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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS
PARA SAÚDE
ZORAIDE NASCIMENTO DA SILVA
EFEITO DA DIETA DA PROTEÍNA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS
WISTAR ADULTAS
Orientadora: Profª. Drª. Vilma Blondet de Azeredo Co-Orientador: Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura
Niterói 2013
ZORAIDE NASCIMENTO DA SILVA
EFEITO DA DIETA DA PROTEÍNA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS
WISTAR ADULTAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação Strictu Sensu da Universidade Federal Fluminense, como pré- requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde. Orientadora: Profª. Drª Vilma Blondet de Azeredo Co-orientador: Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura
Niterói
2013
FICHA CATALOGRÁFICA
S 586 Silva, Zoraide Nascimento da
Efeito da Dieta da Proteína no metabolismo ósseo em ratas Wistar
Adultas / Zoraide Nascimento da Silva; orientador : Vilma Blondet de
Azeredo. – Niterói, 2013.
92 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2013.
1. Dieta 2. Proteína na dieta 3. Densidade óssea 4. Hormônio
I. Azeredo, Vilma Blondet de II. Título
CDD 613.25
ZORAIDE NASCIMENTO DA SILVA
EFEITO DA DIETA DA PROTEINA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS
WISTAR ADULTAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação Strictu Sensu, Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como pré-requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________________________________________ Profª. Drª. Vilma Blondet de Azeredo (Orientadora e Presidente da banca), UFF
__________________________________________________________________ Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura (Co-orientador – UFF) __________________________________________________________________ Profª. Drª. Glorimar Rosa ( Titular - UFRJ) __________________________________________________________________ Profª. Drª. Gabrielle de Souza Rocha (Titular – UFF)
Aprovado em: ______ / ________ / _______
DEDICATÓRIA
Ao meu filho Yuri, por tantos momentos
ausente e a minha mãe pela atenção e ajuda
nesses momentos difíceis.
AGRADECIMENTOS
A Deus, sempre presente em minha vida;
À minha amiga querida Solange Augusta pelo apoio e ajuda para realização deste
trabalho e também pela amizade, carinho e confiança;
Aos meus amigos do LabNE Fernanda, Arindo e Clésio pela ajuda no preparo da
ração, cuidado dos animais, realização de análises e pelos momentos em que
ficavam me escutando falar sobre o trabalho;
Às amigas Vânia Matoso e Vanessa Jesuz pela enorme ajuda na realização do
experimento e pelos vários momentos em que ficávamos discutindo os resultados,
aprendi muito com vocês;
Ao Professor Dr. Carlos Alberto Costa pela participação na construção do artigo
científico e pela mega ajuda e atenção;
Ao estudante da Iniciação Científica Eduardo de Salvo Castro pela contribuição no
cuidado dos animais e no momento da dissecação;
Às mestrandas do LabNE Sheila, Thaís e ao doutorando André pela ajuda nos vários
momentos em que precisei tirar dúvidas;
Aos professores do LANUFF Luiz Antônio dos Anjos e Vivian Wahrlich e a técnica
Ana Paula Souza Santos pelo apoio e realização da densitometria óssea;
À secretária do curso de Pós Graduação em Ciências Aplicada a Produtos para
Saúde Adelina Iorio, sempre atenciosa e pronta para ajudar;
A todos os professores do curso de PGCAPS, com os quais aprendi muito;
Aos meus orientadores professora Vilma Blondet e professor Gilson Teles, pela
orientação, oportunidade, paciência e pelos ensinamentos fornecidos. Minha mais
profunda e eterna gratidão;
Aos meus pais e a minha irmã pelo apoio para que eu concluísse mais um projeto
em minha vida.
A alegria não chega apenas no encontro
do achado, mas faz parte do processo da
busca. E ensinar e aprender não pode
dar-se fora da procura, fora da boniteza e
da alegria.
Paulo Freire
RESUMO
Uma das dietas mais procuradas para perda de peso é a dieta Atkins, caracterizada
como hiperproteica, hiperlipídica e hipoglicídica. O consumo em excesso de
proteínas leva a produção de ácidos provenientes do metabolismo protéico e para
manter a homeostase sanguínea são recrutados íons, principalmente o cálcio
proveniente do osso, levando ao comprometimento deste tecido. Este trabalho teve
como objetivo avaliar o efeito da dieta hiperproteica no tecido ósseo em ratas Wistar.
O estudo teve duração de 60 dias. Animais com 90 dias de idade foram divididas em
4 grupos (n=7); Grupo controle Caseína 1 (C1) e Caseína 2 (C2), Grupo
Hiperproteico 1 (HP1) e Hiperproteico 2 (HP 2). O grupo C2 e HP2 foram submetidos
a 30% de restrição alimentar. O experimento teve a duração de 60 dias. O peso e a
ingestão hídrica eram verificados uma vez por semana. Utilizando absorciometria por
dupla emissão de raios X (DXA) foi avaliada a densidade mineral óssea (DMO
g/cm2), o conteúdo mineral ósseo (CMO g), a Área (cm2), tecido gordo total e do
tronco. A análise densitométrica foi realizada no início e ao final do experimento com
o animal anestesiado. Após o sacrifício foram coletadas amostras de sangue e o
fêmur direito. No fêmur foi realizado densitometria óssea, biometria e com as cinzas
ósseas análises de cálcio, magnésio e fósforo. Do sangue coletado foi obtido o soro
e analisados cálcio, magnésio, fósforo, insulina, osteocalcina e paratormônio. Os
resultados são apresentados com média e erro padrão. Os animais com alimentação
em livre demanda apresentaram maior ganho de massa corporal do que os animais
com restrição calórica. Os grupos hiperproteicos apresentaram maior ingestão
hídrica, quando comparados com o grupo C1 (P<0,05). Na ingestão alimentar, os
grupos experimentais consumiram quantidades similares e menor em comparação
com o Controle 1 (P<0,05). As concentrações de cálcio sérico foram menores entre
os grupos experimentais e C2 (P<0,05). Os valores da osteocalcina sérica foram
menores nos grupos hiperproteicos (P<0,05). A insulina foi significativamente menor
no grupo HP2 (P<0,05), e sem diferença significativa entre os grupos controles e
HP1, sendo que o grupo C2 apresentou redução de mais de 50% em relação ao
grupo C1. Houve redução da largura do ponto médio da diáfise do fêmur nos grupos
experimentais quando comparados com seus respectivos grupos controle. As
concentrações de cálcio ósseo foram menores nos grupos hiperproteicos (P<0,05).
No geral, os resultados densitométricos ósseos total, da pelve e da coluna vertebral
foram semelhantes entre os grupos com consumo em livre demanda e entre os
grupos com restrição alimentar. A DMO do fêmur do grupo HP2 foi menor (P<0,05).
O tecido gordo do tronco nos grupos com consumo em livre demanda foi maior e o
tecido magro total desses grupos foram similares. A dieta da proteína não promoveu
maior perda de peso que a dieta controle. Os grupos hiperproteicos apresentaram
redução da largura do ponto médio da diáfise do fêmur, diminuição do cálcio ósseo e
sérico e da osteocalcina, sendo que o grupo HP2 apresentou também diminuição na
concentração sérica de insulina.
Palavras chave: Dieta Atkins. Dieta hiperproteica. Densidade mineral óssea.
Remodelagem óssea. Hormônios.
ABSTRACT
One of the most sought diet for weight loss is the Atkins’, characterized as a high
protein, lipid and low glycemic diet. The excessive intake of proteins leads to the
production of acids from it’s metabolism. In order to maintain homeostasis, blood ions
are recruited, mainly calcium from the bone, leading to impairment of the tissue. The
objective of the present study was to evaluate the effect of a high protein diet on the
bone tissue in Wistar rats. 90-day-old animals were divided into 4 groups (n = 7):
Casein 1 group control (C1), Casein 2 (C2), High Protein 1 (HP1) and High Protein 2
(HP 2). Groups C2 and HP2 were subjected to 30% of food restriction ( 60 days).
Weight and water intake were checked once a week. Bone mineral density (BMD
g/cm2), bone mineral content (BMC g), total fat tissue and area (cm2) of the thorax
were determined by Dual Emission X-rays (DXA). Anesthetized animals were
subjected to densitometric analysis at the beginning and at the end of the experiment
with anesthetized animals. Then the animals were terminated, and the blood and
right femur collected. Femur densitometry and biometrics were made. Calcium,
magnesium and phosphorus were determined from bone ashes. Serum calcium,
magnesium, phosphorus, insulin, PTH and osteocalcin were measured. Results are
presented as mean and standard error. Animals fed ad libitum gained more body
weight than the animals on restricted diet. High protein groups had higher (P <0.05)
water intake when compared with C1. Food intake in experimental groups was similar
and lower (P <0.05) when compared with C1. Serum calcium concentration were
lower (P <0.05) between the high protein groups and C2. Values of serum
osteocalcin were low (P <0.05) in high protein groups. Insulin was significantly low
(P <0.05) in group HP2. C2 group insulin was reduced by over 50% compared to C1.
Groups HP1 and control were statistically similar. High protein groups showed a
width at the midpoint of the diaphysis when compared with their respective control
groups. Bone calcium concentrations were low (P <0.05) in high protein groups.
Overall, the results of bone, pelvis and spine densitometries were similar between
groups ad libitum and with restricted diets. HP2 group femurs exhibited reduced bone
mass density (BMD). Trunk fat and lean tissues in ad libitum groups were higher
(P<0.05) and similar, respectively. The protein diet did not promote greater weight
loss than the restricted diet. High protein groups showed a width reduction at the
midpoint of the diaphysis, decreased bone and serum calcium and osteocalcin. HP2
group also showed lower serum insulin.
Keywords: Atkins Diet. High protein diet. Bone mineral density. Bone remodeling.
Hormones.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1- Comparação entre a dieta da proteína e as 21
Recomendações da American Heart Association
(AHA) e da National Cholesterol
Education Program (NCEP)
Figura 1 - Produção de corpos cetônicos no fígado 24
Figura 2 - Representação esquemática da parte interna de um osso 26
longo
Figura 3 - A: osso cortical, B: osso trabecular 26
Figura 4 - Remodelagem óssea (adaptado) 28
Figura 5 - Gaiolas com os ratos utilizados no experimento 37
Quadro 2 - Formulação das rações Controle e Experimental (g/100g de 38
ração)
Quadro 3 - Composição da dieta controle utilizada no experimento 39
(g/100g de ração)
Quadro 4 - Composição da dieta Experimental utilizada no experimento40
(g/100g de ração)
Figura 6 - Método para realização do lavado vaginal em ratas 42
Figura 7 - Visualização das lâminas a fresco ou coradas e caracterização 42
das fases do ciclo estral
Figura 8 - Fotomicrografia do esfregaço vaginal corado com o início 42
da fase Estro
Figura 9- Fêmur dissecado, ao lado paquímetro utilizado para 43
a medição
Figura 10- A: Equipamento Lunar iDXA GE, utilizado para mensuração 48
da densidade mineral óssea, B: Animal pronto para realização
da análise, C: Imagem do corpo do animal utilizando o aparelho
densitométrico
Gráfico 1- Evolução do peso corporal 49
Gráfico 2- Ingestão hídrica 50
Gráfico 3- Consumo alimentar 50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Concentrações séricas de minerais e hormônios estudados 51
Tabela 2- Parâmetros biométricos e conteúdo mineral ósseo 52
do fêmur direito das ratas ao final do experimento
Tabela 3- Composição óssea, avaliada com auxílio do DXA 55
Tabela 4- Quantidade de tecido gordo corporal total e no tronco 58
Tabela 5- Quantidade de tecido magro corporal total e no tronco 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Acetil-Coa – Acetil coenzima A
AG – Ácido graxo
AHA- American Heart Association
CCK - colecistoquinina
cm2 - Centímetro quadrado
CMO – Conteúdo Mineral Ósseo
DBP – Proteína de Ligação ao DNA ( Binding Protein)
DXA - Dual Energy X-Ray Absorptiometry
DMO – Densidade Mineral Ósseo
ECM – Matriz extracelular
ELISA – Imunoabsorção Ligado a Enzimas
EPM – Erro Padrão da Média
FAO- Food and Agriculture Organization
g – Grama
g/cm2 - Grama por centímetro quadrado
GH – Growth Hormone
HP - Hiperprotéico
IAA – Anticorpo Anti-Insulina
IGF – Fator de Crescimento Semelhante à Insulina
IGFBP – Insulin-like growth factor binding protein
IL-6 - Interleucina- 6
Kcal – Quilocalorias
mEq – Miliequivalente
mg – Miligrama
ml – Mililitro
NCEP – National Cholesterol Education Program
NHANES – National Health and Nutrition Examination Survey
ng - Nanograma
nm – Nanômetro
OMS – Organização Mundial da Saúde
Pi – Fosfato inorgânico
pg – Picograma
POF – Pesquisa de Orçamento Familiar
PTH – Hormônio Paratireóide ou Partormônio
Run X2 – Runt-related Transcription factor 2
TNF- - Fator de necrose tumoral alfa
VDR – Receptor de Vitamina D
WHO – World Health Organization
μl - Microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
2 REVISÃO DE LITERATURA 19
2.1 Obesidade - Um problema mundial 19
2.2 Dietas da Moda 20
2.3 A “Dieta da proteína” do doutor Atkins 20
2.3.1 Dieta da proteína e perda de peso 22
2.3.2 Dieta da proteína e cetoacidose 23
2.4 O tecido ósseo 25
2.4.1 Manutenção do tecido ósseo 29
2.5 Efeito da Dieta Atkins no tecido ósseo 31
3 JUSTIFICATIVA 34
4 OBJETIVOS 35
4.1 Objetivo geral 35
4.2 Objetivos específicos 35
5 METODOLOGIA 36
5.1 Animais 36
5.2 Comitê de ética 36
5.3 Formação dos grupos 36
5.4 Preparo da ração 37
5.5 Coleta de dados 40
5.5.1 Peso corporal 40
5.5.2 Consumo de ração 41
5.5.3 Ingestão hídrica 41
5.6 Determinação do ciclo estral das ratas 41
5.7 Sacrifício e coleta de sangue e fêmur 43
5.8 Processamento das amostras 44
5.8.1 Determinação da concentração sérica de cálcio, 44
magnésio e fósforo
5.8.2 Determinação da concentração de insulina, 44
osteocalcina e paratormônio
5.8.3 Conteúdo mineral ósseo do fêmur 46
5.8.4 Densitometria óssea 47
5.9 Análise Estatística 48
6 RESULTADOS 49
7 DISCUSSÃO 60
8 CONCLUSÃO 65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66
APÊNDICE A – Produção Científica 74
APÊNDICE B – Publicação em Periódico 75
ANEXO Aprovação do Comitê de Ética 92
17
1 INTRODUÇÃO
A obesidade tem sido amplamente reconhecida como um dos principais
problemas de saúde pública, que leva a inflamação, que parece estar diretamente
envolvida na patogênese do diabetes tipo 2, hipertensão, dislipidemia, aterosclerose,
osteoartrite, apneia do sono, problemas respiratórios e algumas formas de câncer
(YE & KELLER, 2010).
A restrição da ingestão alimentar e realização de atividade física tem sido
sugeridas como a chave para alcançar o objetivo da manutenção de peso corporal
adequado (SONG et al., 2010). Entretanto, a indústria do emagrecimento é um
próspero e lucrativo negócio em muitos países. Muitas pessoas fazem dieta e se
preocupam com a forma física porque são influenciadas pela mídia que impõe certos
padrões de beleza, associado a uma sociedade que almeja um corpo magro como o
ideal. Entretanto, não se preocupam com a qualidade e o impacto dessas dietas na
saúde (DERENE & BERESIN, 2006; TRUBY et al., 2008).
Devido ao crescente aumento epidêmico da obesidade, suportado por um
ambiente rico em alimentos gordurosos, muitos pacientes e profissionais de saúde
estão interessados em dietas populares como estratégia individualizada para
redução de peso e prevenção de doenças (DANSINGER et al., 2005).
Assim, acompanhando a “epidemia da obesidade”, está aumentando o
interesse em dietas populares, que variam enormemente na quantidade de proteínas
e carboidratos. A dieta do Dr. Atkins é uma das dietas hiperproteicas mais
conhecidas e uma das mais extremas em promover a ingestão de elevada
quantidade de proteínas e gorduras e pequena quantidade de carboidratos. É uma
das mais controvertidas para a saúde por ter alto teor de gordura saturada e
colesterol e poucas fibras, antioxidantes e micronutrientes.
