Utilização de enzimas citocromo P- 450 de tilápias (Oreochromis niloticus niloticus) como biomarcadores

no monitoramento da qualidade da água do Rio Guandu

Mayra Mansur Reimann

Rio de Janeiro Julho de 2012

MAYRA MANSUR REIMANN Aluna do curso de Ciências Biológicas – Produção Químico-Biológica

Matrícula: 0823800175

UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS CITOCROMO P- 450 DE TILÁPIAS (OREOCHROMIS NILOTICUS NILOTICUS) COMO

BIOMARCADORES NO MONITORAMENTO DA QUALIDADE DA ÁGUA DO RIO GUANDU

Rio de Janeiro 2012

Trabalho de conclusão de curso,

TCC, apresentado ao curso de

graduação em Ciências Biológicas,

da UEZO como parte dos pré-

requisitos para obtenção do grau de

Bacharel em Ciências Biológicas,

sob a orientação do professor Dr.

João Bosco de Salles e Co-

orientação do Professor Adriano

Arnóbio José da Silva e Silva.

ii

UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS CITOCROMO P- 450 DE TILÁPIAS (OREOCHROMIS NILOTICUS NILOTICUS) COMO

BIOMARCADORES NO MONITORAMENTO DA QUALIDADE DA ÁGUA DO RIO GUANDU

Elaborado por Mayra Mansur Reimann Aluna do Curso de Ciências Biológicas da UEZO

Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau: _10_

Rio de Janeiro, 12 de julho de 2012

______________________________________________ Jayme da Cunha Bastos Neto, Dr. em Ciências (Bioquímica)

______________________________________________ Cristiane Martins Cardoso de Salles,

Dra em Ciências (Biologia/Biociências Nucleares)

______________________________________________ João Bosco de Salles, Dr. em Ciências (Biologia/Biociências Nucleares)

(Orientador/Presidente da Banca) ______________________________________________

Adriano Arnóbio José da Silva e Silva MSc em Ciências Médicas (Co orientador)

Rio de Janeiro, RJ - Brasil

Julho de 2012

iii

Dedico este trabalho a meus pais, que estiveram sempre presentes e fizeram o impossível pela minha formação, com muito amor e carinho.

iv

Agradecimentos

A Deus em primeiro lugar, pois sem ele nada seria possível.

A minha família que amo e sempre me apoiou e me deu forças para

seguir em frente.

Ao meu Professor orientador Dr. João Bosco por ter me dado a

oportunidade de realizar este trabalho e por ser sempre paciente e

dedicado.

Ao meu co-orientador professor Adriano Arnóbio, pelo carinho e

paciência ao me ensinar análise estatística.

As minhas amigas Amanda e Raquel que vou amar para sempre, por

me ajudarem a passar por todos os momentos da graduação tornando-os

mais amenos e divertidos.

As minhas amigas e colegas de laboratório, Cristiane, e Nataly que

me presentearam com sua amizade e paciência, me ajudando sempre,

sendo indispensáveis para conclusão deste trabalho.

A todos os meus colegas de turma e professores que, mesmo

passando por alguns atritos fizeram parte de um momento muito

importante em minha vida e contribuíram para meu melhor entendimento

do conteúdo.

v

Resumo

O rio Guandu é responsável pelo fornecimento de água potável para

mais de 10 milhões de pessoas da região metropolitana do Rio de Janeiro.

Entretanto, diversos estudos têm demonstrado que esse rio apresenta

elevados níveis de contaminação por substâncias que podem causar

mutações e câncer. Portanto, são necessárias providências para melhorar

a qualidade da água dessa bacia hidrográfica. O objetivo deste estudo foi

avaliar o potencial do uso de enzimas do Citocromo P-450 (etoxicumarina

O-desetilase – ECOD e etoxiresorufina O-desetilase - EROD) hepáticas de

tilápias (Oreochromis niloticus niloticus) como biomarcadores no

monitoramento da qualidade da água do rio Guandu. As atividades das

enzimas foram determinadas por fluorimetria em microssoma e frações

pós-mitocondriais de tilápias capturadas no rio Guandu e em dois sítios

controles. Nossos resultados apontaram que a ECOD não é um bom

biomarcador de poluição, já que não apresentou diferença significativa em

sua atividade entre as tilápias do rio Guandu e de sítios controles. Por

outro lado, a EROD apresentou atividade 700% maior nas tilápias do rio

Guandu do que naquelas dos sítios controles, indicando ser favorável sua

utilização no monitoramento de mananciais hídricos de água doce. Este

estudo confirmou ainda a poluição do rio Guandu por indutores de CYP1A.

Finalmente, demonstramos que a utilização de fração pós-mitocondrial é

mais viável do que microssoma no ensaio da atividade de EROD no

monitoramento, por ser esta de mais simples preparo e apresentar

resultados mais homogênios dentre os animais de mesmo sítio.

