Apresentadora: Msc. Geisi Rojas Barreto Applications Scientist Malvern Instruments, Inc.

Moderador: Henrique Kajiyama

Technical Manager Malvern Instruments, Inc.

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www.malvern.com/br

Nanoparticle Tracking Analysis (NTA): Contagem, visualização e análise de tamanho de nanopartículas

Sumário

› Introdução à Tecnologia NTA

› Princípios Básicos do DLS

› Técnicas Complementares: NTA & DLS

› Capacidades Adicionais do NTA

› Aplicações e Benefícios

Nanoparticle Tracking Analysis

Arranjo Óptico para os Instrumentos Nanosight

› VISUALIZAÇÃO da luz espalhada das

nanopartículas no caminho da fonte do laser

Microscópio

Partículas espalham quando laser incide

Partículas para serem visualizadas estão suspensas em um líquido

Fonte de Laser (aprox. 50 µm)

Vidro Superfície Metalizada

Líquido

Princípio de Medição – NTA

› Nanopartículas se movem

› Movimento Browniano

› Partículas pequenas se movem mais

rápido do que partículas maiores

› Coeficiente de Difusão pode ser

calculado acompanhando e analisando

o movimento de cada partícula

separadamente, mas simultaneamente

Tamanho!

Como calcular tamanho?

Mede o Movimento Browniano em tempo real

Obtém o Coeficiente de Difusão

d(H) = 3 p h D

KB T

Princípio de Medição – NTA

KB = Constante de Boltzmann h= Viscosidade T = Temperatura

Princípio de Medição – NTA

› “Rastreamento” do Movimento Browniano de partículas individuais

para medir o coeficiente de difusão

› A aplicação da equação de Stokes-Einstein resulta no diâmetro

hidrodinâmico

Captura do vídeo

Acompanha movimento

Análise

Software em Ação – NTA

Resolução de Pico-a-Pico do NTA

-5,00E+06

0,00E+00

5,00E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+07

2,50E+07

0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00

Part

icle

co

ncen

trati

on

Particle Size (nm)

Tamanho Concentração

MÍNIMO: 10 – 40 nm Tipo de material

Comprimento de onda e potência da

iluminação

Sensibilidade da câmera

MÁXIMO: 1000 – 2000 nm Movimento Browniano

Viscosidade do solvente

MÍNIMA: Aprox 106 / mL Requer maior duração da análise

MÁXIMA: Aprox 109 / mL Dificuldade de distinção das

partículas ao seu redor

Limites de Detecção do NTA

Regulamentação

Definição de Nanomaterial pela União Europeia (2011)

European Commission - IP/11/1202, 18/10/2011

Revisão em 2014

Nanomaterial é qualquer material que contenha 50% ou mais das

partículas, na distribuição de tamanho baseada em número, com uma

ou mais dimensões externas entre 1 nm e 100 nm.

http://europa.eu/rapid/press-release_IP-11-1202_pt.htm

Dynamic Light Scattering

Dynamic Light Scattering (DLS)

› DLS é uma técnica estabelecida em vários tipos

de indústrias e em inúmeras aplicações por mais

de 40 anos

› Rapidez, Reprodutibilidade e Precisão

Laser

Particle Size Distribution Correlation Function Intensity Fluctuation

Princípio de Medição – DLS

• Amostras polidispersas: tamanho médio 1

• Distribuição de tamanho: razão > 3:1 2

• Sem informação de concentração 3

Limitações do DLS

quando o NTA pode ajudar

Comparação entre

DLS e NTA

NTA vs. DLS – Amostra Monodispersa

Análise DLS Resultado Equivalente no NTA

100 nm polystyrene reference particles in water

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

50 100 200 400

Me

as

ure

d p

art

icle

dia

me

ter

in n

m

Standard Latex Particle size in nm

NTA

DLS

Validação do NTA por DLS

Comparação esferas de referência: 50, 100, 200 e 400 nm

NTA vs DLS – Amostra Bimodal

Esferas de poliestireno referência dispersas em água (100nm e 200nm)

Equipamento: Zetasizer Nano

? › No DLS as

nanopartículas de

100 nm não são

detectadas

› Sua presença é

“mascarada” pelo

espalhamento das

nanopartículas de

200 nm

Data reproduced from Filipe, Hawe and Jiskoot (2010) “Critical Evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the Measurement of Nanoparticles and Protein Aggregates”, Pharmaceutical Research, DOI: 10.1007/s11095-010-0073-2

NTA (curva vermelha) vs. DLS (barra azul) para misturas de poliestireno de diferentes tamanhos

Mistura PSL

Capacidades Adicionais

do NTA

Para aqueles que precisam mais do que tamanho

Capacidades Adicionais

do NTA

CONCENTRAÇÃO

Medindo Concentração…

Distribuição de partículas mostra

contagem em número vs tamanho da

partícula

Mistura de esferas de 100 nm e

200 nm de látex dispersas em

água na proporção de 1:1

Com NanoSight, a análise mostra os picos tanto para 100 nm quanto para 200 nm

Cálculo da Concentração

› NTA mede partículas individuais em um volume

conhecido

› Extrapola-se os valores obtidos para estimar a

concentração da amostra

› Quantos agregados há na amostra?