Alguns estudos mostram que os efeitos benéficos deste tipo de dieta sobre os
níveis lipêmicos e resistência a insulina ocorrem pela diminuição do peso corporal e
não devido às mudanças severas na distribuição da energia provenientes dos
lipídios, carboidratos e proteínas. Portanto, as dietas hiperproteicas não devem ser
recomendadas, pois elas são deficientes em uma variedade de nutrientes essenciais
necessários à nutrição adequada, o que pode predispor o organismo ao
desenvolvimento de inúmeras doenças crônicas não transmissíveis, inclusive a
18
osteoporose (ST JEOR et al., 2001; JOHNSTON et al., 2004; CARAPETIS &
PHILIPS, 2006).
O problema da obesidade tem resultado em várias estratégias dietéticas para
perda de peso. No entanto, o efeito específico destas dietas na saúde cardiovascular
e óssea carecem de mais estudos.
Alguns estudos mostraram diminuição do risco de fratura com maior ingestão
de proteínas, enquanto outros encontraram tendência oposta, em particular com as
proteínas de origem animal (DARGENT-MOLINA et al., 2008). A densidade mineral
óssea é muito afetada quando há carência principalmente de cálcio e vitamina D na
dieta, carência esta que pode ocorrer não por deficiente ingestão, mas sim devido a
fatores deste tipo de dieta, como o excesso de proteína e gordura, que podem
reduzir sua absorção e aumentar sua eliminação renal, o que pode predispor os
indivíduos ao desenvolvimento da osteoporose. A consequencia futura é a
predisposição a fratura devido à fragilidade óssea, que contribuem para aumentar a
mortalidade, com a baixa qualidade de vida, bem como um substancial custo direto e
indireto para o setor público (MEDEIROS et al., 2002; LANGSETMO et al., 2010).
Os efeitos de dietas hiperproteicas sobre a estrutura óssea e o provável
desenvolvimento de osteopenia e/ou osteoporose ainda necessita de mais estudos.
Este estudo torna-se relevante à medida que se propõe a investigar os efeitos da
“dieta da proteína” sobre o metabolismo ósseo, contribuindo para um melhor
entendimento do efeito desta dieta neste tecido.
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Obesidade – Um problema mundial
A obesidade é uma desordem metabólica caracterizada por excesso de
armazenamento de gordura e reflete o desequilíbrio entre ingestão e gasto de
energia (PAULA & ROSEN, 2010).
A obesidade atingiu níveis epidêmicos em todo o mundo (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2012B). Desde 1980, o número de indivíduos obesos no mundo
mais que duplicou e estima-se que 2,8 bilhões de pessoas morram anualmente
decorrente de estarem obesas ou com sobrepeso (WHO, 2012A). Dados da
Pesquisa de Orçamento Familiar (IBGE, 2009) revelaram que 12,4% dos homens
brasileiros estão obesos e 16,9% da população feminina encontram-se na mesma
condição.
O aumento da população obesa eleva o custo da saúde e a perda de peso é
benéfica para manter um corpo saudável (GARDNER et al., 2007). Indivíduos
obesos apresentam maior risco de desenvolver doenças crônicas não transmissíveis
como hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, diabetes mellitus,
dislipidemias, osteoartrites, entre outras enfermidades, levando a diminuição da
qualidade e expectativa de vida. O desenvolvimento do excesso de peso e
obesidade envolve múltiplos fatores observados, principalmente com as mudanças
comportamentais do século XX, tais como hábitos de vida, consumo alimentar,
características socioambientais, susceptibilidade genética e biológica (LINO et al.,
2011; NOAKES et al., 2005).
O problema da obesidade tem resultado em várias estratégias dietéticas para
perda de peso, e a adesão a dietas da moda tem se tornado cada vez mais
frequentes e controversas. Vários livros sobre dietas estão disponíveis e também
são notícias em revistas e debates televisivos. Muitas dietas da moda para perda de
peso focam na redução ou exclusão de determinados macronutrientes. Existem
poucos dados sobre o conteúdo de micronutrientes e adequação dessas dietas.
Autoridades médicas tem demonstrado interesse e preocupação sobre o efeito
específico destas dietas na saúde cardiovascular e óssea e na eficácia e segurança
20
de tais dietas e mais estudos são necessários (DANSINGER et al., 2005; GARDNER
et al., 2010).
2.2 Dietas da Moda
Dietas populares tem se tornado cada vez mais prevalentes e controversas.
Guias dietéticos para perda de peso (restrição energética, pobre em gordura, rico
em carboidrato) têm sido contestados, particularmente por proponentes de dietas
com pouco carboidrato. No entanto, há poucos estudos para avaliar efetivamente
essas dietas (GARDNER et al., 2007).
Uma variedade de planos dietéticos é conhecida. Alguns planos minimizam a
ingestão de carboidratos sem restrição de gordura e proteínas (dieta Atkins)
(ATKINS, 1981), muitos modulam o balanço de macronutrientes e carga glicêmica,
dieta Zone (CHEUVRONT, 2003) e outras impõem a restrição de gordura (dieta
Ornish) (ALMEIDA et al., 2009).
2.3 A “dieta da proteína” do doutor Atkins
Dentre os vários tipos de plano alimentar a mais popular é a dieta do doutor
Atkins (dieta da proteína). Provavelmente a popularidade desta dieta se deve a
preocupação cada vez maior da sociedade com a imagem de um corpo magro; e a
“dieta da proteína” do doutor Atkins promove rápida perda de peso (GARDNER et
al., 2010). Pesquisadores justificam sua utilização devido ao fato de que a alta
ingestão de carboidrato refinado, especialmente açúcar branco, causa
hiperestimulação de insulina e o resultado é uma fome incontrolável, além de
favorecer a lipogênese e consequentemente a estocagem de gordura (RILEY &
COVENEY, 2004). O Dr. Atkins afirma que a dieta é eficaz na promoção de perda de
peso, apesar do livre consumo de carnes com gorduras, manteiga e outros produtos
com alto teor de gorduras, restringindo apenas a ingestão de carboidratos para
menos de 30 g por dia (ASTRUP et al., 2004).
A dieta do Dr. Atkins ou “dieta da proteína” é uma das dietas hiperproteicas
mais conhecidas pela sociedade, promovendo o aumento extremo do consumo de
proteínas (25-30%) e lipídeos (55-65%) e minimizando a ingestão de carboidratos (<
21
5%). Em seu livro “A Revolucionária dieta do Doutor Atkins” (Atkins, 1981), Robert
Atkins descreve que o objetivo da dieta é restringir quase que totalmente a ingestão
de carboidratos até o ponto em que a gordura corporal seja mobilizada e utilizada
como combustível energético. Tal dieta, pobre em micronutrientes e fibras, e com
altos teores protéicos e de lipídios está em total desacordo com o preconizado pela
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS AND
WORLD HEALTH ORGANIZATION (FAO/OMS, 2002) e pelo estudo do NATIONAL
HEALTH AND NUTRITION EXAMINATION SURVEY (NHANES III, CDC, 1988-
1994), onde os macronutrientes são distribuídos da seguinte forma: proteínas (10-
15%), carboidratos (55-75%) e lipídeos (15-30%), com baixo teor de gorduras trans
e saturadas. O quadro 1 mostra as recomendações da American Heart Association
(AHA) e da National Cholesterol Education Program (NCEP).
No entanto, alguns estudos observaram melhoras no perfil lipídico, melhor
composição corporal, melhor homeostase glicêmica, com melhora na sensibilidade
insulínica, ganho de massa magra e melhora na pressão arterial em indivíduos que
seguiram dieta com baixo teor de carboidratos (APARICIO et al., 2010; PÉREZ-
GUISADO, 2008; NOAKES et al., 2005).
Quadro 1- Comparação entre a dieta da proteína e as recomendações da American Heart Association (AHA) e da National Cholesterol Education Program (NCEP)
Fonte: Kappagoda et al., 2004.
Dieta Atkins (dieta da proteína)
NCEP III AHA guidelines
Calorias(kcal) 1600 1600 1600 Carboidratos (g) 22 (5%) 220 (55%) 220 (55%)
Proteínas (g) 146 (35%) 60 (15%) 28-72(12%) Gordura (g) 104 (59%) 53 (30%) 53 (30%)
gordura saturada (g) 47 (26%) < 7 18 (<10%) Colesterol (mg) 924 <200 <300
fibra dietética (g) 4 20-30 > 25
22
2.3.1 “Dieta da proteína” e perda de peso
As dietas ricas em proteínas são consideradas mais eficazes na redução e
manutenção do peso do que outras dietas com maior proporção de carboidratos ou
gorduras, não só devido ao maior custo de energia de absorção de nutrientes,
processamento e armazenamento, mas também devido ao seu efeito sobre a
saciedade (MERO et al., 2010). O efeito das proteínas na saciedade pode estar
associado às alterações fisiológicas resultante da ingestão desse macronutriente. O
excesso de aminoácidos na corrente sanguínea, observada após a ingestão das
proteínas estimula a liberação de hormônios anorexígenos que agem na saciedade.
No lúmen intestinal, a presença da proteína e o aumento da concentração de
aminoácidos após o processo digestivo, estimulam a secreção da colecistoquinina
(CCK), favorecendo a diminuição da ingestão alimentar.
O gasto de energia na digestão e metabolização é maior com o consumo de
proteínas de origem animal que contêm grandes quantidades de aminoácidos
essenciais do que com as proteínas de origem vegetal, devido ao efeito térmico dos
nutrientes (KELLER, 2011; PAIVA et al., 2007).
O aparente paradoxo de que a ingestão em livre demanda de alimentos ricos
em proteínas e gordura produz perda de peso, pode ser devido a severa restrição de
carboidratos que esgotam os estoques de glicogênio, levando a excreção de água
(ASTRUP et al., 2004). Cada grama de glicogênio hepático é mobilizada com 2 a 3g
de água, enquanto a degradação de cada grama de glicogênio muscular
corresponde a 3 a 4g de água.
A natureza cetogênica da dieta e o alto teor de proteínas saciogênicas, reduz
a ingestão de alimentos espontaneamente ou as escolhas alimentares limitadas
levam à diminuição da ingestão de energia (SHILS, 2009; OLIVEIRA et al., 2003;
ASTRUP et al., 2004). Farnsworth et al. (2003) relatam que os efeitos favoráveis na
perda de peso corporal das dietas com maior proporção de proteína e menor de
carboidratos foram observados em alguns estudos que adotaram a restrição
energética como forma de tratamento para redução de peso.
23
2.3.2 “Dieta da proteína” e cetoacidose
O baixo teor de carboidratos na dieta leva à cetose (daí o nome da dieta
cetogênica). Com a diminuição dos carboidratos da dieta ocorre uma alteração de
substrato energético e a gordura passa a ser a principal fonte energética para os
processos vitais. Os triacilgliceróis presentes no tecido adiposo são degradados,
através da lipólise, gerando ácidos graxos e glicerol. O glicerol será utilizado na
gliconeogênese pelo fígado para a produção de glicose e manutenção dos níveis
glicêmicos (Marzzoco & TORRES, 2007). Através da circulação, a gordura, sob a
forma de ácidos graxos (AGs) associados a lipoproteínas ou a albumina, tanto da
dieta como as estocadas no tecido adiposo, chegam até os diferentes tecidos
corporais, principalmente o músculo, onde serão oxidados no processo de β-
oxidação nas mitocôndrias, formando acetil-CoA que pode seguir dois caminhos: 1)
alimentar o ciclo de Krebs para produção de energia e 2) ser direcionado para a via
de produção de corpos cetônicos ((PÉREZ-GUISADO et al., 2008; MARZZOCO &
TORRES, 2007).
O acúmulo de acetil-coA no citosol das células hepáticas originam os corpos
cetônicos (β-hidroxibutirato, acetoacetato e acetona) (Figura 1). Os corpos cetônicos
no sangue ocorrem como uma resposta natural ao exercício, ao jejum prolongado e
a dietas com alto teor de proteínas e gordura e baixo teor de carboidratos. A
principal função dos corpos cetônicos é sevir como principal substrato energético
para outros tecidos como o cérebro, os rins, o coração e o músculo esquelético. O
uso prolongado de dietas cetogênicas leva à maior produção de cetonas que pode
levar a cetonemia, com excreção de cetonas no hálito e na urina. A excreção pelos
rins de cetonas é acompanhada pela eliminação de sódio, o que causa um aumento
da diurese e diminuição do pH sanguíneo (PÉREZ-GUISADO et al., 2008;
JOHNSTON et al., 2006).
24
Figura 1- Produção de corpos cetônicos no fígado. Fonte: Marzzoco & Torres, 2007.
25
2.4 O TECIDO ÓSSEO
O tecido ósseo é altamente organizado e é o constituinte principal do sistema
músculo-esquelético. O osso é composto por células mesenquimais inclusas dentro
de uma abundante matriz extracelular. Tem por função sustentar partes moles,
proteger órgãos, armazenar íons, apoiar músculos, produzir células sanguíneas,
revestir superfícies articulares onde absorve choques, facilitar deslizamentos e é
essencial para a formação e crescimento dos ossos longos (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008; STEVENS & LOWE, 2004;) (Figura 2).
É um tipo especializado de tecido conjuntivo formado por células e material
extracelular calcificado. Diferencialmente dos outros tecidos, a matriz óssea contém
mineral que confere ao tecido grande resistência e rigidez.
Juntamente com o tecido ósseo, o tecido cartilaginoso compõe o esqueleto, sendo
uma forma especializada de tecido conjuntivo de consistência rígida. A cartilagem é
composta de células chamadas condrócitos e de uma matriz extracelular altamente
especializada; é um tecido avascular, sendo nutrida pelos capilares do conjuntivo
envolvente (pericôndrio) ou através do líquido sinovial das cavidades articulares,
como no caso da cartilagem articular (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008; STEVENS
& LOWE, 2004).
O osso possui um elaborado suprimento sanguíneo e também contém nervos,
vasos sanguíneos e linfáticos. O periósteo é constituindo por duas camadas, uma
fibrosa externa e uma interna mais celular e vascular; o periósteo cobre as
superfícies ósseas externas e participa na consolidação das fraturas (CROCI et al.,
2003; STEVENS & LOWE, 2004).
Os dois principais tipos de tecido ósseo são o trabecular, uma estrutura de
aspecto esponjoso, e o cortical, mais sólido e formado por osteons ou sistemas
Haversianos, que é uma estrutura em forma de tubo. Além das diferenças
estruturais, os dois tipos diferem também quanto a outros aspectos como a
distribuição espacial das células, densidade da matriz mineralizada, distribuição dos
vasos sanguíneos e área ocupada pela medula óssea. Sobre a sua superfície
movem-se as células ósseas. O osso trabecular tem maior superfície em relação ao
volume sendo metabolicamente mais ativo que o cortical. As diáfises dos ossos
longos possuem praticamente só osso cortical. As metáfises por sua vez e a maioria
dos ossos curtos e planos apresentam paredes relativamente finas de osso cortical
26
com grandes volumes de osso esponjoso. Estas diferenças na distribuição de osso
cortical e esponjoso causam diferenças na consolidação óssea (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008; CROCI et al., 2003; STEVENS & LOWE, 2004).(Figura 3).
Figura 2- Representação esquemática da parte interna de um osso
longo. Fonte: Junqueira & Carneiro, 2008.
Figura 3 - A: osso cortical, B:osso trabecular Fonte: Marcu et al., 2011; Fatorre et al., 2010; Wehrli, 2007.
A matriz extracelular (ECM) é subdividida em parte inorgânica e orgânica. A
matriz orgânica é principalmente constituída pelo colágeno tipo I (cerca de 95%).
27
Este dá ao osso uma grande resistência às forças tensionais (STEVENS & LOWE,
2004). A parte inorgânica contém predominantemente cálcio e fósforo, que
aparecem na forma de cristais de hidroxiapatita depositado na matriz colagenosa.
Cálcio e proteínas são os principais componentes do tecido ósseo. Por peso, o
tecido ósseo é formado por 70% de minerais, 8% de água e 22% de proteínas. As
células importantes no osso são os osteoclastos (responsáveis pela reabsorção) e
os osteoblastos (responsáveis pela deposição de tecido ósseo) (SINGH et al., 2012;
PRENTICE et al., 2006).
Uma característica notável do osso é que é o único tecido que contém um tipo
de célula, o osteoclasto, que tem origem nas células troncos hematopoiéticas
conhecidas como monócitos, cuja função é reabsorver (destruir) o tecido hospedeiro.