Palavras–chave: Rio Guandu, poluição, tilápias, monitoramento, citocromo

P-450.

vi

Abstract

Guandu River is responsible for providing drinking water for more than 10

million people in the metropolitan region of Rio de Janeiro. However,

several studies have shown that this river has high levels of substances

that can cause cell damage, like mutations and cancer. For those reasons,

analysis of chemicals concentrations must be done to monitored water

quality in this watershed. The aim of this study was to evaluate the

potential use of hepatic cytochrome P-450 enzymes (ethoxycoumarin O-

deethylase - ECOD and ethoxyresorufin O-deethylase - EROD) of an

introduced fish species, tilapia (Oreochromis niloticus niloticus). Enzyme

activities were determined by fluorescence method in microsomal and post-

mitochondrial fractions of tilapias caught in Guandu River and compared to

two control sites. Our results indicated that ECOD activity is not a good

pollution biomarker, since no significant difference was detected between

tilapias of Guandu river or control sites. On the other hand, EROD activity

showed 700% higher in tilapias of Guandu River when compared to those

of control sites. These results indicated that EROD activity can be used as

contamination biomarker of fresh water sources. With this study, it is

becoming clear that the mechanism of CYP1A induction is closely related to

Guandu river pollution. Finally, we could demonstrate that post-

mitochondrial fraction is more feasible than microsomal fraction to assay

EROD activity.

Key-words: Guandu River, pollution, tilapia, monitoring, cytochrome P-450.

vii

“Mais pessoas morrem hoje por causa da água

poluída e contaminada do que por todas as formas de

violência, inclusive as guerras"

(UNEP)

viii

SUMÁRIO

Página

Resumo ........................................................................................................ v

Abstract ....................................................................................................... vi

1 - Introdução ............................................................................................... 1

1.1 – O Rio Guandu ................................................................................... 2

1.2 – Avaliações de risco ecológico ........................................................... 3

1.3 – Biomarcadores .................................................................................. 3

1.4 – Enzimas ............................................................................................. 4

1.5 – Tilápias (Oreochromis niloticus niloticus) .......................................... 6

1.6 – Justificativa ........................................................................................ 7

2 – Objetivos ............................................................................................. 8

2.1 – Geral ............................................................................................... 8

2.2 – Específico ....................................................................................... 8

3 – Métodos ............................................................................................ 9

3.1 – Animais ............................................................................................. 9

3.2 – Preparo de frações pós-mitocondriais e microssomais..................... 9

3.3 – Determinação das concentrações protéicas................................... 10

3.4 – Determinação da atividade da 7-etoxicumarina O-desetilase (ECOD)

..................................................................................................................... 10

3.5 - Efeito da quantidade de proteínas sobre a atividade de

ECOD ........................................................................................... 11

3.6 – Curva padrão de umbeliferona .......................................... 11

3.7 - Determinação da atividade da 7-etoxiresorufina O-desetilase

(EROD) .......................................................................................... 11

3.8 – Curva padrão de resorufina ............................................... 12

3.9 – Estatística empregada .......................................................12

4 – Resultados ............................................................................. 13

5 – Discussão .............................................................................. 20

6 – Conclusões ............................................................................ 23

7 – Referências Bibliográficas .................................................... 24

1 – INTRODUÇÃO:

A poluição ambiental aquática acontece desde o início da história da

civilização humana, entretanto não teve a devida atenção até que fosse

atingido um limite onde foi possível notar as conseqüências dessa poluição

nesse ecossistema e nos organismos que o habitam. Fazendo surgir assim

um interesse global em relação a essas questões de poluição aquática,

apesar de ainda haver países que despejam enormes quantidades de

poluição com tendência a aumentar (Shahidul Islam & Tanaka, 2004).

As atividades industriais, agrícolas e domésticas são responsáveis por

utilizar mais de um terço da água doce acessível, além de serem também

as principais responsáveis por sua poluição, com compostos sintéticos.

Essas águas poluídas atingem rios, lagos, nascentes e oceanos com uma

infinidade de compostos químicos (Fent, 2004).

Para o estabelecimento de uma condição homeostática destes

ambientes é extremamente necessária a realização de monitoramento

dessas áreas, possibilitando assim a realização de ações corretivas

(Monserrat et al., 2007). Porém o monitoramento e a avaliação de risco

ambiental não podem ser somente baseados em análises químicas de

amostras ambientais, já que essas análises não são apropriadas para

indicação e predição de efeitos deletérios causados por contaminantes na

biota (Barsiene et al., 2006, Cajaraville et al., 2000). Assim para avaliar os

impactos que os poluentes causam na qualidade ambiental é necessário

que sejam identificados os efeitos que essas substâncias causam nos

seres vivos deste ecossistema (Wells et al., 2001).

Deste modo, faz-se necessário o emprego de um grupo de respostas

biológicas apropriadas, conhecidas como biomarcadores, para determinar

o grau de impacto no bem estar da biota, além de identificar os estressores

ou poluentes responsáveis por esse efeito (Fuentes-Rios et al., 2005).

2

1.1 - O Rio Guandu

O aumento da procura por água potável vem desencadeando muitas

discussões envolvendo o desenvolvimento ambiental sustentável de países

em ascensão, fazendo-se necessário e de suma importância o

planejamento do crescimento urbano juntamente com o manejo da água

(WHO, 2005).