› Qual o tamanho do meu lipossomo? (onde ele

pode ser entregue)

› Quantos existem? (quantos serem entregues)

Cálculo da Concentração

› NTA mede a concentração em partículas/mL

› A concentração estimada é medida por unidade

de tempo

› Portanto, partículas movendo-se para fora e

dentro do campo de visão não irão afetar na

concentração estimada

Concentration Measurement Of 100 nm Duke Latex

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 10 20 30 40 50 60

Theoritical concentration (E+08)particles/ml

Mea

su

red

NT

A c

on

cen

trat

ion

(E+

08)p

arti

cles/m

l

concentration of

100 nm Duke

sample

Linear

(concentration

of 100 nm Duke

sample)

Concentration Measurement Linearity

Tamanho vs. Intensidade vs. Número

NanoSight possui habilidade única de plotar cada tamaho de

partícula em função da intensidade de espalhamento de luz

Capacidades Adicionais

do NTA

INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO

• Gráficos de alta resolução:

tamanho/número/intensidade

• Alterações mínimas de

tamanho levam a altas

variações na intensidade

• Pode identificar diferentes

materiais

• Qualitativa, mas valiosa

Nú

me

ro

200 nm

100 nm

100 nm

dímeros?

Intensidade de Espalhamento – Um parâmetro

adicional

Separando Populações de Tamanhos Similares?

Mistura de Poliestireno (92nm) e Nanopartícula de ouro (90nm)

Au NP

Poliestireno

Capacidades Adicionais

do NTA

FLUORESCÊNCIA

Modo de Fluorescência

Câmera

CCD

Objetiva do

Microscópio As partículas espalham o feixe de laser

e se ela é fluoresente irá fluorescer

Sem filtro de fluorescência, toda luz é transmitida

Com o filtro de fluorescência, a luz espalhada é

bloqueada

Opção com ou sem filtro de fluorescência:

› 4 opções de laser disponíveis

405nm

488nm

532nm

635nm

Aumenta

Sensibilidade

para Partículas

Menores

Modo de Fluorescência

› Permite a medição de partículas específicas

Esferas de 100nm em 100% FBS (Fetal Bovine Serum)

Modo de luz espalhada Modo de fluorescência

(565 nm long pass)

Modo de Fluorescência

Moda: 103 nm

Concentração: 9.5 x108 partículas/mL

• Marcadores fluorescentes são

fotodegradados em um curto período de

tempo.

• A Bomba de Seringa, introduz

continuamente amostras novas na

câmara, expulsando o marcador “gasto”.

• Software pode distinguir o movimento

do fluxo da bomba do Movimento

Browniano e ainda calcular o tamanho da

partícula.

Modo de Fluorescência – em fluxo

APLICAÇÕES NTA

1. Vesículas Extracelulares/ Exossomos

2. Carreamento de Fármacos

3. Virologia/ Vacinas

4. Agregação de Proteínas

5. Nanomateriais/ Nanotoxicologia

APLICAÇÕES: Fluorescência

› Carreamento de fármacos

– a nanopartícula agrega no sangue?

› Vírus

› Exossomos / Microvesículas

– Identificar populações

› Marcação de anticorpos

› Fluorescência inerente

– Quantum dots

APLICAÇÕES: Vesículas Extracelulares

› O quê são? – partículas em Nanoescala provenientes de células

de mamíferos.

Exossomos: 30-100 nm

Microvesículas ou Micropartículas: 100-1000 nm

› O que fazem? Estão envolvidos na sinalização celular.

A “mensagem na garrafa”

Aplicações: Vesículas Extracelulares

› O quê exatamente?

› Por exemplo, doenças como o câncer, pré-eclâmpsia,

etc.

› Mas, pode me explicar um pouco mais?

› Se você entende a mensagem e de onde ela veio e para

onde ela vai, então você talvez pode diagnosticar e

tratar mais efetivamente.

Vesículas Extracelulares

O que

foi?

Socorro! Preciso de

estrógeno. Vou

ovular!

› NTA “CONTA”– Pico da população de exossomos

pode estar relacionado ao aparecimento da doença

(i.e. Células que sinalizam outras de que algo está

errado)

Vesículas Extracelulares

› NTA mede FLUORESCÊNCIA – marcadores

exossomais alertam os pesquisadores de que a

partícula é um exossomo e não um agregado de

proteínas

› Marcadores também podem indicam a origem do

exossomo, por exemplo

Vesículas Extracelulares

› Alta Resolução de TAMANHO

› Subpopulações de exossomos e microvesículas

pode ter funções diferentes

› Todos esses parâmetros em APENAS UMA

MEDIÇÃO – tamanho, concentração e tipo

da população do exossomo

› Citômetros de Fluxo: medem partículas

vesiculares acima de 300 nm

Mistura de partículas fluorescentes

de 50 nm e de 200 nm não

fluorescentes analisadas no modo

de luz espalhada

A mesma mistura quando a luz

espalhada foi removida pelo filtro de

fluorescência

Detecção de Partículas Fluorescentes em

uma Mistura

VÍRUS – Desenvolvimento de Vacina +

Gene Delivery

Mistura complexa: Influenza:

Ensaios biológicos alternativos levam de 5-7 dias para

determinar a concentração viral

Agregação de Proteínas: Indução pelo

aquecimento 1 mg/mL de IgG – 50ºC

Agregação de Proteínas: Indução pelo

aquecimento

Instrumentos NTA Nanosight em todo o mundo

18

700+ equipamentos

1440+ publicações

Matrix de Complementaridade

Faixa de Tamanho

Amostras monodispersas

Fluorescência

Concentração

(partículas/mL)

Ver é crer!

DLS NTA Técnicas

Complementares

Informações de contato

› Apresentadora: Geisi Rojas Barreto

Email: geisi.barreto@malvern.com

› Moderador: Henrique Kajiyama

Email: henrique.kajiyama@malvern.com

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