Isto não ocorre de forma aleatória, mas sim num contexto de uma verdadeira função
homeostática, que é chamado de modelagem óssea durante a infância e
remodelação durante a idade adulta. Esta função caracteriza-se por fases alternadas
de destruição pelos osteoclastos e formação de osso por osteoblastos (KARSENTY
& FERRON, 2012; KRUGER et al., 2010).
Os osteoblastos são responsáveis pela formação óssea, são originárias do
estroma medular das células ósseas (KRUGER et al., 2010). Sintetizam a
osteocalcina que é um marcador de diferenciação osteoblástica e é a mais
abundante proteína óssea não colágena. É carboxilada em 3 resíduos de ácido
glutâmico, que confere à proteína uma elevada afinidade para os minerais tais como
os cristais de hidroxiapatita presente na matriz óssea mineralizada (Figura 4). A
osteocalcina também induz a secreção de insulina e aumenta a sensibilidade à
insulina e gasto de energia, sendo a forma não carboxilada a que está ativa nas
células β do pâncreas (KARSENTY & FERRON, 2012). Também age aumentando
marcadores ósseos anabolizantes, incluindo a síntese de colágeno, produção de
fosfatase alcalina, captação de glicose e aumento da proliferação e diferenciação
celular (FULZELE & CLEMENS, 2012; WONGDEE & CHAROENPHANDHU, 2011).
O metabólito ativo da vitamina D 1,25-dihidroxicolecalciferol [1,25(OH)2D]3, é
considerado o principal regulador da síntese de osteocalcina. A maior parte da
osteocalcina recém-formada continua vinculada ao osso, mas uma pequena fração
da proteína é liberada no sangue (NDIAYE et al., 1995; PARHAMI et al., 2001).
Os osteoblastos possuem receptores para estrogênios, que age sobre o
metabolismo ósseo, promovendo a formação óssea e aumentando o número e
28
função dos osteoblastos e, por outro lado diminui a reabsorção, por apoptose dos
osteoclastos. Atuam também no crescimento, diferenciação e função de muitos
tecidos, portanto a diminuição de estrogênios leva a redução da massa óssea
(AMADEI et al., 2006) (Figura 4).
O fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) é um importante
regulador do metabolismo ósseo, particularmente da formação óssea osteoblástica
(CHEVALLEY et al., 1998). O IGF-I é sintetizado pelo fígado e pelos osteoblastos e
são encontrados em concentrações elevadas na matriz óssea. Também aumentam
o número e função dos osteoblastos, favorecendo a síntese de colágeno. Circulam
ligados a proteínas de ligação (IGFBP), que por sua vez podem ter efeitos inibidores
ou estimuladores sobre o osso. Os IGFs são regulados por hormônios e fatores de
crescimento locais, assim o GH, estrogênio e progesterona aumentam sua
produção, enquanto os glicocorticóides inibem (HERNÁNDEZ-GIL et al., 2006).
Figura 4- Remodelagem óssea (adaptado).
Fonte: Century Center of Excellence (COE) Program Disponível em <http://www.coe-stemcell.keio.ac.jp/member/img/member_img/zu_matsuo2.jpg>
Pesquisadores mostram que a insulina, também, está envolvida na ação
osteogênica por induzir o aumento da proliferação e diferenciação celular, atividade
de fosfatase alcalina e expressão do colágeno tipo I e osteocalcina em osteoblastos
de humanos (WONDEE & CHAROENPHANDHU, 2011).
A união dos dois processos permite a renovação e remodelação ósseas, e é
mantido por toda a vida adulta do indivíduo, sendo responsável pela renovação do
29
esqueleto e mantendo sua integridade anatômica e estrutural. Este mecanismo é
regulado por diversos fatores, como mecanismos regulatórios intracelulares,
influência hormonal, fatores locais e externo. Condições como idade, doenças ósteo-
metabólicas, mobilidade diminuída e ação de algumas drogas podem alterar este
equilíbrio entre formação e reabsorção, levando ao predomínio de um sobre o outro
(AMADEI et al., 2006).
2.4.1 Manutenção do tecido ósseo
O osso sofre contínua remodelação óssea e muitos nutrientes são essenciais
para o crescimento, desenvolvimento e manutenção do esqueleto. A formação e
manutenção óssea requer adequado suprimento de energia, aminoácidos, minerais
(cálcio, fósforo, magnésio e zinco) e de outros íons (cobre e manganês), carbonato,
citrato e vitaminas (C, D e K) que estão envolvidas no cristal e formação de
colágeno, cartilagem e metabolismo ósseo e/ou homeostase do cálcio e fosfato
(DAWSON-HUGHES, 2003; PRENTICE et al., 2006).
O cálcio é essencial para a homeostase óssea. O funcionamento correto do
esqueleto se baseia em níveis normais de cálcio no soro, mas também o osso
desempenha um papel importante na manutenção da homeostase do cálcio
sistêmico. Noventa e nove por cento do cálcio corporal é armazenado no osso, onde
contribui para suas propriedades mecânicas e estruturais. Por conseguinte, o osso
necessita de um fornecimento suficiente de cálcio para manter a integridade do
esqueleto. Esta fonte de cálcio depende, principalmente, da absorção de cálcio no
intestino e da reabsorção de cálcio nos rins. A falha nesse processo pode ocasionar
perda de massa óssea (CASHMAN, 2007).
A manutenção do cálcio é regulada por 3 principais mecanismos: 1) absorção
intestinal, 2) reabsorção renal e 3) turnover ósseo. Estes são regulados pelo
hormônio da paratireóide (PTH), pela 1,25–dihidroxi vitamina D [1,25 (OH)2D] e pela
calcitonina. A maioria do cálcio total do corpo (> 99%) está presente no esqueleto
como complexo cálcio-fosfato, primariamente como hidroxiapatita, que é
responsável por muitas propriedades materiais do osso (PEACOCK, 2010).
30
Os hormônios calciotróficos, PTH, calcitriol e a calcitonina agem em seus
órgãos efetores, principalmente osso, intestino e rins, alterando o transporte dos
íons cálcio para o interior ou para o exterior do fluido extracelular, modulando desta
forma a manutenção da homeostase desse íon (MIYASHIRO & HAUACHE, 2002).
O PTH controla a homeostase do cálcio através da ação direta sobre os
ossos e rins e indiretamente no intestino. Produzido pelas glândulas paratireóides
que respondem à redução dos níveis séricos de cálcio, favorecendo a reabsorção.
Age mobilizando o cálcio do tecido ósseo para o espaço extra-celular, atua nos rins,
aumentando a atividade da enzima 1α-hidroxilase e, assim, ativando a vitamina D
pela inclusão de uma hidroxila do carbono 1 convertendo a vitamina na forma de
1,25-diidroxi-vitamina D. Esta vitamina estimula a síntese de uma proteína nos
enterócitos, chamada calbindina que atua facilitando a absorção de cálcio através do
trato gastrointestinal; atua também nos túbulos renais otimizando a reabsorção de
cálcio (OLIVEIRA & FISBERG, 2003).
Discreta queda dos níveis circulantes de cálcio é suficiente para aumentar a
secreção de PTH em 200 a 300%. Diversas evidências sugerem que o efeito
anabólico do PTH depende não só de sua ação direta sobre osteoblastos e
precursores, como também da participação de fatores de crescimento como o IGF-I
O estímulo de formação envolve incremento de diferenciação de precursores de
osteoblastos, proliferação e ação antiapoptótica de osteoblastos. Em parte esses
efeitos dependem do aumento de expressão do fator de transcrição RunX2, um
elemento chave no processo de diferenciação dos osteoblastos (DE-PAULA, 2009).
O hormônio precursor da vitamina D3 ou calcitriol, pode ser obtido pela dieta
ou a partir do 7-desidrocolesterol na pele através de uma reação não-enzimática
porém dependente da luz ultra violeta (UV). A vitamina D3 é então transportada para
o fígado, onde é hidroxilada e origina 25-hidroxivitamina D3 (25D). A forma 25D
circula no plasma ligada a proteínas de ligação (DBP), a vários tecidos-alvo para
exercer sua ação endócrina que são mediadas pelo receptor de vitamina D (VDR).
Grande parte do calcitriol necessário ao metabolismo sistêmico é sintetizado nas
células dos túbulos renais proximais. A DBP, junto com seus ligantes, apresenta
uma alta taxa de recaptação pelas células dos túbulos proximais, o que evita perda
urinária dos metabólitos do grupo da vitamina D e concentra a 25(OH) nos túbulos
renais, onde será necessário para a conversão em 1,25(OH)2D. Algumas das
funções da 1,25D3 envolve a regulação e metabolismo do cálcio e fosfato, elevando
31
os níveis destes íons no sangue via absorção intestinal e reabsorção renal para
facilitar a mineralização óssea, bem como ativando a reabsorção óssea como parte
do ciclo de remodelagem esquelética (HAUSSLER et al., 2012; CASTRO, 2011).
Em contraste, na hipercalcemia ocorre a supressão da secreção de PTH e
consequente redução da síntese de 1,25(OH)2D3, com resultante diminuição da
reabsorção renal de cálcio, da mobilização do cálcio do osso e da absorção do
cálcio pelo intestino. A hipercalcemia também estimula diretamente a secreção de
calcitonina através de um mecanismo de feedback positivo. A calcitonina é um
hormônio que possui uma atividade hipocalcêmica e exerce sua função reduzindo o
fluxo de cálcio do osso para o fluido extracelular e aumentando a excreção de cálcio.
É um hormônio produzido nas células C ou parafoliculares da tireóide e é inibidor da
reabsorção óssea pela redução do número e da atividade dos osteoclastos
(HERNÁNDEZ-GIL et al., 2006; MIYASHIRO & HAUACHE, 2002).
2.5 Efeito da dieta Atkins no tecido ósseo
Na idade adulta, a proteína não pode ser armazenada nos tecidos do corpo
por simples aumento da quantidade de proteínas exógena. Os aminoácidos
excedentes são utilizados como combustível metabólico e são oxidados, ao contrário
da glicose e dos substratos de ácidos graxos, que são armazenados no fígado e
músculo esquelético e tecido adiposo, respectivamente (KELLER, 2011).
Evidências sugerem que a proteína dietética possa ter influência importante na
saúde do esqueleto, mas a natureza de seu papel permanece controversa. Dietas
ricas em proteína aumentam a perda do osso devido ao ácido produzido pelo
catabolismo da proteína e pela necessidade consequente para que o cálcio deixe o
esqueleto a fim de servir como um agente tampão da acidez elevada no sangue
(MORAIS & BURGOS, 2007; RYLANDER et al., 2006).
O consumo excessivo de proteína pode afetar prejudicialmente a saúde renal e
óssea. Como as proteínas animais são ricas em aminoácidos sulfurados, íons de
amônia produzidos a partir desses aminoácidos levariam, também, à redução do pH
sanguíneo, induzindo a uma acidose metabólica de baixo grau, levando a
hipercalciúria por vários mecanismos. Estes incluem a diminuição da reabsorção
tubular renal de cálcio, aumentando a reabsorção óssea mediada por células e
32
dissolução direta físico-químicas do osso. Em decorrência, levaria à perda de
carbonato e citrato de cálcio ósseo, mobilizados para neutralizar esse excesso de
ácidos. Em teoria, o excesso do consumo de proteína é acidogênica, resultando em
aumento da reabsorção óssea. Os rins são os principais responsáveis por manter
esta compensação (MARDON et al., 2008; MORAIS & BURGOS, 2007; RYLANDER
et al., 2006).
Os efeitos da dieta sobre a excreção urinária de ácido e cálcio não depende
apenas da quantidade de proteínas, mas também pode ser modificado por outros
componentes do alimento, tais como potássio e bicarbonato presente em frutas e
legumes. A deficiência dessas bases na dieta aumenta a carga de ácidos sistêmicos
produzidos por proteínas. Consequentemente, o resultado da alta ingestão de
proteínas e dieta deficiente em frutas e vegetais é a geração de acidose metabólica
crônica, que, embora de baixo grau, tem efeitos deletérios sobre o corpo. As
consequências metabólicas de tais dietas incluem alterações do balanço ácido-base
e eletrolítico, do metabolismo ósseo, da função renal e da função endócrina
(LÓPES-LUZARDO, 2009; KERSTETTER et al., 2003).
Noakes et al.(2005) avaliaram o efeito de dietas hiperproteicas e
hiperglicídicas em mulheres, não encontrando redução no cálcio urinário e não
comprovando efeito deletério na função óssea nesse estudo. Ressalta-se que foram
consumidos vegetais durante a dieta e isso provavelmente impediu a perda de cálcio
devido ao efeito alcalinizante dos vegetais. No entanto, alguns estudos mostram
alterações decorrentes da acidose metabólica crônica no metabolismo ósseo,
sugerindo perda de cálcio nos ossos, efeitos celulares em osteoblastos e
osteoclastos e desordem na mineralização da matriz óssea (JEHLE & KRAPF,
2010).
Se o osso for mobilizado para transportar apenas 1 mEq de ácido a cada dia,
15% do cálcio total do corpo em uma pessoa média seria perdida em uma década.
Evidências sugerem que a proteína dietética possa ter uma influência importante na
saúde do esqueleto, mas a natureza do seu papel envolvido na calciúria permanece
controverso, e o impacto em longo prazo de dietas ricas em proteínas sobre a saúde
óssea ainda é obscuro (PROMISLOW et al., 2002; DARGENT-MOLINA et al., 2008).
Por outro lado, a proteína dietética também poderia afetar a integridade do
esqueleto através de sua influência sobre a produção do IGF-I, que exerce vários
efeitos positivos sobre o esqueleto (PROMISLOW et al., 2002). O aumento do nível
33
circulante de IGF-I pode ser observado em resposta à ingestão aumentada de
proteínas. Essa estimulação do IGF-I tem um efeito favorável sobre a economia
mineral óssea por dupla ação renal. O IGF-I aumenta a produção de 1,25D, a forma
ativa da vitamina D. A 1,25D por sua vez, estimula a absorção intestinal de cálcio e
de fosfato inorgânico (Pi). A segunda ação de IGF-I ao nível renal é aumentar a
reabsorção tubular de Pi. Através desta atividade dupla do IGF-I a concentração de
cálcio e de Pi aumenta no compartimento sistêmico extracelular e, assim, influencia
positivamente o processo de mineralização óssea (CHEVALLEY et al., 1998).
Além disso a dieta rica em gordura, particularmente a gordura saturada como
a encontrada na dieta Atkins, pode ter importante efeito na saúde óssea. Estudos
em animais indicam que estas dietas podem afetar adversamente o osso. Uma
variedade de mecanismos estão envolvidos, como alterações na absorção do cálcio,
síntese de prostaglandinas, formação de osteoblastos e oxidação de lipídios. A
gordura pode reduzir a absorção intestinal de cálcio e, possivelmente, eleva a
excreção renal. Dietas hiperlipídicas aumentam a excreção intestinal e urinária de
cálcio e forma sabões insolúveis de cálcio no intestino resultando no aumento da
sua excreção fecal (MORAIS & BURGOS, 2007; CORWIN et al., 2006).
34
3 JUSTIFICATIVA
Com o crescente aumento da população com excesso de peso é cada vez
maior o interesse por dietas populares. A “dieta da proteína” é uma das mais
procuradas para perda de peso, é rica em proteínas e lipídios, porém o excesso
desses macronutrientes e a quantidade reduzida de carboidratos parece afetar a
saúde óssea.
A literatura ainda é contraditória quanto ao efeito do excessivo consumo de
proteínas e a manutenção e integridade do tecido ósseo. Alguns pesquisadores, ao
contrário do pressuposto que dietas ricas em proteínas prejudicam o osso,
verificaram em observações epidemiológicas associação da alta ingestão de
proteína com anabolismo ósseo.
É bem estabelecido que uma dieta equilibrada é essencial para o bom
funcionamento do organismo e para prevenção de doenças, entretanto o efeito de
dietas populares, incluindo a dieta do Dr. Atkins sobre o organismo ainda carece de
mais estudos.
Assim, esse estudo tem o propósito de avaliar o efeito da Dieta da proteína
sobre o metabolismo ósseo de ratas Wistar adultas.
35
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Avaliar possíveis alterações no metabolismo ósseo de ratas Wistar
alimentadas com a “dieta da proteína”.
4.2 Objetivos específicos
Avaliar a variação de peso corporal dos animais;
Determinar a concentração sérica e óssea de cálcio, fósforo e magnésio;
Determinar a concentração sérica de Insulina, Osteocalcina e
Paratormônio;
Observar modificações na densidade mineral óssea e no conteúdo mineral
ósseo das ratas;
Avaliar possíveis associações entre os indicadores bioquímicos e a
densidade e o conteúdo mineral ósseo.