O rio Guandu é responsável pelo fornecimento de 80% da água

potável consumida pela região metropolitana do Rio de Janeiro, suprindo

cerca de 10 milhões de habitantes. Cerca de 60% da água deste rio é

adquirida a partir da transposição do rio Paraíba do Sul. Esta transposição

foi projetada para produção de energia elétrica, mas hoje é de vital

importância para o suprimento de água da região metropolitana do Rio de

Janeiro. A água transposta do rio Paraíba do Sul pretende diluir um pouco

da poluição que o rio Guandu recebe de seus efluentes originados de

municípios como Paracambi, Queimados, Nova Iguaçu, Japeri, Seropédica,

que, além de esgoto doméstico, também inclui esgoto industrial (Massena,

2007).

A construção de barragens e reservatórios para a transposição do rio

Paraíba do Sul para o rio Guandu, aumentou a vazão do rio Guandu de

20m³ s-1 para aproximadamente 160m³ s-1, o que possibilitou a

disponibilização dessa água para o abastecimento público (DNAEE, 2001).

Porém, devido ao crescimento demográfico, ao forte e diverso

desenvolvimento industrial e também às atividades agrícolas na região do

rio Guandu, esse manancial tornou-se excessivamente vulnerável

(Massena, 2007). Diversos estudos vêm demonstrando que o rio Guandu

apresenta elevados níveis de contaminação por dibenzo-p-dioxinas

policloradas (PCDD), bifenilas policloradas (PCB) e hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos (HPA), substâncias que podem provocar mutações

e câncer (Parente et al., 2008), e que são originadas principalmente do

excesso no uso de pesticidas, que acaba chegando ao rio e contribuindo

para sua poluição.

3

Desde os anos 80 a utilização de determinados pesticidas tem sido

severamente proibida no Brasil, porém é possível que existam em

fazendas, estoques dessas substâncias que acabam vendidas ilegalmente

(Torres, 2002).

1.2 - Avaliações de risco ecológico

A definição de avaliação de risco ecológico é tida como a

probabilidade condicional da ocorrência de um determinado evento

ecológico específico, que deve ser relacionado com a explicação de suas

conseqüências ecológicas, como por exemplo, a redução da

biodiversidade, perda de recursos comerciais importantes ou instabilidade

do ecossistema (Tallini et al., 2012).

A poluição de mares e rios decorrentes da adição direta e/ou indireta

de contaminantes químicos representa hoje uma das maiores

preocupações da população mundial, já que resulta em perda na

biodiversidade dos ambientes afetados, impactando assim todos os

recursos explorados pela economia, ou processos biogeoquímicos

importantes (Veiga, 2010).

Na realização da avaliação do efeito nocivo de um determinado

contaminante despejado no ambiente, se estiver abaixo dos níveis

permitidos pela legislação, são utilizados testes de toxicidade. Estes,

porém caracterizam-se pela impossibilidade de confiança em seus dados,

tornando o uso dos biomarcadores mais efetivos na avaliação de risco

ecológico (Jesus & Carvalho, 2008).

1.3 - Biomarcadores

Os biomarcadores são excelentes ferramentas de avaliação do efeito

de substâncias poluentes em ambientes aquáticos, que através da

aplicação e desenvolvimento de técnicas de exposição e/ou efeito, torna

4

possível o esclarecimento da relação causa-efeito e dose-efeito, na

avaliação de risco à saúde (Jesus & Carvalho, 2008).

As respostas biológicas aos poluentes servem como indicadoras de

danos aos peixes, e podem ser utilizadas como biomarcadores, esses

biomarcadores são parâmetros biológicos que se alteram em resposta a

xenobióticos e outros estressores fisiológicos e ambientais, indicando tanto

a exposição de seres a poluentes, como os efeitos de compostos tóxicos

(Chambers et. al., 2002).

Na utilização de enzimas como biomarcadores de exposição e efeito

são necessários conhecimentos sobre as substâncias tóxicas propriamente

ditas, as enzimas das espécies estudadas e fatores intrínsecos /

extrínsecos, como por exemplo, a estação do ano na época da coleta, pois

todos esses parâmetros podem influenciar a atividade enzimática

(Domingues et al., 2010).

Os biomarcadores têm sido muito utilizados como ferramentas no

monitoramento ambiental, avaliando respostas dos organismos a

contaminantes presentes no ambiente (Durieux et al., 2011). O uso de

enzimas de biotransformação envolvidas na desintoxicação celular e

excreção de poluentes como biomarcadores de exposição a xenobióticos

tem sido de grande interesse (Pennec, 2003).

1.4 - Enzimas

Para o desenvolvimento deste trabalho foram escolhidas atividades de

enzimas da Fase I de Biotransformação: Sistema Citocromo P-450

(Etoxiresorufina O-Desetilase “EROD” / Etoxicumarina O-Desetilase

“ECOD”).

O sistema monoxigenase de função mista (MFO) desempenha um

papel central no metabolismo oxidativo e na eliminação de substâncias de

ocorrência natural e xenobióticos (Bonacci et al., 2007). O citocromo p-450

é uma família de enzimas que faz parte deste sistema e que apresenta

5

muitas isoformas, com diferentes funções no metabolismo de compostos

endógenos e xenobióticos (Goksøyr & Förlin, 1992).

