V TALLER DE MICROBIOLOGIA CLINICA digestivas
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7/10/2016
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V TALLER DE MICROBIOLOGIA CLINICA
Servicio de Microbiología ClínicaValencia 12-13 de Julio de 2016
Organización
Infecciones urinarias
Infecciones digestivas
Enfermedades de trasmisión sexual
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos
Taller de Microbiología Clínica
Modulo 1.- Dr. J.M. Nogueira Organización del laboratorio. Peticiones y Toma
de muestras, Infecciones del tracto urinario. Infecciones de trasmisión sexual. Bases interpretativas de los estudios de sensibilidad
Modulo 2.- Dr. JJ Camarena. Infecciones del tracto respiratorio, Infecciones
sistémicas (sepsis). Infecciones del sistema nervioso central. Diagnostico micológico y Micobacterias
Taller de Microbiología Clínica
Modulo 3.- Dr. Ángel Ros Técnicas rápidas. Diagnostico serológico de
urgencia. Modulo 4.- Dr. Rosa Gonzalez Diagnostico serológico en Microbiología Clínica Modulo 5.- Dr. Juan Alberola Bases del diagnostico molecular en Microbiología
Clínica
Taller de Microbiología Clínica
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Servicio de Microbiología ClínicaPersonal facultativos
Dr. JJ Camarena MiñanaJefe de Sección Bacteriología
Hemocultivo, Micobacterias, Micología
Dra. Carmina Inigo FEA Bacteriología II
Dr. Ángel Ros Die FEA Bacteriología I
Dra. Rosa González Pellicer FEA Serología microbiana
Dra. Benedicta Casado Sánchez FEA Técnicas rápidas ,
Parasitología clínica
Dr. Juan Alberola Enguidanos FEAMicrobiología molecular
Servicio de Microbiología ClínicaHospital Dr. Peset
Registro Biología molecular
Serología infecciosa
Bacteriología I
Ascensores 1º IZQ
Hall
Bacteriología II
Micologia y Micobacterias
Toma de muestras
Hemocultivos
Técnicas Rápidas-Continuada, Parasitología
Diagnostico microbiológico en Urgencias
Diagnostico E. infecciosas
P: Paciente A: Antecedentes S: Síndrome E: Etiología O: Organización
Reglas generales
La mayoría de los tratamientos en Urgencias son empíricos.
En todos los casos Tomar la muestra antes del
tratamiento antibiótico. Garantizar la calidad de la
muestra ¿Contaminaciones? Remitir la muestra lo más
rápidamente posible. En muestras escasas: priorizar.
Importancia de la Historia Clínica
Streptococcus pyogenes es universalmente sensible a penicilina
Prevención complicaciones
Tratamiento quirúrgico
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Quorum SengingLenguaje secreto de la bacterias
Desarrollo comportamientos sociales coordinados poblaciones bacterias
(Autoinduccion)
Moléculas sensoras :acil-homoserina-lactonas (acil-HSL).
Trabajo en equipo de la bacterias
Comunicacion
Calidad total del diagnostico microbiológico
Paciente Obtención
transporte
Análisis
Informe
Diagnostico y tratamiento
IdentificaciónQCQC
Petic
ión
por
Orio
n-Cl
inic
Datos de identificación Datos de ubicación
Tipo de petición y fecha
Medico/firma
Estudio solicitado
Muestrafecha y hora de
obtención
Diagnostico Justificación de la peticion
Volante verde
Anotaciones del laboratorio
Importante3 copiasNºmuestra
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Toma de muestras
Transporte universal
Organización
Infecciones urinarias
Infecciones digestivas
Enfermedades de trasmisión sexual
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos
II Taller de Microbiología Clínica Indicaciones del urocultivo
• Sospecha de pielonefritis
• Sospecha de ITU en neonatos, lactantes y niños
• Sospecha de ITU en varones
• ITU recurrente en mujeres
• Sospecha de ITU complicada* en mujeres
• Sospecha de ITU en pacientes portadores de sonda permanente
• Sospecha de sepsis de origen urinario
• Como control de tratamiento en los casos anteriores
• Como cribaje en
• Primer trimestre del embarazo (16 semanas)
• Antes de practicar cirugía urológica
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Infecciones de tracto urinario
Muestra: Orina (¿tipo?) Importancia de la toma de
muestras: ¿Interpretación? Preparación del paciente Orina en pacientes sondados Tiempo ultima micción Evitar contaminaciones No se aceptan muestras de
bolsas colectoras
Técnicas rápidas Tinción de Gram
Se informa PMN, Flora, células epiteliales
Orienta el tratamiento empírico. (CGP)
Emplear en casos urgentes y graves
¡ Ojo con la tiras reactivas!Sensibilidad y especificidad
1000 UFC/ml20’20’
2000 UFC/ml
120’120’128.000 UFC/ml
Bacteriuria significativa
¿Contaminación o Infección?
