USO DE QUITOSANA COMO ALTERNATIVA NATURAL PARA … · Aos Laboratórios de Bromatologia e...

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ILSA CUNHA BARBOSA

USO DE QUITOSANA COMO ALTERNATIVA NATURAL

PARA A CONSERVAÇÃO DE SUCO DE ACEROLA

RECIFE

2011

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ILSA CUNHA BARBOSA

USO DE QUITOSANA COMO ALTERNATIVA NATURAL

PARA A CONSERVAÇÃO DE SUCO DE ACEROLA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, para a obtenção do título de Mestre em Nutrição.

Orientadora: Profª Drª Tânia Lúcia Montenegro Stamford

Co-orientadora: Profª Drª Thayza Christina Montenegro Stamford

RECIFE

2011

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Barbosa, Ilsa Cunha

Uso de quitosana como alternativa natural para aconservação de suco de acerola / Ilsa Cunha Barbosa. –Recife : O Autor, 2011.

121 folhas; il., fig., tab.; 30 cm.

Orientador: Tânia Lúcia Montenegro Stamford. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Nutrição, 2011.

Inclui bibliografia, anexos e apêndices.

1. Quitosana. 2. Suco de acerola. 3. Conservante. I. Stamford, Tânia Lúcia Montenegro. I. Título.

UFPE 664.028 .CDD (20.ed.) CCS2011-16

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A Deus, porque dEle por Ele e para Ele são todas as coisas;

Aos meus pais Maria José e Jairo, meus mestres, modelos de ética, perseverança, dedicação e parceria;

À minha irmã Camila, companheira de todos os momentos;

Às professoras Tânia e Thayza, orientadoras dedicadas.

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Agradecimentos

A Deus, porque sua benignidade não tem fim, renova-se a cada manhã. Grande é a sua fidelidade. Aos meus pais, Maria José e Jairo que confiaram em mim e acreditaram no meu potencial. Agradeço a sua total dedicação nos meus projetos. À minha irmã, Camila pelo apoio e incentivo em todos os momentos. Às minhas orientadoras, Tânia Stamford e Thayza Stamford por partilharem valiosos ensinamentos acadêmicos e de vida, pela confiança, dedicação e paciência. Agradeço ainda, por serem meus modelos de pesquisadores e verdadeiros educadores, assim como de seres humanos éticos. Ao Prof. Dr. Marcos Lima, pela colaboração no experimento. Ao grupo de pesquisa da UFPE, Teresa, Geíza, Adriana, Viviane, Ticiane, Rebeka, Marilene, Danielle, Flávia, Amanda e Iris pela ajuda no experimento, momentos de descontração e troca de experiências. Ao grupo de pesquisa da UFPB, Amanda, Beto, Bárbara, Fábio, Eugênio, João por sua valiosa contribuição. Ao NPCIAMB da Universidade Católica de Pernambuco, em especial a prof. Drª Galba e Profª Aline pelas contribuições. Ao todos do LEAAL UFPE, Camilo, Artur, Alexandre, Moisés, Vivaldo,Viviane, Silvinha e Lourdes que de alguma forma contribuíram para o meu experimento. Aos Laboratórios de Bromatologia e Microbiologia dos alimentos da UFPB, Profª Rita Queiroga, Prof. Evandro Leite e Profª Lúcia que tiveram importante papel na minha formação acadêmica e na execução dos experimentos. Ao LACOM UFPB e Laboratório de Química do Departamento de Farmácia UFPE, Prof. Antônio Gouveia e Profª Rute pelas contribuições. Ao Laboratório de Química da UFRPE, em especial a Adriana Menezes que me ajudou com as análises de cor.

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Às amigas, Estefânia Garcia e Márcia Gabrielle, grandes companheiras de graduação, de profissão, de pós – graduação e de vida obrigada pela amizade, carinho, trocas de experiências e grandes contribuições no meu experimento. Aos amigos, professores e futuros doutores Carlos Eduardo e Maria Elieidy pela valiosa amizade e pelas grandes contribuições ao longo da minha vida acadêmica, meus grandes e eternos orientadores informais. Muito obrigada. A Neci, secretária da pós - graduação em nutrição, pela disponibilidade e assistência.

À minha turma de mestrado, pelo convívio e amizade.

À CAPES, pela bolsa de mestrado.

A todos os meus grandes amigos que de uma forma ou de outra contribuíram para a realização desse trabalho: MUITO OBRIGADA.

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Resumo

Conservantes tradicionais têm sido extensivamente utilizados por muitos anos, no entanto consumidores têm exigido alimentos cada vez mais frescos, saudáveis, seguros e sem a adição de conservantes químicos. Uma alternativa promissora ao uso dessas substâncias é a aplicação de novos produtos naturais a fim assegurar a segurança microbiológica e prevenir a perda de qualidade. Nesse contexto, o uso da quitosana, um biopolímero que tem se destacado devido a suas propriedades, tais como bioatividade, biodegradabilidade, e atoxidade que aliadas ao baixo custo de obtenção, o tornam ideal para uso em sistemas naturais de conservação de sucos de frutas. Assim, o objetivo desse estudo foi verificar a ação antifúngica e conservante da quitosana comercial na extensão da vida de prateleira do suco de acerola. Para verificar a atividade antifúngica da quitosana dos fungos Aspergillus spp., Penicillium spp. e Furasium spp. foram conduzidos ensaios de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM), Crescimento micelial radial e Morfogênese das cepas dos fungos filamentosos. A avaliação da ação da quitosana na extensão da vida de prateleira do suco de acerola foi realizada por meio de determinação de sólidos solúveis totais, acidez titulável, pH, vitamina C, turbidez, potencial de escurecimento, viscosidade, cor, análise sensorial, contagem total de bactérias acido láticas, aeróbias mesófilas e bolores e leveduras. As quatro cepas de fungos filamentosos se mostraram sensíveis a ação da quitosana, no entanto o Aspergillus flavus apresentou uma maior resistência com taxa inibição radial de 69%, menor que a dos demais fungos. A presença de quitosana em suco de acerola (pH 3,37), variando de 5 a 10 mg/mL inibiu o crescimento de todos os fungos filamentosos estudados. A quitosana interferiu na morfogênese dos fungos filamentosos em concentrações de 2,5 a 5 mg/mL, produzindo alterações no micélio fúngico e formação de estruturas de resistência, os clamidosporos. A quitosana estendeu a vida de prateleira do suco de acerola, com o controle da acidez, do escurecimento e redução da proliferação microbiana. Com a concentração de 5 mg/mL obteve-se no entanto, uma redução significativa do teor de ácido ascórbico. A quitosana proporcionou ainda uma redução da aceitação sensorial imediatamente ao processamento do suco de acerola. Durante o armazenamento, no entanto, aumentou a aceitação devido a sua ação na estabilidade do suco. Conclui-se que a quitosana tem potencial para uso na conservação do suco de acerola em substituição aos aditivos químicos tradicionalmente utilizados. Recomenda-se o uso de uma concentração de 2,5 mg/mL em até 7 dias de armazenamento a fim de manter a qualidade nutricional e sensorial. Assim é importante a realização de pesquisas com quitosana e seus derivados a fim de reduzir o impacto destes compostos nas características sensoriais.

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Palavras – chave: Quitosana, suco de acerola, conservante.

Abstract

Traditional preservatives have been used extensively for many years, however, consumers have increasingly demanded fresh, healthy, safe and without the addition of chemical preservatives food. A promising alternative to the use of these substances is the application of new natural products to ensure microbiological safety and prevent loss of quality. In this context, the use of chitosan, a biopolymer derived from chitin, has been outstanding due to its properties such as bioactivity, biodegradability, low toxicity and that together with the low cost of production, making it ideal for use in natural preservation systems juice fruit. Thus, the purpose of this study was to evaluate the antifungal and preservative effect of chitosan on extension of shelf life of acerola juice. To verify the antifungal activity of chitosan aganist Aspergillus spp., Penicillium spp. and Furasium spp. tests were performed in the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal Concentration (MFC), Mycelial radial growth and morphogenesis in the strains of filamentous fungi. In assessing the effect of chitosan on shelf life extension of the acerola juice was performed by determination of soluble solids, acidity, pH, vitamin C, turbidity, browning potential, viscosity, color, sensory analysis, total count lactic acid bacteria, aerobic mesophilic and yeast and mold. The four strains of filamentous fungi were sensitive to the action of chitosan, however that Aspergillus flavus showed a greater resistance to radial inhibition rate of 69%, lower than that of other fungi. The presence of chitosan in acerola juice (pH 3.37), ranging from 5 to 10 mg / mL inhibited the growth of all filamentous fungi studied. Chitosan interfered in the morphogenesis of filamentous fungi at concentrations of 2.5 to 5 mg / mL, producing changes in the mycelium and the formation of resistance structures, the chlamydospores. Chitosan has extended the shelf life of acerola juice, the acidity control, reduction of browning and bacterial growth. With the concentration of 5 mg / mL was obtained, however, a significant reduction in the ascorbic acid content. Chitosan also provided a reduction of sensory acceptance immediately processing the acerola juice. During the storage, however, increased due to its action on the stability of juice. It is concluded that chitosan has potential for use in the conservation of West Indian cherry juice in place of chemical additives traditionally used. However, as most antibiotics are not only biostatic and biocides, it is recommended to use a concentration of 2.5 mg / mL within 7 days of storage in order to maintain nutritional and sensory quality. So it is important to conduct research with chitosan and its derivatives to reduce the impact of these compounds on the sensory characteristics.

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Keywords: Chitosan, acerola juice, preservative.

Lista de figuras

Figura 1- Fluxograma do processamento do suco de acerola...........................45

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Lista de Tabelas

Tabela 1- Códigos e tratamentos das amostras de suco de acerola...................49

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SUMÁRIO

1. Introdução....................................................................................................14 1.1 Objetivos....................................................................................................17 1.2 Hipótese.................................................................................................18 2. Revisão de literatura................................................................................19 Revisão de literatura – Artigo de revisão....................................................20 Resumo......................................................................................................21 Abstract........................................................................................................21 Introdução...................................................................................................22 Composição dos sucos................................................................................24 Deterioração microbiológica.......................................................................25 Controle de qualidade.................................................................................26 Quitosana...................................................................................................27 Atividade antimicrobiana da quitosana........................................................28 Aplicação da quitosana em suco de frutas.........................................................31 Considerações finais....................................................................................34 Referências...................................................................................................34 Agradecimentos..........................................................................................42 3. Métodos.................................................................................................43 3.1. Solubilização da quitosana.....................................................................44 3.2. Elaboração do suco de acerola............................................................44 3.3. Determinação da atividade antifúngica da quitosana..........................45 3.3.1. Obtenção das cepas microbianas.......................................................45 3.3.2. Preparo do inoculo.................................................................................46 3.3.3. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração fungicida mínima (CFM).............................................................................46 3.3.4. Interferência sobre o crescimento micelial radial fúngico...................47 3.3.5. Interferência sobre a morfogênese do Aspergillus flavus.......................47 3.3.5.1. Microscopia óptica............................................................................47 3.3.5.2. Microscopia eletrônica de varredura..............................................47 3.4. Determinação da vida de prateleira do suco enriquecido com quitosana...48 3.4.1. Análises físico-químicas......................................................................49 3.4.1.1. Sólidos solúveis totais (°Brix)........................................................49 3.4.1.2. Acidez titulável..................................................................................49 3.4.1.3. pH...................................................................................................49 3.4.1.4. Vitamina C.....................................................................................49 3.4.1.5. Turbidez..........................................................................................49

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3.4.1.6. Potencial de escurecimento.............................................................50 3.4.1.7. Viscosidade.....................................................................................50 3.4.1.8. Cor................................................................................................50 3.4.2. Análises microbiológicas..................................................................50 3.4.2.1. Contagem de Bactérias ácido-láticas..............................................50 3.4.2.2.Contagem de fungos filamentosos e leveduriformes........................50 3.4.2.3. Contagem de Aeróbias mesófilas....................................................51 3.4.2.4. Detecção de Salmonella spp.............................................................51 3.4.2.5. Coliformes totais e fecais................................................................51 3.4.3. Análise sensorial...............................................................................52 3.5. Análises estatísticas.............................................................................52 4. Resultados.............................................................................................54 Artigo 1: Atividade antifúngica da quitosana in vitro e em matriz alimentar............................................................................................................55 Artigo 2: Potencial da quitosana como conservante natural de sucos...........82 5. Considerações finais..............................................................................112 Referências...............................................................................................113 Apêndices..................................................................................................116 Apêndice A: Fichas de análise sensorial......................................................117 Apêndice B: Termo de consentimento livre e esclarecido.........................118 Anexos.......................................................................................................121 Anexo A: Encaminhamento do artigo ao periódico....................................122 Anexo B: Parecer do comitê de ética........................................................123

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INTRODUÇÃO

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1. Introdução

A Acerola, também conhecida como “Cereja das Antilhas”, pertence à família

Malpighaceae, sendo um fruto com drupa de superfície lisa ou dividida em três gomos de

tamanhos variados. Possui várias aplicações, podendo ser utilizada, in natura, na forma de

polpas congeladas, doces, sucos, sorvetes, geléias. A produção de sucos se constitui uma

atividade rentável já que o Brasil se destaca como maior produtor e exportador dentre os

países em desenvolvimento, principalmente os Estados do Rio Grande do Norte, Bahia e

Paraíba (CHAVES et al., 2004).

O suco de acerola apresenta-se como uma boa fonte de vitamina C, vitamina A, ferro e

cálcio sendo uma bebida consumida em todo o mundo por pessoas de todas as fases da vida

(CHAVES et al., 2004). Considerando esse fato, é essencial que esse produto atenda as

demandas de qualidade tanto da indústria alimentícia quanto do mercado consumidor. A

indústria objetiva estender período em que os alimentos se encontram adequados para o

consumo, tornar o alimento mais atrativo, de qualidade, fornecer todos os nutrientes

necessários, a um baixo custo e que acima de tudo não tragam riscos à saúde (FELLOWS,

2006). Os consumidores, por sua vez, buscam alimentos de qualidade, que não comprometam

a saúde, a um preço acessível (FELLOWS, 2006).

Nesse contexto, existe hoje uma grande preocupação da sociedade com o uso de

aditivos químicos na conservação de alimentos devido ao risco de intoxicações que essas

substâncias podem causar a curto e longo prazo (MIDIO; MARTINS, 2000). Na conservação

de suco de frutas, bem como na recuperação das suas características, são utilizados aditivos

alimentares, como conservantes antimicrobianos e antioxidantes, além dos corantes. A

utilização desses produtos químicos podem trazer prejuízos a saúde humana, a sua ausência

em alimentos acarretaria, no entanto, em uma elevação nos custos de produção, uma vez que

alimentos isentos dessas substâncias necessitam de uma efetividade maior na conservação

térmica e melhorias no sistema de embalagens (MIDIO; MARTINS, 2000).

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Diante disso, é desafio da tecnologia de alimentos encontrar um aditivo que detenha a

funcionalidade do tradicional sem, no entanto, prejudicar a saúde do consumidor, atendendo

as necessidades tanto da indústria alimentícia quanto do mercado consumidor (MIDIO;

MARTINS, 2000). Nesse sentido, pesquisas vêm sendo realizadas no intuito de substituir os

aditivos químicos por produtos naturais que apresentem propriedades semelhantes aos

aditivos convencionais e que sejam de baixo custo (NO, 2007).

No contexto de produtos naturais tem-se a quitosana, que tem sido utilizada como

aditivo alimentar de origem natural em países asiáticos (US FDA/CFSAN, 2006). É um

heteropolimero constituído por unidades de β- (1-4) N-acetilglucosamina e β- (1-4) N-

glucosamina sendo encontrado naturalmente na parede celular de alguns fungos.

Comercialmente a quitosana é obtida pelo processo de deacetilação da quitina (CAMPANA

FILHO; DESBRIÈRES, 2000).

A quitosana possui propriedades únicas como bioatividade, atoxidade,

biocompatibilidade, ação polieletrolítica, biodegradabilidade, o que atrai interesse científico e

industrial em vários campos, dentre eles a tecnologia de alimentos (ROBERTS, 1992;

GILDBERG; STENBERG, 2001). Essas propriedades juntamente com o baixo custo de

obtenção, tornam esse biopolímero ideal para o uso como aditivo na indústria de alimentos

(SHAHIDI, ARACHCHI; JEON, 1999).

Em sucos de frutas, pode ser utilizada na clarificação, com a redução da turbidez

(SOTO-PERALTA; MLLER; KNORR, 1989; CHEN; LI, 1996; CHATTERJEE et al., 2004;

LIU, 2006; RUNGSARDTHONG et al., 2006; WANG; GUAN; YANG, 2007), na redução da

acidez (IMERI; KNORR, 1988; RWAN; WU, 1996), na redução do escurecimento

enzimático (SAPERS, 1992), como antimicrobiano (ROLLER; COVILL, 1999; RHOADES;

ROLLER, 2000; KISKO; SHARP; ROLLER, 2005; MALINOWSKA-PANCZYK et al.,

2009; DIANA et al., 2009), antioxidante (CHIEN et al., 2007) e na extensão da vida de

prateleira (DIANA et al, 2009).