Citocromo P-450 1A subfamília (CYP1A) são enzimas expressas

principalmente no fígado e em outros tecidos e fazem parte da ativação

metabólica de uma grande variedade de genotóxicos e agentes

cancerígenos. Os mamíferos expressam duas isoformas do citocromo P-

450, CYP1A1 / 1A2, assim como as aves que também expressam duas

isoformas 1A4 / 1A5, já as espécies de peixes, com exceção das enguias e

salmões, parecem expressar apenas uma enzima CYP1A (Goldstone &

Stegeman, 2006).

A classe das isoenzimas pertencentes ao citocromo P-450, a

subfamília CYP1A presente nos peixes, é responsável pela

biotransformação de uma grande quantidade de xenobióticos. A atividade

de CYP1A tem sido utilizada como biomarcador de contaminação

ambiental em peixes pelo fato destas enzimas serem induzidas por

compostos como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (Jung et al.,

2001) e bifenilas policloradas (Rice & Roszell, 1998). A função catalítica e

a regulação do CYP1A podem definir a suscetibilidade de diferentes

células, órgãos, indivíduos e espécies de animais a compostos estranhos,

particularmente àqueles compostos cuja toxicidade depende de

biotransformação.

Muitas subfamílias do citocromo P-450 são conhecidas por possuírem

um metabolismo oxidativo ativado por diferentes substratos, dentre elas

estão às enzimas do CYP1A, em especial a etoxiresorufina O-desetilase

(EROD) e a etoxicumarina O-desetilase (ECOD). Estas isoformas

desempenham um importante papel na biotransformação de compostos

orgânicos, incluindo hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs),

bifenilas policloradas (PCBs) e dioxinas, que estão entre os compostos

mais perigosos liberados em habitats aquáticos (Safe & Phil, 1990).

A enzima EROD, presente tanto em vertebrados quanto em

invertebrados, transforma compostos lipofílicos em compostos mais

hidrofílicos, auxiliando sua excreção. Porém, muitos metabólitos formados

durante esse processo são extremamente reativos, podendo ser

6

genotóxicos e causar sérios danos ao DNA e, em casos extremos, podem

levar a carcinogênese. Após a contaminação do ambiente por xenobióticos,

os níveis de EROD se elevam, sendo esta a base para o uso desta enzima

como biomarcadora dos efeitos da contaminação de habitats aquáticos por

poluentes orgânicos (Cajaraville et al., 2000).

A utilização da enzima EROD como biomarcador é uma das mais bem

estudadas, além de ser considerada extremamente eficaz na detecção de

efeitos de compostos poluentes em peixes (Pacheco et al., 2005).

1.5 - Tilápia (Oreochromis niloticus niloticus)

Foi selecionada para realização deste projeto a espécie de tilápia

Oreochromis niloticus niloticus (figura 1), que é uma espécie originada das

bacias de rios africanos e foi trazida e inserida em vários pontos da

América do Sul.

A espécie é muito utilizada por pescadores e piscicultores, sendo

espalhadas assim, por todo território brasileiro (Graça, 2007). Alimenta-se,

preferencialmente, de larvas de insetos e detritos (Beyruth et al., 2004).

Esta espécie de tilápia, embora exótica, representa hoje o maior número

de peixes pescados na bacia do rio Guandu. Sendo assim, escolhemos

trabalhar com esta espécie, primeiramente por ser muito estudada, e

também por ser facilmente encontrada na bacia do rio Guandu. Finalmente,

entendemos que, por ser exótica, a captura de espécimes de tilápias no rio

Guandu não prejudica a biodiversidade deste ecossistema.

Figura 1 – Tilápia (Oreochromis niloticus niloticus); Família: Cichlidae; Subfamília: Pseudocrenilabrinae; Ordem: Perciformes. Fonte: Sindicato dos trabalhadores de Iguatu.

7

1.6 - Justificativa

A região hidrográfica do rio Guandu, responsável pelo fornecimento

de água para 80% da população metropolitana do Rio de Janeiro, tem

demonstrado grande crescimento industrial, e deverá receber cerca de R$

10 bilhões em investimentos privados após a construção do arco

metropolitano do Rio de Janeiro. Entretanto, muitos cuidados devem ser

tomados para evitar que esses investimentos acabem por acarretar mais

impactos a esta região que já se encontra muito degradada. Sendo assim,

é necessária a realização de monitoramentos e criação de parâmetros para

controlar e fiscalizar a qualidade da água desta importante bacia

hidrográfica.

8

2 – OBJETIVOS:

2.1 - Geral

Desenvolvimento de bioensaios que possam ser empregados na

avaliação da qualidade de corpos d'água através da utilização de enzimas

de fígado de Tilápias (Oreochromis niloticus niloticus) como biomarcadoras

de exposição e efeitos subletais de poluentes.

2.2 - Específico

Comparar atividades hepáticas de ECOD e EROD de tilápias

capturadas em água livre de contaminação ambiental (Represa de Ribeirão

das Lajes, RJ / piscicultura de Taubaté, SP) com aquelas capturadas nas

águas supostamente poluídas do rio Guandu.