Urinocultivo cuantitativo
Obtener la orina y tapar inmediatamente el bote después de recogida.
Despegar la pegatina amarilla e insertar el tubo de transporte de Urinocultivo
Invertir el tubo para cultivo varias veces para mezclar la orina con el conservante que está en el fondo del tubo
Tubo con conservante para urinocultivo
Dar la instrucciones para una adecuada obtención de la muestraImportante no despegar la etiqueta amarilla
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RECOGIDA DE MUESTRAS DE ORINA PARA URINOCULTIVO
Frasco para suministrar al paciente
Servicio de Microbiologia Clínica
No demorar la siembra mas de 2 h.
Si no es posible conservar a 4ºC o con sistema de transporte de muestras de orina
Método del Urinocultivo
Cultivo de la parte central de
la micción
Cultivo de la parte central de
la micción
Orina
Estudios de sensibilidadEstudios de sensibilidad
AM
P
GM
Va
CM
IdentificaciónAsa 1 l = 1000 ufc/ml
Asa 10 l= 100 ufc/ml
Tincion de GramTincion de Gram
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Medios cromogenicos
Características• Medio cromogenico que permite
la cuantificación e identificación presuntiva de los principales agentes etiológicos de la ITU
Identificación• E.coli:-glucoronidasa+ e indol+• Proteus: TDA+• Enterococcus: -glucosidasa+
Características• Medio cromogenico que permite
la cuantificación e identificación presuntiva de los principales agentes etiológicos de la ITU
Identificación• E.coli:-glucoronidasa+ e indol+• Proteus: TDA+• Enterococcus: -glucosidasa+
Posibilidad de antibiograma directo rápido
RecuentoUFC/ml
ClínicaMuestra
Presencia de microbios
Resultado
0 Ninguno Negativo
102Mujer sintomáticaPunción suprapubica
Cultivo puro BGN
Cualquier nº y especieIdentificaciónInforme
103Varón sintomáticoCatéter vesical
1 patógenocultivo puro
IdentificaciónInforme
104Catéter vesical 2 patógenos probables
3 o mas
IdentificaciónInformeNo identificaciónContaminación
105Orina normal 1 patógeno
2 patógenos en sintomáticoMas 2 especies
IdentificaciónInformeNo identificaciónContaminación
Interpretación del urinocultivo
Nota importante : Importante señalar el el volante y en la historia si el paciente esta sondado
Resistencias de patógenos urinarios Escherichia coli
Antimicrobianos % RFosfomicina 3,2Ciprofloxacino 32,0Cefuroxima 5,2Amoxicilina-Clavulanico 7,7Ampicilina 60,6Clotrimoxazol 27,6Nitrofurantoina 1,6
• Enterococcus faecalis: Sensible ampicilina
• Emergencia de BLEA (ESBL) en E. coli y K. pneumoniae
Año 2012 N= 3027Organización
Infecciones urinarias
Infecciones digestivas
Enfermedades de trasmisión sexual
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos
II Taller de Microbiología Clínica
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Diarrea infecciosas
Diarrea no inflamatoria Diarrea inflamatoriaStaphylococcus aureusBacillus cereusClostridium perfringensE. coli enterotoxigenicoVibrio cholerae
Salmonella ssp. No typhiCampylobacterShigella, VibrioYersiniaClostridium difficile
Rotavirus, Norovirus, Astrovirus
Adenovirus entericos 40,41
Cryptosporidium . Giardia Entamoeba histolytica
Evitar el uso de torundas con medio de transporte para la detección de antígenos. (Torunda de Cary-Blair)
Coprocultivo
Celula epitelial
Lamina propia
Linfatico
Histiocito
Vibrio cholerae E.coli ET
Shigella
E.coli EI
Salmonella
Yersinia
Salmonella typhi
Rotavirus
Vibrio parahemolyticus
Visión directa
¿Qué informamos?‐ Leucocitos
diarrea inflamatoria: ¿Tto?diarrea no inflamatoria
‐ Otros: hematíes, parásitos...