Nesse sentido, frente ao reconhecido do potencial da quitosana como conservante

natural esta pesquisa teve como objetivo avaliar a ação antifúngica e conservante da quitosana

comercial (Sigma®) em suco de acerola.

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1.1 OBJETIVOS

Objetivo geral

Verificar a ação antifúngica e conservante da quitosana comercial (Sigma®) na

extensão da vida de prateleira do suco de acerola.

Objetivos específicos

Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida

Mínima (CFM) em meio de cultura e em suco de acerola;

Avaliar o efeito sobre o crescimento micelial radial fúngico;

Analisar a interferência da quitosana na morfogênese das cepas fúngicas;

Avaliar a vida de prateleira do suco de acerola enriquecido com quitosana segundo

seus aspectos físico-quimicos, microbiológicos e sensoriais.

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1.2 HIPÓTESE

A quitosana apresenta ação antifúngica e conservante, em substituição ao uso de

aditivos químicos tradicionais utilizados em sucos.

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REVISÃO DE LITERATURA

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2. Revisão de literatura: Artigo de revisão

A revisão de literatura na forma de artigo foi submetida a revista “Ciência rural”,

sendo intitulada “QUITOSANA COMO ALTERNATIVA NATURAL PARA A

CONSERVAÇÃO DE SUCOS”. A revista é classificada como B4 em Medicina II.

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Quitosana como alternativa natural para a conservação de sucos

Ilsa Cunha Barbosa I, Thayza Christina Montenegro StamfordII, Tânia Lúcia Montenegro

StamfordI

I Programa de Pós-Graduação em Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE),

II Departamento de Fisiologia e Patologia, Universidade Federal da Paraíba (UFPB)

E-mail: [email protected]

RESUMO:

Quitosana como alternativa natural para a conservação de sucos

Aditivos químicos são utilizados há anos na conservação de alimentos, no entanto

consumidores têm exigido alimentos cada vez mais naturais, saudáveis, frescos, seguros e

isentos dessas substâncias. Dessa forma, a utilização de conservantes de origem natural para

garantir a segurança microbiológica e a qualidade de sucos de frutas é uma alternativa

promissora. Nesse contexto, a quitosana, um polissacarídeo, apresenta propriedades únicas

tais como bioatividade, atoxidade, biocompatibilidade, biodegradabilidade e atividade

antimicrobiana que, aliadas ao baixo custo de obtenção tornam esse biopolímero ideal para o

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uso como conservante natural em alimentos. Diante disso, essa revisão tem como objetivo

descrever o potencial de aplicação da quitosana como conservante em sucos.

Palavras chave: Polissacarídeo, conservante de alimentos, sucos.

ABSTRACT

Chitosan as a natural alternative to juices preservation

Traditional additives have been used for many years, however, consumers have increasingly

demanded natural, fresh, safe and healthier food. Thus, the use of natural preservatives to

ensure the microbiological safety and quality of fruit juice is a promising alternative. In this

context, chitosan, a polysaccharide, has unique properties such as bioactivity, nontoxic,

biocompatible, action polyelectrolyte, biodegradability which together with the low cost of

production makes it ideal for use as an additive in foods of natural origin. Given this, this

review aims to show the potential application of chitosan as a preservative in fruit juices.

Key Words: Polysaccharide, Food Preservatives, juices.

INTRODUÇÃO

A industrialização de sucos teve início em 1869, com o engarrafamento de suco de uva

não fermentado pela indústria Welch de Vineland em Nova Jersey, introduzindo a

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pasteurização como principal forma de conservação de sucos (ASHURST, 1995). A utilização

dos tratamentos de esterilização UHT (Ultra High Temperature) e envase asséptico, na

segunda metade da década de 70, favoreceu o incremento no consumo de sucos de frutas.

Estas tecnologias permitiram a fabricação em larga escala, obtendo produtos de qualidade e

de vida útil prolongada (SUTHERLAND, 1994).

O interesse dos consumidores por produtos naturais contribui para o aumento do

consumo de sucos e bebidas a base de frutas. Por sua diversidade de aromas, sabores e valor

nutricional as frutas cítricas tropicais tem ampliado sua importância no mercado alimentício.

O suco de acerola destaca-se, por apresentar grande potencial comercial devido ao seu alto

teor de vitamina C (REINOLD, 2000). Os sucos apresentam uma vida de prateleira curta o

que limita a sua comercialização. Deterioração microbiana, odores desagradáveis e

degradação de ácido ascórbico são os principais fatores responsáveis pela perda da qualidade

durante o armazenamento (FELLERS, 1988).

Na conservação de suco de frutas, bem como na recuperação das suas características,

são utilizados aditivos químicos, que podem trazer prejuízos à saúde humana. A ausência dos

aditivos em alimentos acarretaria na elevação dos custos de produção, uma vez que alimentos

isentos dessas substâncias necessitam de uma efetividade maior na conservação térmica e

melhorias no sistema de embalagens. Nesse sentido, é essencial a busca de alternativas

naturais ao uso de conservantes químicos que apresentem propriedades semelhantes aos

aditivos convencionais e tenham baixo custo (NO et al., 2007).

Nesse contexto, tem-se a quitosana, um biopolimero, que é utilizado como aditivo

alimentar de origem natural no Japão, Coréia, Inglaterra e Estados unidos. Quitosana é um


glucosamina. Este polissacarídeo apresenta propriedades peculiares como bioatividade,

atoxidade, biocompatibilidade, ação polieletrolítica, biodegradabilidade e atividade

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antimicrobiana, que lhe conferem uma variedade de aplicações (GILDBERG & STENBERG,

2001). Essas propriedades, juntamente com o baixo custo de obtenção, tornam a quitosana

ideal para o uso como aditivo na indústria de alimentos. Em sucos de frutas, pode ser

utilizada no processo de clarificação, no controle da acidez, na prevenção do escurecimento

enzimático, como agente antioxidante e antimicrobiano (NO et al., 2007).

Assim, dada à importância do estudo de aditivos naturais, este ensaio teórico objetiva

descrever o potencial de aplicação da quitosana como conservante em sucos através de uma

revisão da literatura.

COMPOSIÇÃO DOS SUCOS

Atualmente a legislação brasileira por meio de decreto nº 6871/2009 (BRASIL, 2009)

define suco de fruta como bebida obtida da fruta mediante processos mecânicos, sendo não

fermentada, não diluída e não concentrada, apresentando características de cor, odor e sabor

típicas da fruta que procede e submetido a tratamento que assegure sua conservação e

apresentação até o momento do consumo.

O teor de nutrientes varia de acordo com a espécie frutífera ao qual o suco é

proveniente. Os sucos cítricos são ricos em ácidos orgânicos, que determinam a acidez sendo

essenciais na sua aceitabilidade sensorial. O ácido cítrico é o mais importante deles

apresentando conteúdo elevado em laranjas e limões. O ácido málico também se apresenta em

quantidades significativas (LIMA et al., 2000).

Os sucos de frutas contêm carboidratos em quantidades consideráveis, sendo

importante fonte de energia, porém seu conteúdo protéico é muito baixo. Esses sucos

apresentam 80% dos sólidos totais compostos de glicose, sacarose e frutose em quantidades

que variam de acordo com a variedade, as condições climáticas dentre outros fatores. Os

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sólidos totais de sucos de frutas cítricas tropicais variam de 8 a 11,6 °Brix (LIMA et al.,

2000).

O conteúdo de Vitamina C é determinante no valor nutritivo dos sucos, se destacando

o de acerola que apresenta 1000 mg/100g. O teor de ácido ascórbico pode variar de acordo

com a composição do solo de plantio das frutas, a localização do cultivo, a variedade e grau

de maturação da planta. As diferenças na elaboração do suco também podem ser um fator de

variação. As perdas de vitamina C durante o processamento são pequenas e no caso dos sucos

tratados termicamente, conserva-se aproximadamente 97% do conteúdo inicial de ácido

ascórbico (LIMA et al., 2000).

Os sucos de fruta são também uma importante fonte de minerais. Cálcio, fósforo e

magnésio se apresentam em quantidades significativas em sucos cítricos. Podem também ser

fontes importantes de ferro, cobre, zinco e manganês. Soares et al. (2004) avaliaram a

composição mineral de sucos de frutas brasileiras e relataram que todos os sucos analisados

mostraram-se uma boa fonte de potássio para adultos e crianças e que os sucos de abacaxi e

acerola são capazes de fornecer 6 a 12% da ingestão diária recomendada de ferro.

Outros compostos importantes dos sucos de frutas são os terpenos e sesquiterpenos,

responsáveis pelo sabor e aroma. O monoterpeno limoneno compreende mais de 95% do óleo

essencial de laranja conferindo importante aroma frutal que a caracteriza. O conjunto de

aldeídos, ésteres, cetonas, alcoóis, ácidos orgânicos também contribuem para o aroma e sabor.

A hidrólise desses compostos, principalmente dos ésteres ocorrem durante o armazenamento

podendo haver perda no aroma e no sabor dos sucos. O tratamento térmico provoca mudanças

no sabor e aroma dos sucos cítricos devido principalmente aos produtos da reação de Maillard

(SUTHERLAND, 1994).

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Os pigmentos dos sucos cítricos se concentram em minúsculos orgânulos chamados

cromoplastos. Os carotenóides, incluindo o licopeno e o β-caroteno são os mais importantes

na maioria dos cítricos. A quantidade de pigmento e a intensidade da cor variam de acordo

com a variedade, o grau de maturação da fruta e o clima (SUTHERLAND, 1994).

DETERIORAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE SUCOS DE FRUTA

Quando é destruída a barreira da fruta o suco atua como agente seletivo para os

microrganismos ácido-tolerantes presentes na fruta ou nos equipamentos do processamento

(FRANCO & LANDGRAF, 2008). Assim, o crescimento de leveduras e bactérias é

favorecido pelo alto teor de água, mas fungos filamentosos também crescem na superfície

quando em contato com o ar (ALDRIGUE, 2003).

As bactérias ácido-láticas são os microrganismos que dão início a deterioração de

sucos, porém seus números são drasticamente reduzidos pela pasteurização. Já os fungos

resistem a condições osmóticas altas e a baixos valores de pH, além de crescerem a

temperatura de refrigeração, sendo as leveduras os principais envolvidos na deterioração de

sucos de frutas (LOUREIRO & QUEIROL, 1999).

A deterioração de sucos de frutas frescas armazenadas a temperatura ambiente é

decorrente da fermentação alcoólica, por leveduras formadoras de película, ou por bolores que

crescem na superfície (CHAVES et al., 2004). Os efeitos da deterioração por leveduras

consistem em visíveis ou detectáveis alterações das propriedades físico-químicas e sensoriais

de alimentos como resultado da sua atividade. As alterações mais conhecidas ocorrem em

bebidas ácidas com ou sem açúcar e são caracterizadas pela abundante produção de gás que

pode causar deformação nas embalagens, escurecimento, sedimentação ou formação de

película, com presença de cheiros e sabores desagradáveis devido à formação de alcoóis,

dióxido de carbono e ésteres (LOUREIRO & QUEIROL, 1999).

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CONTROLE DE QUALIDADE

Os sucos produzidos em pequena escala não apresentam a necessidade de um rígido

controle de qualidade visto que a variabilidade das características do produto é aceitável. Em

escala industrial, por sua vez, recomenda-se a busca por um controle de qualidade aplicando

ferramentas tais como APPCC (análise dos perigos e pontos críticos de controle) e boas

práticas de fabricação. Deve-se verificar se o suco está recebendo um tratamento térmico

adequado, condições higiênicas de processamento adequadas e prevenção de contaminação

durante o processo de envase e distribuição. Em relação ao produto final, busca-se a avaliação

do sabor, da cor, além da determinação do conteúdo de sólidos (°Brix), do pH e da qualidade

microbiológica (SUTHERLAND, 1994).

Os sucos de frutas apresentam uma vida de prateleira limitada. De acordo com Fellers

(1988), a vida de prateleira de um suco pasteurizado chega até 10 dias após o processamento.

Diante disso, é necessária a utilização de métodos adicionais de conservação para estender a

vida de prateleira deste produto. Os aditivos químicos utilizados na conservação e controle de

qualidade de sucos têm suas quantidades e normas de rotulagem estipuladas sob a

responsabilidade do governo de cada país. No Brasil a regulamentação de aditivos alimentares

são determinados pela Portaria no 540, de 27 de outubro de 1997 (BRASIL, 1997).

Os aditivos comumente utilizados em sucos industrializados são os conservantes,

dióxido de enxofre, sulfitos, benzoato de sódio e o acidulante ácido cítrico. Os sulfitos são

tradicionalmente utilizados na prevenção do escurecimento enzimático e na inibição do

crescimento de microrganismos em sucos. No entanto, o uso desse aditivo foi restringido pela

FDA americana desde 1990 devido aos perigosos efeitos colaterais para pessoas com asma

(RAYBAUDI-MASSILIA et al., 2009). McCann et.al. (2007), por sua vez, em estudo dos

efeitos de corantes e do benzoato de sódio em crianças de 3, 8 e 9 anos de idade,

28

evidênciaram que aditivos alimentares intensificam o comportamento hiperativo (falta de

atenção, impulsividade e hiperatividade) em crianças.

Diante disso, é desafio da tecnologia de alimentos pesquisar aditivos naturais que

detenham a funcionalidade dos aditivos químicos sem, no entanto, prejudicar a saúde do

consumidor, atendendo as necessidades tanto da indústria alimentícia quanto da sociedade

(MIDIO & MARTINS, 2000).

QUITOSANA

Quitina, um polímero natural, insolúvel, linear que apresenta o mesmo tipo de unidade

monomérica β-1,4 N-acetilglucosamina, é largamente distribuído na natureza, sendo segundo

biopolímero mais abundante depois da celulose. É o principal componente estrutural do

exoesqueleto de animais marinhos podendo também ser encontrada na cutícula dos insetos e

na parede celular de alguns fungos e leveduras (CAMPANA-FILHO et. al., 2007). Quitosana

é um heteropolimero natural, composto por unidades β-1,4 D-glucosamina ligadas a resíduos

de N-acetilglucosamina, sendo encontrada na parede celular de fungos. Comercialmente a

quitosana pode ser obtida a partir da hidrólise da quitina, em meio alcalino, por meio da

reação de desacetilação a altas temperaturas (CAMPOS-TAKAKI, 2005).

A quitosana apresenta propriedades específicas que revelam seu potencial para

inúmeras aplicações em várias áreas. As principais propriedades deste polissacarídeo são:

bioatividade, biodegradabilidade, biocompatibilidade, atoxidade, reatividade do grupo amino

desacetilado, permeabilidade seletiva, ação polieletrolítica, atividade antimicrobiana,

habilidade em formar gel e filme, habilidade de quelação e capacidade adsortiva (RINALDO,

2006). Em pH biológico a quitosana apresenta-se como um policátion. Essas propriedades

juntamente com o baixo custo de obtenção atraem o interesse científico e industrial nos

29

campos bioteconológico, farmacêutico, cosmético, agricultura, ciência de alimentos, têxtil e

de tratamento de resíduos de água (JEON et al., 2000).

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA QUITOSANA

A atividade antimicrobiana da quitosana tem sido demonstrada contra várias cepas

bacterianas e fúngicas. A investigação dessa propriedade teve início há duas décadas com a

pesquisa com fungos patogênicos originários do solo e de alimentos na agroindústria e

indústria de alimentos (RABEA et, al, 2003). Tal atividade depende de fatores intrínsecos e

extrínsecos, tais como: natureza policatiônica, grau de desacetilação, peso molecular,

capacidade quelante de metais, espécie microbiana, pH, temperatura e a componentes da

matriz alimentar (DEVLIEGHERE et al., 2004).

Um importante fator na atividade antimicrobiana da quitosana é a sua natureza

policatiônica. Em meio ácido os grupos amino da quitosana captam íons hidrogênio do meio,

resultando em uma carga global positiva ao polímero, o que permite a sua interação com

moléculas carregadas negativamente (RINALDO, 2006). A natureza policatiônica da

quitosana está diretamente relacionada ao seu grau de desacetilação, que quando alto (97,5%)

leva uma maior densidade de carga positiva, conferindo um espectro de ação antimicrobiano

maior quando comparado a quitosana de grau de desacetilação menor (83,7%) (KONG et. al.,

2008).

Outro parâmetro que influência na ação antimicrobiana da quitosana é o seu peso

molecular. A quitosana com alto peso molecular forma um filme na superfície celular

impedindo que os nutrientes adentrem a célula. Por outro lado, quitosana de baixo peso

molecular, abaixo de 5 kDa, atua penetrando na célula e interagindo com os nutrientes

negativamente carregados interferindo, dessa forma, nas reações metabólicas (TIKHONOV et

al., 2006). A quitosana possui ainda, a capacidade quelante de vários íons metais (Ni2+, Zn2+,

30

Co2+, Fe2+, Mg2+ e Cu2+). Esses se combinam com as moléculas da parede celular dos

microrganismos modificando a sua estabilidade (KURITA, 1998).

A quitosana possui distintos efeitos inibitórios contra fungos, bactérias Gram-

positivas e Gram- negativas. As concentrações inibitórias mínimas relatadas para específicos

organismos alvos variam de 0,018 mg/mL a 10 mg/mL (KNOWLES & ROLLER, 2001). A

atividade antimicrobiana da quitosana é mais imediata em fungos e algas que em bactérias.