9

3 – MÉTODOS:

3.1 - Animais

Os animais foram obtidos ainda vivos, junto a pescadores em três

locais diferentes: na represa de Ribeirão das Lajes, principal tributária

natural do rio Guandu, em uma piscicultura comercial em Taubaté-SP

(fazem parte do grupo controle), e no rio Guandu, próximo à estação de

tratamento de água da CEDAE (ETA – GUANDU).

Estes animais foram medidos e sacrificados por ruptura da coluna

vertebral. Os fígados foram coletados e armazenados em nitrogênio

líquido. As coletas foram realizadas no inverno e no verão.

3.2 - Preparo de frações pós-mitocondriais e microssomais

Para o preparo de frações pós-mitocondriais os fígados foram

descongelados, pesados e homogeneizados em homogeneizador Potter-

Elvejhem teflon/vidro, numa proporção de 1,0 g de fígado para 4,0 mL de

solução tampão gelada (fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0, contendo 0,25

M de sacarose). Os homogeneizados hepáticos foram subsequentemente

centrifugados a 9.000 x g por 30 min a 4 ºC. Alíquotas do sobrenadante

(fração pós-mitocondrial) foram congeladas em nitrogênio líquido até o

uso. O restante das frações pós-mitocondriais foram usadas para o

preparo de microssomas hepáticos. Estas frações foram centrifugadas em

ultracentrífuga Hitachi, a 100.000 x g por 60 min a 4 ºC. Os sedimentos

obtidos foram ressuspensos no mesmo tampão de homogeneização (1,0

mL de tampão/grama de tecido), re-homogeneizados manualmente em

Potter, e congelados em nitrogênio líquido.

10

3.3 - Determinação das concentrações protéicas

As concentrações de proteínas dos microssomas hepáticos e das

frações pós-mitocondriais foram determinadas conforme o método de

Peterson (1977).

3.4 - Determinação da atividade da 7-etoxicumarina-O-desetilase

(ECOD)

A atividade de 7-etoxicumarina-O-desetilase (ECOD) foi determinada

conforme descrito por Greenlee & Poland (1978), com pequenas

modificações. Foram adicionados em tubos eppendorfs, em banho de gelo,

o tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,8 (q.s.p. 500 µL), 5,0 µL de

cloreto de magnésio (MgCl2) 1,0 M em água (10 mM final), 5,0 µL de

etoxicumarina 100 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) da Merck (1,0 mM

final), e 400 µg de microssoma hepático. Após 1 minuto de pré-incubação a

37°C, a reação foi disparada pela adição 20 µL de NADPH 25 mM em água

(1,0 mM final), sendo paralisada 10 min depois pela adição 500 µL de uma

solução de ácido tricloroacético (TCA) 5% (2,5 % final). Após incubação,

os tubos foram centrifugados a 1000 rpm por 8 minutos a 5 °C, e 500 µL

sobrenadantes foram retirados e adicionados a tubos de vidro.

Imediatamente antes da leitura da fluorescência, foram adicionados aos

tubos 2,0 mL de tampão glicina/hidróxido de sódio (NaOH) 1,6 M pH 10,3

para alcalinizar o meio. A fluorescência foi avaliada com excitação a 390

nm e emissão a 440 nm. Os brancos da reação foram feitos basicamente

da mesma maneira que os ensaios, exceto pelo fato do microssoma ter

sido incluído apenas após o acréscimo do TCA.

11

3.5 - Efeito da quantidade de proteínas sobre a atividade de ECOD

Foi avaliado o efeito de diversas quantidades de proteínas

microssomais hepáticas de tilápias sobre a atividade de ECOD. Usamos

quantidade de proteínas entre 100 e 800 µg/mL.

3.6 - Curva padrão de umbeliferona

Inicialmente preparamos uma solução de umbeliferona em etanol

absoluto a 1,0 mM. Esta solução foi então diluída em etanol até chegar a

10 µM. Adicionamos em tubos eppendorfs o tampão fosfato de potássio 0,1

M em pH 7,8, a umbeliferona (50, 100, 200 e 400 pmol), o etanol nos

controle, e o 500 µL TCA 5%. No momento da leitura foram adicionados

2,0 mL de tampão glicina-NaOH 1,6 M, pH 10,3 em temperatura ambiente e

a leitura da fluorescência foi feita com excitação a 390 nm, emissão a 440

nm, e fendas de 1:1.

3.7 – Determinação da atividade da 7-etoxiresorufina-O-desetilase

(EROD)

A atividade da 7-etoxiresorufina-O-desetilase foi determinada

basicamente conforme descrito por Burke et al. (1985), com pequenas

modificações.

Em cubeta de quartzo, posicionada dentro do espectrofluorímetro

(com temperatura controlada a 37°C por um banho-maria com circulação

de água), foram pipetados o tampão fosfato de potássio 0,1M pH 7,8 (q.s.p.

2,0 mL), 10 µL de cloreto de magnésio (MgCl2)1,0 M em água destilada (5

mM final), 10 µL de 7-etoxiresorufina 1,0 mM em DMSO da Merck (5,0 µM

final) e microssoma hepático ou fração pós-mitocondrial. Após 3 min de

pré-incubação, a reação foi disparada com a adição de 20 µL de NADPH

25 mM em água (0,25 mM final). A velocidade da reação foi determinada

12

pelo aumento da fluorescência causada pelo acúmulo de resorufina. A

fluorescência foi lida continuamente por 90 segundos em um

espectrofluorímetro com excitação a 550 nm e emissão a 582 nm, com

fendas 1/1.

