA 112 submetidos a diferentes condições de lavagem a 40ºC utilizando as enzimas proteases e α-amilases dialisadas de Bacillus sp SMIA-2. Letras iguais não se diferem estatisticamente
Lavagens a 40ºC Refletância*
25 mL água 62,09c
25 mL Detergente 64,52b
20 mL Detergente + 11,78 U/mL protease e 2,53 U/mL α-amilase 67,51a
15 mL Detergente + 23,56 U/mL protease e 5,06 U/mL α-amilase 67,83a
10 mL Detergente + 35,34 U/mL protease e 7,58 U/mL α-amilase 66,08a
5 mL Detergente + 47,12 U/mL protease e 10,11 U/mL α-amilase 67,31a
Com o objetivo de avaliar a influência da temperatura no desempenho das
enzimas, a lavagem dos tecidos EMPA 112 também foi realizada nas
temperaturas de 25º e 55ºC (Tabela 10 e 11). Os tecidos lavados a 25ºC
utilizando apenas o detergente e o detergente adicionado de extrato enzimático
dialisado não apresentaram diferença estatística entre si para a refletância, ou
seja, nesta temperatura o desempenho da enzima não foi satisfatório (Tabela 10).
Já a temperatura de 55ºC favoreceu a atuação das enzimas e os tecidos
lavados com adição do extrato enzimático apresentaram a média dos valores da
refletância superiores e estatisticamente distintos aos apresentados pelos tecidos
43
lavados só com detergente sem adição de extrato. As concentrações testadas a
55ºC também apresentaram diferença estatística entre si, o volume de 10mL de
detergente e 15mL de extrato enzimático apresentou o maior valor para a
refletância comparado aos demais testados nas outras condições (Tabela 11). Os
tecidos EMPA 112 lavados a 55ºC são mostrados na Figura 8.
Tabela 10. Medidas da refletância de tecidos EMPA 112 submetidos a diferentes
condições de lavagem a 25ºC utilizando as enzimas proteases e α-amilases dialisadas de Bacillus sp SMIA-2. Letras iguais não se diferem estatisticamente
Lavagens a 25ºC Refletância*
25 mL água 62,68b
25 mL Detergente 64,39a
20 mL Detergente + 11,78 U/mL protease e 2,53 U/mL α-amilase 65,26a
10 mL Detergente + 35,34 U/mL protease e 7,58 U/mL α-amilase 65,61a
Tabela 11. Medidas da refletância de tecidos EMPA 112 submetidos a diferentes
condições de lavagem a 55ºC utilizando as enzimas proteases e α-amilases dialisadas de Bacillus sp SMIA-2. Letras iguais não se diferem estatisticamente
Lavagens a 55ºC Refletância*
25 mL água 63,00d
25 mL Detergente 64,30c
20 mL Detergente + 11,78 U/mL protease e 2,53 U/mL α-amilase 66,42b
10 mL Detergente + 35,34 U/mL protease e 7,58 U/mL α-amilase 68,20a
44
(a) (b) (c) (d) (e)
Figura 8. Efeito da solução “detergente-enzimas” na remoção de sujidades dos tecidos
sujos padrão (EMPA 112) utilizando diferentes condições de lavagem a 55ºC. (a)Tecido sem lavar, (b) Tecido após a lavagem com água, (c) Tecido após a lavagem com 25 mL detergente, (d) Tecido após a lavagem com 20 mL detergente e 5 mL enzimas, (e) Tecido após a lavagem com 10 mL detergente e 15 mL enzimas.
5.7. Desempenho das enzimas proteases e α-amilases dialisadas de Bacillus
sp SMIA-2 na lavagem de tecidos manchados com diferentes alimentos
O desempenho das enzimas proteases e α-amilases dialisadas de
Bacillus sp. SMIA-2 na lavagem de tecidos manchados com diferentes alimentos
foi testado. Os tecidos foram lavados com 20 mL de solução detergente+ 5 mL de
extrato enzimático (amilase 2,53 U/mL e protease 11,78 U/mL) por 15 minutos a
40ºC.
O resultado da lavagem dos tecidos manchados inicialmente com molho
de tomate em diferentes condições está mostrado na Figura 9. Quando
comparada visualmente, a lavagem dos tecidos com detergente adicionados das
enzimas de Bacillus sp SMIA-2, proporcionou uma melhor remoção das manchas
de molho de tomate.
(a) (b) (c)
Figura 9. Remoção de manchas de tecidos sujos com molho de tomate utilizando diferentes condições de lavagem a 40ºC. (a) Tecido após a lavagem com água, (b) Tecido após a lavagem com 25 mL detergente, (c) Tecido após a lavagem com 20 mL detergente e 5 mL enzimas.
45
O resultado da lavagem dos tecidos manchados com Toddynho® está
mostrado na Figura 10. Quando comparada visualmente, a lavagem dos tecidos
com detergente adicionado das enzimas de Bacillus sp SMIA-2, foi muito mais
eficiente na remoção das manchas de chocolate.
(a) (b) (c)
Figura 10. Remoção de manchas de tecidos sujos com Toddynho® utilizando diferentes
condições de lavagem a 40ºC. (a) Tecido após a lavagem com água, (b) Tecido após a lavagem com 25 mL detergente, (c) Tecido após a lavagem com 20 mL detergente e 5 mL enzimas.