Esse polimero exibe uma ação antifúngica principalmente pela inibição da esporulação e da

germinação de esporos. As Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) para alguns fungos

filamentosos variam de 0,001 mg/mL para o Botrytis cinerea até 5 mg/mL para Piricularia

oryzae (KNOWLES & ROLLER, 2001). Plascencia-Jatomea (2003), estudando o efeito da

quitosana na germinação de esporo do Aspergillus niger detectou a inibição do crescimento

radial e da germinação dos esporos, sendo verificada uma atividade fungiostática e não

fungicida. O maior valor de inibição de crescimento radial foi de 73%, determinado em 24h

com concentrações entre 3 e 5 mg/mL de quitosana.

Os fungos fitopatogênicos Fusarium solani e Colletotrichum lindemuthianum foram

inibidos pela quitosana e N-carboximetil quitosana (CUERO; et al., 1991). Resultados

similares foram obtidos com Aspergillus niger e Aspergillus parasiticius em alimento oriental

(EL GHAOUTH et. al., 2000). Ela inibe ainda a produção de toxinas por Aspergillus

alternata (DEVLIEGHERE et al., 2004).

A quitosana inibe o crescimento de uma grande variedade de bactérias. Os valores de

CIM variam de 0,001mg/mL da Corinebacterium michiganence até 2 mg/mL da Salmonella

typhimurium (RABEA et al., 2003). O modo de ação da quitosana a nível bacteriano é mais

complexo que o fúngico diferindo entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas, devido,

principalmente, as diferenças na superfície celular. A atividade antibacteriana é mais eficaz

contra bactérias Gram negativas do que em Gram positivas (RABEA et al., 2003).

31

A composição nutricional da matriz alimentar pode influenciar na atividade

antimicrobiana da quitosana. Devlieghere et al. (2004) ao estudarem a interação da quitosana

com os componentes dos alimentos observaram que altas concentrações de amido (30% w/v)

inibiram a atividade antimicrobiana da quitosana. Esse resultado, no entanto, não pode ser

generalizado para todos os tipos de amido. A influência das proteínas, por sua vez, depende

da sua carga. Se estiver carregada negativamente irá interagir com a quitosana neutralizando a

maioria das cargas positivas, impedindo-a de atuar na superfície celular, reduzindo assim a

atividade antimicrobiana. O NaCl interfere nas forças eletrostáticas entre a quitosana e a

célula microbiana. Em relação às gorduras, constatou-se que a sua influência na atividade

antimicrobiana da quitosana é insignificante.

O mecanismo da atividade antimicrobiana não foi totalmente elucidado, mas várias

hipóteses têm sido postuladas. Uma delas é a mudança na permeabilidade celular devido às

interações entre a quitosana policatiônica e as cargas eletronegativas nas superfícies celulares.

Essa interação leva a uma ligação de eletrólitos intracelulares e constituintes protéicos. Outra

hipótese é a inibição do RNAm, da síntese protéica, quelação de metais, elementos do esporo

e nutrientes essenciais. A quitosana pode também ativar diversos processos de defesa no

tecido hospedeiro, se ligar à água e inibir várias enzimas (DEVLIEGHERE et al., 2004).

APLICAÇÃO DA QUITOSANA EM SUCOS DE FRUTAS

A utilização da quitosana em escala industrial teve início em 1970, sendo hoje

comercializado como aditivo de alimentos ou suplemento no Japão, Coréia, Inglaterra, Itália,

Portugal e Estados Unidos (RODRÍGUEZ et al., 2002). Desde 1983 no Japão e 1995 na

Coréia a quitosana foi aprovada como aditivo em alimentos (NO et al., 2007). Nos Estados

Unidos foi reconhecido como GRAS (generelly recognised as safe) pela Food and Drug

Administration (FDA) em 2005, representando a certificação da sua segurança para o

32

consumo (USFDA, 2007). Em sucos, a quitosana apresenta varias aplicações, podendo ser

utilizada como agente clarificante, controle da acidez, escurecimento enzimático,

antimicrobiano e antioxidante.

O processo de clarificação de sucos normalmente envolve o uso de agentes

clarificantes tais como gelatina, bentonita, sílica e taninos. Sais de quitosana, carregados

positivamente, tem sido efetivos no processo de clarificação e de controle da acidez de sucos

(NO et al.,2007). A clarificação de sucos de frutas com quitosana foi relatada por diversos

autores, sendo esse biopolimero mais eficaz na redução da turbidez do que bentonita e

gelatina (CHATTERJEE et. al., 2004; LIU, 2006; RUNGSARDTHONG et. al., 2006; WANG

et. al. 2007).

Poucos estudos relatam sobre a atividade antimicrobiana da quitosana em sucos

(RHOADES & ROLLER, 2000; KISKO et al., 2005; MALINOWSKA-PANCZYK et al.

2009; DIANA et al., 2009).

Roller & Covill (1999) considerarame a quitosana glutamato como um conservante

efetivo contra leveduras deterioradoras em suco de maçã. A presença de quitosana glutamato

(Grau de desacetilação 75% a 85%) em suco de maçã (pH 3,4) a um nível de 0,1 a 5 g/L

inibiu o crescimento de todas as leveduras testadas, Zygosaccharomyces bailii 906 HP;

Saccharomyces cerevisiae 3085, SD 28; Schizosaccharomyces pombe; Saccharomyces

exiguous; Saccharomycodes ludwigii, a 25 ◦C. Dos sete fungos filamentosos testados, M.

racemosous e Byssochlamys spp foram inibidos pela quitosana glutamato à níveis próximos

ou um pouco acima de 1 mg/mL.

Rhoades & Roller (2000) estudaram a atividade da quitosana contra a microbiota

natural do suco de maçã pasteurizado (pH 3,3) estocado a 7 °C. A adição ao nível de 0,3 mg

/mL de quitosana inibiram o crescimento de leveduras durante 13 dias de armazenamento. No

entanto, a contagem total e a contagem de bactérias ácido láticas aumentaram numa taxa

33

menor do que no controle. Kisko et. al. (2005) relataram que a adição de quitosana à nível de

0,05 a 0,1% em suco de maçã, não pasterurizado, retardou o crescimento de leveduras

(Kloeckera apiculata, Metschnikowia pulcherrima, Saccharomyces cerevisiaea e Pichia spp.)

à 25 °C por até 12 dias. A quitosana diminuiu a contagem de leveduras para 2 a 3 log UFC

por até 10 dias de armazenamento, mas prolongou a sobrevida da E. coli O157:H7 até 3 a 5

dias. Entretanto a sobrevivência da Salmonella entérica sorovar Typhimurium não foi afetada

pela quitosana.

Chien et al. (2007) relataram o efeito antioxidante da quitosana, de diferentes pesos

moleculares, em um sistema aquoso e em suco de maçã, verificando que este polimero de

diferentes pesos moleculares apresentaram atividade antioxidante. Os resultados in vitro

demostraram que a quitosana de baixo peso molecular pode aumentar a atividade antioxidante

em suco de maçã.

Diana et al. (2009) ao estudarem a influência da quitosana na extensão da vida de

prateleira do suco de acerola, observaram que o aumento na concentração do polissacarídeo

estendeu a qualidade do suco significativamente, reduzindo o escurecimento enzimático e não

enzimático, e controlando a deterioração microbiana durante o armazenamento. No entanto,

concentrações maiores que 1 mg/mL de quitosana reduziram os teores de ácido ascórbico e de

carotenóides. Isso se deve a carga positiva da quitosana conferir a habilidade de flocular e

coagular substâncias carregadas negativamente. Além disso, essas concentrações foram

classificadas como inaceitáveis pelo painel sensorial devido a um aumento da amargura.

Assim, os autores recomendaram concentrações de até 1mg/mL de quitosana para estender a

qualidade e preservar o conteúdo de ácido ascórbico e carotenóides durante o período de

armazenamento de sucos de laranja.

Zoldeners et al. (2005) estudaram a estabilidade de solução de quitosana em ácido

acético a 2% na presença de diferentes quantidades de ácido ascórbico e descreveram

34

diminuição na concentração de ácido ascórbico. Os autores relataram que o ácido ascórbico

mesmo em baixas concentraçoes e a temperatura ambiente induz a degradação da quitosana

com a formação de frações hidrossolúveis. Ao mesmo tempo, o polímero acelera o processo

de oxidação do ácido ascórbico e diminiu a energia de ativação da reação. O ácido ascórbico

participa na formação de radicais hidroperóxidos que ataca as cadeias de quitosana. Assim, ao

utilizar a quitosana em alimentos ricos em ácido ascórbico é essencial considerar a destruição

acelerada do polímero e a oxidação da vitamina C nesses sistemas.

Malinowska-Panczyk et. al (2009) avaliaram o efeito combinado da quitosana e da

pressão de 193 MPa a -20°C em células de Escherichia coli e Staphylococcus aureus, assim

como na microbiota natural da carne de porco picada e do suco de maçã. Imediatamente após

o tratamento combinado de quitosana em pressão de 193 Mpa as bactérias testadas, o efeito

sinérgico foi maior contra E.coli em relação a S. aureus aumentando 3,6 e 0,7 log

respectivamente, quando comparado a cada tratamento isolado. No entanto a incubação de S.

aureus por 20h a 37°C depois do tratamento com pressão na presença de quitosana levou à

completa inativação da bacteriana. Em suco de maçã, o efeito combinado da pressão e

quitosana aumentou a inativação da população bacteriana.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A utilização da quitosana em substituição aos aditivos químicos utilizados em

alimentos, particularmente em sucos, é uma proposta viável, no entanto alguns fatores devem

ser considerados. Um deles é escassez de artigos científicos que avaliam as mudanças nas

características sensoriais de sucos de frutas causadas pela adição da quitosana, que pode

causar efeitos adversos ao perfil sensorial do produto e até mesmo descaracterizá-lo. Outro

fator determinante na aplicação de quitosana em alimentos é a perda de vitamina C decorrente

35

da sua utilização, principalmente em sucos onde o teor de ácido ascórbico é determinante no

valor nutritivo. Diante disso, torna-se importante a realização de novas pesquisas com

quitosana e seus derivados e a combinação do uso de conservantes com outras tecnologias de

preservação de alimentos objetivando a redução do impacto destes compostos nas

características sensoriais.

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AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro da CAPES e a colaboração da Universidade

Católica de Pernambuco e da Universidade Federal da Paraíba.

43

MÉTODOS

44

3. MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos nos Laboratório de Experimentação e Análises de

Alimentos (LEAAL) e Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal de Pernambuco

(UFPE) e da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) Campus I, de Físico - química da

Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e Núcleo de Pesquisa em Ciências

Ambientais NPCIAMB da Universidade Católica de Pernambuco.

3.1. Solubilização da quitosana

Quitosana comercial de crustáceo (Sigma®) de grau de desacetilação (GD) 85% foi

utilizada nesse estudo. A solução de quitosana foi preparada em ácido acético 1% (v/v), a uma

concentração de 20mg/mL com pH ajustado para 5,5 usando NaOH 20% (SHIGEMASA;

MINAMI, 1996).

3.2. Elaboração do suco de acerola

45

Para a elaboração do suco de acerola, foram utilizadas acerolas em uma concentração

de 60% (m/v), homogeneizadas em liquidificador e filtradas. Posteriormente o suco foi

pasteurizado (62ºC por 30 min), adicionado de quitosana e armazenado em garrafas plásticas,

sob refrigeração (8ºC) , até o momento da condução das análises (Figura 1).

Acerola (Malphigia labra.)

Seleção

Lavagem

Desintegração e despolpa

Filtração

Pasteurização

46

Incorporação da solução do biopolímero e homogeneização (quitosana 0 a 5 mg/mL)

Armazenamento em refrigeração

Figura 1: Fluxograma do processamento do suco de acerola

3.3. Determinação da atividade antifúngica da quitosana

3.3.1. Obtenção das cepas microbianas

As cepas fúngicas utilizadas como microrganismos teste foram obtidas da coleção de

cultura de microrganismos da Micoteca, Departamento de Micologia, CCB, UFPE, isoladas

segundo metodologia descrita por Menezes; Assis, (2004). Foram utilizados para os testes

quatro fungos filamentosos, Aspergillus flavus (4540), Penicillium foniculosum (4511), Fusarium

moniliforme (4542) e Penicillium pinophilum (4546).

3.3.2. Preparo do inóculo

As cepas fúngicas foram repicadas em ágar Sabouraud e incubadas em estufa

bacteriológica a 28°C, overnight. Em seguida, foram obtidas suspensões padronizadas em 107

células viáveis/mL em solução fisiológica esterilizada (NaCl 0,9%) pela técnica de exclusão

com azul de Amann em câmara de Neubauer para cada cepa analisada.

3.3.3. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida

Mínima (CFM) em meio de cultura e em matriz alimentar:

As CIM e CFM da quitosana foram determinadas através da técnica de macrodiluição

em caldo Sabouraud ou suco de acerola. Foram realizadas diluições seriadas da quitosana 20

mg/mL em meio caldo Sabouraud ou suco de acerola, obtendo-se concentrações finais de

47

quitosana (0,312; 0,625; 1,25; 2,5; 5,0 e 10,0 mg/mL). Posteriormente foi inoculado 1 mL da

suspensão fúngica. Foram estabelecidas duas amostras controle, uma sem a adição de

quitosana e outra na presença de ácido acético 1% (1:1 v/v). Em seguida, o sistema foi

incubado em estufa a 28 °C por 72 horas. Ao término do período de incubação, a

concentração mais baixa de quitosana que não apresentou crescimento fúngico visível foi

considerada como a CIM.

Após a obtenção da CIM, alíquotas de 100 µL dos tubos que não apresentarem

crescimento fúngico foram inoculadas em placas de Petri com ágar Sabouraud e incubadas em

estufa por 72 horas a 28 ºC. Foi considerada CFM a primeira concentração, na qual a cepa

fúngica não apresentou capacidade de crescimento em meio ágar Sabouraud adicionado de

quitosana (SHARMA; TRIPATHI, 2007).

3.3.4. Interferência sobre o crescimento micelial radial fúngico

A avaliação da inibição do crescimento micelial radial foi determinada utilizando-se a

técnica do envenenamento do substrato de crescimento (diluição em meio sólido). Para a

execução da técnica, inicialmente foi tomada uma porções de 2 mm de diâmetro de culturas

da cepas fúngicas com crescimento de 10 dias em ágar Sabouraud a 28 °C, a qual foi colocada

no centro de placas de Petri estéreis com ágar Sabouraud adicionado de quitosana em

diferentes concentrações (2,5; 5; 10 mg/mL) escolhidos com base nos resultados de CIM e

CFM. O sistema foi incubado em estufa a 28 °C até que o tratamento controle tomasse toda a

placa. Em intervalos de tempo de incubação de 12 hs, o crescimento micelial radial da colônia

fúngica foi medido em triplicata e o resultado expresso em milímetros (mm) (DAFERERA;

ZIOGAS; POLISSIOU, 2003). Os controles incluídos neste ensaio foram a observação do

crescimento micelial radial da cepa fúngica em ágar Sabouraud sem adição de quitosana e

adicionado de ácido acético a 1%.

3.3.5. Efeito sobre a morfogênese das cepas do Aspergillus flavus

O A. flavus foi selecionado para os ensaios de morfogênese em virtude da sua resistência a

quitosana observada nos ensaios anteriores e de acordo com Velmurugan et al. (2009). O fungo foi

repicado em meio BDA para produção de esporos e incubado a 28ºC por 6 dias. Após este período, um

total de 107 esporos/mL foram coletados e inoculados em caldo Sabouraud, acrescido de quitosana nas

concentrações de 1,25; 2,5 e 5 e incubados a 28ºC sob agitação orbital de 150 rpm por 2 dias.

48

Amostras controle foram crescidas no meio sem quitosana, adicionada de ácido acético a 1% (1:1 v/v)

e pH ajustado para 5,5 nas mesmas condições descritas acima.

3.3.5.1. Microscopia Óptica

Amostras coletadas com dois dias de crescimento, oriundas dos meios de cultura com

diferentes concentrações de quitosana, foram lavadas em solução salina tamponada, pH 7,2, por duas

vezes, durante 10 minutos. Em seguida, as amostras foram montadas em lâmina de microscopia,

coradas com azul de Amann, observadas e fotografadas em Microscópio (Ziess).

3.3.5.2. Microscopia Eletrônica de Varredura


diferentes concentrações de quitosana, foram lavadas em solução salina tamponada, pH 7,2,

por duas vezes, durante 10 minutos. Em seguida foram fixadas com glutaraldeído 2,5% em

tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 1 hora, a 28ºC. Finda a etapa de fixação, todas as

amostras foram novamente lavadas com tampão fosfato, duas vezes durante 10 minutos.