3.8 - Curva padrão de resorufina

Inicialmente preparamos uma solução de resorufina 0,1 mM em água

destilada. Esta solução foi então diluída em água até chegar a 1,0 µM e a

0,1 µM. Adicionamos em tubos eppendorfs o tampão fosfato de potássio

0,1 M pH 7,8 (q.s.p. 2,0 mL) e a resorufina (de 2,5 a 80 pmol), e

procedemos a leitura no espectrofluorímetro com excitação a 550 nm e

emissão a 582 nm, com fendas 1/1.

3.9 - Estatística empregada

Na realização dos testes estatísticos foi utilizado o Software livre

Bioestat 5.0. Primeiramente foi realizada a análise de variância através do

teste de Kruskal-Wallis, já que as amostras não são paramétricas, em

seguida foi realizado o teste de Mann-Whitney para amostras

independentes, já que o número de indivíduos é diferente. Para comparar

os grupos de fração microssomal e fração pós-mitocondrial foi realizada a

estatística descritiva para dados quantitativos.

13

4 – RESULTADOS:

A fim de analisarmos a atividade da enzima 7-etoxicumarina O-

desetilase (ECOD), fizemos inicialmente uma curva padrão de

umbeliferona (figura 2), o produto desta enzima quando usamos

etoxicumarina como substrato.

y = 1133.8x + 7637.5

R² = 1

0

100000

200000

300000

400000

500000

0 100 200 300 400 500

Flu

ore

scê

nci

a

picomols de umbeliferona

Figura 2 – Análise da variação da fluorescência versus a concentração de umbeliferona usada. Excitação a 390 nm e emissão a 440 nm, em temperatura ambiente.

A figura 3 apresenta a proporcionalidade da atividade da

etoxicumarina O-desetilase (ECOD) microssomal hepática de tilápia

determinada com diferentes quantidades de proteína, até a concentração

de 800 microgramas/mL. A partir deste experimento, passamos a usar 400

microgramas de proteína para a determinação da ECOD.

14

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 200 400 600 800

Inte

nsi

da

de

de

flu

ore

scê

nci

a

Microgramas de proteína microssomal hepática

Figura 3 – Efeito da variação da quantidade de proteína sobre a atividade da 7-etoxicumarina O-desetilase microssomal hepática de tilápia. A atividade da enzima foi determinada usando-se um pool de microssomas hepáticos de três tilápias da Represa de Ribeirão das Lajes.

Como apresentado na figura 4, as atividades de ECOD em fração

microssomal hepática de tilápias coletadas no rio Guandu (G1) e em

Ribeirão das Lajes (C1) não apresentaram diferenças significativas (p >

0,05).

Com intuito de analisarmos a atividade da enzima 7-etoxiresorufina O-

desetilase (EROD), fizemos uma curva padrão de resorufina (figura 5), o

produto desta enzima quando usamos como substrato a 7-etoxiresorufina.

Como observado, obtivemos uma curva com excelente linearidade até 80

pmols de resorufina.

15

Figura 4 - Atividade da Etoxicumarina O-desetilase (pmol de umbeliferona.min-1.mg-

1) em fração microssomal hepática de tilápias (Oreochromis niloticus niloticus). Coletadas em sítio controle (C1, Represa de Ribeirão das Lajes – 8 animais contendo entre 22 a 25 cm) e no rio Guandu, próximo à captação de água da ETA - Guandu (G1 – 9 animais contendo entre 16 e 19,5 cm), em agosto/setembro de 2011. O “boxplot” mostra a mediana (linha dentro da caixa), os quartis 75% e 25% (bordas superior e inferior da caixa) e os valores mínimo e máximo dos dados (extremidades da linha vertical). Os dados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e em seguida pelo teste U de Mann-Whitney.

y = 5526.3x + 3948.1

R² = 0.9992

0

100000

200000

300000

400000

500000

0 20 40 60 80

Flu

ore

scê

nci

a

Pmols de resorufina

Figura 5 – Análise da variação da fluorescência versus a concentração de resorufina usada. Excitação a 550 nm e emissão a 582 nm, a 37 ºC.

16

Na figura 6 estão comparadas as atividades da 7-etoxiresorufina O-

desetilase (EROD) microssomal hepática de tilápias de sítios controle (C1

– inverno e C2 – verão) com aquelas do rio Guandu (G1 – inverno e G2 –

verão). Como pode ser claramente observado, as tilápias do rio Guandu,

de ambas as coletas apresentam atividades bem maiores que aquelas dos

sítios controles.

A atividade específica média de EROD das tilápias do grupo C1, foi

6,99 ± 3,35 pmols de resorufina.min-1.mg-1, enquanto a atividade específica

média desta mesma enzima nos animais coletados no rio Guandu (G1) foi

51,13 ± 45,30 pmols de resorufina.min-1.mg-1. Portanto estas últimas

apresentaram atividade de EROD 700% maior que os do sítio controle 1.