36
5 METODOLOGIA
5.1 Animais
Foram utilizados, 28 Rattus novergicus, adultos, com 90 dias de idade,
fêmeas, Wistar albino, pesando em torno de 200g, provenientes do Laboratório de
Nutrição Experimental (LabNE) do Departamento de Nutrição e Dietética da
Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro da Universidade Federal
Fluminense (UFF). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, em ambiente
com temperatura controlada, em torno de 22°C ± 2°C e ciclo claro/escuro de 12 em
12 horas (Figura 5).
5.2 Comitê de Ética
O presente projeto foi submetido ao Comitê de ética responsável por
pesquisas em animais de laboratório da Universidade Federal Fluminense (UFF),
tendo sido aprovado com protocolo de pesquisa de número 0027/08. Todos os
animais foram manipulados de acordo com os princípios éticos adotados pelo
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), anexo1.
5.3 Formação dos grupos
Os animais foram divididos em quatro grupos (n= 7/grupo):
1- Grupo Hiperproteico 1 (HP1) - recebeu ração pobre em carboidrato
(4,73g), rica em proteína (49,77g) e lipídios (11,97g), com livre consumo;
2- Grupo Hiperproteico 2 (HP2) – recebeu ração idêntica ao grupo
experimental HP1, entretanto com redução de 30% da ingestão alimentar*.
3- Grupo controle 1 (C1) - recebeu ração à base de caseína, com livre
consumo, balanceada atendendo às necessidades nutricionais, segundo a
AIN 93M (proteína= 11,26g; carboidrato= 59,17g; lipídio= 4,77g).
4- Grupo controle 2 (C2) - recebeu ração idêntica ao grupo controle 1
(caseína), entretanto com redução de 30% da ingestão alimentar*.
37
* A restrição foi realizada em função da diminuição da oferta de ração aos animais,
totalizando oferta de 70% do consumo diário dos grupos HP1 e C1.
Figura 5- Gaiolas com os ratos utilizados no experimento. Biotério do LabNE.
5.4 Preparo da ração
As rações foram preparadas no LabNE da Faculdade de Nutrição da UFF.
Para a ração à base da “dieta da proteína” foi necessário o preparo da carne.
Utilizou-se carne bovina moída (acém), adquirida no comércio local, desidratada em
estufa e ventilada a temperatura de 65ºC ± 2°C por 24 horas. Após, esta foi retirada
das bandejas e triturada em liquidificador industrial até a obtenção do pó, sendo em
seguida peneirado.
Os ingredientes utilizados no preparo das respectivas rações foram pesados,
separadamente, em balança eletrônica da marca BioPrecisa®, homogeneizados em
batedeira industrial até obterem consistência adequada (Quadro 2). Posteriormente,
as mesmas foram moldadas em forma cilíndrica e colocadas em estufa ventilada da
marca Espectru® a 65ºC ± 2°C por 24 horas para desidratação.
A formulação das rações é apresentada no Quadro 2 e a composição
nutricional nos Quadros 3 e 4.
38
Quadro 2- Formulação das rações Controle e Hiperproteica (g/100g de ração).
DIETA CONTROLE DIETA HIPERPROTEICA
INGREDIENTES Grama Grama
CARNE (PÓ) 0 64,07
LEITE (PÓ) 0 20,0
CASEÍNA 14,0 0
AMIDO 58,2 0
AÇÚCAR 10,0 0
ÓLEO 4,0 4,0
FIBRA 5,0 5,0
MIST MINERAIS 3,5 3,5
MIST VITAMINAS 1,0 1,0
L-CISTINA 1,8 1,8
COLINA 2,5 2,5
ÁGAR 0 1,5
TOTAL 100g 100g
39
Quadro 3 – Composição da ração controle utilizada no experimento (g/100g de ração).
Ingredientes Quantidade Glicídio Proteína Lipídio Fibras
Caseína 14,0% - 11,2 - -
Amido 59,07% 47,43 0,06 0,77 -
Óleo 4,0% - - 4,0 -
Celulose 5,0% - - - 5,0
Mix de vitaminas1 1,0% 0,97 - - -
Mix de minerais2
Cálcio
Fósforo
Magnésio
3,5%
38,2
21,2
23,4
0,77 - - -
B- Colina 0,25% - - - -
L- Cistina 0,18% - - - -
Açúcar 10,0% 10,0 - - -
Total 100,0% 236,68 45,04 42,93 5,0
VET (kcal) 324,65 236,68 45,04 42,93
*%de proteína da caseína = 92,5% proteína/100 gramas de caseína
1 Mix de vitaminas (mg/Kg dieta): palmitato de retinol 2,4, colecalciferol 0,025, bissulfito sódico de
benadiona 0,8, biotina 0,22, cianocobalamina 0,01, riboflavina 6,6, hidrocloreto de tiamina 6,6 e acetato de tocoferol 100.
2 Mix de minerais (g/Kg dieta): sulfato de cobre 0,1, molibdato de amônio 0,026, iodato de sódio
0,0003, cromato de potássio 0,028, sulfato de zinco 0,091, hidrogenofosfato de cálcio 0,145, sulfato de ferro amoniacado 2,338, sulfato de magnésio 3,37, sulfato de manganês 1,125, cloreto de sódio 4, carbonato de cálcio 9,89 e diidrogenofosfato de potássio 14,75.
40
Quadro 4– Composição da ração hiperproteica utilizada no experimento (g/100g de ração).
Ingredientes Quantidade Glicídio Proteína Lipídio Fibras
Carne (pó) 64,07% - 47,54 7,94 -
Leite
desnatado
(pó)
20,0% 2,99 2,23 0,03 -
Óleo 4,0% - - 4,0 -
Celulose 5,0% - - - 5,0
Mix de
vitaminas1
1,0% 0,97 - - -
Mix de
minerais2
Cálcio
Fósforo
Magnésio
3,5%
44,8
15,3
17,4
0,77
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B- Colina 0,25% - - - -
L- Cistina 0,18% - - - -
Ágar 1,5% - - - 1,5
Total 100,0% 18,92 199,08 107,73 6,5
VET (kcal) 325,73 18,92 199,08 107,73
1 Mix de vitaminas (mg/Kg dieta): palmitato de retinol 2,4, colecalciferol 0,025, bissulfito sódico de
benadiona 0,8, biotina 0,22, cianocobalamina 0,01, riboflavina 6,6, hidrocloreto de tiamina 6,6 e acetato de tocoferol 100.
2 Mix de minerais (g/Kg dieta): sulfato de cobre 0,1, molibdato de amônio 0,026, iodato de sódio
0,0003, cromato de potássio 0,028, sulfato de zinco 0,091, hidrogenofosfato de cálcio 0,145, sulfato de ferro amoníacado 2,338, sulfato de magnésio 3,37, sulfato de manganês 1,125, cloreto de sódio 4, carbonato de cálcio 9,89 e diidrogenofosfato de potássio 14,75.
5.5 Coleta de dados
5.5.1 Peso corporal
O ensaio biológico teve a duração de 60 dias. Durante a experimentação os
animais foram pesados em balança eletrônica da marca BioPrecisa®, uma vez por
semana, para obtenção da variação do peso corporal, em gramas.
41
5.5.2 Consumo de ração
O controle da ração foi realizado da seguinte forma: para os grupos C1 e HP1
a ração foi ofertada em livre demanda, ou seja, consumiam à vontade. A partir do
consumo destes grupos foi estipulado a quantidade de ração a ser ofertada para os
grupos C2 e HP2 que receberam 70% do consumo, totalizando restrição alimentar
de 30%, sendo que a oferta de ração para estes grupos era realizada diariamente.
5.5.3 Ingestão hídrica
O controle da oferta de água foi realizado uma vez por semana para todos os
grupos. Tanto a oferta quanto a sobra de ração (g) e água (mL) foram controladas
para serem determinadas as quantidades ingeridas. Para pesagem da sobra de
ração foi utilizada balança eletrônica da marca BioPrecisa® e para mensuração da
sobra de água foi utilizada proveta graduada da marca LaborGlas® (expressa em
ml).
5.6 Determinação do ciclo estral das ratas
Devido à atuação dos hormônios sexuais femininos sobre a fisiologia e
metabolismo do organismo, determinou-se realizar o sacrifício dos animais que
estivessem em uma fase específica (estro). Assim, foi verificado antes do sacrifício,
o ciclo estral das ratas. Para tal foi realizado um lavado vaginal com soro fisiológico,
usando pipeta automática de volume fixo (100 μL) (Figura 6). A secreção coletada foi
colocada em lâminas de vidro para observação das células predominantes. As
células da secreção vaginal foram observadas a fresco, em microscópio óptico em
objetiva com aumento de 40X (Figuras 7 e 8). Somente os animais na fase estro
eram sacrificados (AZEREDO, 2012).
42
Figura 6 - Método para realização do lavado vaginal em ratas. Manipulação do animal e coleta
da secreção vaginal. Técnica realizada no LabNE da Faculdade de Nutrição da UFF.
Figura 7- Visualização das lâminas a fresco ou coradas e caracterização das fases do ciclo
estral.
Figura 8 - Fotomicrografia do esfregaço vaginal corado com o início da fase Estro.
Representado pelo aumento do número e predominância de células
queratinizadas. Técnica realizada no LabNE da Faculdade de Nutrição da UFF.
43
5.7 Sacrifício e coleta de sangue e fêmur
Após 60 dias de experimento, os animais foram anestesiados com injeção
intraperitoneal de cloridrato de xilazina associado a ketamina na proporção de 1:1,
na dosagem de 0,1 ml/200g de peso corporal. Em seguida foi realizada coleta de
sangue por punção cardíaca. Os animais que não vinham a óbito durante esta
punção foram sacrificados em câmara de CO2. O sangue foi colocado em tubos
Vaccutainer sem anticoagulante e após a retração do coágulo foi centrifugado a
3000 rpm, durante 20 minutos, para obtenção do soro. E em seguida alíquotas
foram separadas e congeladas a
-80ºC ± 2°C para análises posteriores.
O fêmur direito foi retirado logo após o sacrifício do animal e dissecado. Em
seguida pesado em balança eletrônica da marca BioPrecisa® com precisão de
0,01g. O peso foi expresso em gramas (g). As medidas da distância entre as epífises
e a largura do ponto médio da diáfise foram realizadas com paquímetro modelo LEE
TOOLS (precisão 0,05mm) (Figura 9). Após a medição, foi utilizado para análise do
conteúdo mineral ósseo e para análise densitométrica.
Figura 9- Fêmur dissecado, ao lado paquímetro utilizado para a medição.
As carcaças dos animais foram embaladas em saco plástico e congeladas até
o seu recolhimento pela empresa especializada em retirada de material hospitalar.
44
5.8 Processamento das amostras
5.8.1 Determinação da concentração sérica de cálcio, magnésio e fósforo
As concentrações de cálcio, magnésio e fósforo sérico foram determinadas
por método colorimétrico, utilizando kits comerciais BioClin, específicos para cada
mineral. A leitura das reações obtidas foi realizada por absorbância em
espectrofotômetro modelo SP Biospectro, utilizando comprimentos de onda
específicos para cada analito: cálcio (510nm), fósforo (650nm) e magnésio (500nm).
Após a leitura da absorbância foi realizado o cálculo segundo a fórmula contida na
bula de cada kit, obtendo assim a quantificação final do analito, sendo expresso em
mg/dL.
5.8.2 Determinação da concentração de insulina, osteocalcina e paratormônio
As concentrações séricas de insulina, osteocalcina e paratormônio foram
determinadas por Imunoabsorção Ligado a Enzimas, utilizando o kit para rato da
marca UScn Life Science Inc.
Na determinação da insulina o ensaio emprega a técnica de inibição
competitiva enzimática. Nesta técnica ocorre uma correlação inversa entre a
concentração de insulina na amostra e a intensidade do sinal. A placa de
microtitulação fornecidas no kit era revestido com um anticorpo monoclonal
específico de insulina para rato (IAA). As amostras e os padrões foram adicionados
nos poços da placa. Uma reação de inibição era iniciada entre a insulina de rato
marcada com biotina e a insulina de rato não marcada (amostra ou padrões) com o
anticorpo específico revestido de insulina para rato. Após a incubação o conjugado
não ligado é lavado. Em seguida, avidina conjugada com peroxidase de rábano
silvestre foi adicionado em cada placa e incubada. A quantidade de conjugado ligado
com a peroxidase de rábano era inversamente proporcional a concentração de
insulina na amostra. A mudança de cor foi medida espectrofotometricamente no
leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A
45
concentração de IAA na amostra foi determinada comparando a densidade ótica das
amostras com a curva padrão e os resultados expressos em pg/mL.
Para a concentração sérica de osteocalcina foram utilizadas placas de
microtitulação fornecidos no kit e pré-revestido com um anticorpo específico para
osteocalcina. As amostras, os padrões e a preparação de anticorpo específico para
osteocalcina conjugada com biotina foram adicionadas na microplaca. Após, avidina
conjugada com peroxidase de rábano silvestre foi adicionada em cada poço e
incubado. Em seguida foi adicionada solução de substrato. Somente os poços que
continham osteocalcina, anticorpo conjugado com biotina e avidina conjugada com
enzima exibiam uma mudança na cor. A reação enzima-substrato era terminada pela
adição da solução de ácido sulfúrico e a mudança na cor medida
espectrofotometricamente no leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento
de onda de 450 nm. A concentração de osteocalcina nas amostras foi então
determinada através da comparação da densidade ótica das amostras com a curva
padrão. A curva foi constituída por análise de regressão e os resultados expressos
em ng/mL.
Para a concentração sérica de paratormônio (PTH) empregou-se a técnica da
inibição competitiva enzimática. Um anticorpo monoclonal específico para PTH de
rato foi pré-revestido na microplaca. Uma reação de inibição competitiva foi iniciada
entre o PTH de rato marcado com biotina e PTH de rato não marcado (padrões e
amostras) com o anticorpo específico para PTH de rato pré-revestido. Após
incubação o conjugado não-ligado foi lavado, em seguida avidina conjugada com
peroxidase de rábano foi adicionada em cada poço da microplaca e incubada. A
quantidade de peroxidase de rábano ligado é inversamente proporcional a
concentração de PTH na amostra. Após adição da solução de substrato, a
intensidade da cor desenvolvida é reversamente proporcional a concentração de
PTH na amostra. A mudança de cor foi medida espectrofotometricamente no leitor
de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A concentração
de PTH na amostra foi determinada através da comparação da densidade ótica das
amostras com a curva padrão. Os resultados foram expressos pg/mL.
46
5.8.3 Conteúdo mineral ósseo do fêmur
Antes da análise, todo o material utilizado foi previamente lavado por imersão
em ácido nítrico diluído (1:4), posteriormente, cuidadosamente enxaguado com água
deionizada e, por fim, colocado em estufa à 105º C para a secagem. Os materiais
foram resfriados no dessecador e depois colocados por 3 horas na mufla para
posterior resfriamento e pesagem em balança analítica.
Primeiramente foi determinada a umidade, realizada por meio da técnica
gravimétrica com emprego de calor (105º C) (CECCHI,1999).
Para obtenção das cinzas, o fêmur direito de cada animal foi colocado no
cadinho, identificados individualmente, aquecidos em mufla (Quimis) a 550º C por 3
horas (até a queima total de matéria orgânica) e resfriados em dessecador até a
temperatura ambiente, para posterior pesagem em balança analítica. Novas
pesagens foram realizadas até as amostras adquirirem peso constante (CECCHI,
1999). Os resultados foram expressos em gramas. Com os resultados de umidade e
cinzas foi possível determinar o resíduo mineral fixo de cada amostra.
Após produzidas as cinzas, estas em seus respectivos cadinhos foram
acidificadas com 3 ml de ácido nítrico (65%), colocadas em placa aquecida à 80º C
por 30 minutos. Depois de resfriados, os cadinhos foram lavados com 10 ml de água
deionizada e foram recuperados 5 ml de amostra com uma seringa. A solução foi
filtrada com filtro Jet BioFil (Innovative unique) acoplado a seringa. Essa solução foi
transferida para tubos lavados em ácidos para que assim pudessem ser realizadas
as análises de minerais.
As análises de minerais foram realizadas a partir dos kits comerciais (Bioclin).
A leitura das reações obtidas foi realizada em espectrofotômetro modelo SP
Biospectro, utilizando comprimentos de onda específicos para cada analito: cálcio
(510nm), magnésio (500nm) e fósforo (650nm). Após a leitura da absorbância foi
realizado o cálculo segundo a fórmula contida na bula de cada kit, considerando a
diluição da amostra, obtendo assim a quantificação final do analito, sendo o
resultado expresso em mg/dL.