Seguiu-se a pós-fixação com tetróxido de ósmio 1%, em tampão fosfato 0,1 M, durante 1 hora

a 28ºC, em condições de escuridão. Em seguida, as amostras foram, mais uma vez lavadas

com tampão fosfato 0,1M, sendo posteriormente destinadas ao processo de desidratação. Para

a desidratação das amostras foi utilizado etanol, em proporções de 50%, 70%, 90% (intervalos

de 5 minutos para cada troca) até a proporção de 100% (três vezes, 10 minutos cada troca)

(DE SOUZA, 2000). Logo em seguida as amostras foram submetidas à secagem em ponto

crítico, e então observadas e fotografadas no microscópio eletrônico de varredura (JEOL, JSM

5600 LV).

3.4 Determinação vida de prateleira suco enriquecido com quitosana

Nos ensaios de vida de prateleira, o tempo de armazenamento à 4°C estabelecido foi

de até 14 dias após o processamento, de acordo com Fellers (1988). Os experimentos foram

conduzidos em triplicata imediatamente, 7 e 14 dias após o processamento. A concentração

máxima de quitosana instituída foi de 5 mg/mL, depois de uma triagem sensorial e com base

em Rabea et al. (2003).

49

Foram testadas duas concentrações (2,5 e 5 mg/mL) e estabelecidas duas amostras

controle sem adição

de quitosana e outra

adicionada de ácido

acético 1%. As

amostras, códigos

e

concentrações estão discriminados na (Tabela 1).

Tabela 1: Tratamentos das amostras de suco de acerola.

Código da

amostra Tratamento

T1 0 mg/mL de quitosana

T2 0 mg/mL de quitosana com adição de ácido

acético 1%

50

3.4.1. Análises físico-químicas

3.4.1.1. Sólidos solúveis totais

Foram determinados por meio da leitura em refratômetro de bancada (aus jena Modelo

II), com os resultados expressos em °Brix (AOAC, 1997).

3.4.1.2. Acidez titulável

A acidez total titulável, com os resultados expressos em ácido cítrico, foi determinada

por meio de titulação com solução de NaOH 0,1 N (AOAC, 1997).

3.4.1.3. pH

O pH de 20mL das amostras foi determinado a temperatura ambiente usando

potenciômetro digital (modelo pH Meter Tec-2 , Tecnal) (AOAC, 1997).

3.4.1.4. Vitamina C

O teor de ácido ascórbico (mg.100 g-1 de polpa), baseia-se na redução do corante sal

sódico de 2,6-diclorofenol indofenol por uma solução ácida de vitamina C (AOAC, 1997).

3.4.1.5. Turbidez

T3 2,5 mg/mL de quitosana

T4 5 mg/mL de quitosana

51

Medida usando leitura direta no espectofotômetro (Bioespectro – espectrofotômetro

SP-22) com comprimento de onda do instrumento de 600 nm, água deionizada foi utilizada

como branco e os resultados expressos em unidades de absorbância (UA) mL-1 suco de

acerola fresco (DIANA et. al., 2009).

3.4.1.6. Potencial de escurecimento

A absorbância à 320 nm de alíquotas desses extratos foi medida e os resultados

expressos em unidades de absorbância (UA) mL-1 suco de acerola (DIANA et. al., 2009).

3.4.1.7. Viscosidade

A viscosidade de cada amostra de suco de acerola foi medida usando Viscosímetro de

Brooksfield. A velocidade foi regulada para 50 rpm por 1 min e utilizou-se o spindle 1.

(DIANA et. al., 2009).

3.4.1.8. Cor

Os parâmetros de cor L*a*b foram medidos em um colorímetro Minolta (DIANA et.

al., 2009).

3.4.2. Análises microbiológicas

3.4.2.1 Contagem de bactérias ácido láticas

As alíquotas das diluições seriadas do suco foram inoculadas em ágar DeMan-Rogosa-

Sharpe e incubadas a 37°C por 72 horas de acordo com metodologia descrita por Vanderzant;

Spplittstoesser (1992). Os resultados foram expressos em Log de Unidades Formadoras de

Colônias por g (Log de UFC/mL).

3.4.2.2. Contagem de fungos filamentosos e leveduriformes

52

Foi realizada através da técnica de plaqueamento em superfície utilizando-se como

inóculo 0,1 mL das diluições decimais e como meio de contagem o ágar Sabouraud incubado

a 25 °C (± 1 °C) por 48 - 72 horas. Após o término do período de incubação, foi realizada a

contagem do número de UFC, sendo os resultados expressos em Log de UFC/mL

(VANDERZANT; SPPLITTSTOESSER, 1992).

3.4.2.3 Contagem de bactérias aeróbias mesófilas

Foi realizada através da técnica de plaqueamento em profundidade utilizando-se como

inóculo 1 mL das diluições seriadas e como meio de contagem o ágar Contagem Padrão

incubado a 37 °C por 48 horas. Após o término do período de incubação, foi realizada a

contagem do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC), sendo os resultados

expressos em Log de UFC/mL (VANDERZANT; SPPLITTSTOESSER, 1992).

3.4.2.4. Detecção de Salmonella spp.

A análise foi realizada através de uma etapa de pré-enriquecimento da amostra

utilizando-se caldo lactosado, seguido por uma etapa de enriquecimento seletivo utilizando-se

Caldo Tetrationato e Caldo Selenito Cistina. Em seguida, fez-se plaqueamento em ágar

bismuto sulfito e ágar entérico de Hektoen. As colônias com característica típicas de

Salmonella foram isoladas em ágar nutriente, sendo finalmente realizados os testes

bioquímicos de confirmatórios (VANDERZANT; SPPLITTSTOESSER, 1992).

3.4.2.5. Coliformes totais e fecais

Foi realizada através da técnica de tubos múltiplos, em caldo CLBVB e caldo EC

incubados a 37 ºC/48 horas e 44,5 ºC/24 horas, respectivamente. Os resultados foram

expressos em Número Mais Provável de coliformes fecais ou totais por mL da amostra

(NMP/mL) (VANDERZANT; SPPLITTSTOESSER, 1992).

3.2.3 Análise Sensorial

53

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE/CCS sob número

de protocolo 050/10, a avaliação sensorial dos sucos foi realizada ao longo da vida de

prateleira, imediatamente após a elaboração, depois de 5 e 7 dias de armazenamento, período

estabelecido de acordo com os resultados físico-químicos. Só foram submetidos a este teste os

sucos com parâmetros dentro do preconizado pela RDC nº 12 para os padrões

microbiológicos (BRASIL, 2001) e pelos Padrões de Identidade e Qualidade do suco de

acerola (BRASIL, 2000).

A análise sensorial foi realizada segundo metodologia do Instituto Adolfo Lutz (2005),

o teste de aceitabilidade utilizando uma escala hedônica de nove pontos (1 = desgostei

extremamente; 2 = desgostei muito; 3 = desgostei moderadamente; 4 = desgostei

ligeiramente; 5 = nem gostei/nem desgostei; 6 = gostei ligeiramente; 7 = gostei

moderadamente; 8 = gostei muito; 9 = gostei extremamente) avaliou os atributos aparência,

textura, preferência global, sabor e odor. Paralelamente também foi avaliada a intenção de

compra. Para tanto, foi empregado a escala hedônica de cinco pontos (1 = jamais compraria; 2

= possivelmente não compraria; 3 = talvez comprasse/talvez não comprasse; 4 =

possivelmente compraria; 5 = compraria).

Para a realização desses testes foi utilizado um painel de 50 provadores não treinados

(18-50 anos), alunos, professores e funcionários da UFPE, selecionados com base nos hábitos

e interesse em consumir suco de acerola.

Em ambos os testes, as amostras foram servidas, simultaneamente e de forma

aleatória, a aproximadamente 8°C, em copos plásticos de cor branca codificados com

números aleatórios de 3 dígitos. Juntamente com as amostras foram oferecidos aos provadores

bolacha e água e estes foram orientados a entre uma amostra e outra fazer o uso da bolacha e

da água, para remoção do sabor residual e a provarem estas da esquerda para direita. Os testes

foram realizados no Laboratório de Análise Sensorial da UFPE, em cabines individuais

utilizando-se luz branca, longe de ruídos e odores, em horários previamente estabelecidos

(excluindo uma hora antes e duas horas após o almoço).

3.5 Análises estatísticas

54

As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se testes de estatística descritiva

(média e desvio padrão) e inferencial (teste de Tukey) para determinação de diferenças

estatisticamente significantes (p<0,05) entre os tratamentos aplicados. Para o tratamento

estatístico utilizar-se-á o software Sigma Stat. 2.0

55

Resultados

56

Artigo 1:

O artigo será submetido a Revista Food Science and Technology-LWT, sendo

intitulado “ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA QUITOSANA IN VITRO E EM MATRIZ

ALIMENTAR” A revista é classificada como B1 em Medicina II.

57

Atividade antifúngica da quitosana in vitro e em matriz alimentar

Ilsa Cunha Barbosaa; Thayza Christina Montenegro Stamfordb; Marcos Antônio Barbosa de

Limac; Tânia Lúcia Montenegro Stamfordd.

a Programa de Pós - Graduação em Nutrição - Mestrado, Universidade Federal de Pernambuco, Recife – PE, Brasil;

b Departamento de Fisiologia e Patologia, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa – PB, Brasil;

c Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife – PE, Brasil;

d Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco, Recife -PE, Brasil.

Resumo

A atividade antifúngica da quitosana foi investigada em meio de cultura e suco de acerola

contra quatro fungos filamentosos associados a deterioração de alimentos, a fim de analisar o

potencial do seu uso como conservante natural. As quatro cepas de fungos filamentosos se

mostraram sensíveis a ação da quitosana, no entanto o Aspergillus flavus apresentou uma

maior resistência com CIM de 5mg/mL, CFM de 10mg/mL e taxa inibição radial de 69%. A

presença de quitosana em suco de acerola (pH 3,37), variando de 5 a 10 mg/mL inibiu o

crescimento de todos os fungos filamentosos estudados. O Penicillium foniculosum em suco

de acerola foi a cepa mais sensível com concentração fungicida de 5 mg/mL. A microscopia

óptica e eletrônica mostraram que a quitosana em concentrações de 2,5 a 5 mg/mL produziu

alterações no micélio fúngico e formação de estruturas de resistência, os clamidosporos.

Conclui-se que a quitosana tem potencial para uso em substituição aos aditivos químicos em

suco de acerola.

Palavras chave: Biopolímero, fungos filamentosos, suco de acerola.

58

1. Introdução

A contaminação por fungos representa uma das causas mais comuns da deterioração

de alimentos. As perdas de qualidade de alimentos ao longo do armazenamento ocorrem em

conseqüência de mudanças microbiológicas, enzimáticas, físicas e químicas. Perdas de

inocuidade e qualidade dos alimentos devido a microrganismos são importantes porque se

constituem um risco para os consumidores, pela possível presença de toxinas no produto, ou

pelas perdas econômicas decorrentes da deterioração microbiana (Davidson, 2001).

Diversos métodos para a conservação de alimentos, tais como fervura, congelamento,

redução de atividade de água, acidificação, embalagens com atmosfera modificada,

fermentações ou aditivos químicos tem sido aplicados no controle microbiano (Davidson,

2001). O interesse por substâncias naturais que inibam a deterioração microbiana, mantendo a

qualidade do alimento, tem crescido nos últimos anos devido ao aumento da demanda por

alimentos saudáveis, frescos e seguros contendo o mínimo de conservantes possível.

Nesse contexto tem-se a quitosana, polissacarídeo utilizado como aditivo alimentar de

origem natural em países asiáticos (US FDA/CFSAN, 2006). A quitosana é um


glucosamina. É encontrado naturalmente na parede celular de alguns fungos e comercialmente

é obtida pelo processo de desacetilação da quitina (Campana Filho & Desbrières, 2000).

A quitosana possui propriedades únicas como bioatividade, atoxidade,

biocompatibilidade, ação polieletrolítica, biodegradabilidade, o que atrai interesse científico e

industrial em vários campos, dentre eles a tecnologia de alimentos (Roberts, 1992; Gildberg

& Stenberg, 2001). A atividade antifúngica da quitosana é a sua principal bioatividade, na

redução do crescimento de fungos fitopatogênicos que são responsáveis pela deterioração de

59

vegetais, frutas e seus subprodutos. Poucos estudos, entretanto, relatam a atividade

antimicrobiana da quitosana em sucos (Roller & Covill, 1999; Rhoades & Roller, 2000;

Kisko, Sharp & Roller, 2005; Malinowska-Panczyk, Kolodziejska, Murawska & Wolosewicz,

2009; Diana, Rico, Barat & Barry- Ryan, 2009).

A fim de analisar o potencial da quitosana como conservante natural em suco de

acerola, o presente estudo teve por objetivo avaliar a atividade antimicrobiana da quitosana

para quatro fungos filamentosos, em meio de cultura e em suco de acerola e verificar as

alterações morfológicas nos fungos ocasionadas pela quitosana.

2. Métodos

2.1. Obtenção das cepas microbianas

As cepas fúngicas utilizadas como microrganismos teste foram obtidas da coleção de

cultura de microrganismos da Micoteca, Departamento de Micologia, CCB, UFPE, isoladas

segundo metodologia descrita por Menezes & Assis, (2004). Foram utilizados para os testes

quatro fungos filamentosos, Aspergillus flavus (4540), Penicillium foniculosum (4511), Fusarium

moniliforme (4542) e Penicillium pinophilum (4546).

2.2. Solubilização da quitosana


utilizada nesse estudo. A solução de quitosana foi preparada em ácido acético 1% (v/v), a uma

concentração de 20mg/mL com pH ajustado para 5,5 usando NaOH 20% (Shigemasa &

Minami, 1996).

60

2.3 Preparo do inóculo

As cepas fúngicas foram repicadas em ágar Sabouraud e incubadas em estufa

bacteriológica a 28°C, overnight. Em seguida, foram obtidas suspensões padronizadas em 107

esporos viáveis/mL em solução fisiológica esterilizada (NaCl 0,9%) pela técnica de exclusão

com azul de Amann em câmara de Neubauer para cada cepa analisada.

2.4. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida

Mínima (CFM) em meio de cultura e em matriz alimentar:

As CIM e CFM da quitosana foram determinadas através da técnica de macrodiluição

em caldo Sabouraud ou suco de acerola em uma concentração de 60% (m/v) homogeneizado

em liquidificador, pasteurizado, adicionado de quitosana e armazenado sob refrigeração em

garrafas plásticas até o momento de condução das análises.

Foram realizadas diluições seriadas da quitosana 20 mg/mL em meio caldo

Sabouraud ou suco de acerola, obtendo-se concentrações finais de quitosana (0,312; 0,625;

1,25; 2,5; 5,0 e 10,0 mg/mL). Posteriormente foi inoculado 1 mL da suspensão fúngica.Foram

estabelecidas duas amostras controle, uma sem a adição de quitosana e outra na presença de

ácido acético 1% (1:1 v/v). Em seguida, o sistema foi incubado em estufa a 28 °C por 72

horas. Ao término do período de incubação, a concentração mais baixa de quitosana que não

apresentou crescimento fúngico visível foi considerada como a CIM.

Após a obtenção da CIM, alíquotas de 100 µL dos tubos que não apresentarem

crescimento fúngico foram inoculadas em placas de Petri com ágar Sabouraud e incubadas em

estufa por 72 horas a 28 ºC. Foi considerada CFM a primeira concentração, na qual a cepa

61

fúngica não apresentou capacidade de crescimento em meio ágar Sabouraud adicionado de

quitosana (Sharma & Tripathi, 2007).

2.5. Interferência sobre o crescimento micelial radial fúngico

A avaliação da inibição do crescimento micelial radial foi determinada utilizando-se a

técnica do envenenamento do substrato de crescimento (diluição em meio sólido). Para a

execução da técnica, inicialmente foi tomada uma porções de 2 mm de diâmetro de culturas

da cepas fúngicas com crescimento de 10 dias em ágar Sabouraud a 28 °C, a qual foi colocada

no centro de placas de Petri estéreis com ágar Sabouraud adicionado de quitosana em

diferentes concentrações (2,5; 5; 10 mg/mL) escolhidos com base nos resultados de CIM e

CFM. O sistema foi incubado em estufa a 28 °C até que o tratamento controle tomasse toda a

placa. Em intervalos de tempo de incubação de 12 hs, o crescimento micelial radial da colônia

fúngica foi medido em triplicata e o resultado expresso em milímetros (mm) (Daferera,

Ziogas & Polissiou, 2003). Os controles incluídos neste ensaio foram a observação do

crescimento micelial radial da cepa fúngica em ágar Sabouraud sem adição de quitosana e

adicionado de ácido acético a 1% (1:1 v/v).

2.6. Efeito sobre a morfogênese das cepas de A.flavus

A. flavus foi selecionado para os ensaios de morfogênese em virtude da sua resistência a

quitosana observada nos ensaios anteriores e de acordo com Velmurugan, Kumar, Han, Nahm, &

Yang (2009). O fungo foi repicado em meio BDA para produção de esporos e incubado a 28ºC por 6

dias. Após este período, um total de 107 esporos/mL foram coletados e inoculados em caldo

Sabouraud, acrescido de quitosana nas concentrações de 1,25; 2,5 e 5 e incubados a 28ºC sob

62

agitação orbital de 150 rpm por 3 dias. Amostras controle foram crescidas no meio sem quitosana,

adicionada de ácido acético a 1% (1:1 v/v) e pH ajustado para 5,5 nas mesmas condições descritas

acima.