¡¡¡Orienta el tratamiento!!!
Detección de antígenosDetección de
Rotavirus‐Adenovirus‐Norovirus Astrovirus
Heces recién emitidas Bote de boca ancha Solo en niños
Parásitos en heces No urgente Visión directa Detección de Giardia 3 muestras en días alternos
para concentración.
Diarrea crónica: Técnica de detección de antígenos de
Giardia y/o Cryptosporidium.
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Detección de antígeno y toxina de C difficile
¿Qué? ¿Dónde? ‐ Heces recién emitidas‐ Bote de boca ancha
Informamos‐ Presencia de antígeno +/‐ toxina
¿A quién?‐ Antecedentes de toma de antibióticos- Ancianos, hospitalizados
GDH Positivo y Toxina Positivo indica:1. CDAD – Tanto A+/B‐ o A‐/B+ o A+/B+2. CDAD – Cepa virulenta NAP1/027
GDH Positivo y Toxina Negativo puede indicar: 1. Cepa No‐toxigénica (otra razón para la diarrea)2. CDAD ‐ C. difficile Toxigénico con niveles de
toxina indetectables 3. CDAD – Las toxinas pueden haberse
degradado (GDH menos lábil que las toxinas)
Organización
Infecciones urinarias
Infecciones digestivas
Enfermedades de trasmisión sexual
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos
II Taller de Microbiología Clínica Infecciones urogenitalesMuestras del tracto
genital femenino Cultivo de exudados vaginales
Mejores para Candida, Trichomonas y vaginosis
Cultivo de exudados endocervicales Mejores para Gonococo, Chlamydia,
Mycoplasma hominis o Ureaplasmaurealyticum
Visión directa: Leucocitos, levaduras, Trichomonas, hematíes.
1 torunda con medio: visión directa (Medio universal E‐swab)
Medio de Stuart: Solo cultivo Gram: Se informa Leucocitos ,
Flora microbiana (No permite el diagnostico de la gonococia en la mujer.
Muestras del tracto genital masculino
¿Qué muestra? Exudados uretrales, anales,
faríngeos, Orina (1ª porcion)
¿Cómo? Introducir torunda fina 3‐5
cm en el interior de la uretra y rotar
Recoger muestra tras 2‐3 hora sin micción
Gram: Se informa Leucocitos , Flora. La presencia de DCG negativos intracelulares elevada sospecha de gonococia
E‐swab‐Uretral
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Sensibilidad diagnostica de la Tinción de Gram en la infección genital por N. gonorrhoeae
DiagnosticoHombre (uretral) Mujer (Cervical)
Nº casos % Nº casos %
Certeza 165 95,4 9 25,0
Sospecha 4 2,3 11 30,6
Negativo 4 2,3 16 44,4
PCR-TR Test Dx CT/NG/MG
Muestras:•Exudado cervical•Exudado vaginal•Orina•Exudados rectales
Organismo Sensibilidad Especificidad
C. trachomatis 98.3% 99.6 %
N.gonorrhoeae 100 % 99.8%
M. genitalium 450 genoma –eq./ml
Limites relativos de detección de C. trachomatis (nº organismos por muestra)
1 102101 103 104 105 106
PCR
Cultivo
DFA
EIA
Sondas DNA
Diagnostico de la ITSITS: E-Swabs
Gram y/o cultivo• N. gonorrhoeae• U. urealyticum• M. hominis• T. vaginalis
Secreción uretral y/o vaginal
RT-PCR (Seegene ST7)1. Chlamidia trachomatis2. Neisseria gonorrhoeae3. Mycoplasma genitalium4. Micoplasma hominis5. Ureaplasma urealyticum6. Ureaplasma parvum7. Trichomonas vaginalis
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Tratamiento de la gonococia
Resistencia de N.gonorrhoeae a Ciprofloxacino
Tratamiento de la gonococia
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Dr. JM Nogueira
