1
Cardosina ACardosina A Estrutura terciáriaEstrutura terciária
2
Precursor Intermediário Cardosina Amadura Modelo proposto para o processamento proteolítico da Cardosina A. Os locais de clivagem Pro/cadeia de 31 KDa, cadeia de 31 KDa/PSI e PSI/cadeia de 15 KDa estão assinalados com setas.
Pro 31 KDa 15 KDaPSI
RGTVRDSGSA HAIGANGVMNQQ
EHLSTSSEE
3
Cardosina ACardosina A Estrutura secundáriaEstrutura secundária
Cadeia de 15 KDaCadeia de 15 KDa
Cadeia de 31 KDaCadeia de 31 KDa
4
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de pistilos de Cynara cardunculus Cynara cardunculus L.L.
Tampão citrato de Tampão citrato de sódio 100 mM, pH 3,5sódio 100 mM, pH 3,5
1 Passo. Extracção Acídica1 Passo. Extracção Acídica
5
Separação baseada em Separação baseada em propriedades dos propriedades dos
compostoscompostosExclusão MolecularExclusão Molecular
Detector UVDetector UV
MBarros
Direcção do fluxoDirecção do fluxo
Solvente Solvente
Proteínas fraccionadasProteínas fraccionadas
6
2 Passo. Cromatografia de Exclusão 2 Passo. Cromatografia de Exclusão MolecularMolecular
Coluna: Superdex G75Eluente: Tampão Tris 25 mM, pH
7,6
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 50 100 150 200
Tempo de retenção (min)
Abs
orvâ
ncia
a 2
80 n
m (
mA
U)
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
7MBarros
Separação baseada em Separação baseada em propriedades dos compostospropriedades dos compostos
Detector UVDetector UV
Cromatografia de Troca IónicaCromatografia de Troca Iónica
++
++
--++ --
TampãoTampãoBB
TampãoTampãoAA
BombasBombasA e BA e B
Aplicaçãoda amostra
Mistura Mistura dede
proteínaproteínass
Proteínas Proteínas carregadas + são carregadas + são eluídas primeiroeluídas primeiro
Coluna Coluna de DEAEde DEAE
ResinaResina
Proteína Proteína ++
Proteína Proteína --
Gradiente linear de Gradiente linear de salsal
Fo
rça
ión
i ca
Fo
rça
ión
i ca
Mistura Mistura dede
proteínaproteínass
8
Coluna: Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)
Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6
Gradiente crescente de 1M Gradiente crescente de 1M NaClNaCl
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
0 20 40 60 80 100 120
Tempo de retenção (min)
Abs
orvâ
ncia
a 2
80 n
m (m
AU
)
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
3 Passo. Cromatografia de troca iónica3 Passo. Cromatografia de troca iónica
9
31 KDa
15 KDa
34 KDa
14 KDa
A0
5. Controlo de Pureza das Cardosinas5. Controlo de Pureza das Cardosinas
Para o controlo de
pureza das amostras
de cardosinas
recorre-se a
electroforese vertical
em gel de
poliacrilamida, em
condições
desnaturantes (SDS-
PAGE).
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
Após Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)
10
As amostras de cardosinas A0, A e B recolhidas na cromatografia de troca iónica são sujeitas a uma nova cromatografia de exclusão molecular numa coluna Desalting G25, com o objectivo de remover o sal.
4 Passo. Desalting – eliminar o sal das 4 Passo. Desalting – eliminar o sal das amostras da cromatografia anterioramostras da cromatografia anterior
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10
Tempo de retenção (min)
Abs
orvâ
ncia
a 2
80
nm
(m
AU
)
Coluna: Sephadex G25Eluente: Água Mili_Q (água ultra
pura)
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
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Coluna: Mono Q (trocador aniónico)
Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6
Gradiente crescente de 1 M NaCl
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo de retenção (min)
Abs
orvâ
ncia
a 2
80 n
m (m
AU
)
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
A amostra de cardosina B necessita de ser submetida a uma nova cromatografia de troca iónica numa coluna de maior resolução, a fim de remover a maior parte da cardosina A que contamina a amostra obtida na primeira troca iónica.
6 Passo. Recromatografia de troca 6 Passo. Recromatografia de troca iónica da amostra de cardosina Biónica da amostra de cardosina B
12
ResumoResumo
• A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos
e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou
afinidade por determinados ligandosafinidade por determinados ligandos
• Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa
solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma
superfície sólida.superfície sólida.• A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém
um gel constituído por esferas.um gel constituído por esferas.• A natureza das esferas determina o tipo de separação A natureza das esferas determina o tipo de separação
realizado. De acordo com:realizado. De acordo com:• - a massa, cromatografia de exclusão molecular- a massa, cromatografia de exclusão molecular• - a carga, cromatografia de troca iónica- a carga, cromatografia de troca iónica• - a afinidade, cromatografia de afinidade- a afinidade, cromatografia de afinidade
ResumoResumo
• A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos
e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou
afinidade por determinados ligandosafinidade por determinados ligandos
• Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa
solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma
superfície sólida.superfície sólida.• A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém
um gel constituído por esferas.um gel constituído por esferas.• A natureza das esferas determina o tipo de separação A natureza das esferas determina o tipo de separação
realizado. De acordo com:realizado. De acordo com:• - a massa, cromatografia de exclusão molecular- a massa, cromatografia de exclusão molecular• - a carga, cromatografia de troca iónica- a carga, cromatografia de troca iónica• - a afinidade, cromatografia de afinidade- a afinidade, cromatografia de afinidade MBarros
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