2.6.1. Microscopia Óptica


diferentes concentrações de quitosana (1,25; 2,5 e 5 mg/mL), foram lavadas em solução salina

tamponada, pH 7,2, por duas vezes, durante 10 minutos. Em seguida, as amostras foram montadas

em lâmina de microscopia, coradas com azul de Amann, observadas e fotografadas em Microscópio

(Ziess).

2.6.2. Microscopia Eletrônica de Varredura


diferentes concentrações de quitosana, foram lavadas em solução salina tamponada, pH 7,2,

por duas vezes, durante 10 minutos. Em seguida foram fixadas com glutaraldeído 2,5% em

tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 1 hora, a 28ºC. Finda a etapa de fixação, todas as

amostras foram novamente lavadas com tampão fosfato, duas vezes durante 10 minutos.

Seguiu-se a pós-fixação com tetróxido de ósmio 1%, em tampão fosfato 0,1 M, durante 1 hora

a 28ºC, em condições de escuridão. Em seguida, as amostras foram, mais uma vez lavadas

com tampão fosfato 0,1M, sendo posteriormente destinadas ao processo de desidratação. Para

a desidratação das amostras foi utilizado etanol, em proporções de 50%, 70%, 90% (intervalos

de 5 minutos para cada troca) até a proporção de 100% (três vezes, 10 minutos cada troca)

63

(De Souza, 2000). Logo em seguida as amostras foram submetidas à secagem em ponto

crítico, e então observadas e fotografadas no microscópio eletrônico de varredura (JEOL, JSM

5600 LV).

3. Resultados e discussão

3.1 CIM e CFM

Quitosana (85% DD) solubilizada em ácido acético 1% apresentou atividade

fungiostática e fungicida para todas as cepas de fungos testadas, tanto em meio de cultura

quanto em suco de acerola (Tabela 1). A solução de quitosana apresentou CIM de 1,25

mg/mL e de 5mg/mL para P. foniculosum em meio de cultura e suco de acerola,

respectivamente e CIM de 5 mg/mL para as outras cepas testadas em ambas as condições (

meio e suco). Só foi verificada diferença na CFM da solução de quitosana em meio de cultura

e suco de acerola também para o P. foniculosum, sendo respectivamente de 2,5mg/mL e de 5

mg/mL, contudo visualiza-se na Tabela 1 a mesma CFM (10 mg/mL) em meio de cultura e

em suco de acerola para todas as outras cepas. O controle ácido apresentou crescimento

normal indicando que o ácido acético não influenciou na atividade antimicrobiana da

quitosana.

Esses resultados estão de acordo com Seo, Mitsuhashi & Tanibe, (1992); Knowles &

Roller, (2001) cujos resultados variam de 0,001 mg/mL para o Botrytis cinerea até 5 mg/mL

para Piricularia oryzae. Stossel & Leuba (1984); Cuero, Duffus, Osuji & Pettit (1991)

verificaram que os fungos fitopatogênicos Fusarium solani e Colletotrichum lindemuthianum

foram inibidos pela quitosana e N-carboximetil quitosana, sendo necessária uma concentração

de 10g/L para inibir algumas cepas de fungos filamentosos. Resultados similares foram

64

relatados com Aspergillus niger e Aspergillus parasiticius em alimento oriental por El

Ghaouth et al. (2000). Para o Fusarium oxysporum, Peng, Han, Liu & Xu (2005) obteveram

valores de CIM e CFM de 10 e 10 mg/mL respectivamente para a hidroxipropil quitosana.

Roller & Covill (1999) verificaram que M. racemosous e Byssochlamys spp foram inibidos

pela quitosana glutamato à níveis próximos ou um pouco acima de 1 mg/mL. Quitosana a

1mg/mL reduz o crescimento de vários fungos exceto os zigomycetos que são os fungos

contendo a maior quantidade desse componente na sua parede celular.

Roller & Covill (1999) relatam que a quitosana glutamato foi considerada um

conservante efetivo conta fungos leveduriformes deterioradores em suco de maçã. A presença

de quitosana glutamato (Grau de desacetilação 75% a 85%) em suco de maçã (pH 3,4) a um

nível de 0,1 a 5 g/L inibiu o crescimento de todas as leveduras deterioradoras

Zygosaccharomyces bailii 906 HP; Saccharomyces cerevisiae 3085, SD 28;

Schizosaccharomyces pombe; Saccharomyces exiguous; Saccharomycodes ludwigii a 25 ◦C.

Esses valores estão de acordo, com Fang, Li & Shih, (1994) que investigaram o uso da

quitosana em fungos deterioradores de Kumquat cristalizado e obtiveram a concentração

inibitória de 6 mg/mL de quitosana para as cepas testadas.

As propriedades biocidas da quitosana em sistemas tais como água destilada, tampões

e meios de cultura são insuficientes em indicar o desempenho da quitosana na matriz

alimentar onde interações com outros componentes podem interferir na atividade

antimicrobiana da quitosana. O presente estudo, no entanto, não evidenciou grandes

diferenças entre os testes in vitro e na matriz alimentar. Isso ocorreu principalmente pelo fato

do suco ter um pH baixo (3,37) possibilitando uma melhor dissolução e interação das cargas

positivas da quitosana com a superfície celular dos fungos carregada negativamente

(Devlieghere, Vermeulen & Debevere, 2004).

65

Devlieghere, Vermeulen & Debevere (2004) estudaram a interação da quitosana com

o amido proteínas, NaCl e gorduras, relatando que todos exceto a gordura tiveram efeito na

atividade antimicrobiana. O sucos são compostos de carboidratos simples como glicose,

frutose e sacarose, são pobres em proteínas, NaCl e gorduras, não representando assim

grande interferência na atividade antimicrobiana da quitosana.

3.2. Crescimento micelial radial fúngico

Solução de quitosana a 2,5 mg/mL (CIM/2) inibiu o crescimento do A. flavus em 53%

após 30h, de P. pinophilum em 69% após 18h e F. moniliforme em 59% com 42h de

crescimento. Na concentração CIM (5 mg/mL) a solução de quitosana inibiu o crescimento do

A. flavus em 69% após 30h, do P. pinophilum em 70% após 18h e F. moniliforme em 79%

com 42h de crescimento, como observado nas figuras 1, 2 e 3. O controle adicionado de ácido

apresentou crescimento normal indicando que o ácido acético não teve influência na atividade

antimicrobiana da quitosana.

A porcentagem de inibição do crescimento radial aumentou com a concentração de 0

mg/mL para 5 mg/mL ao longo do tempo. Esses resultados são corroborados com El Hassni,

El Hadrami, Daayf, Barka & El Hadrami (2004) que observaram inibição do crescimento do

Fusarium oxyosporum f.sp.albedinis em 10, 40 e 75% na presença de quitosana 0,1; 0,5 e

1mg/mL respectivamente.

Resultados semelhantes foram evidenciados por El Ghaouth, Arul, Asselin &

Benhamou (1992) que relataram redução do crescimento radial dos fungos filamentosos

Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Colletrotichum gloeosporioides e Rhizopus stolonifer

com o aumento da concentração de quitosana de 0,75 a 6,0 mg/mL. O mesmo efeito foi

66

observado contra Sclerotinia sclerotiorum ao se aumentar a concentração de quitosana de 1 a

4% (m/v) por Cheah & Page (1997).

Outros estudos mostraram um decréscimo linear do crescimento de Rhizoctonia solani

com o gradual aumento da concentração de 0,5 a 6,0 mg/mL de quitosana (Wade &

Lamondia, 1994). Os crescimentos miceliais de Fusarium solani f. sp. phaseoli e F. solani f.

sp pisi foram inibidos a concentrações mínimas de 12 e 18 mg/mL (Kendra & Hadwiger,

1984). Inibições completas do crescimento dos fungos F. oxysporum, R. stolonifer,

Penicillium digitatum e C. gloeosporioides foram obtidas na concentração de 3% (m/v)

(Bautista-Baños,, Hernández-López, Bosquez-Molina & Wilson, 2003; Bautista-Baños,,

Hernández-López & Bosquez-Molina,2004). Esses resultados estão de acordo com

Plascencia-Jatomea, Viniegra, Olayo, Castillo-Ortega & Shirai, (2003) que detectaram a inibição

do crescimento radial do Aspergillus niger, sendo verificado uma atividade fungiostática e

não fungicida da quitosana, com taxa máxima de inibição de crescimento radial de 73%,

determinado em 24h com concentrações entre 3 e 5 mg/mL. Tikhonov et al. (2006) mostraram

uma inibição no crescimento do F. oxysporum pela quitosana de baixo peso molecular com

concentrações de 0,1 a 1 %.

A. flavus foi o fungo mais resistente para quitosana apresentando porcentagens de

inibição menores que as outras cepas testadas. Esse resultado está de acordo com

Velmurugan, Kumar, Han, Nahm, & Yang (2009) que cita o Aspergillus spp. como melhor

exemplo de fungo resistente a quitosana. Roller & Covill (1999) relatam ainda que o

crescimento de A. flavus resistiu a quitosana glutamato até uma concentração de 10 mg/mL.

3.1. Microscopia óptica

67

Os aspectos morfológicos observados ao microscópio óptico do micélio de A. flavus

submetido ao tratamento com diferentes concentrações de quitosana (1,25; 2,5 e 5,0 mg/mL)

são demonstrados na figura 4. No micélio controle (Fig. 4a), sem adição de quitosana, podem-

se observar hifas lineares, alongadas, com citoplasma homogêneo, bem como paredes e

estruturas internas normais. O micélio tratado com 1,25 mg/mL de quitosana (Fig. 4b) não

apresentou modificações morfológicas, exibindo hifas bem coradas e conteúdo citoplasmático

homogêneo.

Por outro lado, observações microscópicas das hifas tratadas com quitosana nas

concentrações de 2,5 e 5,0 mg/mL revelaram que o polímero pode alterar a morfologia das

hifas. O micélio cultivado no meio com 2,5 mg/mL de quitosana (Fig. 4c-d) apresentou hifas

menos pigmentadas associada a perda de conteúdo citoplasmático e com grande quantidade

de material amorfo ligada a parede celular ao longo de toda a hifa. A presença de precipitado

amorfo foi verificada na maioria, mas não em todas as hifas.

Por conseguinte, a análise das hifas submetidas ao tratamento com 5,0 mg/mL de

quitosana (Fig. 4e-f) permitiu verificar alterações morfológicas mais severas, como hifas

curtas, largas, deformadas, com maior ramificação, citoplasma granular sugestivo de autólise,

perda de conteúdo citoplasmático em alguns pontos da hifa com ruptura da parede celular.

Além do que, podem-se observar estruturas anômalas semelhantes a brotos e bifurcações no

ápice das hifas, assim como a indução de estruturas de resistência como os clamidosporos.

Contudo, não observamos a presença de precipitado amorfo nas hifas tratadas com maior

concentração de quitosana. Isto pode ser explicado pelo fato do número elevado de cargas

positivas provavelmente formarem uma rede de carga positiva que impediu a sua precipitação

(Sudarshan et al. 1992). Não foram identificadas alterações na morfologia da amostra tratada

com ácido acético a 1%, o que indica que o ácido não influenciou na atividade antimicrobiana

da quitosana.

68

Resultados semelhantes foram obtidos por Benhamou (1992), El Ghaouth et al. (1992),

Cheah & Page (1997) nos fungos F. oxysporum f. sp. radicislycopersici, R. stolonifer e S.

sclerotiorum tratados com quitosana mostrando excessivas ramificações micelianas, formas

anormais, dilatação e redução do tamanho das hifas. Similarmente, a quitosana causou

mudanças morfológicas como grandes vesículas ou células vazias isentas de citoplasma nas

hifas de B. cinerea e F. oxyporum f. sp. albedinis (Ait Barka et al., 2004; El Hassni et al.,

2004). Singh et al. (2008) estudando o efeito da quitosana nas características fisiológicas e

morfológicas de Sphaeropsis sapinea e Trichoderma harzianum verificou como principal

resultado uma tendência a redução do comprimento e diâmetro das hifas com o aumento da

concentração de quitosana.

Neste estudo, também observamos redução do comprimento das hifas, porém em

contraposição verificamos um maior espessamento das mesmas. As alterações morfológicas

obtidas neste trabalho foram mais freqüentes e mais intensas com o aumento da concentração

de quitosana.

3.4 Microscopia eletrônica de varredura

Estudos dos efeitos de inibidores sobre a morfologia celular são importantes, pois as

mudanças morfológicas decorrentes podem sugerir o alvo ou o mecanismo de ação do

referido inibidor (Souza, 2010).

Os efeitos de concentrações crescentes de quitosana na morfologia e superfície celular

de A. flavus examinados ao Microscópio Eletrônico de Varredura são apresentados na figura

5. O micélio controle cultivado na ausência de quitosana (Fig. 5a) exibe hifas homogêneas e

regulares de diâmetro constante com superfície externa lisa e ápices arredondados. Após 2

69

dias de incubação em meio contendo quitosana (2,5 e 5,0 mg/mL) as hifas apresentaram

alterações morfológicas e de superfície celular quando comparadas com as amostras controle.

As hifas tratadas com 2,5 mg/mL de quitosana (Fig. 5b) apresentaram-se distorcidas e

com superfície irregular e áspera evidenciando uma camada extracelular cobrindo toda a hifa.

A extensão da camada extracelular sobre a hifa é mais evidente na figura 5c. Este resultado

confirma a observação feita ao microscópio óptico onde registrou-se deposição de material

amorfo sobre a superfície da hifa.

Com o aumento da concentração de quitosana para 5,0 mg/mL pode-se observar hifas

mais largas, distorcidas e altamente enrrugadas apresentando um clamidósporo (Fig. 5d). A

redução do conteúdo citoplasmático verificada na microscopia óptica pode explicar o

enrrugamento das hifas observadas na microscopia eletrônica. Além disso, na figura 5e

verifica-se efeitos mais drástico induzidos pela quitosana como a destruição da estrutura

celular evidenciada pela ruptura de algumas hifas.

Estes resultados estão de acordo com os achados de Muzzarelli et al. (2001) e Vesentini, et

al. (2007), que demonstraram que a quitosana é capaz de induzir profundas modificações na

morfologia de diferentes espécies de fungos, além de formarem uma película sobre toda a

superfície das hifas. Jatomea et al. (2003), por sua vez, estudando o efeito da quitosana sobre a

germinação de Aspergillus niger, verificaram anormalidades morfológicas como esporos

equinulados e a deposição de agregados de quitosana sobre os esporos. Estes autores sugerem que

o mecanismo de inibição da germinação de esporos pode ser explicado pela interação direta da

quitosana com a parede celular do esporo.

Por outro lado, não se pode afirmar que as alterações da organização celular da hifa

observadas nesta pesquisa estão relacionadas ao efeito direto da quitosana (Benhamou, 1992).

A atividade antimicrobiana da quitosana está relaciona com sua natureza policatiônica, haja

vista, sua capacidade de interferir prontamente com os resíduos carregados negativamente de

moléculas presentes na superfície celular microbiana, levando por sua vez, a alteração da

70

permeabilidade da membrana celular e, por conseguinte, a um desequilíbrio osmótico

(Benhamou, 1992). Dessa forma, podemos inferir que as desordens morfológicas verificadas

nas hifas de A. flavus, tais como perda de conteúdo citoplasmático, hifas vazias e superfície

celular enrrugada, são decorrentes da ação da quitosana sobre a membrana celular.

Assim sendo, a análise ao microscópio óptico e eletrônico de varredura revelou que a

inibição do crescimento de A. flavus induzido pela quitosana obtida neste estudo, está

diretamente associada a marcantes alterações morfológicas.

4. Conclusão

A quitosana (85% DD) apresenta atividade fungiostática e fungicida in vitro e em

matriz alimentar, para os fungos Aspergillus flavus, Penicillium foniculosum, Penicillium

pinophilum e Furasium moniliforme. Em concentrações CIM/2 e CIM a quitosana acarreta em

alterações morfológicas em Aspergillus flavus.

Levando em consideração que a maioria dos agentes antimicrobianos utilizados em

alimentos são apenas biostáticos e não biocidas, considera-se que a concentração ideal para a

aplicação em alimentos é de 5mg/mL. Dessa forma, o presente estudo apresenta a quitosana

como alternativa natural ao uso de conservantes químicos tradicionais utilizados na indústria

de alimentos, para a conservação de suco de acerola.

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Tabela 1- Determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) e Concentrações

Fungicidas Mínimas (CFM) da quitosana contra cepas de fungos filamentosos em meio de

cultura e suco de acerola.

Microrganismos

CIM (mg/mL) CFM (mg/mL)

Meio de

cultura Suco de acerola

Meio de

Cultura Suco de acerola

Aspergillus flavus 5 5 10 10

Penicillium pinophilum 5 5 10 10

Penicillium foniculosum 1,25 5 2,5 5

Fusarium moniliforme 5 5 10 10

78

Figura 1- Inibição do crescimento radial (%) do A. flavus com 12, 18, 24 e 30h de crescimento.

Figura 2- Inibição do crescimento radial (%) do P. pinophilum com 12 e 18h de crescimento.

79

Figura 3- Inibição do crescimento radial (%) do F. moniliforme com 30, 36 e 42h de crescimento.