Antibioticos Total INTERMEDIO %I RESISTENTE %R
Ciprofloxacina 78 0.0% 53 67.9%
Azitromicina 75 2 2.7% 3 4.0%
Cefixima 71 0.0% 0.0%
Cefotaxima 16 0.0% 0.0%Ceftazidima 69 0.0% 0.0%
Cefuroxima 16 0.0% 0.0%
Tetraciclina 34 0.0% 3 8.8%
Doxiciclina 57 2 3.5% 4 7.0%
Levofloxacina 76 0.0% 50 65.8%
Penicilina 79 56 70.9% 11 13.9%
Rifampicina 16 0.0% 0.0%
Ceftriaxona 74 0.0% 0.0%
Resistencia de N. gonorrhoeae 2014 Hospital Universitario Dr. Peset (Valencia)
Organización
Infecciones urinarias
Infecciones digestivas
Enfermedades de trasmisión sexual
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos
II Taller de Microbiología Clínica
Antimicrobiano Microorganismo resistente
Vancomicina Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus, Erysipelothrix
Cefalosporinas Anaerobios*, Enterococcus spp., Listeria monocytogenes
Clindamicina, vancomicina, teicoplanina y Daptomicina Bacterias gramnegativas
Clindamicina, cotrimoxazol Enterococcus spp.
Aztreonam, colistina Bacterias grampositivas
Fluoroquinolonas, cotrimoxazol Streptococcus pyogenes
Nitrofurantoína Proteus spp., Morganella spp., Providencia spp., Acinetobacter spp.
Quinupristina‐dalfopristina Enterococcus faecalis
Microorganismos intrínsecamente resistentes a ciertos antibióticos
Mutante resistente
Presión selectiva
Cepa sensible
Resistencia adquirida
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¿Que antibiótico es mas eficaz frente a la bacterias estudiada?
Colonias bacterianas
Disco de antibiotico
Zona de no crecimiento
Test de Kirby‐Bauer Métodos Agar con concentración (breakpoint)
Agar con 6µg/ml de Oxacilina o 4 µg/ml Cefoxitina + ClNa Medios cromogénicos
Crecimiento= R
No crecimiento =S
MRSA
Sensibilidad in vitroAntibiograma
Método de Difusión en agar(Kirby-Bauer)
Método E-testEpsilograma
0,05 €-Test 3 €-Test
128
32
8
2
0.5
0.06
6 10 20 30 40Diametro halo(mm)
MIC (µg/ml)
Ampicilina 10 µg
Lorian, p37
Relacion CMI y diametro halo inhibicion
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Concentración mínima inhibitoria (CMI) y Concentración mínima bactericida (CMB)
Pruebas de identificación y sensibilidad rápidas
Ejemplo Informes de antibiograma
CMI
Determinación del valor critico (breakpoint) para una población bimodal
susceptible
resistente
CMIN
º de
cepa
s in
hibi
das
Valor critico
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Susceptible 1g/mlIntermedio 2 g/ml
Resistente 4 g/ml
Cambios en los Puntos de CorteEnterobacterias
ATBCLSI M100‐S19 (2009) CLSI M100‐S22 (2012)
Susc Int Res Susc Int ResCefazolin ≤8 16 ≥32 ≤1 2 ≥4Cefotaxime ≤8 16‐32 ≥64 ≤1 2 ≥4Ceftizoxime ≤8 16‐32 ≥64 ≤1 2 ≥4Ceftriaxone ≤8 16‐32 ≥64 ≤1* 2 ≥4Ceftazidime ≤8 16 ≥32 ≤4** 8 ≥16Aztreonam ≤8 16 ≥32 ≤4 8 ≥16
* Interpretación basada en 1 g cada 24 h
** Interpretación basada en 1 g cada 8 hNo realizar Test confirmatorio de BLEESNo cambiar interpretación
Test confirmatorio de BLEES/Cambiar interpretación
Sensibilidad in vitro (Antibiograma)Sistemas automáticos
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Resistencia a β-lactamicos Escherichia coli (ESBL)
Antibiótico Halo (mm) Int CMI
(μg/ml) Int
Ampicilina 6 R >128 R
Amoxi-Clavulanico 20 S 8/4 S
Carbenicilina 6 R >128 R
Ticarcilina 6 R >128 R
Piperacilina 16 R >128 R