47
5.8.4 Densitometria óssea
A densitometria óssea foi realizada no Laboratório de Avaliação Nutricional e
Funcional – (LANUFF) da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro da UFF.
A massa óssea e a composição corporal foram avaliadas por absorciometria com
dupla emissão de raios-X, utilizando o densitômetro LUNAR – IDXA (GE-Healthcare,
Madison, WI), com software encore versão 13.40 (Figura 10), utilizou-se um
programa para análises densitométricas em pequenos animais (TSUJIO et al., 2009;
GLICKMAN et al., 2004).
Analisamos parâmetros densitométricos de todos os animais utilizando o
sistema Dual Energy X-Ray Absorptiometry (DXA). Este é um método com grande
precisão e acurácia para medidas do conteúdo mineral ósseo (CMO), que utiliza
baixa quantidade de radiação. É um método preciso também para medir tanto a
massa óssea quanto os componentes corporais de gordura e massa magra
(HERMSDORFF & MONTEIRO, 2004).
Baseia-se na atenuação sofrida pelos raios X ao atravessarem os diferentes
tipos de tecidos de um corpo. Os dois tipos de energia padronizado nesses raios X
possibilitam a diferenciação entre os vários tecidos corporais, dividindo o organismo
em conteúdo mineral, massa gorda e massa magra (isenta de gordura). No
compartimento ósseo, o método é capaz de determinar a quantidade de minerais
em gramas (conteúdo mineral ósseo) contida em uma determinada projeção do
osso. Dividindo-se esse conteúdo mineral pela área óssea do local, obtém-se o que
se convencionou chamar de Densidade Mineral Óssea (DMO), embora se trate de
uma medida de g/cm2 (LAZARETTI-CASTRO, 2004).
As análises densitométricas, Densidade Mineral Óssea (DMO,g/cm2),
Conteúdo Mineral Ósseo (CMO,g) e a Área óssea (cm2) foram realizadas,
individualmente, no início do experimento (com o animal anestesiado) para garantir
que todos os animais tinham os mesmos parâmetros densitométricos. Nova análise
foi realizada ao final do experimento, momentos antes do sacrifício, com o animal já
anestesiado. Embora tenha sido realizado a densitometria óssea do corpo inteiro do
animal apenas os seguintes sítios foram analisados: a densitometria óssea total, a
pelve, a coluna, o tecido gordo e magro do tronco e tecido gordo e magro total.
48
O mesmo procedimento foi realizado com o fêmur direito. A densitometria
óssea foi realizada nas peças colocadas (uma de cada vez) em recipiente com arroz
para simular os tecidos moles (COSTA et al., 2012).
Figura 10 a Figura 10 b Figura 10 c
Figura 10 a – Equipamento Lunar iDXA GE, utilizado para mensuração da densidade mineral óssea. Figura 10 b - animal pronto para realização da análise. Figura 10 c - imagem do corpo do animal utilizando o aparelho densitométrico.
5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados são apresentados a partir de estatística descritiva como média
e erro padrão da média (EPM). Análises de comparação de médias dentro do
próprio grupo (antes e depois) foram realizadas a partir da utilização do teste de
hipóteses pareado (t-pareado) para os parâmetros densitométricos (DMO, CMO e
Área óssea) e para análises de comparação de média entre os grupos utilizamos
ANOVA com medidas de repetição, e Duncan como pós-teste. Para análise da
evolução da massa corporal (g), foi utilizada ANOVA bi-variada. Trabalhamos com
um nível de significância de 5%. Para estas análises foi utilizado o software
GraphPad inStat versão 3.1 para Win/95 NT.
49
6 RESULTADOS
6.1 Peso corporal, ingestão hídrica e consumo de ração
Ao final do experimento o grupo HP1 e C1 apresentaram aumento do peso
corporal (HP1: 277,3 ± 17,35 g; C1: 269,0 ± 6,48 g) quando comparados aos grupos
HP2: 187,0 ± 11,47 g e C2: 177,6 ± 1,76 g) (P<0,05). A diferença significativa dos
grupos HP2 e C2 começou a ser observada a partir da quarta e sexta semana,
respectivamente (Gráfico 1).
Quanto à ingestão hídrica, os grupos hiperproteicos apresentaram maior
consumo (HP1: 11,46 ± 10,33 e HP2: 14,46 ± 12,08, ml/dia/100g PC), quando
comparados ao grupo C1 (7,84 ± 0,61 ml/dia/100gPC) (P<0,05). O grupo C2 ingeriu
10,4 ± 7,97, ml/dia/100gPC e apresentou ingestão hídrica semelhante aos grupos C1
e HP1 (Gráfico 2).
O consumo de ração em g/dia foi maior nos grupos com ingestão em livre
demanda, que consumiram quantidades similares entre si, o mesmo ocorreu entre
os grupos com restrição alimentar, porém com quantidade inferior aos grupos com
consumo em livre demanda (C1: 14,32 ± 0,65; HP1: 12,79 ± 0,81; C2: 9,12 ± 0,21;
HP1: 8,20 ± 0,04).
0 2 4 6 8 100
100
200
300
400
b bbb bbba a a a a
Semanas (60 dias)
Ma
ss
a c
orp
ora
l (g
)
Gráfico 1- Evolução do peso corporal (g, ANOVA bi-variada, P<0,05); Grupos controles (●, C1; ■, C2), Grupos Hiperproteicos (▲, HP1; ▼, HP2). Diferentes letras denotam dieferença estatística (P<0,05), a – HP1 significativamente diferente de HP2; b – C1 significativamente diferente de C2.
50
C1 HP1 C2 HP20
5
10
15
20
a
b,ca,b
cL
íqu
ido
In
geri
do
dia
(m
L/1
00g
PC
)
Gráfico 2- Ingestão hídrica (mL/100g de peso corporal/dia); ANOVA uni-variada, (P<0,05). Grupo controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2 e HP2. a,b,c
Valores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes (P<0,05).
C1 HP1 C2 HP2
0
5
10
15
20
aa
b
b
Co
nsu
mo
Ali
men
tar
(g/d
ia)
Gráfico 3- Consumo alimentar (g/dia); ANOVA uni-variada, (P<0,05); Grupo Controle (C 1); Grupo
Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30 % de restrição alimentar C2 e HP2. a,b
Valores médios
com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes (P<0,05).
51
6.2 Concentrações séricas de minerais e hormônios estudados
As análises bioquímicas do sangue evidenciaram que os grupos
hiperproteicos apresentaram concentração sérica de cálcio (HP1: 7,43 ± 0,17; HP2:
7,15 ± 0,11) menor quando comparada ao grupo C1 (8,22 ± 0,20) (P<0,05). O grupo
HP2 apresentou menor concentração sérica de insulina (0,35 ± 0,13), em relação
aos demais grupos (C1: 1,45 ± 0,33; HP1: 0,91 ± 0,3; C2 0,64 ± 0,14) (P<0,05). As
concentrações séricas de osteocalcina foram menores nos grupos hiperproteicos
(P<0,05) (HP1: 0,38 ± 0,12; HP2: 0,33 ± 0,15) quando comparados com os grupos
controle (C1: 1,21 ± 0,47; C2: 0,73 ± 0,13). Não houve diferenças significativas nas
concentrações de magnésio, fósforo e paratormônio (Tabela 1).
Tabela 1- Concentrações séricas de minerais e hormônios estudados. C1 HP1 C2 HP2
Cálcio (mg/dL) 8,22 ± 0,20 a 7,43 ± 0,17 b 7,76 ± 0,14 a ,b 7,15 ± 0,11 b
Magnésio (mg/dL) 1,84 ± 0,15 2,13 ± 0,25 2,27 ± 0,43 1,98 ± 0,10
Fósforo (mg/dL) 5,08 ± 0,31 4,21 ± 0,20 4,12 ± 0,25 4,47 ± 0,31
Insulina (pg/mL) 1,45 ± 0,33a 0,91 ± 0,39 a 0,64 ± 0,14 a 0,35 ± 0,13b
Osteocalcina (ng/mL) 1,21 ± 0,47a 0,38 ± 0,12c 0,73 ± 0,13b 0,33 ± 0,15c
Paratormônio (pg/mL) 8,48 ± 1,16 8,70 ± 1,43 9,04 ± 1,54 7,35 ± 1,59
Grupo Controle (C 1); Grupo Hiperprotéico (HP1). Grupos submetidos a 30 % de restrição alimentar C2 e HP2.
a,b,cValores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes
(ANOVA uni-variada, P<0,05).
6.3 Valores de peso, distância entre as epífises e largura do ponto médio
das diáfises e conteúdo mineral ósseo do fêmur direito
O peso (g) e a distância (mm) entre as epífises do fêmur não diferiram entre
os grupos. No entanto, a largura (mm) do ponto médio da diáfise (HP1 0,45 ± 0,01;
52
HP2 0,46 ± 0,02; C1 0,5 ± 0,01; C2 0,52 ± 0,01) e o conteúdo de cálcio ósseo
(mg/dL) (HP1 12,38 ± 0,24; HP2 11,59 ± 0,3; C1 17,11 ± 2,63; C2 16,89 ± 3,42)
foram menores nos grupos hiperproteicos quando comparados com os grupos
controle (P<0,05). A concentração de magnésio (mg/dL) foi maior nos grupos
hiperproteicos (HP1 8,2 ± 1,09; HP2 8,19 ± 1,42; C1 4,00 ± 0,33; C2 3,88 ± 0,37)
(P<0,05). Não houve diferença estatística significativa entre os grupos em relação à
concentração de fósforo (Tabela 2).
Tabela 2- Parâmetros biométricos e conteúdo mineral ósseo do fêmur direito das ratas ao final do experimento. C1 HP1 C2 HP2
Peso (g) 0,92 ± 0,01 0,93 ±0,05 0,92 ± 0,01 0,84 ± 0,02
Distância entre as
epífises (mm)
3,15 ± 0,05 3,20 ± 0,05 3,20 ± 0,05 3,08 ± 0,04
Largura do ponto
médio das diáfises
(mm)
0,51 ± 0,01a 0,45 ± 0,01b 0,52 ± 0,0a 0,46 ± 0,02b
Conteúdo Mineral
Cálcio (mg/dL) 17,11±2,63a 12,38 ±0.24b 16,89 ± 3,42 a 11,59 ± 0,3b
Magnésio (mg/dL) 4,00 ± 0,33 a 8,2 ± 1,09b 3,88 ± 0,37 a 8,19 ± 1,42b
Fósforo (mg/dL) 7,37 ± 1,87 6,10 ± 0,97 5,08 ± 1,77 5,76 ± 1,03
Grupo Controle (C 1); Grupo Hiperprotéico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2 e H2.
a,b,cValores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes
(ANOVA uni-variada, P<0,05).
53
6.4 Densitometria óssea
Foi avaliada a densidade mineral óssea (DMO g/cm2), o conteúdo mineral
ósseo (CMO g) e a Área óssea (cm2). A análise densitométrica realizada no início do
experimento revelou que todos os animais tinham os mesmos parâmetros
densitométricos. Foi analisado também o incremento de cada um dos parâmetros,
DMO, CMO e da Área óssea. O incremento foi obtido pela diferença entre os
resultados densitométricos obtidos no início do experimento e ao final do
experimento (dados na tabela 3).
A DMO corporal total, ao final do experimento, foi maior nos grupos que
receberam dieta em livre consumo (HP1 e C1), com incremento deste indicador
(P<0,05). Cabe ressaltar que o grupo HP1 apresentou incremento da DMO similar
aos grupos com restrição. Com exceção do grupo HP1(que começou com uma DMO
maior em relação aos outros grupos), todos os outros grupos apresentaram aumento
siginificativo (P<0,05) da DMO ao final do experimento em relação ao início (DMO,
g/cm2- Início i, Final F, Incremento I (g), C1 i 0,129 ± 0,001, F 0,160 ± 0,01, I 0,032 ±
0,01; HP1 i 0,135 ± 0,01, F 0,150 ± 0,01, I 0,022 ± 0,01; C2 i 0,129 ± 0,01, F 0,140 ±
0,01, I 0,01 ± 0,01; HP2 i 0,131 ± 0,01, F 0,140 ± 0,01, I 0,015 ± 0,01).
Em relação ao CMO corporal total e seu incremento, observa-se maior
(P<0,05) conteúdo mineral e de incremento nos grupos com livre consumo do que os
grupos com restrição (CMO, g - Início i, Final F, Incremento I (g), C1 i 5,92 ± 0,1, F
8,80 ± 0,36, I 2,65 ± 0,4; HP1 i 6,26 ± 0,5, F 8,28 ± 0,14, I 2,02 ± 0,4; C2 i 5,82 ± 0,1,
F 6,40 ± 0,15, I 0,58 ± 0,1; HP2 i 6,08 ± 0,1, F 6,82 ± 0,03, I 0,740 ± 0,1). Todos os
grupos apresentaram aumento siginificativo (P<0,05) do CMO ao final do
experimento em relação ao início.
Houve aumento significativo da Área óssea e do seu incremento nos grupos
HP1 e C1, o mesmo não sendo observado nos grupos com restrição, quando
comparamos os dados do final do experimento com o início (Área óssea, cm2- Início
i, Final F, Incremento I (g), C1 i 45,5 ± 0,8, F 52,40 ± 1,8, I 7,25 ± 1,25; HP1 i 46,0 ±
1,9, F 52,60 ± 0,4, I 6,60 ± 2,06; C2 i 45,2 ± 0,8, F 45,8 ± 0,9, I 0,60 ± 0,8; HP2 i 46,4
± 0,6, F 46,60 ± 0,8, I 0,20 ± 1,24).
Quanto à região da pelve, ao final do experimento, a DMO foi maior nos
grupos HP1 e C1(P<0,05). O incremento foi menor nos grupos com restrição sendo
que o HP1 apresentou valores similares ao C1 e ao HP2 (DMO, g/cm2 - Início i, Final
54
F, Incremento I (g), i C1 0,127 ± 0,01, F 0,160 ± 0,01, I 0,032 ± 0,01; HP1 i 0,135 ±
0,01, F 0,160 ± 0,01, I 0,023 ± 0,01; C2 i 0,126 ± 0,01, F 0,130 ± 0,01, I 0,002 ± 0,01;
HP2 i 0,125 ± 0,01, F 0,140 ± 0,01, I 0,013 ± 0,01) (P<0,05).
O CMO da pelve foi menor no grupo C2 (P<0,05). Quando avaliamos o
incremento, verificamos valores similares entre os grupos HP1 e os grupos controle
e entre os grupos HP1 e os grupos com restrição (CMO, g - Início i, Final F,
Incremento I (g), C1 i 2,025 ± 0,15, F 2,34 ± 0,2, I 0,720 ± 0,4; HP1 i 2,08 ± 0,01, F
1,98 ± 0,1, I -0,10 ± 0,1; C2 i 2,00 ± 0,1, F 1,70 ± 0,1, I -0,3 ± 0,1; HP2 i 2,24 ± 0,01,
F 1,84 ± 0,1, I -0,4 ± 0,2). Na análise por grupo, apenas o C2 não apresentou
aumento da DMO, enquanto que na análise do CMO não houve aumento em
nenhum grupo quando comparamos o início e o final do experimento. Não houve
diferença significativa da Área óssea e do incremento entre os grupos, porém,
observa-se diferença significativa (P<0,05) quando comparamos dados do final do
experimento com o início nos grupos HP1, HP2 e C2 (P<0,05) (Área óssea, cm2 -
Início i, Final F, Incremento I (g), C1 i 16,0 ± 1,5, F 14,80 ± 0,6; I -1,00 ± 1,9; HP1 i
15,4 ± 0,6, F 12,20 ± 0,4, I -3,2 ± 0,7; C2 i 15,8 ± 1,35, F 13,20 ± 1,0, I -2,6 ± 0,9;
HP2 i 17,6 ± 0,7, F 13,0 ± 0,8, I -4,6 ± 1,5).
A DMO e o incremento da coluna vertebral foram maiores nos grupos C1 e
HP1 (P<0,05) (DMO, g/cm2- Início i, Final F, Incremento I (g), C1 i 0,115 0,01, F
0,150 ± 0,01, I 0,03 ± 0,01; HP1 i 0,115 ± 0,01, F 0,150 ± 0,01, I 0,04 ± 0,01; C2 i
0,113 ± 0,01, F 0,120 ± 0,01, I 0,004 ± 0,01; HP2 i 0,120 ± 0,01, F 0,120 ± 0,01, I
0,007 ± 0,01).
