1

Cardosina ACardosina A Estrutura terciáriaEstrutura terciária

2

Precursor  Intermediário Cardosina Amadura  Modelo proposto para o processamento proteolítico da Cardosina A. Os locais de clivagem Pro/cadeia de 31 KDa, cadeia de 31 KDa/PSI e PSI/cadeia de 15 KDa estão assinalados com setas.

Pro 31 KDa 15 KDaPSI

RGTVRDSGSA HAIGANGVMNQQ

EHLSTSSEE

3

Cardosina ACardosina A Estrutura secundáriaEstrutura secundária

Cadeia de 15 KDaCadeia de 15 KDa

Cadeia de 31 KDaCadeia de 31 KDa

4

Extracção e purificação de cardosinas a partir dos Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de pistilos de Cynara cardunculus Cynara cardunculus L.L.

Tampão citrato de Tampão citrato de sódio 100 mM, pH 3,5sódio 100 mM, pH 3,5

1 Passo. Extracção Acídica1 Passo. Extracção Acídica

5

Separação baseada em Separação baseada em propriedades dos propriedades dos

compostoscompostosExclusão MolecularExclusão Molecular

Detector UVDetector UV

MBarros

Direcção do fluxoDirecção do fluxo

Solvente Solvente

Proteínas fraccionadasProteínas fraccionadas

6

2 Passo. Cromatografia de Exclusão 2 Passo. Cromatografia de Exclusão MolecularMolecular

Coluna: Superdex G75Eluente: Tampão Tris 25 mM, pH

7,6

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 50 100 150 200

Tempo de retenção (min)

Abs

orvâ

ncia

a 2

80 n

m (

mA

U)

Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.

7MBarros

Separação baseada em Separação baseada em propriedades dos compostospropriedades dos compostos

Detector UVDetector UV

Cromatografia de Troca IónicaCromatografia de Troca Iónica

++

++

--++ --

TampãoTampãoBB

TampãoTampãoAA

BombasBombasA e BA e B

Aplicaçãoda amostra

Mistura Mistura dede

proteínaproteínass

Proteínas Proteínas carregadas + são carregadas + são eluídas primeiroeluídas primeiro

Coluna Coluna de DEAEde DEAE

ResinaResina

Proteína Proteína ++

Proteína Proteína --

Gradiente linear de Gradiente linear de salsal

Fo

rça

ión

i ca

Fo

rça

ión

i ca

Mistura Mistura dede

proteínaproteínass

8

Coluna: Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)

Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6

Gradiente crescente de 1M Gradiente crescente de 1M NaClNaCl

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

0 20 40 60 80 100 120

Tempo de retenção (min)

Abs

orvâ

ncia

a 2

80 n

m (m

AU

)

Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.

3 Passo. Cromatografia de troca iónica3 Passo. Cromatografia de troca iónica

9

31 KDa

15 KDa

34 KDa

14 KDa

A0

5. Controlo de Pureza das Cardosinas5. Controlo de Pureza das Cardosinas

Para o controlo de

pureza das amostras

de cardosinas

recorre-se a

electroforese vertical

em gel de

poliacrilamida, em

condições

desnaturantes (SDS-

PAGE).

Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.

Após Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)

10

As amostras de cardosinas A0, A e B recolhidas na cromatografia de troca iónica são sujeitas a uma nova cromatografia de exclusão molecular numa coluna Desalting G25, com o objectivo de remover o sal.

4 Passo. Desalting – eliminar o sal das 4 Passo. Desalting – eliminar o sal das amostras da cromatografia anterioramostras da cromatografia anterior

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8 10

Tempo de retenção (min)

Abs

orvâ

ncia

a 2

80

nm

(m

AU

)

Coluna: Sephadex G25Eluente: Água Mili_Q (água ultra

pura)

Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.

11

Coluna: Mono Q (trocador aniónico)

Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6

Gradiente crescente de 1 M NaCl

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo de retenção (min)

Abs

orvâ

ncia

a 2

80 n

m (m

AU

)

Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.

A amostra de cardosina B necessita de ser submetida a uma nova cromatografia de troca iónica numa coluna de maior resolução, a fim de remover a maior parte da cardosina A que contamina a amostra obtida na primeira troca iónica.

6 Passo. Recromatografia de troca 6 Passo. Recromatografia de troca iónica da amostra de cardosina Biónica da amostra de cardosina B

12

ResumoResumo

• A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos

e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou

afinidade por determinados ligandosafinidade por determinados ligandos

• Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa

solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma

superfície sólida.superfície sólida.• A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém

um gel constituído por esferas.um gel constituído por esferas.• A natureza das esferas determina o tipo de separação A natureza das esferas determina o tipo de separação

realizado. De acordo com:realizado. De acordo com:• - a massa, cromatografia de exclusão molecular- a massa, cromatografia de exclusão molecular• - a carga, cromatografia de troca iónica- a carga, cromatografia de troca iónica• - a afinidade, cromatografia de afinidade- a afinidade, cromatografia de afinidade

ResumoResumo

• A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos

e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou

afinidade por determinados ligandosafinidade por determinados ligandos

• Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa

solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma

superfície sólida.superfície sólida.• A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém

um gel constituído por esferas.um gel constituído por esferas.• A natureza das esferas determina o tipo de separação A natureza das esferas determina o tipo de separação

realizado. De acordo com:realizado. De acordo com:• - a massa, cromatografia de exclusão molecular- a massa, cromatografia de exclusão molecular• - a carga, cromatografia de troca iónica- a carga, cromatografia de troca iónica• - a afinidade, cromatografia de afinidade- a afinidade, cromatografia de afinidade MBarros