Este resultado é comprovado ao dosarmos a atividade específica

média de EROD das tilápias do grupo C2, que foi 4,75 ± 1,82 pmols de

resorufina.min-1.mg-1, e a atividade específica média desta mesma enzima

nos animais coletados no rio Guandu (G1) foi 30,64 ± 21,95 pmols de

resorufina.min-1.mg-1. Portanto estas últimas também apresentaram

atividade de EROD 700% maior que os do sítio controle 2.

Ao realizar o teste estatístico encontramos p < 0,05, confirmando que

obtivemos uma diferença significativa entre as atividades de EROD

microssomal hepática das tilápias dos grupos controles e aquelas

coletadas no rio Guandu.

17

Figura 6 – Atividade da Etoxiresorufina O-desetilase (pmol de resorufina.min-1.mg-1) em fração microssomal hepática de tilápias (Oreochromis niloticus niloticus). Coletadas em sítio controle (C1, Represa de Ribeirão das Lajes / setembro de 2011 - 8 animais contendo entre 22 a 25 cm e C2, piscicultura comercial em Taubaté-SP / março de 2012 – 8 animais contendo entre 21 a 26 cm) e no rio Guandu, próximo à captação de água da ETA - Guandu (G1 – 9 animais contendo entre 16 e 19,5 cm coletados em agosto de 2011 e G2 – 7 animais contendo entre 16 a 25 cm coletados em março de 2012). O “boxplot” mostra a mediana (linha dentro da caixa), os quartis 75% e 25% (bordas superior e inferior da caixa) e os valores mínimo e máximo dos dados (extremidades da linha vertical). Os dados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e em seguida pelo teste U de Mann-Whitney. Foram excluídos dois resultados do grupo G1 (0,53 e 1,14 pmol de resorufina.min-1.mg-1) e um resultado do grupo G2 (1,36 pmol de resorufina.min-1.mg-1), pois apresentaram valores menores que qualquer controle, caracterizando outline (Biostatistical Analysis, 2007).

Visto que observamos grande variabilidade individual na atividade de

EROD em fração microssomal, mesmo no grupo controle, resolvemos

analisar esta atividade também em fração pós-mitocondrial (S9).

Como já era de se esperar, a atividade de EROD medida em fração

microssomal hepática de tilápia foi maior do que a mesma atividade

medida em fração pós-mitocondrial (FPM), sendo a primeira

aproximadamente duas vezes maior do que a segunda, como mostra a

figura 7.

Os resultados também mostraram que apesar da atividade de EROD

em FPM ser menor do que em fração microssomal hepática, existe uma

18

boa relação linear entre as duas frações, sugerindo, portanto que a

atividade de EROD em fração pós-mitocondrial hepática é um biomarcador

suficientemente sensível na avaliação da exposição de tilápia

(Oreochromis niloticus niloticus) a substâncias poluentes presentes no rio

Guandu, além de seu preparo ser muito mais simples de realizar.

Ao realizar o teste estatístico encontramos que p < 0,05, confirmando

que obtivemos uma diferença significativa entre o grupo controle e o grupo

de teste para fração pós-mitocondrial.

Figura 7 - Atividade da Etoxiresorufina O-desetilase (pmol resorufina.min-1.mg-1) em frações microssomais (C2 e G2) e pós-mitocondriais (C2P e G2P) hepáticas de tilápias (Oreochromis niloticus niloticus). Coletadas em sítio controle (C2 / C2P, piscicultura comercial em Taubaté-SP – 8 animais contendo entre 21 a 26 cm) e no rio Guandu, próximo à captação de água da ETA - Guandu (G2 / G2P – 7 animais contendo entre 16 a 25 cm), em março de 2012. O “boxplot” mostra a mediana (linha dentro da caixa), os quartis 75% e 25% (bordas superior e inferior da caixa) e os valores mínimo e máximo dos dados (extremidades da linha vertical). Os dados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e em seguida pelo teste U de Mann-Whitney. Foi excluído um resultado do grupo G2 (1,36 pmol de resorufina.min-1.mg-1) e um resultado do grupo G2P (0,61 pmol de resorufina.min-1.mg-1), pois apresentaram valores menores que qualquer controle, caracterizando outline (Biostatistical Analysis, 2007).

Como pode ser observado na tabela 1, os coeficientes de variação

obtidos através do teste de estatística descritiva foram bem menores para

fração pós-mitocondrial do que para fração microssomal, o que claramente

indica que a fração pós-mitocondrial é a melhor opção para realizar a

19

determinação da atividade da enzima EROD em fígado de tilápia, por

fornecer um conjunto de dados mais homogêneos.

EROD Média Aritmética Desvio Padrão Coeficiente de Variação (%)

C2 4,74 1,82 38,41

G2 36,50 18,58 50,91

C2P 2,45 0,48 19,62

G2P 25,05 10,81 43,18

Tabela 1 – Comparação de variabilidade da enzima EROD em frações microssomais (C2/G2) e pós-mitocondriais (C2P/G2P) hepáticas de tilápia. Resultados obtidos através do teste de estatística descritiva para dados quantitativos.