O CMO também foi maior nos grupos C1 e HP1 (P<0,05), no entanto, o
incremento deste parâmetro foi similar entre todos os grupos (CMO, g- Início i, Final
F, Incremento I (g), C1 i 1,275 ± 0,05, F 1,78 ± 0,2, I 0,200, HP1 i 1,02 ± 0,2, F 1,74
± 0,05, I 0,720 ± 0,1, C2 i 1,00 ± 0,2, F 1,12 ± 0,1, I 0,10 ± 0,4; HP2 i 1,26 ± 0,1, F
1,12 ± 0,1, I -0,14 ± 0,01). Quando analisamos por grupo o início e o final do
experimento, observa-se que houve aumento da DMO nos grupos HP1, HP2 e C1 e
aumento do CMO apenas no grupo HP1.
Os valores obtidos da área óssea e do seu incremento foram similares entre
todos os grupos. Na análise por grupo não houve aumento da área ao final do
experimento (Área óssea, cm2 - Início i, Final F, Incremento I (g), C1 i 10,75 ± 0,5, F
55
12,00 ± 1,0, I -1,25 ± 3,6; HP1 i 9,00 ± 1,0, F 11,40 ± 0,5, I 2,40 ± 0,9; C2 i 8,6 ± 1,0,
F 9,40 ± 0,8, I 0,80 ± 1,6; HP2 i 10,6 ± 0,2, F 9,0 ± 0,8, I -1,60 ± 0,7).
Na avaliação do fêmur, foi observado menor DMO no grupo HP2 (P<0,05)
(DMO, g/cm2 - C1: 0,156 ± 0,01; HP1: 0,146 ± 0,01; C2: 0,145 ± 0,01; HP2: 0,132 ±
0,01). O CMO e a área não apresentaram diferença estatística significativa.
Tabela 3 - Composição óssea, avaliada com o auxílio do DXA (continua) Total C1 HP1 C2 HP2
DMO (g/cm2)
Início
Final
Incremento
0,129 ± 0,001*
0,160 ± 0,01a
0,032 ± 0,01a
0,135 ± 0,01
0,150 ± 0,01ª
0,022 ± 0,01a,b
0,129 ± 0,01 *
0,140 ± 0,01b
0,01 ± 0,01b
0,131 ± 0,01*
0,140 ± 0,01b
0,015 ± 0,01b
CMO (g)
Início
Final
Incremento
5,92 ± 0,1*
8,80 ± 0,36 a
2,65 ± 0,4a
6,26 ± 0,5*
8,28 ± 0,14a
2,02 ± 0,4a
5,82 ± 0,1*
6,40 ± 0,15b
0,58 ± 0,1b
6,08 ± 0,1*
6,82 ± 0,03 b
0,740 ± 0,1b
Área óssea
(cm2)
Início
Final
Incremento
45,5 ± 0,8*
52,40 ± 1,8 a
7,25 ± 1,25a
46,0 ± 1,9*
52,60 ± 0,4a
6,60 ± 2,06a
45,2 ± 0,8
45,80 ± 0,9b
0,60 ± 0,8b
46,4 ± 0,6
46,60 ± 0,8b
0,20 ± 1,24b
56
Tabela 3 - Composição óssea, avaliada com o auxílio do DXA (continua) Total C1 HP1 C2 HP2
Pelve
DMO (g/cm2)
Início
Final
Incremento
0,127 ± 0,01*
0,160 ± 0,01a
0,032 ± 0,01a
0,135 ± 0,01*
0,160 ± 0,01a
0,023 ± 0,01a,c
0,126 ± 0,01
0,130 ± 0,01b
0,002 ± 0,01b
0,125 ± 0,01*
0,140 ± 0,01b
0,013 ± 0,01b,c
CMO (g)
Início
Final
Incremento
2,025 ± 0,15
2,34 ± 0,2 a
0,72 ± 0,4a
2,08 ± 0,01
1,98 ± 0,1 a
-0,10 ± 0,1a,b
2,00 ± 0,1
1,70 ± 0,1b
-0,30 ± 0,1a,b
2,24 ± 0,01
1,84 ± 0,1a
-0,40 ± 0,2b
Área óssea
(cm2)
Início
Final
Incremento
16,0 ± 1,5
14,80 ± 0,6
-1,0 ± 1,9
15,4 ± 0,6*
12,20 ± 0,4
-3,2 ± 0,7
15,8 ± 1,35*
13,20 ± 1,0
-2,6 ± 0,9
17,6 ± 0,7*
13,00 ± 0,8
-4,6 ± 1,5
Coluna
Vertebral
DMO (g/cm2)
Início
Final
Incremento
0,115 ± 0,01*
0,150 ± 0,01a
0,03 ± 0,01a
0,115 ± 0,01*
0,150 ± 0,01a
0,04 ± 0,01a
0,113 ± 0,01
0,120 ± 0,01b
0,004 ± 0,01b
0,120 ± 0,01
0,120 ± 0,01b
0,007 ± 0,01b
57
Tabela 3 - Composição óssea, avaliada com o auxílio do DXA (conclusão) C1 HP1 C2 HP2
Coluna
Vertebral
CMO (g)
Início
Final
Incremento
1,275 ± 0,05
1,78 ± 0,2 a
0,20 ± 0,5
1,02 ± 0,2*
1,74 ± 0,05 a
0,72 ± 0,1
1,00 ± 0,2
1,12 ± 0,1b
0,10 ± 0,4
1,26 ± 0,1
1,12 ± 0,1b
-0,14 ± 0,01
Área óssea
(cm2)
Início
Final
Incremento
10,75 ± 0,5
12,00 ± 1,0
-1,25 ± 3,6
9,00 ± 1,0
11,40 ± 0,5
2,40 ± 0,9
8,6 ± 1,0
9,40 ± 0,8
0,80 ± 1,6
10,6 ± 0,2
9,00 ± 0,8
-1,60 ± 0,7
Fêmur **
DMO (g/cm2)
0,156 ± 0,01a
0,146 ± 0,01 a
0,145 ± 0,01 a
0,132 ± 0,01b
CMO (g) 0,400 ± 0,01 0,380 ± 0,02 0,370 ± 0,01 0,360 ± 0,05
Área (cm2) 2,80 ± 0,10 2,80 ± 0,10 2,71 ± 0,10 2,66 ± 0,20
Grupo Controle 1 (C 1); Grupo Hiperproteico 1 (HP1); Grupo Controle 2 (C2), Grupo Hiperproteico 2 (HP2).
a,b,cValores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes
(ANOVA uni-variada, P<0,05). * Diferença significativa ao final do experimento em relação ao início.
* * Diferença significativa entre os grupos ao final do experimento.
6.4.1 Quantidade de tecido gordo e magro corporal no tronco e total
O tecido gordo no tronco e o total bem como seus respectivos incrementos
foram maiores nos grupos HP1 e C1(P<0,05). Ressalta-se que na análise por grupo
58
esses ganharam tecido gordo, enquanto os grupos com restrição perderam gordura
ao final do experimento. Quando comparamos por grupo, o tecido gordo total,
observamos que apenas o grupo HP1 não apresentou diferença significativa ao final
do experimento em comparação com o início (Tecido gordo no tronco- Início i, Final
F, Incremento I (g), C1 i 38,0 ± 5,21, F 82,6 ± 9,97, I 37,7 ± 7,16; HP1 i 37,4 ± 4,30,
F 63,8 ± 2,63, I 26,4 ± 3,83; C2 i 37,2 ± 1,82, F 26,8 ± 1,68, I -10,4 ± 2,52; HP2 i
39,8 ± 2,82, F 24,4 ± 1,77, I -15,4 ± 2,94. Tecido gordo total- C1 i 44,5 ± 5,95, F
96,2 ± 11,3, I 43,5 ± 7,36, HP1 i 50,8 ± 7,51, F 69,8 ± 7,86, I 19,0 ± 13,8, C2 i 43,2 ±
2,06, F 33,8 ± 1,80, I -9,4 ± 2,6, HP2 i 45,2 ± 3,04, F 31,4 ± 2,48, I -13,8 ± 3,51)
(Tabela 4).
Tabela 4 - Quantidade de tecido gordo no tronco e total
Grupo Controle 1 (C 1); Grupo Hiperproteico 1 (HP1); Grupo Controle 2 (C2);Grupo Hiperproteico 2 (HP2).
a,b,cValores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes
(ANOVA uni-variada, P<0,05). * Diferença significativa ao final do experimento em comparação ao início.
Os valores do tecido magro do tronco foram similares entre os grupos
hiperproteicos e o grupo C1, sendo que o resultado do grupo HP2 foi similar ao do
grupo C2. Apenas o grupo HP2 apresentou perda significativa de tecido magro no
tronco ao final do experimento quando comparamos com o início (P<0,05). O valor
do incremento de tecido magro no tronco foi similar entre os grupos hiperproteicos e
o grupo C1, tendo o grupo C2 apresentado valor significativamente menor dos
Tecido gordo (g) C1 HP1 C2 HP2
Tronco
Início
Final
Incremento
Total
Início
Final
Incremento
38,0 ± 5,21*
82,6 ± 9,97a
37,7 ± 7,16 a
44,5 ± 5,95*
96,2 ± 11,3 a
43,5 ± 7,36 a
37,4 ± 4,30*
63,8 ± 2,63a
26,4 ± 3,83 a
50,8 ± 7,51
69,8 ± 7,86 a
19,0 ± 13,8a,c
37,2 ± 1,82*
26,8 ± 1,68b
-10,4 ± 2,52b
43,2 ± 2,06*
33,8 ± 1,80b
-9,4 ± 2,6b,c
39,8 ± 2,82*
24,4 ± 1,77b
-15,4 ± 2,94b
45,2 ± 3,04*
31,4 ± 2,48a
-13,8 ± 3,51b
59
outros grupos (P<0,05). O tecido magro total do grupo HP1 apresentou valor similar
ao do grupo C1, o mesmo aconteceu entre os grupos HP2 e C1 e entre os grupos
com restrição. O incremento do tecido magro total apresentou valores semelhantes
entre os grupos hiperproteicos e o grupo C1 e entre si. Quando se analisa por grupo
verifica-se que apenas o grupo C2 apresentou perda significativa (P<0,05) ao final
do experimento em comparação com o início (Tecido magro no tronco- Início i, Final
F, Incremento I (g), C1 i 153,7 ± 7,47, F 137 ± 9,6, I -7,5 ± 4,42; HP1 i 160 ± 8,3, F
154,07 ± 3,4, I -6,0 ± 6,35; C2 i 155,2 ± 8,0, F 106,2 ± 3,5, I -49 ± 5,17, HP2 i
153,4 ± 4,27, F 118 ± 4,1, I -35,4 ± 7,10. Tecido magro total- C1 i 173,5 ± 8,2, F
158 ± 10,2, I -6,0 ± 3,5; HP1 i 185,2 ± 10,6, F 180 ± 3,78, I -5,2 ± 8,6; C2 i 174 ± 8,1,
F 127 ± 3,8, I -46,8 ± 5,0, HP2 i 171,4 ± 4,7, F 142 ± 4,0, I -29 ± 7,1) (tabela 5).
Tabela 5 - Quantidade de tecido magro corporal no tronco e total
Grupo Controle 1 (C 1); Grupo Hiperproteico 1 (HP1); Grupo Controle 2 (C2);Grupo Hiperproteico 2 (HP2).
a,b,cValores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes
(ANOVA uni-variada, P<0,05). * Diferença significativa ao final do experimento em comparação ao início.
Tecido magro (g) C1 HP1 C2 HP2
Tronco
Início
Final
Incremento
Total
Início
Final
Incremento
153,7 ± 7,47
137,0 ± 9,6a
-7,5 ± 4,42 a
173,5 ± 8,2
158,0 ± 10,2a,c
-6,0 ± 3,5a
160,0 ± 8,3
154,07 ± 3,4a
-6,0 ± 6,35 a
185,2 ± 10,6
180,0 ± 3,78a
-5,2,0 ± 8,6a
155,2 ± 8,0
106,2 ± 3,5b
-49,0 ± 5,17b
174,0 ± 8,1*
127,0 ± 3,8b
-46,8 ± 5,0b
153,4 ± 4,27*
118,0 ± 4,1a,b
-35,4 ± 7,10 a
171,4 ± 4,7
142,0 ± 4,0b,c
-29,0 ± 7,1a,b
60
7 Discussão
As dietas ricas em proteínas são as mais procuradas para perda de peso. São
consideradas mais eficazes na redução e manutenção da massa corporal do que
outras dietas com maior proporção de carboidratos ou gorduras devido ao seu efeito
saciogênico que leva o indivíduo a ingerir quantidade menor de alimento. No entanto
ainda há questionamentos sobre o efeito destas dietas no tecido ósseo.
O efeito das proteínas na saciedade pode estar associado às alterações
fisiológicas resultante da ingestão desse macronutriente (MERO et al., 2010). Devido
a indução da cetose e aumento da concentração de aminoácidos na corrente
sanguínea, hormônios anorexígenos são liberados, agindo na saciedade. O aumento
da secreção de CCK, derivado do aumento de aminoácidos após o processo
digestivo, também atua neste processo (JOHNSTONE et al., 2008; PAIVA et al.,
2007). Encontramos menor consumo de ração nos grupos hiperproteicos, o que já
era esperado devido ao efeito saciogênico das proteínas como já relatado.
Outro fator envolvido na perda de peso é que dietas hiperpoteicas induz a
gliconeogênese (KELLER, 2011), que leva a maior perda de água e consequente
perda de peso. Entretanto, mesmo não medindo o volume urinário, observamos que
os grupos hiperproteicos excretaram maior volume urinário e ingeriram maior
quantidade de líquido em comparação ao grupo C1, porém, ao final do experimento
o grupo HP2 apresentou peso similar ao grupo C2 assim como o grupo HP1
apresentou peso similar ao grupo C1. Associamos o menor peso dos grupos com
restrição alimentar ao menor consumo, ou seja, o que influenciou a perda de peso
foi a quantidade de ração ingerida e não a qualidade da dieta.
Halton e Hu (2004), em um estudo de revisão observaram que dentre os
quinze trabalhos analisados, sete encontraram diferença estatística na diminuição do
peso corporal com o uso da dieta rica em proteína, sendo que destes, três estavam
associados a uma restrição energética.
Apesar de todos os animais terem consumo adequado de cálcio, os grupos
experimentais apresentaram redução das concentrações de cálcio sérico e ósseo
(porém, dentro da faixa de normalidade), possivelmente devido ao maior
requerimento deste íon para regularizar a acidose provocada pelo metabolismo
protéico (RYLANDER et al., 2006). Não houve diferença estatística nas dosagens de
61
fósforo, magnésio e PTH entre os grupos analisados, o que mostra que a dieta
hiperproteica não interferiu na concentração desses analitos. Em um estudo com
camundongos Hamrick et al. (2008), também encontraram níveis similares de PTH
entre os grupos com restrição e os grupos que receberam alimentação em livre
demanda com dieta a base de caseína.
Dietas pobres em carboidratos (como as dietas hiperproteicas) levam a menor
liberação de insulina. Estudos recentes mostram que os osteoblastos possuem
receptores para insulina e respondem à insulina exógena, aumentando os
marcadores anabolizantes ósseos, incluindo a síntese de colágeno, produção de
fosfatase alcalina e a captação de glicose (FULZELE & CLEMENS, 2012).
Observamos que apenas o grupo HP2 apresentou concentração sérica de insulina
significativamente menor quando comparados aos outros grupos, o que já era
esperado devido a condição de restrição imposta. O grupo C2 apresentou uma
redução de 55% em relação ao grupo C1, embora sem diferença significativa.
Mesmo consumindo uma dieta pobre em carboidratos o grupo HP1 apresentou
concentração sérica de insulina similar ao grupo C1, ou seja, a diminuição da
insulina foi dependente da quantidade de carboidratos na dieta e da quantidade de
ração ingerida.