80

Figura 4 – Microscopia Óptica do micélio de Aspergillus flavus cultivado em caldo Sabouraud com e sem quitosana durante 2 dias a 25-28ºC sob agitação orbital de 150 rpm. a) Micélio controle de A. flavus. b) Micélio tratado com 1,25 mg/mL de quitosana. c-d) Efeito de 2,5 mg/mL de quitosana. e-f) Alterações morfológicas do micélio induzido por 5,0 mg/mL de quitosana. Ampliação 1000x.

81

Figura 5- Microscopia Eletrônica de Varredura de Aspergillus flavus cultivado em caldo Sabouraud com e sem quitosana durante 2 dias a 25-28ºC sob agitação orbital de 150 rpm. a) Micélio controle de A. flavus. b-c) Efeito de 2,5 mg/mL de quitosana. d-e) Alterações ultraestruturais do micélio induzido por 5,0 mg/mL de quitosana. Barras de escala 5µm.

e

a b

c d

82

Artigo 2:

O artigo será submetido à revista Food Control sendo intitulado “POTENCIAL DA

QUITOSANA COMO CONSERVANTE NATURAL DE SUCO”. A revista é classificada

como B1 em Medicina II.

83

Potencial da quitosana como conservante natural de suco

Ilsa Cunha Barbosaa; Thayza Christina Montenegro Stamfordb; Carlos Eduardo

Vasconcelos de Oliveirac; Tânia Lúcia Montenegro Stamfordd2.

a Programa de Pós-graduação em Nutrição - Mestrado, Universidade Federal de Pernambuco, Recife – PE, Brasil;

b Departamento de Fisiologia e Patologia, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa – PB, Brasil;

c Programa de Pós-graduação em Nutrição - Doutorado, Universidade Federal de Pernambuco, Recife – PE, Brasil;

d Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco, Recife -PE, Brasil;

Resumo

O estudo do potencial do uso de quitosana como conservante natural de suco de

acerola em substituição a aditivos químicos foi realizado por meio da avaliação de parâmetros

físico químicos, sensoriais e microbiológicos. A quitosana comercial (Sigma®) foi dissolvida

em ácido acético a 1% (20mg/mL). O suco de acerola foi testado com concentrações de

quitosana de 2,5 e 5 mg/mL com armazenamento 0, 7 e 14 dias. Para os parâmetros

sensoriais, usou-se o armazenamento de 0, 5 e 7 dias. A quitosana estendeu a vida de

prateleira do suco de acerola, com relação ao controle da acidez, do escurecimento e inibição

do crescimento microbiano. Na concentração de 5 mg/mL de quitosana houve uma redução

significativa do teor de ácido ascórbico. Nos tempos 5 e 7 dias de armazenamento a quitosana

aumentou a aceitação sensorial devido a sua ação na estabilidade do suco. Conclui-se que a

quitosana tem potencial para uso na conservação do suco de acerola em substituição aos

aditivos químicos tradicionalmente utilizados. No entanto recomenda-se o uso de uma

concentração de 2,5 mg/mL em até 7 dias de armazenamento a fim de manter a qualidade

nutricional e sensorial.

Palavras-chave: Biopolímero, Suco de acerola, Vida de prateleira.

Corresponding author Tel. 00558132684611

84

E-mail Adress: [email protected]

1. Introdução

O interesse por alimentos naturais tem crescido e contribuído para o aumento do

consumo de sucos de frutas. As frutas exóticas tropicais são ideais para o crescente mercado

de sucos devido a sua diversidade de aromas e sabores, além do seu valor nutricional. Nesse

grupo, destaca-se a acerola, Malphighia glabra, que é um fruto nativo das Antilhas, mas

cultivado também na América do Sul, Flórida e Texas. De acordo com o país de origem pode

receber vários nomes dentre eles Cereja das Antilhas e Cereja de Barbados. No Brasil, os

produtos de acerola destacam-se pelo alto teor de ácido ascórbico e qualidade sensorial sendo

os mais comercializados a polpa congelada e o suco pasteurizado (Gomez, Reynes, Dornier &

Herbert, 1999).

O suco de acerola, assim como os demais sucos de frutas, apresenta vida de prateleira

limitada, chegando a até 10 dias após o processamento. A deterioração microbiana, produção

de odores desagradáveis e degradação de ácido ascórbico são três das principais causas da

perda de qualidade durante a vida de prateleira. As características físico químicas, tais como

alta atividade de água, alta acidez e alto teor de açúcares contribuem para o crescimento de

bactérias ácido láticas, aeróbias mesófilas e bolores e leveduras que são responsáveis pela sua

deterioração e conseqüente redução da vida de prateleira (Fellers, 1988).

A fim de prolongar a vida útil de sucos, aditivos químicos são utilizados, no entanto

alguns países limitam seu uso devido aos possíveis danos à saúde. Nesse sentido, a utilização

de sulfitos está restrita nos Estados Unidos desde 1990, devido aos perigosos efeitos colaterais

para pessoas com asma (Raybaudi-Massilia, Mosqueda-Melgar, Soliva-Fortuny, & Martih-

Belloso, 2009).

Esses fatos, combinados com a crescente demanda dos consumidores por alimentos

naturais, estimula o estudo da área ciência dos alimentos a obter novos conservantes que

atendam as perspectivas do mercado sem negligenciar as demandas de qualidade dos

consumidores.

Nesse contexto tem-se a quitosana que é um heteropolimero natural, composto por

unidades β-1,4 D-glucosamina e N-acetilglucosamina. Devido as suas características

biológicas únicas, que incluem biodegradabilidade e atoxidade, tem sido amplamente aplicada

na indústria farmacêutica, de alimentos e no tratamento de água. A quitosana é obtida a partir

85

da desacetilação da quitina, um oligossacarídeo natural que é o principal componente da

parede celular de fungos e exoesqueleto de artrópodes e insetos, sendo um dos mais

abundantes materiais orgânicos depois da celulose. Possui atividade antimicrobiana contra

bactérias, fungos filamentosos e leveduras, com um amplo espectro de atividade contra

bactérias Gram positivas e Gram negativas mas baixa toxidade em células de mamíferos

(Ueno, K., Yamaguchi, T., Sakairi, Nishi & Tokura, 1997).

A quitosana ainda não é aprovada como aditivo alimentar na América do Sul, no

entanto já é empregada na produção de alimentos em países como Japão, Estados Unidos e

Alemanha. Desde 1983 no Japão e 1995 na Coréia a quitosana é aprovada como aditivo em

alimentos (No, Meyers, Prinyawiwatkul & Xu, 2007) e nos Estados Unidos foi reconhecido

como GRAS (Generelly Recognised as Safe) pela Food and Drug Administration (FDA) em

2005 (USFDA, 2007).

Essas propriedades tornam a quitosana ideal para uso como aditivo no processamento

de sucos de frutas. Pode ser utilizada no processo de clarificação, com a redução da turbidez

(Soto-Peralta, Mller & Knorr, 1989; Chen & Li, 1996; Chatterjee, Chatterjee, Chatterjee &

Guha, 2004; Liu, 2006; Rungsardthong, Wongvuttanakul, Kongpien & Chotiwaranon, 2006;

Wang, Guan & Yang, 2007), na redução da acidez (Imeri & Knorr, 1988; Rwan & Wu, 1996),

na redução do escurecimento enzimático (Sapers, 1992), como antimicrobiano (Roller &

Covill, 1999; Rhoades & Roller, 2000; Kisko, Sharp & Roller, 2005; Malinowska-Panczyk,

Kolodziejska, Murawska, & Wolosewicz, 2009; Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan, 2009),

antioxidante (Chien, Sheu, Huang, & Su, 2007) e na extensão da vida de prateleira (Diana,

Rico, Barat, & Barry- Ryan, 2009).

O trabalho teve como objetivo verificar a eficácia da quitosana comercial na extensão

da vida de prateleira do suco de acerola, abordando os seus aspectos físico químicos,

sensoriais e microbiológicos.

2. Materiais e métodos

2.1 Materiais


dissolvida em ácido acético a 1% (20mg/mL) com pH ajustado para 5,5 (Shigemasa &

Minami, 1996).

86

Na elaboração do suco de acerola, os frutos foram lavados, desintegrados e

despolpados em liquidificador. Usou-se uma diluição de 60% (m/v), após a filtração foi

pasteurizado à 62°C por 30 min, adicionado em seguida o gel de quitosana e armazenado a

4°C em garrafas plásticas e refrigeradas até o momento das análises.

2.2 Métodos

2.2.1. Parâmetros físico químicos

Foram avaliadas as seguintes análises: Sólidos solúveis totais (SST) determinados por

leitura em refratômetro de bancada (aus jena Modelo II), com os resultados expressos em

°Brix, acidez titulável, com os resultados expressos em ácido cítrico, determinada por meio de

titulação com solução de NaOH 0,1 N. O pH foi determinado utilizando potenciômetro digital

(modelo pH Meter Tec-2 , Tecnal) e o teor de ácido ascórbico foi medido por titulometria

com 2,6 diclorofenolindofenol, (AOAC, 1997).

A turbidez foi medida por leitura direta no espectofotômetro (Bioespectro –

espectrofotômetro SP-22) com comprimento de onda de 600 nm, água destilada utilizada

como branco e os resultados expressos em unidades de absorbância (UA) mL-1 suco de

acerola. O potencial de escurecimento a uma absorbância a 320 nm foi medido e os resultados

expressos em unidades de absorbância (UA) mL-1 suco de acerola. Para a medida da

viscosidade utilizou-se um viscosímetro de Brooksfield (LVT, série 86910), utilizou-se o

spindle nº 1. Os parâmetros de cor L*a*b foram medidos em um colorímetro (Minolta)

(Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan, 2009).

2.2.2. Parâmetros microbiológicos

A contagem de bactérias ácido láticas, de bactérias aeróbias mesófilas, de fungos

filamentosos e leveduriformes, coliformes totais e fecais e detecção de Salmonella foram

realizadas de acordo com metodologia descrita por Vanderzant & Spplittstoesser (1992). Os

resultados foram expressos em Log de Unidades Formadoras de Colônias por mL (Log de

UFC/mL), exceto para coliformes totais e fecais que foram expressos em NMP/mL e a análise

de Salmonella expressa em presença ou ausência.

2.2.3. Análise Sensorial

87

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE/CCS sob número

de protocolo 050/10. A avaliação sensorial dos sucos foi realizada segundo metodologia do

Instituto Adolfo Lutz (2005), ao longo da vida de prateleira, imediatamente após a elaboração,

com 5 e 7 dias de armazenamento. Este período foi estabelecido de acordo com os resultados

físico químicos. Só foram submetidos a este experimento os sucos com parâmetros dentro do

preconizado pela RDC nº 12 para os Padrões Microbiológicos (Brasil, 2001) e pelos Padrões

de Identidade e Qualidade (PIQ) do suco de acerola (Brasil, 2000).

O teste de aceitabilidade utilizando uma escala hedônica de nove pontos (1 = desgostei

extremamente; 2 = desgostei muito; 3 = desgostei moderadamente; 4 = desgostei

ligeiramente; 5 = nem gostei/nem desgostei; 6 = gostei ligeiramente; 7 = gostei

moderadamente; 8 = gostei muito; 9 = gostei extremamente) avaliou os atributos aparência,

viscosidade, preferência global, sabor e odor. Paralelamente também foi avaliada a intenção

de compra. Para tanto, foi empregado a escala hedônica de cinco pontos (1 = jamais

compraria; 2 = Possivelmente não compraria; 3 = talvez comprasse/talvez não comprasse; 4 =

possivelmente compraria; 5 = compraria). Foi utilizado um painel de 50 provadores treinados

(18-50 anos), alunos, professores e funcionários da UFPE, selecionados com base nos hábitos

e interesse em consumir suco de acerola. Os testes foram realizados no Laboratório de Análise

Sensorial da UFPE, em cabines individuais utilizando-se luz branca, longe de ruídos e odores,

em horários previamente estabelecidos.

2.2.4. Delineamento experimental e análises estatísticas

Nos ensaios de vida de prateleira, o tempo de armazenamento à 4°C foi de até 14 dias

após o processamento, de acordo com Fellers (1988). Os experimentos foram conduzidos em

triplicata nos tempos 0, 7 e 14 dias após a elaboração do suco. Foram testadas duas

concentrações de quitosana 2,5 (T3) e 5 mg/mL (T4) com base em triagem sensorial e nos

valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) para fungos e bactérias (Rabea, Badawy,

Stevens, Smagghe & Teurbaut, 2003). Foram realizados dois experimentos: na ausência de

quitosana (T1) e na ausência de quitosana e presença de ácido acético 1% (T2).

88

Utilizou-se testes de estatística descritiva (média e desvio padrão) e inferencial (teste

de Tukey) para determinação de diferenças estatisticamente significantes (p<0,05) entre os

tratamentos aplicados. Para o tratamento estatístico utilizou-se o software Sigma Stat.2.03.

3. Resultados e discussão

3.1 Parâmetros físico-químicos

3.1.1. Sólidos Solúves Totais °Brix (SST)

Os valores de Sólidos Solúveis Totais (SST) variaram de 4,33 a 8°Brix (Tabela 1).

Estes estão dentro dos preconizados pelos Padrões de Identidade e Qualidade (PIQ) (mínimo

5 °Brix) de sucos de frutas exceto o tratamento com 5 mg/mL de quitosana (T4) do tempo 14

que apresentou o valor 4,33 (Brasil, 2000). Os resultados encontrados estão de acordo com

Matsuura & Rolim (2002), Figueirêdo, Grandin & Martucci (2001), Quinteros (1995), Matta,

Cabral & Silva (2004), que encontraram valores semelhantes variando de 5,8 a 8 °Brix.

Os SST dos tratamentos com quitosana 2,5 e 5 mg/mL (T3 e T4) reduziram

significativamente (p < 0,05) em relação ao controle sem quitosana (T1) e com ácido acético

(T2). Esses resultados corroboram com Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009) que

estudaram a ação da quitosana na estabilidade do suco de laranja.

A redução dos SST com a adição de quitosana pode ser explicada pela habilidade

desse polímero positivamente carregado coagular os sólidos suspensos por meio da ligação

aos açúcares carregados negativamente (Sapers, 1992).

Houve uma redução significativa (p<0,05) dos SST em todos os tratamentos (T1, T2,

T3 e T4) ao longo do armazenamento. Matta, Cabral & Silva (2004) encontraram resultados

semelhantes em suco de acerola armazenado em garrafa de vidro. Esta redução, entretanto,

pode ser atribuída mais a problemas de amostragem e homogeneidade da amostra do que ao

armazenamento em si, já que não foi observada uma tendência de redução ou de aumento

desse parâmetro.

3.1.2 Acidez titulável

89

Em relação à acidez, os valores encontrados variaram de 0,87% a 1,97% (Tabela 1)

estando de acordo com o preconizado pelo PIQ do suco de acerola (mínimo de 0,8%) (Brasil,

2000). Figueirêdo, Grandin & Martucci (2001), Matsuura & Rolim (2002) e Chaves, Golveia,

Almeida, Leite & Silva (2004) encontraram valores semelhantes em suco de acerola de

1,07%, 0,89% e 1,14%.

A amostra T4 em 14 dias de armazenamento (Tabela 1) mostrou uma redução

significativa (p<0,05) da acidez em relação aos controles T1 e T2. Imeri & Knorr, (1988)

encontraram resultado semelhante em suco de maçã e de cenoura. Houve leve diminuição,

porém não significativa, da acidez com a adição de quitosana o que corrobora com Rwan &

Wu (1996) que mostraram que a adição de quitosana a uma concentração de 15 mg/mL

reduziu o conteúdo de ácido cítrico em 56,6 %.

A acidez do suco aumentou significativamente nos controles (T1 e T2) ao longo de 14

dias. Sousa, Yuyama, Aguiar, & Pantoja. (2006) obtiveram resultado semelhante, com o

aumento da acidez do suco de açaí ao longo do armazenamento. Este aumento, entretanto, não

teve influência significativa sobre o suco de acerola adicionado de quitosana (T3 e T4). Esse

efeito é explicado pela capacidade da quitosana, carregada positivamente em pH baixo, se

ligar aos ácidos, de carga negativa (Einbu & Varum, 2003).

3.1.3 pH

Os valores de pH variaram de 2,07 a 4,0 (Tabela 1). Resultados semelhantes foram

obtidos por Figueirêdo, Grandin, & Martucci (2001) que encontraram um pH de 3,5,

Quinteros(1995) 3,10 e Matsuura & Rolim (2002) de 3,30 em suco de acerola.

O pH de T4 aumentou significativamente com a concentração de quitosana em relação

a T1. Esses resultados estão de acordo com Diana, Rico, Barat & Barry- Ryan (2009) que

obtiveram um aumento do pH com a adição de quitosana 2 mg/mL.

Houve uma redução significativa do pH de T1 e T2 com 14 dias de armazenamento.

Resultados semelhantes foram mostrados por Sousa, Yuyama, Aguiar & Pantoja. (2006). Em

T3 e T4 o armazenamento não afetou significativamente o pH demonstrando o efeito da

quitosana na estabilidade do suco.

O aumento do pH e a estabilidade do suco durante a vida de prateleira pode ter

ocorrido devido a capacidade da quitosana reduzir a acidez (Imeri & Knorr, 1988; Rwan &

Wu, 1996) o que corrobora com a redução de acidez evidenciada neste estudo.