20

5 – DISCUSSÃO:

O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de

bioensaios que possam ser empregados na avaliação da qualidade de

corpos d'água através da utilização de enzimas de Tilápias (Oreochromis

niloticus niloticus) como biomarcadoras de exposição e efeitos subletais de

poluentes. Neste sentido, realizamos uma comparação entre as atividades

enzimáticas das tilápias coletadas no rio Guandu, com aquelas coletadas

em áreas supostamente livres de poluição (represa de Ribeirão das Lajes e

piscicultura comercial).

Os resultados obtidos com a enzima ECOD não apresentaram

diferença significativa entre as atividades das tilápias coletadas no rio

Guandu com aquelas coletadas em área livre de poluição. Desta forma

podemos concluir que esta enzima não é um bom biomarcador para realização do

monitoramento de habitats aquáticos.

Já os resultados obtidos com EROD demonstraram que houve uma indução

significativa na atividade desta enzima em fígado de tilápia, caracterizando um

aumento superior a 700% no grupo do rio Guandu.

Os resultados fornecem forte indício da exposição das tilápias do rio

Guandu a contaminantes indutores de CYP1A. Esta grande elevação da

atividade da enzima EROD em frações pós-mitocondriais e microssomais

hepáticas de tilápias capturadas no rio Guandu em comparação com a

atividade dessa mesma enzima nas tilápias capturadas em sítios controles.

Esses resultados vem confirmar os estudos de Parente et al. (2004/2008),

que também sugerem que a bacia hidrográfica do rio Guandu está

contaminada por substâncias químicas indutoras de CYP1A, já que os

resultados obtidos no nosso estudo também indicam essa contaminação.

As substâncias químicas citadas são produzidas por uma variedade de

processos industriais.

Nossos resultados mostraram que o uso de frações pós-mitocondriais

(FPM) para a determinação da atividade de EROD hepática de tilápias é

mais favorável do que o uso de microssomas. As FPM fornecem resultados

mais homogêneos e são mais fáceis de preparar. Estes dados validam os

21

resultados descritos por Parente et al. (2008), que também obtiveram resultados

positivos com FPM.

Dois afluentes do rio Guandu passam pelo distrito industrial de

Queimados (rio Poços e rio Queimados), onde diversas indústrias se

estabeleceram durante os últimos anos. Também está localizado neste

distrito, próximo ao rio Queimados, um depósito de resíduos químicos

perigosos, uma mistura de hidrocarbonetos clorados que tem como base

óleo de ascarel, usado como fluido isolante para transformadores elétricos.

Infelizmente quando a utilização deste óleo foi interrompida, o depósito foi

abandonado com uma quantidade substancial de resíduos ambientalmente

persistentes. Com condições erradas de armazenamento, os recipientes

foram corroídos e seu conteúdo vazou contaminado solo e água. Além

deste fato aconteceram pelo menos dois incêndios neste depósito nos

últimos anos, resultando numa provável produção de uma quantidade

considerável de dioxinas (Pinto, 2001).

Consequentemente, PCBs e dioxinas são possíveis indutores de

CYP1A, contaminantes da área do rio Guandu (Parente et al., 2008).

Apesar de o rio Guandu receber grandes quantidades de resíduos

industriais, o deságüe de esgoto doméstico parece ser a principal fonte de

contaminação desta bacia hidrográfica (Parente et al., 2008).

Vale ressaltar que a tilápia, Oreochromis niloticus niloticus, provou ser

uma boa espécie sentinela para realização do monitoramento de corpos

d’água nas áreas metropolitanas do Brasil, por ser uma espécie muito

resistente e possuir uma taxa de crescimento rápida. A princípio a espécie,

originária da África, foi introduzida no Brasil a fim de servir como fonte de

proteína animal em reservatórios nas regiões áridas e semi-áridas do

nordeste do Brasil em 1970 (Bizerril & Primo, 2001). Entretanto a espécie

se popularizou e passou a ser utilizada para cultura de peixes e tem se

espalhado por todo país, está hoje entre os peixes de água doce mais

consumidos nas regiões sul e sudeste do Brasil, onde além se serem

criadas em fazendas, são também encontradas em reservatórios, rios,

lagos e barragens (Parente et al., 2008).

22

A tilápia (Oreochromis niloticus niloticus) é uma das espécies mais

interessantes para a realização de programas de monitoramento ambiental

no Brasil. Uma de suas vantagens é o fato de essa espécie ser

amplamente utilizada em pisciculturas, sendo estes empreendimentos

contínuos fornecedores de grupos controles para a análise de mananciais

híbridos supostamente contaminados (Parente et al., 2008).

23

6 – CONCLUSÕES:

• A enzima ECOD não parece ser uma boa alternativa como

biomarcadora de contaminação de corpos hídricos, visto que

não apresentou alteração significativa de atividade se

comparada entre os sítios controles e o rio Guandu.

• A enzima EROD pode ser usada como excelente biomarcadora

de contaminação de corpos hídricos. Mostrou-se intensamente

induzida em fígado de tilápias no rio Guandu, quando

comparada com tilápias de sítios controles.

• O rio Guandu apresenta-se contaminado com indutores de

CYP1A, provavelmente hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos.

• A fração pós mitocondrial de fígado de tilápia é mais prática e

segura que o microssoma para o monitoramento da qualidade

de corpos hídricos, usando-se a enzima EROD como

biomarcadora.

24

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