É relatado na literatura que o consumo em excesso de proteínas parece
exercer efeito negativo sobre o osso, apenas, em condições de baixa ingestão de
cálcio, o que pode confirmar os efeitos negativos observados no grupo que recebeu
a dieta da proteína com restrição alimentar. Os ajustes fisiológicos que podem estar
associados a isto são a hipercalciúria, devido à redução da reabsorção tubular de
cálcio em função da acidose, aumento na reabsorção óssea e, consequentemente,
desmineralização deste tecido (DARGENT-MOLINA et al., 2008). A gordura de
origem animal também influencia negativamente o metabolismo ósseo devido à
reabsorção de citocinas ósseas, a reabsorção óssea pelos osteoclastos e inibição da
síntese de colágeno pelos osteoblastos (HALADE et al., 2009, AMANZADEH et al.,
2003). Trabalhos de Parhami et al. (2001) encontraram uma redução de 35% da
expressão da osteocalcina em ratos alimentados com dieta hiperlipídica,
possivelmente devido a alterações metabólicas. A restrição alimentar também
influenciou o tecido ósseo nos estudos realizados por Ndiaye et al. (1995), em que
encontraram concentração sérica de osteocalcina diminuída em ratos submetidos a
restrição energética, atribuindo este achado com a redução de síntese e não a uma
62
alteração no metabolismo. Nossos resultados estão de acordo com o que é descrito
na literatura. Nesse experimento a concentração sérica de osteocalcina dos grupos
hiperproteicos foram menores quando comparados ao grupo C1, sendo que o grupo
C2 também obteve redução na concentração desse hormônio, o que mostra que
tanto a composição da dieta como a quantidade ingerida estão envolvidos na
expressão da osteocalcina.
Na maior parte das análises densitométricas o grupo HP1 apresentou valores
semelhantes ao C1 o que parece estar associado ao consumo em livre demanda,
visto que os grupos com ingestão alimentar restrita também apresentaram
resultados similares. Entretanto, quando analisamos o conteúdo mineral ósseo
quantitativo, realizado no fêmur, vemos diferenças da concentração de minerais
entre os grupos controle e hiperproteico. Ou seja, a maior concentração de
magnésio ósseo encontrado nos grupos hiperproteicos parece ter compensado a
menor concentração de cálcio encontrado nesses grupos. Esse dado é relevante
porque embora o DXA revele o CMO, ele não quantifica os minerais. A concentração
diminuída de cálcio encontrado nos grupos hiperproteicos está de acordo com o que
se conhece de dietas cetogênicas, como a dieta da proteína. Assim, o maior
recrutamento de cálcio para o tamponamento sanguíneo contribuiu para um
comprometimento ósseo não revelado pelo DXA, porém, demonstrado pela análise
do conteúdo mineral ósseo.
A DMO do fêmur do grupo HP2 foi significativamente menor quando
comparado aos outros grupos e atribuímos esse achado à dieta e à restrição
alimentar. No entanto, embora o grupo HP1 não tenha apresentado redução da
DMO do fêmur, acreditamos que a dieta influenciou seu metabolismo ósseo. A
diminuição da largura do ponto médio das diáfises nos grupos experimentais
evidencia o comprometimento ósseo. Ressalta-se que esses animais já estavam na
fase adulta e não era de se esperar aumento no comprimento do fêmur.
Trabalhos encontrados na literatura científica relacionam o aumento do
consumo de proteínas com uma melhora nos parâmetros densitométricos. Maior
ingestão de proteína foi associada com uma mudança favorável da densidade
mineral óssea do corpo total (CAO et al., 2011; JESUDASON & CLIFTON, 2010;
DAWSON-HUGHES, 2003) e aumento no balanço de cálcio, resultando na
preservação do conteúdo mineral ósseo (KELLER, 2011).
63
Em estudo de revisão de vários artigos científicos que trata da ingestão de
proteínas e saúde óssea Jesudason e Clifton (2010), citam que em mulheres jovens
e na pré-menopausa, o aumento da proteína dietética parece ser positivamente
correlacionada com a maior densidade óssea, pelo menos em alguns locais,
principalmente o rádio. Os melhores resultados foram obtidos naquelas em que além
do consumo elevado de proteínas receberam uma suplementação de cálcio mais
elevado. Este estudo de revisão concluiu que a proteína dietética, por si só parece
ter um efeito anabólico no osso e tem demonstrado efeitos variáveis sobre
marcadores ósseos, incluindo IGF-I e densidade óssea.
Em um estudo prospectivo de mulheres francesas na pós-menopausa, não
houve associação significativa entre a ingestão de proteínas e risco de fraturas na
população que ingeriu grande quantidade de proteínas e cálcio. No entanto, um
elevado risco de fratura foi encontrado em mulheres com elevado consumo de
proteínas na presença de baixa ingestão de cálcio (< 400 mg/1000 Kcal)
(DARGENT-MOLINA et al., 2008). Estes resultados podem ser explicados pelo fato
de que o impacto da proteína sobre o esqueleto é dependente de outros
componentes da dieta. Tem sido sugerido que a maior absorção de cálcio pode
ajudar a compensar a perda urinária de cálcio induzida por alta ingestão de
proteínas. Assim, se a proteína exerce um efeito negativo sobre o osso, deve-se
apenas em condições de baixa ingestão de cálcio. A influência do cálcio dietético no
efeito da proteína não foi completamente investigada (DARGENT-MOLINA et al.,
2008).
Promislow et al. (2002), encontraram uma associação positiva entre consumo
de proteína animal, avaliada por questionários de frequência alimentar, e da DMO.
Observou-se aumento da DMO no quadril, colo do fêmur, coluna vertebral e corpo
total.
No estudo realizado com camundongos por Hamrick et al. (2008), não
encontrou-se diferenças na DMD e CMO nos grupos com restrição energética e
controle (alimentados com dieta à base de caseína). No entanto, houve uma
redução significativa desses parâmetros no fêmur dos alimentados com restrição
calórica quando comparados com camundongos alimentados com livre consumo.
O peso corporal está altamente correlacionado com a massa óssea e
densidade mineral óssea, mas o papel da composição corporal (músculo, massa
magra e massa gorda) na regulação da formação e reabsorção óssea é pouco clara.
64
Sabe-se que o tecido adiposo produz estrógenos através da aromatização de
andrógenos e gordura e estes podem influenciar positivamente a massa óssea
(HAMRICK et al., 2008; WAJCHENBERG, 2000). No entanto, Halade et al. (2009)
relatam que dietas hiperproteicas também são ricas em gorduras, e estas podem
afetar negativamente o tecido ósseo. O tecido adiposo produz citocinas pró-
inflamatórias como interleucina-6 (IL-6) e Fator de necrose tumoral (TNF-α) que
estimulam a osteoclastogênese. Ao final do experimento verificamos que houve
ganho de tecido gordo no tronco nos grupos com consumo em livre demanda,
porém, apenas o grupo HP1 apresentou alteração óssea, o que leva a crer que a
dieta rica em proteína e gordura de origem animal levou ao maior comprometimento
ósseo. Porém, mesmo quando em condição de restrição alimentar, observamos o
mesmo efeito, como verificado no grupo HP2.
A dieta da proteína levou ao comprometimento ósseo observado nos grupos
experimentais, pelo maior recrutamento de cálcio para o tamponamento sanguíneo e
também devido à diminuição dos marcadores ósseos anabolizantes, sendo o grupo
experimental com restrição alimentar o mais afetado.
65
8 CONCLUSÃO
A partir dos resultados encontrados pode-se perceber que:
A dieta hiperproteica não promoveu maior perda de peso corporal do
que a dieta controle;
De um modo geral os grupos com restrição alimentar apresentaram
diminuição nos valores densitométricos, sendo o fêmur do grupo HP2
o mais afetado;
Os grupos que receberam dieta hiperproteica, tanto o grupo com
consumo em livre demanda como o grupo com restrição energética,
apresentaram comprometimento da formação óssea revelado pela
redução da largura do ponto médio da diáfise do fêmur, diminuição do
cálcio sérico e ósseo e da osteocalcina. O grupo HP2 apresentou
também diminuição na concentração sérica de insulina;
Houve maior comprometimento ósseo no grupo HP2, ou seja, tanto a
dieta como a quantidade ingerida influenciaram esse tecido.
66
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74
APÊNDICE A
Produção Científica relacionado à dissertação
Premiação classificada em 2º lugar no XXI Seminário de Iniciação Científica.
Prêmio UFF Vasconcellos Torres de Ciência e Tecnologia
Premiação classificada em 3º lugar No IV Encontro de Nutrição Clínica
Funcional e Medicina do Rio de Janeiro & II Simpósio de Nutrição Esportiva
Apresentação de trabalho no XXII Congresso Brasileiro de Nutrição
75
APÊNDICE B
Publicação em Periódico
76
1
EFEITO DA “DIETA DA PROTEÍNA” NO TECIDO ÓSSEO
EFFECT OF THE “PROTEIN DIET” ON BONE TISSUE
“DIETA DA PROTEÍNA” E TECIDO ÓSSEO / “PROTEIN DIET” AND BONE TISSUE
Zoraide Nascimento da Silva1; Vanessa Azevedo de jesuz2; Eduardo de Salvo Castro3;
Carlos Alberto Soares da Costa4; Gilson Teles Boaventura5; Vilma Blondet de Azeredo6
1- Bióloga, Técnica do Laboratório de Nutrição Experimental da Faculdade de Nutrição,
Mestranda do curso Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil. Telefone: 55 021 26299860.
2-Graduanda em Nutrição, Bolsista de Iniciação Científica do CNPq no Laboratório de
Nutrição Experimental da Faculdade de Nutrição da Universidade Federal Fluminense,
Niterói, RJ, Brasil.
3-Graduando em Medicina da Universidade do Grande Rio, Bolsista de Iniciação Científica
da FAPERJ no Laboratório de Nutrição Experimental da Faculdade de Nutrição da
Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.
4-Nutricionista Pós Doutorando Associado da Faculdade de Nutrição, Departamento de
Nutrição e Dietética da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.
5-Professor D.Sc. Associado da Faculdade de Nutrição, Departamento de Nutrição e
Dietética da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.
6-Vilma Blondet de Azeredo*, D.Sc. Professor Adjunto da Faculdade de Nutrição,
Departamento de Nutrição e Dietética da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ,
Brasil. Phone: 55 XX 21 26299842 Fax: 55 XX 21 26299842 E-mail:
* Autor responsável pelas negociações: Vilma Blondet de Azeredo. Endereço para
correspondência: Avenida Professor João Brasil, número 150, apartamento 1205, bloco 1,
Fonseca-Niterói / Rio de Janeiro - Brasil. CEP:24130-082.
Este artigo é baseado na dissertação de mestrado intitulada “Efeito da dieta da proteína
sobre o metabolismo ósseo”, do curso de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos
para Saúde da Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, a ser defendida
em 28 março de 2013.
2
EFEITO DA “DIETA DA PROTEÍNA” NO TECIDO ÓSSEO
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do consumo da dieta da proteína no tecido
ósseo. Métodos: O estudo teve duração de 60 dias. Vinte e oito ratas Wistar albino, adultos,
provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental foram divididas em 4 grupos (n=7);
Controle 1 (C1), Controle 2 (C2), Hiperprotéico 1 (HP1) e Hiperprotéico 2 (HP2). Os grupos
C2 e HP2 foram submetidos a restrição alimentar de 30%. A dieta hiperproteica foi
manipulada para simular a dieta da proteína. Ao final do experimento os animais foram
anestesiados para os procedimentos de densitometria óssea (DXA) e coleta de tecidos.
Análises sérica e óssea de minerais foram realizadas pelo método colorimétrico usando
aparelho automatizado. Resultados: A Densidade mineral óssea total (DMO), da pelve e da
coluna vertebral dos grupos com restrição alimentar (HP2 e C2) foi menor (P<0,05) do que
dos grupos C1 e HP1. Enquanto a DMO do fêmur do grupo HP2 foi menor (P<0,05) em
relação aos outros grupos. Houve redução (P<0,05) da largura do ponto médio da diáfise do
fêmur e da concentração de cálcio ósseo nos grupos hiperproteicos (HP1 e HP2). Efeito
semelhante foi observado na concentração sérica de osteocalcina, que foi inferior (P<0,05)
nos grupos hiperproteicos, enquanto a concentração de insulina apresentou-se menor,
somente, no grupo HP2. Já o cálcio sérico dos grupos hiperproteicos e C2 mostrou-se
inferior (P<0,05) ao grupo C1. Conclusão: A dieta da proteína promove alteração óssea
significativa no fêmur e na concentração dos hormônios relacionados à formação e
manutenção deste tecido.
Termos de indexação: Dieta hiperprotéica, densidade mineral óssea, remodelagem óssea,
hormônios, dieta Atkins.
3
Abstract
The aim of this study is to evaluate the effect of the protein diet consumption on bone
tissue. Methods: The study was conducted during sixty days. Twenty eight Wistar albinus
rats, adults, originated from Laboratório de Nutrição Experimental were divided in four
groups: (n=7); Control 1 (C1), Control 2 (C2), Hyperproteic 1 (HP1) e Hyperproteic 2 (HP2).
The C2 and HP2 groups were submitted to 30% of food restriction. The hyperproteic diet was
prepared to simulate the protein diet. At the end of the study the animals were anesthetized
to performer bone densitometry analyses by DXA and blood and tissue collection. Serum
and bone minerals analyses were conducted by colorimetric methods in automated
equipment. Results: The total bone mineral density (DMO) of the pelvis and the spine of the
food restriction groups (HP2 e C2) were lower (P<0.05) than C1 e HP1 groups. While the
femur DMO of the HP2 was lower (p<0.05) related to others groups. It had been observed
reduction (P<0.05) in the medium point of the width of femur diaphysis and in bone calcium
level in the hyperproteic groups (HP1 e HP2). It was observed similar effect on the
osteocalcin level, that presented lower (P<0.05) in the hyperproteic groups. The insulin level
was lower only in HP2 and serum calcium of the HP1 and HP2 groups was lower than C1.
Conclusion: The protein diet promotes significant bone change on femur and in the
hormones levels related to bone synthesis and maintenance of this tissue.
Indexing terms: hyperproteic diet, bone mineral density, bone remodeling, hormones, Atkins
diet.
4
Introdução
A dieta da proteína é a uma das dietas “da moda” mais procurada e tem sido
considerada eficaz na redução de peso1,2,3. Caracteriza-se por alta concentração de
proteínas e lipídeos e baixa concentração de carboidratos3. No entanto, existem evidências
de que o consumo excessivo de proteína pode prejudicar a saúde óssea, podendo contribuir
para o desenvolvimento da osteoporose, principalmente entre as mulheres na idade adulta4.
A alteração óssea promovida pelo consumo em excesso de proteínas e gordura de
origem animal tem sido atribuída ao desenvolvimento da acidose metabólica ocasionada
pela produção excessiva de corpos cetônicos, resultante do metabolismo proteico e lipídico.
Este estado de cetogênese parece estimular a reabsorção óssea e inibir a atividade dos
osteoblastos5,6.
Entretanto, a literatura ainda é controversa sobre o real efeito da elevada ingestão
protéica e as possíveis modificações no tecido ósseo. Alguns estudos sugerem que dietas
hiperproteicas estão associadas a maior propensão a perda óssea7,8. Porém, outros
pesquisadores relatam resultados benéficos, incluindo o aumento da densidade mineral
óssea9,10.
Logo, o conjunto dos relatos anteriores são inconclusivos o que requer mais estudos
sobre a dieta hiperprotéica e suas repercussões na saúde óssea e o provável
desenvolvimento de osteopenia e/ou osteoporose ainda necessita de investigações. Assim,
o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da dieta da proteína (hiperproteica) sobre o
tecido ósseo de ratas Wistar adultas.
Metodologia
O estudo foi realizado no Laboratório de Nutrição Experimental do Departamento de
Nutrição e Dietética da Faculdade de Nutrição da Universidade Federal Fluminense, com
Rattus Norvergicus Wistar Albino, fêmeas, com 90 dias de vida, pesando aproximadamente
200g. Todos os animais foram mantidos em experimentação por 60 dias, em gaiolas
individuais de polipropileno devidamente identificadas, em ambiente com temperatura
constante (24ºC ± 2ºC) e iluminação adequada com ciclo claro e escuro de 12 em 12 horas.
Os animais foram divididos em 4 grupos (n=7/grupo): 1) Grupo Controle (C1) e 2)
Grupo Controle 2 (C2)*- que receberam ração constituída de 69,20% de carboidratos
(59,20% de amido e 10% de açúcar); 11,30% de proteína (caseína); 4,80% de lipídio (óleo
de soja); 1% de mistura vitamínica (Prag soluções, São Paulo, Brasil); 3,5% de mistura de
minerais (Prag Soluções, São Paulo, Brasil); 5% de fibras (celulose); 0,25% de bitartarato de
colina e 0,18% de L-cistina, manufaturadas seguindo as recomendações do American
Institute of Nutrition (AIN-93M)11. 3) Grupo Hiperproteico 1 (HP1) e 4) Grupo Hiperproteico 2
5
(HP2)*- que receberam ração contendo 4,73% de glicídio (lactose); 49,77% de proteína
(47,54% de proteína da carne bovina e 2,23% de proteína do leite); 15,97% de lipídio
(11,97% gordura animal da carne e 4% óleo de soja); 1% de mistura de vitaminas (Prag
Soluções, São Paulo, Brasil); 3,5% de mistura de minerais (Prag Soluções, São Paulo,
Brasil); 7% de fibras (5% celulose e 2% Agar); 0,18% de L-cistina e 0,25% de bitartarato de
colina. O Agar foi usado para dar liga e moldar a ração. *Os Grupos C2 e HP2 receberam
70% da quantidade de ração consumida pelos grupos C1 e HP1.