90

3.1.4 Ácido ascórbico

O teor de ácido ascórbico variou de 302,6 mg/100g a 1611,54 mg/100g de vitamina C

(Tabela 2). Os valores de T4 no tempo de 7 e 14 e T3 no tempo 14 estavam abaixo do

preconizado pelo PIQ do suco de acerola (mínimo de 600 mg/100g) (Brasil, 2000). Valores

semelhantes foram obtidos por Matsuura & Rolim (2002) 1.000 mg/100g, Maia et al. (2007)

593,8 mg/100g, Chaves, Golveia, Almeida, Leite & Silva (2004) 98,65 mg/100g em suco de

acerola.

A concentração de quitosana 5mg/mL (T4) teve efeito significativo (p<0,05) na

redução do conteúdo de ácido ascórbico (AA) em relação ao controle (T1). Esse resultado

corrobora com Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009), estando associado à capacidade da

quitosana se ligar a ácido (Imeri & Knorr, 1988), além da habilidade de acelerar o processo de

oxidação do AA (Zoldeners, Kiseleva & Kaiminch, 2005).

Houve uma redução significativa do teor e vitamina C do suco de acerola ao longo da

vida de prateleira em todos os tratamentos (T1, T2, T3 e T4). Isso está de acordo com Freitas,

Maia, Sousa, Brasil & Pinheiro (2006) que observaram uma redução de 42,12% do teor de

ácido ascórbico ao final do armazenamento do suco de acerola. Yamashita, Benassi, Tonzar,

Moriya, & Fernandes (2003) evidenciaram uma perda de 32% do ácido ascórbico do suco de

acerola pasteurizado em 4 meses. Carvalho & Guerra (1995) mostraram perda de 35,44% em

suco de acerola armazenado por 150 dias. Maia et al. (2003) por sua vez, detectaram uma

redução de ácido ascórbico de 16,87% em bebida de acerola em 120 dias a 25°C. A

degradação de vitamina C em produtos de acerola ao longo do armazenamento depende do

tipo de processamento, da temperatura e tempo de estocagem, ocorrendo devido

principalmente a oxidação enzimática (Freitas, Maia, Sousa, Brasil & Pinheiro, 2006).

3.1.5 Turbidez

Os valores de turbidez variaram de 0,037 UA a 0,163 UA (Tabela 2), Caleguer &

Benassi (2007) encontraram valor semelhante em refresco de laranja.

A adição 5 mg/mL de quitosana (T4) ao suco reduziu significativamente (p<0,05) a

turbidez (Tabela 3). Esse resultado corrobora com Chatterjee, Chatterjee, Chatterjee & Guha,

(2004) e Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009) que obtiveram uma redução na turbidez de

91

suco com a adição de quitosana. Essa é causada na maioria das vezes pela presença de

polissacarídeos e a proliferação microbiana. A quitosana é capaz de controlar a turbidez se

ligando aos açúcares, coagulando-os (Grassin & Fauquembergue, 1996). O uso da quitosana

como agente clarificante foi demonstrado, ainda, por Soto-Peralta, Mller & Knorr, (1989);

Chen & Li, (1996); Liu, (2006); Rungsardthong, Wongvuttanakul, Kongpien &

Chotiwaranon, (2006); Wang, Guan & Yang (2007) e Chatterjee, Chatterjee, Chatterjee &

Guha, (2004). Esse polímero possui atividade antimicrobiana em sucos (Roller & Covill,

1999; Rhoades & Roller, 2000; Kisko, Sharp & Roller, 2005; Malinowska-Panczyk,,

Kolodziejska, Murawska, & Wolosewicz, 2009; Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan, 2009)

contribuindo para a redução da turbidez.

No tempo 7 observou-se diferença significativa entre T1 e T2 o que pode estar

relacionado com amostragem ou homogeneidade do suco sem necessariamente estar

relacionada com a adição de ácido acético.

A turbidez aumentou significativamente com 14 dias de armazenamento, estando de

acordo com Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009). Matta, Cabral & Silva (2004)

encontraram resultado semelhante com o aumento da turbidez em cerca de 50 % em 15 dias

de armazenamento, podendo essa característica estar relacionada com o aumento da

proliferação microbiana.

3.1.6 Potencial de escurecimento

Os valores observados neste estudo variaram de 0,120 UA a 0,850 UA (Tabela 2),

estando de acordo com Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009) cujos resultados variaram

de 0,150 a 0,800 UA. Tanto a concentração de 2,5 mg/mL (T3) quanto a concentração de 5

mg/mL (T4) influenciaram na redução do potencial de escurecimento do suco de acerola.

Esses resultados estão de acordo com os encontrados por Sapers (1992) e Diana, Rico, Barat,

& Barry- Ryan (2009), que demonstraram o controle do escurecimento enzimático em suco de

maçã, pêra e laranja. Houve diferença significativa entre T3 e T4 indicando que o suco com

maior concentração de quitosana obteve uma maior redução do potencial de escurecimento.

Esse potencial aumentou ao longo da vida de prateleira, estando de acordo com Diana, Rico,

Barat, & Barry- Ryan (2009). O controle do escurecimento pode estar associado à capacidade

da quitosana de coagular sólidos nos quais as enzimas que causam o escurecimento estão

ligadas. A quitosana apresenta, ainda, capacidade antioxidante o que pode explicar a redução

92

do potencial de escurecimento, pela inibição do processo oxidativo (Park, Je, & Kim, 2004;

Chien, Sheu, Huang, & Su, 2007).

3.1.7. Viscosidade

Os valores de viscosidade do suco de acerola variaram de 1,73 a 11,07 mPas (Tabela

2), Gomes, (2006) encontrou resultados semelhantes estudando suco de laranja. A adição de

quitosana aumentou significativamente a viscosidade do suco. As concentrações de 2,5 e

5mg/mL (T3 e T4) obtiveram viscosidades maiores do que os controles (T1 e T2). Isso

ocorreu porque a quitosana foi adicionada na forma de gel, aumentando a viscosidade do

suco.

A viscosidade reduziu significativamente ao longo do armazenamento. Esse resultado

corrobora com Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009) que obtitiveram uma redução em de

10 dias de armazenamento. Isso se deve principalmente a degradação de pectina, resultando

em uma diminuição da capacidade de retenção de água e liberação de água livre para o

sistema (Abdullah, Sulaiman, Aroua, & Megat Mohd Noor, 2007).

3.1.8 Cor

Os valores encontrados para o parâmetro a* variaram de 2,48 a 19,46, os de b* de

25,94 a 40,63 e os de L* de 48,09 a 72,28 (Tabela 3). Neves & Lima (2010), estudando néctar

de acerola encontraram resultados semelhantes, os valores de a* de 3,35 a 3,64 ; b* de 18,20 a

21,14 e L* variaram de 45 a 50,11. As características cromáticas do suco de acerola

apresentaram valores positivos de a* e de b*, ou seja, as cores vermelha e amarela,

respectivamente, estando relacionados às antocianinas e carotenóides. No entanto, constata-se

que a intensidade do componente amarelo *b foi maior que a do componente vermelho a*,

revelando que o suco apresentou uma coloração alaranjada.

A quitosana teve efeito significativo sobre a* sendo observados valores menores em

T4 em relação a T1. Em b* a quitosana reduziu T4 do tempo 0 comparado a T1. Com relação

a L* houve um aumento significativo em T3 do tempo 14 e em T4 no tempo 0 em relação a

T1. O efeito da quitosana em a* ocorreu principalmente pela capacidade da quitosana se ligar

a antocianina. Isso foi evidenciado por Horst, Parizel, Lacerdal & Laranjeira (2009) que

93

observaram que o corante natural antocianina interage de forma física com a matriz

polimerica. Knorr (1983) sugere que a quitosana é capaz de se ligar a corantes, estando de

acordo com os resultados evidenciados nesse estudo. A redução inicial em b* com a adição de

quitosana se deve principalmente a sua habilidade de seqüestrar carotenóides Diana, Rico,

Barat, & Barry- Ryan (2009). O aumento na luminosidade L* ocorreu em decorrência das

propriedades clarificantes da quitosana. Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009) por sua

vez, encontrou resultados semelhantes em suco de laranja, utilizando concentrações de

quitosana de até 2 mg/mL.

Observou-se ainda, uma redução significativa de a* ao longo de 14 dias. Isso se deve a

perda de antocianinas, por meio da interação com ácido ascórbico e pelo contato com a luz

que atravessa o plástico transparente dos recipientes onde o suco é armazenado (Freitas, Maia,

Sousa, Brasil & Pinheiro, 2006). A interação das antocianinas com o ácido ascórbico causa a

degradação de ambos levando a uma perda do corante (Bobbio & Bobbio, 1995), em suco de

frutas isso ocorre simultaneamente. A redução desse parâmetro está associada ao aumento do

escurecimento enzimático e não enzimático (Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan, 2009),

estando de acordo com o aumento do potencial de escurecimento evidenciado no presente

estudo. A redução de L* ao longo do armazenamento está de acordo com Diana, Rico, Barat,

& Barry- Ryan (2009) que atribuiu esse efeito a decantação de partículas instáveis do suco e a

perda de pigmentos como carotenóides.

3.2 Parâmetros microbiológicos

As contagens totais de bactérias ácido láticas e bolores e leveduras foram de até 6 Log

ufc/mL (Figura 1 e 2) e as de aeróbias mesófilas de até 5 log UFC/mL(Figura 7). Esses

resultados foram menores do que os encontrados por Matta, Cabral & Silva (2004), que

evidenciaram contagens de bolores e leveduras de 10 e 15 UFC/mL e que Rhoads & Roller

(2000) que encontraram uma contagem máxima bolores e leveduras, bactérias acido láticas e

aeróbias mesófilas de 7 log UFC/mL.

Constatou-se que contagem total de bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras e

bactérias ácido láticas, reduziram com a adição de quitosana representando um efeito positivo

para a extensão da vida de prateleira. A quitosana reduziu a contagem de bactérias ácido

láticas e aeróbias mesofilas em 1 log (T3 e T4) e a contagem de bolores e leveduras em

94

aproximadamente 2 log UFC/mL (T4) comparado a T1. Esses resultados corroboram com

Rhoads & Roller (2000), Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009), que estudaram a

quitosana contra a microbiota natural do suco de maçã e laranja.

A concentração de 5 mg/mL foi mais eficiente na redução do crescimento de bolores e

leveduras do que a de 2,5mg/mL. Isso ocorreu provavelmente pelo fato das leveduras fazerem

parte da microflora predominante de sucos estando presentes em grandes quantidades e pela

concentração inibitória mínima (CIM) que variam de 0,02 mg/mL to 1 mg/mL para algumas

bactérias e de fungos filamentosos de 0,01 mg/ml to 5 mg/mL (Rabea, Badawy, Stevens,

Smagghe & Teurbaut,2003).

Ao longo dos 14 dias de armazenamento observou-se um aumento da contagem de

bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras e bactérias ácido láticas, o que foi observado

também em Rhoades & Roller (2000); Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009) e Matta,

Cabral & Silva (2004).

É importante destacar que comparar valores de contagem total de diferentes estudos

com quitosana é difícil devido às possíveis diferenças nas propriedades químicas e estruturais

da quitosana usada nesses estudos, as técnicas experimentais, os diluentes, assim como a

composição do suco.

Os valores de coliformes totais (Coliformes a 35 °C) e coliformes fecais (Coliformes a

45 °C) foram inferiores a 3 NMP/mL. Não foi detectada a presença de Salmonella sp nas

amostras avaliadas ao longo do armazenamento. Isso ocorreu provavelmente devido a ação

antimicrobiana da quitosana, boas práticas de processamento e tratamento térmico adequado.

Wang, Du & Liu (2004) observaram Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) de quitosana,

de 0,25 mg/mL para Escherichia coli e de 0,5 mg/mL para Salmonella enteridis. Os sucos

atenderam aos padrões estabelecidos pela legislação federal vigente (Brasil, 2001)

A atividade antimicrobiana da quitosana é conhecida contra uma variedade de

organismos alvo. Essa atividade varia consideravelmente com o tipo de quitosana, os

microrganismos alvo, e a matriz alimentar em que é aplicada. Apesar do mecanismo

animicrobiano da quitosana ser ainda desconhecido várias hipóteses tem sido postuladas. Uma

delas é a interação entre as moléculas positivamente carregadas de quitosana e a membrana

celular negativamente carregadas dos microrganismos (Rabea, Badawy, Stevens, Smagghe &

Teurbaut, 2003). A quitosana age basicamente na superfície celular da bactéria, interagindo

com a membrana celular e alterando a permeabilidade celular.

95

A maioria dos trabalhos que reportam a atividade antimicrobiana da quitosana se

baseiam em testes in vitro, poucos estudos tratam da atividade antimicrobiana da quitosana

em sucos. A matriz alimentar é formada por diferentes compostos que podem interferir no

resultado, pela interação com o polímero (Devlieghere, Vermeulen & Debevere 2004), isso

significa que a maioria dos resultados obtidos in vitro, tampão ou meio microbiológico não

traduz fielmente o que ocorre na matriz alimentar. Assim, é essencial que os ensaios

antimicrobianos não se limitem aos testes in vitro, se estendendo também a matriz alimentar.

3.3. Análise sensorial

A concentração de quitosana afetou significativamente (p<0,05) a aceitação sensorial

do suco de acerola (Tabela 4). As notas sensoriais variaram de 4,54 “desgostei ligeiramente” a

8,32 ”gostei muito”.

A avaliação global, no tempo 0 evidenciou uma redução significativa da aceitação

sensorial com a adição de quitosana de “gostei moderadamente” para “gostei ligeiramente”

(Figura 4). No tempo 5, ocorreu um aumento de “nem gostei/nem desgostei” para “gostei

moderadamente”(Figura 5). No tempo 7, por sua vez, a aceitação aumentou de “ nem

gostei/nem desgostei” para “gostei ligeiramente” (Figura 6). Não houve no entanto, para esse

atributo diferença com o aumento da concentração 2,5 (T3) para 5 mg/mL (T4).

Assim, imediatamente ao processamento (tempo 0) o suco de acerola recebeu as

maiores notas sensoriais que foram no entanto reduzidas com a adição de quitosana (T3 e T4).

Esses resultados corroboram com Diana, Rico, Barat, & Barry- Ryan (2009) que encontraram

uma redução da avaliação global do suco com a adição de quitosana. Isso se deve ao sabor

amargo do suco decorrente da adição do gel de quitosana (Han, Lederer, McDaniel, & Zhao,

2005).

Ao longo do armazenamento houve uma redução das notas de aceitação sensorial. No

tratamento T4, no entanto, para os atributos aparência, sabor, viscosidade e avaliação global

não houve redução significativa (p<0,05). Esses resultados corroboram com Freitas, Maia,

Sousa, Brasil & Pinheiro (2006) que observaram uma redução na aceitação da cor e do sabor

além da redução da nota da avaliação global ao fim da vida de prateleira do suco de acerola.

A quitosana teve um efeito positivo na estabilidade do suco, devido principalmente a redução

da acidez do suco (Imeri & Knorr, 1988; Rwan & Wu, 1996).

96

Os sucos adicionados de quitosana foram considerados aceitáveis (“nem gostei/nem

desgostei” a “gostei muito”) mesmo ao final do tempo de armazenamento apesar das notas

serem menores comparadas as do início, estando de acordo com Diana, Rico, Barat, & Barry-

Ryan (2009).

A intenção de compra do suco de acerola variou de 2 “Possivelmente não compraria” a

4,44 “possivelmente compraria” (Tabela 5). Não houve diferença significativa (p<0,05) na

intenção de compra do suco no tempo 0, no entanto o T4 teve uma nota menor em relação a

T1. Nos tempos 5 e 7 a adição de quitosana (T3 e T4) aumentou significativamente a intenção

de compra (p<0,05) em relação ao controle (T1). Houve uma redução significativa das notas

sensoriais de T1 e T3 ao longo do armazenamento, em T4 isso não foi evidenciado. Assim, se

os sucos adicionados com quitosana estivessem disponíveis no mercado os consumidores

possivelmente comprariam.

4. CONCLUSÃO

A quitosana se mostrou uma alternativa viável ao uso de aditivos químicos na

extensão da vida de prateleira do suco de acerola, no entanto, variações nas concentrações de

quitosana foram críticas com a redução do teor de vitamina C.

Diante disso, estudos com a modificação das características da quitosana são

necessários para reduzir o impacto no valor nutricional do suco.

Agradecimentos

Os autores agradecem a CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado.

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Tabela 1: Sólidos solúveis totais, acidez e viscosidade do suco de acerola sem adição de quitosana (T1), adicionado de ácido acético 1% (T2), adicionado de quitosana a 2,5 mg/mL (T3) e adicionado de quitosana a 5 mg/mL (T4).