Piperacilina-Tazobactan 28 S 1/4 S
Cefazolina 6 R >128 R
Cefuroxima 6 R >128 R
Antibiótico Halo (mm) Int CMI
(μg/ml) Int
Cefoxitina 27 S 4 S
Ceftazidima 30 S->R 0,12 S->R*
Cefotaxima 16 I->R 32 I->R*
Cefepime 23 S->R 8 S->R*
Aztreonam 26 S->R 4 S->R*
Imipenem >30 S 0,12 S
Meropenen >30 S 0,03 S
Ertapenem >30 S 0,01 S
Inferencia según criterios CLSI (producción de ESBL)
Pruebas de sensibilidad
2561921289664483224161286432
1.51.0.75.05
EAK
Tira con gradiente de antibiótico
Detección de ESBL
Resistencia inducible
Cepas productoras de β-lactamasasβ‐lactamasas Familias Actividadβ‐lactamasas plasmidicas de espectro amplio (BLEA)
TEM‐1 TEM‐2 SHV‐1, OXA Inactivan Penicilinas, Aminopenicilinas y CIG.Permanecen estables: Cefamicinas, CIIIG, aztreonan, Carbapenems
β‐lactamasas de espectro expandido BLEE( ESBL)
CTX‐M: Inhibición por acido clavulanicoIRT: No Inhibición por acido clavulanico
Inactivan AminopenicilinasCarboxipenicilinasUreidopenicilinasCIG , CIIG, CIIIG, Aztreonan,Carbapenems mantienen su actividad
Tipo AmpC Son induciblesEl espectro depende de la hiperproduccion de enzimas
Inactivan penicilinas Cefalosp. CefamicinasNo inhibidas por Clavulanico, Sulbactan o tazobactan
Carbapenemasas KPC, GES: Inhibición por ac. ClavulanicoMetalo‐β‐lactamasas: No Inhibición por ac. clavulanico
Inactivan todos los β‐ lactamicos incluyendo carbapenems
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Día 4Día 3Día 2Día 1
Diagnostico rápido en microbiologíaAntes y con SeptiFast
Gram EspecieHemocultivo Resistencia
Especie
6 h
SeptiFast
Cultivo
PCR
Nota: La PCR no trata de remplazar al cultivo
opcional: mecA Resistancia (+2.5h)
Técnicas rápidas
1. Conocimiento2. Comunicación3. Coordinación
Utilización racional de los recursos“ El tiempo es oro”
La técnica no es el fin , es el medio
Importante la Historia Clínica¿Qué es normal?
Un gallego de unos 45 años va al médico en Madrid para un chequeo general, y ésta es la conversación MÉDICO: ¿Cómo está comiendo? GALLEGO: Normal MÉDICO: ¿Qué es para usted normal? GALLEGO: 3 veces al día, comida balanceada y sin muchas grasas. MÉDICO: Muy bien ¿Y de ejercicio? GALLEGO: Normal MÉDICO: ¿Qué es para usted normal? GALLEGO: 2 ó 3 veces por semana MÉDICO: Muy bien ¿Y de sexo? GALLEGO: Normal MÉDICO: ¿Qué es para usted normal? GALLEGO: 1 ó 2 veces al mes MÉDICO: ¿Está loco? Eso no es nada.. Normal a su edad sería 1 o 2 veces por semana.
GALLEGO: Eso para usted que es médico en Madrid, pero para mi que soy cura en Galicia..........
Exámenes microscópicos directos• Tinción de Gram• Tinciones fluorescentes
Cultivos• Cultivos específicos
Detección de productos microbianos• Detección de antígenos
• Detección de AANN (ADN/ARN)
Respuesta inmune (Serología microbiana)
CrecimientoViable¿Vivo/muerto?
¿Vivo/muerto? ¿Vivo/muerto?
Proceso de diagnostico etiológico
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Bases del diagnostico microbiológico
Mejor la película que un fotograma
La microbiología es una ciencia interpretativa (???????)
¡ Los tiempos son importantes!
Información y teléfonos de contacto
Página WEB- Manual de toma de muestras
E-mail:[email protected] Teléfonos de consulta 961622315 961622432
Teléfono atención continuada: 42778