Resultados similares foram encontrados para tecidos manchados com
gema de ovo, em que a lavagem dos mesmos com detergente adicionado das
enzimas proteases e α-amilases dialisadas de Bacillus sp SMIA-2 foi mais
eficiente na remoção das manchas (Figura 11).
(a) (b) (c)
Figura 11. Remoção de manchas de tecidos sujos com gema de ovo utilizando diferentes
condições de lavagem a 40ºC. (a) Tecido após a lavagem com água, (b) Tecido após a lavagem com 25 mL detergente, (c) Tecido após a lavagem com 20 mL detergente e 5 mL enzimas.
A lavagem dos tecidos sujos com gema de ovo a 55ºC removeu quase
que completamente as manchas como mostrado na Figura 12, demonstrando a
melhor eficiência das enzimas quando se aumentou a temperatura de lavagem. A
concentração das enzimas foi a mesma usada na lavagem a 40ºC, porém de
46
acordo com os resultados apresentados na figura 4, as atividades das enzimas
protease e amilase foram maiores a 55ºC do que a 40ºC, o que justifica o melhor
desempenho na lavagem a 55ºC.
(a) (b) (c)
Figura 12. Remoção de manchas de tecidos sujos com gema de ovo utilizando diferentes
condições de lavagem a 55ºC. (a) Tecido após a lavagem com água, (b) Tecido após a lavagem com 25 mL detergente, (c) Tecido após a lavagem com 20 mL detergente e 5 mL enzimas.
Hmidet et al. (2009) conseguiram melhor desempenho na remoção de
manchas de sangue, chocolate e molho “barbecue” em tecidos quando usaram
solução detergente suplementadas com extrato enzimático contendo enzimas
protease e amilase de Bacillus licheniformis NH1 nas lavagens a 50ºC por 60
minutos.
Abidi et al. (2008) realizando lavagens de tecidos com manchas de
sangue, chocolate e gema de ovo também conseguiram melhorar o desempenho
na remoção das manchas quando adicionaram extrato enzimático (5 mL de
proteases 1900U/mL) de fungo Botrytis cinerea a 50 mL de solução detergente.
5.8. Estabilidade ao armazenamento de extratos dialisados congelado
Os extratos dialisados das enzimas proteases e α-amilases produzidas
simultaneamente por Bacillus sp. SMIA2 foram congelados e em intervalos de
tempo definidos às atividades de ambas as enzimas foram determinadas. De
acordo com os resultados apresentados na Figura 13, ao final de 60 dias a α-
amilase manteve 90% da atividade inicial, enquanto a protease foi ainda mais
estável e manteve 98% da sua atividade inicial. Portanto, esses resultados
demonstram que o extrato dialisado apresentou boa estabilidade quando
congelado.
47
dia؛ 1 30 dias 60 dias
0
10
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60A
tiv
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tea
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U/m
L
dia؛ 1 30 dias 60 dias
0
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4
6
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Ati
vid
ad
e d
a a
mil
as
e U
/mL
Figura 13. Estabilidade de extratos dialisados congelados das enzimas proteases (a) e α-amilases (b) produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2.
(a) (b)
48
6. RESUMO E CONCLUSÕES
No presente trabalho foi avaliado o desempenho das enzimas, α-amilase
e protease, produzidas simultaneamente por Bacillus sp. SMIA-2, na remoção de
manchas de Ketchup, gema de ovo e chocolate (Toddynho® e EMPA 112) em
tecidos.
As enzimas foram coproduzidas por fermentações submersas de Bacillus
sp. SMIA-2. Após a concentração por precipitação com sulfato de amônio e
diálise, a atividade especificada da ɑ-amilase que era de 7,20U/mg aumentou
para 17,92 U/mg de proteína, assim como a atividade da protease que era de
34,34U/mg aumentou para 80,60U/mg de proteína.
Os extratos enzimáticos foram usados na lavagem dos tecidos. Também
foram usados extratos dialisados e liofilizados nas lavagens. As α-amilase e
protease produzidas por Bacillus sp. SMIA-2 melhoraram o desempenho do
detergente Tixan® (7mg/mL) quando foram adicionadas nas concentrações iguais
ou superiores a 11,78 U/mL protease e 2,53 U/mL amilase, nas lavagens dos
tecidos sujos padrão EMPA 112 realizadas a 40ºC e 55ºC.
A adição de enzimas no detergente Tixan® nas lavagens dos tecidos de
algodão com mancha de gema de ovo, Ketchup e chocolate (Toddynho®) não só
melhorou o desempenho do detergente, como também removeu quase
completamente a mancha do Toddynho® dos tecidos lavados a 40ºC e o da gema
de ovo dos tecidos lavados a 55ºC.
49
A ɑ-amilase e a protease do extrato enzimático dialisado e congelado
mantiveram 90% e 98% de estabilidade na sua atividade ao final do período de 60
dias.
O estudo de caracterização desse extrato dialisado revelou que o pH
ótimo dessas enzimas é 8,5. Neste pH, a ɑ-amilase manteve 89% de sua
atividade e a protease manteve 77%. A temperatura ótima de atividade da
protease foi 70ºC, enquanto o da ɑ-amilase foi 90ºC.
As enzimas protease e ɑ-amilase produzidas por Bacillus sp. SMIA-2 se
mostraram eficientes na remoção de manchas de alimentos ricos em proteína e
amido. Além disso, apresentaram características importantes e necessárias para
o uso em detergentes enzimáticos, devendo, portando, ser testadas em
formulação de detergentes.
50
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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