Ensaio Tempo (dias)

Tratamento T1 T2 T3 T4

MÉDIA DP MÉDIA DP MÉDIA DP MÉDIA DP SST¹ (Brix) 0 8,00a(A) ±0,00 7,67ab(A) ±0,58 7,00b(A) ±0,00 6,00c(A) ±0,00 7 7,33a(AB) ±0,58 7,00a(A) ±0,00 5,67b(B) ±0,58 5,00b(B) ±0,00 14 6,33a(B) ±0,58 6,00a(B) ±0,00 5,33ac(B) ±0,58 4,33bc(B) ±0,58 Acidez (%) 0 1,14a(C) ±0,16 1,16a(B) ±0,15 1,11a(A) ±0,12 0,87a(A) ±0,00 7 1,57a(B) ±0,03 1,52a(A) ±0,21 1,35a(A) ±0,54 0,88a(A) ±0,02 14 1,96a(A) ±0,05 1,97a(A) ±0,22 1,40ac(A) ±0,53 0,92bc(A) ±0,10

104

*Sólidos Solúveis Totais. Valores em uma mesma linha, para cada média, seguidos de diferentes letras minúsculas e valores em uma mesma coluna, para cada média, seguidos de diferentes letras maiúsculas diferem estatisticamente (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey

Tabela 2: Vitamina C, Turbidez, Potencial de Escurecimento e Viscosidade do suco de acerola sem adição de quitosana (T1), adicionado de ácido acético 1% (T2), adicionado de quitosana a 2,5 mg/mL (T3) e adicionado de quitosana a 5 mg/mL (T4). ¹Vitamina C ²Turbidez ³ Escurecimento 4Viscosidade. Valores em uma mesma linha, para cada média, seguidos de diferentes letras minúsculas e valores em uma mesma coluna, para cada média, seguidos de diferentes letras maiúsculas diferem estatisticamente (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.

pH 0 3,18b(A) ±0,08 3,17b(A) ±0,04 3,40ab(A) ±0,15 3,58a(B) ±0,18 7 2,80b(B) ±0,56 2,73b(A) ±0,41 3,63ab(A) ±0,20 3,85a(AB) ±0,12 14 2,50b(C) ±0,47 2,07b(B) ±0,08 3,72a(A) ±0,13 4,00a(A) ±0,01

105

Ensaio Tempo (dias)


MÉDIA DP MÉDIA DP MÉDIA DP MÉDIA DP Vit¹ C 0 1585,89a(A) ±104,5 1611,54a(A) ±167,64 1539,52a(A) ±52,62 874,84b(A) ±110,82 mg/100g 7 947,05a(B) ±71,62 915,25a(B) ±76,35 640,92b(B) ±50,75 487,59b(B) ±162,93 14 648,80a(C) ±64,92 646,80 a(C) ±47,43 488,57a(C) ±97,56 302,60b(B) ±61,51 Turb² 0 0,085a(B) ±0,015 0,065a(A) ±0,012 0,059ab(B) ±0,008 0,037b(C) ±0,004 (UA) 7 0,152a(A) ±0,012 0,099b(A) ±0,024 0,073b(B) ±0,008 0,071b(B) ±0,004 14 0,163a(A) ±0,010 0,128a(A) ±0,033 0,150a(A) ±0,010 0,120a(A) ±0,007 Escure³ 0 0,47a(A) ±0,03 0,40a(C) ±0,00 0,24c(C) ±0,02 0,12d(B) ±0,00 (UA) 7 0,61a(A) ±0,01 0,60a(B) ±0,00 0,32b(B) ±0,03 0,23c(A) ±0,01 14 0,71ac(A) ±0,22 0,85a(A) ±0,00 0,46bc(A) ±0,01 0,30b(A) ±0,07 Viscosi4 0 2,68c(A) ±0,59 3,04c(A) ±0,04 8,60b(A) ±0,29 11,07a(A) ±0,91 mPas 7 2,73c(A) ±0,04 2,71c(B) ±0,15 5,58b(B) ±0,17 7,20a(B) ±0,06 14 1,89c(A) ±0,14 1,73c(C) ±0,11 3,22b(C) ±0,09 4,12a(C) ±0,09

Cor Tempo (dias)


MÉDIA DP MÉDIA DP MÉDIA DP MÉDIA DP a* 0 19,06a(A) ±0,15 19,46a(A) ±0,67 14,28b(A) ±0,80 13,62b(A) ±0,30 7 6,81a(B) ±1,65 8,67a(B) ±1,34 5,93ab(B) ±1,78 2,48b(B) ±0,20 14 5,72a(B) ±0,05 5,44ab(C) ±0,29 6,12a(B) ±0,49 3,52b(B) ±1,51 b* 0 39,93a(A) ±0,72 40,63a(A) ±0,49 40,27a(A) ±0,95 36,29b(A) ±1,99 7 37,87a(A) ±1,27 36,50a(AB) ±3,84 38,50a(A) ±0,81 31,84a(A) ±7,44 14 33,76a(B) ±2,08 26,88a(B) ±7,60 33,51a(B) ±2,26 25,94a(A) ±1,09

106

Tabela 3: Parâmetros de cor a*, b* e L* do suco de acerola sem adição de quitosana (T1), adicionado de ácido acético 1% (T2), adicionado de quitosana a 2,5 mg/mL (T3) e adicionado de quitosana a 5 mg/mL (T4).

Valores em uma mesma linha, para cada média, seguidos de diferentes letras minúsculas e valores em uma mesma coluna, para cada média, seguidos de diferentes letras maiúsculas diferem estatisticamente (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey

L* 0 61,37b(A) ±4,46 63,90ab(A) ±2,10 62,19ab(A) ±6,57 72,28a(A) ±1,08 7 60,83ab(A) ±0,67 60,37ab(B) ±0,74 57,45b(A) ±2,11 67,01a(A) ±6,11 14 49,82b(B) ±0,74 50,91ab(C) ±0,54 54,90a(A) ±2,13 48,09b(B) ±2,40

107

Tabela 4: Teste de aceitação do suco de acerola sem adição de quitosana (T1), adicionado de quitosana a 2,5 mg/mL (T3) e adicionado de quitosana a 5 mg/mL (T4).

* Avaliação Global.Valores em uma mesma linha, para cada média, seguidos de diferentes letras minúsculas e valores em uma mesma coluna, para cada média, seguidos de diferentes letras maiúsculas diferem estatisticamente (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.

Atributos sensoriais

Tempo (dias)

Tratamento T1 T3 T4

MÉDIA DP MÉDIA DP MÉDIA DP Aparência 0 8,18a(A) ±1,06 8,12a(A) ±1,18 7,80a(A) ±1,44 5 7,22a(B) ±1,22 7,38a(B) ±1,03 7,48a(AB) ±1,25 7 5,66b(C) ±1,55 6,24b(C) ±1,44 6,92a(B) ±1,29 Cor 0 8,06a(A) ±1,17 8,28a(A) ±1,23 8,12a(A) ±1,37 5 7,50a(A) ±1,17 7,60a(B) ±1,28 7,44a(A) ±1,16 7 5,66a(B) ±1,76 6,20a(C) ±1,65 6,44a(B) ±1,85 Aroma 0 8,32a(A) ±1,00 7,86ab(A) ±1,29 7,44b(A) ±2,02 5 5,86b(B) ±1,63 6,90a(B) ±1,49 6,74a(A) ±1,24 7 4,56b(C) ±1,63 5,88a(C) ±1,78 5,56a(B) ±1,63 Sabor 0 7,88a(A) ±1,51 7,54a(A) ±1,42 6,48b(A) ±2,23 5 5,06b(B) ±1,65 6,24a(B) ±1,67 6,68a(A) ±1,60 7 4,54b(B) ±2,27 6,42a(B) ±1,43 6,44a(A) ±1,30 Viscosidade 0 7,40a(A) ±1,43 7,34a(A) ±1,27 7,04a(A) ±1,85 5 6,04b(B) ±1,31 6,90a(A) ±1,13 6,60ab(A) ±1,51 7 5,04b(C) ±1,77 5,96ab(B) ±1,59 6,26a(A) ±1,64 A. Global * 0 7,96a(A) ±1,09 7,60ab(A) ±1,34 6,90b(A) ±1,97 5 5,64b(B) ±1,60 7,00a(AB) ±1,60 6,38ab(A) ±1,59 7 5,02b(B) ±1,55 6,56a(B) ±1,16 6,96a(A) ±1,26

108

Tabela 5: Teste de intenção de compra do suco de acerola sem adição de quitosana (T1), adicionado de quitosana a 2,5 mg/mL (T3) e adicionado de quitosana a 5 mg/mL (T4).

Tempo (dias)

Tratamento T1 T3 T4

MÉDIA DP MÉDIA DP MÉDIA DP

Intenção de compra

0 4,24a(A) ±0,98 4,44a(A) ±0,97 3,96a(A) ±1,25 5 2,44c(B) ±0,97 3,44b(B) ±0,95 3,92a(A) ±1,05 7 2,00c(B) ±0,93 3,10b(B) ±1,06 3,66a(A) ±1,12

Valores em uma mesma linha, para cada média, seguidos de diferentes letras minúsculas e valores em uma mesma coluna, para cada média, seguidos de diferentes letras maiúsculas diferem estatisticamente (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.

109

Figura 1: Contagem total de bactérias ácido láticas. (T1 Controle, T2 Controle ácido, T3 concentração de 2,5 mg/mL e T4 Concentração de 5mg/mL)

Figura 2: Contagem total de bolores e leveduras. (T1 Controle,T2 Controle ácido, T3 concentração de 2,5 mg/mL e T4 Concentração de 5mg/mL)

110

Figura 3: Contagem total de aeróbias mesófilas. (T1 Controle,T2 Controle ácido, T3 concentração de 2,5 mg/mL e T4 Concentração de 5mg/mL)

111

Figura 4: Gráfico do teste de aceitação tempo 0 da vida de prateleira. (T1 controle, T3 concentração de 2,5 mg/mL e T4 Concentração de 5mg/mL) Figura 5: Gráfico do teste de aceitação tempo 5 da vida de prateleira. (T1 controle, T3 concentração de 2,5 mg/mL e T4 Concentração de 5mg/mL)

112

Figura 6: Gráfico do teste de aceitação tempo 7 da vida de prateleira. (T1 controle, T3 concentração de 2,5 mg/mL e T4 Concentração de 5mg/mL).

113

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os resultados obtidos neste trabalho evidenciaram que a quitosana mostrou-se efetiva

na inibição e eliminação dos fungos do gênero Aspergillus spp. Penicillium spp. e Fusarium

spp. Nos ensaios com suco de acerola, a atividade não foi influenciada significativamente

pelos componentes da matriz alimentar. A quitosana foi efetiva na extensão da vida de

prateleira do suco de acerola. No entanto reduziu o teor de acido ascórbico.

Dessa forma, podemos concluir que a quitosana tem potencial para uso como

conservante em suco de acerola em substituição aos aditivos químicos tradicionalmente

utilizados.Considera-se que o interesse no emprego da quitosana por suas mais variadas

propriedades será aumentado, sobremaneira, no futuro, permitindo que estudos mais

aprofundados conduzam a novas aplicações de importância.

114

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Mulberry Juice. Liquor-making Science & Technology. 2007.

118

Apêndice

119

A: Ficha de análise sensorial

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

Teste de Aceitação e Intenção de compra

Nome:_________________________________________ Idade:_____ e-mail:_____________

Fone:_______________ Escolaridade:__________________________ Data: _____________

Você está recebendo 03 amostras codificadas de suco de acerola. Prove-as da esquerda para direita, avalie sensorialmente as amostras de acordo com cada atributo nos quadros e escreva o valor da escala que você considera correspondente à amostra (código) no que diz respeito aos atributos avaliados. Antes de cada avaliação, você deverá fazer uso da água e da bolacha.

9 – gostei muitíssimo

8 – gostei muito

7 – gostei moderadamente

6 – gostei ligeiramente

5 – nem gostei/nem desgostei

4 - desgostei ligeiramente

3 – desgostei moderadamente

2 – desgostei muito

1 – desgostei muitíssimo

Agora indique sua atitude ao encontrar este suco no mercado.

5 – compraria

4 – possivelmente compraria

3 – talvez comprasse/talvez não comprasse

2 – possivelmente não compraria

1 – jamais compraria

ATRIBUTOS

AMOSTRAS

(Código)

Aparência

Cor

Aroma

Sabor

Viscosidade

Avaliação Global

ATRIBUTOS

AMOSTRAS

(Código)

Intenção de Compra

120

Comentários:_______________________________________________________________________

___________________________________________________________________

OBRIGADA!

B: Termo de consentimento livre e esclarecido

UFPE

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Você está sendo convidado(a) a participar, como voluntário(a), da pesquisa “Suco de acerola enriquecido com quitosana: otimização para estender a vida de prateleira”, no caso de você concordar em participar, favor assinar ao final do documento. Sua participação não é obrigatória, e, a qualquer momento, você poderá desistir de participar e retirar seu consentimento. Sua recusa não trará nenhum prejuízo em sua relação com o pesquisador(a) ou com a instituição.

Você receberá uma cópia deste termo onde consta o telefone e endereço do pesquisador(a) principal, podendo tirar dúvidas do projeto e de sua participação.

NOME DA PESQUISA: “Suco de acerola enriquecido com quitosana: otimização para estender a vida de prateleira”

PESQUISADOR(A) RESPONSÁVEL: Ilsa Cunha Barbosa

ENDEREÇO: R. São Mateus 852. Iputinga. TELEFONE: (81) 86328846

ENDEREÇO do CEP: Av Prof. Morais Rego, S/N – Cidade universitária - Recife/PE TELEFONE: (81) 2126.8588

PESQUISADORES PARTICIPANTES: Tânia Lúcia Montenegro Stamford e Thayza Christina Montenegro Stamford

OBJETIVOS: Verificar a ação antifúngica e conservante da quitosana na extensão da vida de prateleira do suco de acerola.

PROCEDIMENTOS DO ESTUDO:

O teste de comparação pareada será aplicado segundo metodologia descrita por IAL (2005), sendo avaliada a preferência global do provador em relação ao suco acerola controle e o adicionado de quitosana. Será realizado o teste de aceitabilidade utilizando uma escala hedônica de nove pontos sendo avaliados os atributos aparência, textura, preferência global, sabor e odor. Paralelamente também será avaliada a intenção de compra. Para tanto, será empregado a escala hedônica de cinco pontos. Na seleção dos provadores será considerada a habilidade em discriminar as amostras, repetibilidade das avaliações e consenso com os demais membros da equipe. As amostras dos produtos serão servidas, aos provadores, em cabines individuais iluminadas com luz branca, à temperatura de 24 ºC, em pratos brancos de porcelana, aleatoriamente codificadas.

121

RISCOS: não há riscos à saúde dos provadores pois é um produto biodigestível, biodegradável e atóxico. Pode, no entanto, trazer aos provadores algum desconforto em relação ao sabor.

BENEFÍCIOS: a quitosana pode ser usada no auxílio à perda de peso e como protetora de alimentos, por possuir atividade antimicrobiana. O projeto é relevante para a sociedade por trazer informações ainda ausentes na literatura a respeito da aplicação da quitosana em alimentos. Aos provadores a quitosana pode se constituir uma alternativa natural ao uso de aditivos artificiais tradicionalmente utilizados em sucos, resultando em prevenção de doenças e melhoria na qualidade de vida.Os resultados da pesquisa serão disponibilizados aos participantes, que ficarão cientes das vantagens e limitações do uso da quitosana como alternativa aos aditivos químicos.

CUSTO/REEMBOLSO PARA O PARTICIPANTE: Os participantes de pesquisa não arcarão com nenhum gasto decorrente da sua participação. Além disso, os participantes da pesquisa não receberão qualquer espécie de gratificação devido à participação na pesquisa.

CONFIDENCIALIDADE DA PESQUISA: Garantimos que somente serão divulgados dados diretamente relacionados aos objetivos da pesquisa; e a privacidade dos sujeitos, quanto aos dados pessoais, serão confidenciais.

Assinatura do Pesquisador Responsável: ____________________________________

122

UFPE

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO

Eu, _______________________________________ - NOME DO

ENTREVISTADO(A), ___________________ - RG/CPF, declaro que li as informações

contidas nesse documento, fui devidamente informado(a) pelo pesquisador(a) Ilsa Cunha

Barbosa dos procedimentos que serão utilizados, riscos e desconfortos, benefícios,

custo/reembolso dos participantes, confidencialidade da pesquisa, concordando ainda em

participar da pesquisa. Foi-me garantido que posso retirar o consentimento a qualquer

momento, sem que isso leve a qualquer penalidade. Declaro ainda que recebi uma cópia

desse Termo de Consentimento.

LOCAL E DATA:

NOME E ASSINATURA

__________________________________ _______________________________

(Nome por extenso) (Assinatura)

Testemunhas:

_____________________________________

____________________________________________

123

Anexos

124

A: Encaminhamento do artigo ao periódico Ilsa, Barbosa: Informamos que o artigo abaixo foi submetido a Ciência Rural, constando sua participação como autor. Artigo: "CR-4646 - Quitosana como alternativa natural para a conservação de sucos" Caso não concorde com a sua participação nesse artigo favor entrar em contato para que possamos tomar as ações necessárias. Rudi Weiblen Ciência Rural Thayza C. M. Stamford ________________________________________________________________________ Ciência Rural http://submission.scielo.br/index.php/cr/index

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B: Parecer do comitê de ética

USO DE QUITOSANA COMO ALTERNATIVA NATURAL PARA … · Aos Laboratórios de Bromatologia e...

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