Os ingredientes para a formulação da dieta da proteína foram adquiridos no comércio
local, a carne bovina (acém) foi desidratada, triturada, peneirada e misturada aos outros
ingredientes para formulação da ração. A dieta da proteína (hiperproteica) foi acrescida de
leite para atender as recomendações da dieta do Dr. Atkins3 que inclui a ingestão de
laticínios.
O cuidado dos animais foi realizado disponibilizando-se água em livre demanda para
todos os grupos. O peso corporal (g) e o consumo de água (mL) foram aferidos
semanalmente utilizando balança (Bioprecisa JY 50001, de precisão 0,1g) e proveta,
respectivamente. A sobra da água foi quantificada para obtenção da ingestão diária. O
controle da oferta e sobra de ração dos grupos C1 e HP1 foi realizado semanalmente, já dos
grupos C2 e HP2 foi feito diariamente em função da restrição alimentar de 30% a qual foram
submetidos.
Ao final do período experimental, todos os animais foram submetidos ao
procedimento de lavado vaginal para identificação da fase do ciclo estral. Após esta análise,
aqueles que estavam na fase “estro” do ciclo, foram separados e mantidos em jejum por
seis horas para posterior sacrifício. Foram, então, anestesiados com injeção intraperitoneal
(cloridrato de xilazina associado a ketamina na proporção de 1:1) na dosagem de 0,1
ml/200g e submetidos a densitometria óssea por meio do Dual-energy X-ray Absorptiometry
(DXA) (Lunar DXA 200368 GE instrument, Wisconsin, USA), no Laboratório de Avaliação
Nutricional da Faculdade de Nutrição da UFF. A análise foi realizada com auxílio de software
específico para pequenos animais12,13 (encore 2008. Version 13.40 GE Healthcare).
Densidade mineral óssea (DMO; g/cm2), conteúdo mineral ósseo (CMO;g) e a área óssea
(cm2) foram analisados em cada animal.
Após o DXA, com os animais ainda anestesiados, foi realizada a coleta de sangue
por punção cardíaca. O sangue foi coletado em tubos sem anticoagulante e centrifugado a
3000 rpm, durante 20 minutos, para obtenção do soro. Em seguida, após o sacrifício, o
fêmur direito foi retirado, limpo e pesado. As amostras de soro e as peças ósseas foram
congeladas a -80ºC para análises posteriores.
As concentrações séricas de cálcio, fósforo e magnésio foram determinados por
método colorimétrico utilizando kits comerciais (BioClin, Belo Horizonte, Brasil) em aparelho
6
automatizado. A concentração sérica de insulina, osteocalcina e paratormônio foram
determinadas por Imunoabsorção Ligado a Enzima (ELISA) utilizando Kits comerciais
específicos (UScn, Life Science Inc) e a leitura realizada em aparelho Thermo Plater
Reader.
A avaliação da distância entre as epífises e a largura do ponto médio da diáfise do
fêmur foi realizada com paquímetro, com leitura em milímetros. Posterior a avaliação do
peso do fêmur (g) foram analisadas a DMO (g/cm2), o CMO (g) e a área óssea (cm2) com o
auxílio do DXA. As peças foram colocadas (uma de cada vez) em recipiente com arroz para
simular os tecidos moles14.
A composição mineral óssea do fêmur foi realizada a partir da produção de cinzas15,
que posteriormente foram acidificadas, aquecidas e diluídas em água deionizada.
Posteriormente, foram realizadas as análises de cálcio, fósforo e magnésio pelo método
colorimétrico utilizando aparelho automatizado.
Os resultados são apresentados a partir da estatística descritiva como média e
desvio padrão. Para as análises de comparação de médias entre os grupos foi utilizado
ANOVA com medidas de repetição e Duncan como pós-teste. Para análise da evolução do
peso corporal (g), foi utilizada ANOVA bi-variada. Trabalhamos com um nível de
significância de 5%. Para estas análises foi utilizado o software GraphPad inStat versão 3.1
for Win/95 NT.
O presente projeto foi submetido ao Comitê de ética responsável por pesquisas em
animais de laboratório da UFF, tendo sido aprovado com protocolo número 0027/08. Todos
os animais foram manipulados de acordo com os princípios éticos adotados pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Resultados
Durante o período estudado pode-se observar que os grupos que receberam ração
em livre consumo (C1 e HP1) apresentaram aumento do peso corporal (P<0,05), enquanto
àqueles que sofreram restrição alimentar (C2 e HP2) perderam peso (Gráfico 1).
7
GRÁFICO 1- Evolução do peso corporal dos animais ao longo do experimento. Grupu
Controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2 e
HP2. Diferentes letras denotam diferença estatística (ANOVA, P<0,05). Niterói, 2011.
Em relação a ingestão alimentar diária, o grupo controle (C1) apresentou maior
consumo de ração (P<0,05) em relação aos outros grupos; enquanto o grupo HP2
apresentou o menor consumo de ração. O consumo do grupo hiperproteico que recebeu a
dieta da proteína em livre demanda (HP1) foi similar ao do grupo C2. (Gráfico 2).
Quanto à ingestão hídrica, os grupos que receberam a dieta da proteína,
principalmente o grupo HP2, apresentaram maior ingestão de água (P<0,05) quando
comparados ao grupo controle (C1). Enquanto o grupo C2 apresentou ingestão hídrica
semelhante aos grupos que receberam a dieta em livre consumo (C1 e HP1) (Gráfico 2).
Observou-se, também, que os grupos que receberam a dieta da proteína apresentaram
diurese muito maior do que os outros grupos (dados observacionais não apresentados).
8
Gráfico 2- Consumo diário médio de ração (g/dia) e ingestão hídrica (mL/100g de peso corporal) dos
animais. Grupo controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição
alimentar C2 e HP2. Diferentes letras denotam diferença estatística (ANOVA, P<0,05). Niterói, 2011.
As análises bioquímicas do sangue são apresentadas na Tabela 1. Pode-se observar
que os grupos que receberam a dieta da proteína (HP1 e HP2) apresentaram concentração
sérica de cálcio inferior (P<0,05) a do grupo C1. Em relação a insulina, observa-se que o
grupo hiperproteico com restrição alimentar (HP2) apresentou menor (P<0,05) concentração
sérica em relação aos demais grupos. Enquanto a concentração de osteocalcina foi menor
(P<0,05) nos grupos que receberam a dieta da proteína (HP1 e HP2). As concentrações de
magnésio, fósforo e paratormônio apresentaram-se semelhantes entre os grupos.
9
TABELA 1- Concentração sérica dos minerais e hormônios estudados, ao final do
experimento.
C1 HP1 C2 HP2
Cálcio (mg/dL) 8,22 ± 0,20 a 7,43 ± 0,17 b 7,76 ± 0,14 a ,b 7,15 ± 0,11 b
Magnésio (mg/dL) 1,84 ± 0,15 2,13 ± 0,25 2,27 ± 0,43 1,98 ± 0,10
Fósforo (mg/dL) 5,08 ± 0,31 4,21 ± 0,20 4,12 ± 0,25 4,47 ± 0,31
Insulina (pg/mL) 1,45 ± 0,33a 0,91 ± 0,39 a 0,64 ± 0,14 a 0,35 ± 0,13b
Osteocalcina (ng/mL) 1,21 ± 0,47a 0,38 ± 0,12c 0,73 ± 0,13b 0,33 ± 0,15c
Paratormônio (pg/mL) 8,48 ± 1,16 8,70 ± 1,43 9,04 ± 1,54 7,35 ± 1,59
Grupo controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2
e HP2. Diferentes letras sobrescritas denotam diferença estatística (ANOVA, P<0,05). Niterói, 2011.
A análise de densitometria do corpo total mostra que os grupos C2 e HP2
apresentaram menor (P<0,05) DMO, CMO e área óssea quando comparados aos grupos C1
e HP1. Ao analisarmos regiões específicas como a região da pelve, observou-se que os
grupos C2 e HP2, também, apresentaram menor (P<0,05) DMO em relação aos grupos C1
e HP1, enquanto o CMO da pelve foi menor (P<0,05), apenas, no grupo C2. Para a região
da coluna vertebral, os grupos que sofreram restrição alimentar (C2 e HP2) apresentaram
menor (P<0,05) DMO e CMO em relação aos grupos com dieta em livre consumo (C1 e
HP1). No entanto, ao analisar a DMO e a CMO do fêmur do grupo HP2 observa-se que esta
foi inferior (P<0,05) a dos outros grupos (Tabela 2).
TABELA 2- Valores da densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, área total
corporal, da pélvis, coluna vertebral e do fêmur dos animais estudados.
(continua)
C1 HP1 C2 HP2
Total
DMO (g/cm2)
CMO (g)
ÁREA (cm2)
0,16 ± 0,01a
8,80 ± 0,36 a
52,40 ± 1,80a
0,15 ± 0,01 a
8,28 ± 0,14 a
52,60 ± 0,40 a
0,14 ± 0,01b
6,40 ± 0,15b
45,80 ± 0,91b
0,14 ± 0,01b
6,82 ± 0,03 b
46,60 ± 0,87 b
Pelve
DMO (g/cm2)
CMO (g)
Área (cm2)
0,16 ± 0,01a
2,34 ± 0,16a
14,80 ± 0,58
0,16 ± 0,01a
1,98 ± 0,11a
12,20 ± 0,37
0,13 ± 0,01b
1,70 ± 0,11b
13,20 ± 1,07
0,14 ± 0,01b
1,84 ± 0,11a
13,0 ± 0,83
10
TABELA 2- Valores da densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, área total corporal, da pélvis, coluna vertebral e do fêmur dos animais estudados. (conclusão)
C1 HP1 C2 HP2
Coluna Vertebral
DMO (g/cm2)
CMO (g)
Área (cm2)
0,15 ± 0,01a
1,78 ± 0,20 a
12,00 ± 1,0
0,15 ± 0,01 a
1,74 ± 0,05 a
11,40 ± 0,50
0,12 ± 0,01 b
1,12 ± 0,13 b
9,40 ± 0,87
0,12 ± 0,01 b
1,12 ± 0,12 b
9,00 ± 0,83
Fêmur
DMO (g/cm2)
CMO (g)
Área (cm2)
0,156 ± 0,01a
0,400 ± 0,01 a
2,80 ± 0,1
0,146 ± 0,01a
0,380 ± 0,02 a
2,80 ± 0,1
0,145 ± 0,01a
0,370 ± 0,01 a
2,71 ± 0,1
0,132 ± 0,01b
0,360 ± 0,03 b
2,66 ± 0,2
Grupo controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2
e HP2. Diferentes letras sobrescritas denotam diferença estatística (ANOVA, P<0,05). Niterói, 2011.
Ao analisar os parâmetros biométricos do fêmur pode-se observar que não houve
diferença significativa para as análises de peso e distância entre as epífises. No entanto,
observou-se redução (P<0,05) na largura do ponto médio da diáfise do fêmur nos grupos
que receberam a dieta da proteína (HP1 e HP2), quando comparados com os seus
respectivos grupos controle (C1e C2). Resultado semelhante foi encontrado quando
avaliada a composição mineral do fêmur, os grupos HP1 e HP2 apresentaram menor
(P<0,05) concentração de cálcio neste osso. Maior concentração (P<0,05) de magnésio foi
encontrada nos grupos que receberam a dieta da proteína, em relação aos grupos C1e C2
(Tabela 3).
TABELA 3- Parâmetros biométricos e concentração de minerais do fêmur dos animais
estudados. (continua)
C1 HP1 C2 HP2
Peso (g) 0,92 ± 0,01 0,93 ± 0,05 0,92 ± 0,01 0,84 ± 0,02
Distância entre as
epífises (mm)
3,15 ± 0,05 3,20 ± 0,05 3,20 ± 0,05 3,08 ± 0,04
Largura do ponto médio
das diáfises (mm)
0,51 ± 0,02a
0,45 ± 0,05b
0,52 ± 0.02a
0,46 ± 0,06b
11
TABELA 3- Parâmetros biométricos e concentração de minerais do fêmur dos animais
estudados. (conclusão)
C1 HP1 C2 HP2
Composição óssea:
Cálcio (mg/dL) 17,11 ± 2,63a 12,38 ± 0,24
b 16,89 ± 3,42
a 11,59 ± 0,3
b
Magnésio (mg/dL) 4.00 ± 0.33 a 8.2 ± 1.09
b 3.88 ± 0.37
a 8,19 ± 1,42
b
Fósforo (mg/dL) 7,37 ± 1,87 6,10 ± 0,97 5,08 ± 1,77 5,76 ± 1,03
Grupo controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2
e HP2. Diferentes letras sobrescritas denotam diferença estatística (ANOVA, P<0,05). Niterói, 2011.
Discussão
O Dr. Atkins16 afirma que os indivíduos que utilizam a dieta hiperproteica podem
ingerir mais energia e perder peso. Contudo, não existem evidências científicas que
confirmem que esta dieta tenha vantagens metabólicas sobre as dietas convencionais para
a redução de peso e manutenção da fisiologia óssea.
No presente estudo, pode-se observar que a dieta hiperproteica parece promover
maior saciedade quando consumida em livre demanda, entretanto, como esta dieta
apresenta maior valor energético por grama de ração consumida, a menor ingestão de ração
pelo grupo HP1 não foi suficiente para levar a perda de peso corporal; e quando esta dieta é
associada à restrição alimentar a perda de peso é semelhante ao da dieta hipocalórica
balanceada. Mostrando que não é a dieta da proteína que leva à perda de peso corporal,
mas sim a restrição energética imposta aos animais. Corroborando nossos resultados,
estudos mostram que, em humanos, o consumo em livre demanda da dieta da proteína
parece aumentar a saciedade e o efeito térmico da dieta, o que segundo estes autores pode
levar a perda de peso corporal, apenas, após longos períodos17,18. Outros estudos sugerem
que a menor ingestão alimentar pode estar relacionada à formação excessiva de corpos
cetônicos devido a mudança do substrato utilizado no metabolismo energético ou ainda,
outro fator sugerido é que a ingestão elevada de proteína leva ao aumento da concentração
sérica de aminoácidos que estimulam a liberação de hormônios anorexígenos agindo na
saciedade; e ao estímulo conferido pelos aminoácidos à secreção da colecistoquinina (CCK)
favorecendo a diminuição da ingestão alimentar 1,19,20.
Metabolicamente, o maior precursor de corpos cetônicos é o Acetil coenzima A,
produzido pela oxidação de ácidos graxos e pelos aminoácidos cetogênicos. A cetose
produzida por este tipo de dieta pode aumentar a osmolalidade plasmática e, assim,
12
desencadear a sensação de sede e o maior consumo hídrico21. Fato este, observado no
presente estudo, onde os animais que receberam a dieta da proteína apresentaram maior
ingestão de água do que os animais do grupo controle, evidenciando que o consumo da
dieta hiperproteica associada à restrição energética pode promover maior produção de
corpos cetônicos, desencadeando maior consumo hídrico e maior diurese.
As proteínas e o cálcio são os maiores componentes do tecido ósseo, de modo que
para manter o processo de remodelagem óssea voltada para a fase de formação existe a
necessidade de suprimento adequado tanto do mineral quanto da proteína. Estudos
observacionais evidenciam associações entre a ingestão de proteína e massa óssea e inclui
tanto efeitos positivos quanto negativos22. Os resultados da densitometria óssea do presente
estudo mostram que os grupos que sofreram restrição alimentar apresentaram menor
densidade e conteúdo mineral ósseo na pélvis e coluna vertebral, provavelmente devido a
maior formação de corpos cetônicos e menor ingestão de cálcio, confirmando os dados da
literatura. No entanto, ao contrário do que foi observado na pélvis e na coluna vertebral, o
fêmur do grupo que recebeu a dieta da proteína associada a restrição alimentar foi a parte
óssea analisada mais afetada com redução na densidade, conteúdo mineral ósseo total,
redução da largura no ponto médio da diáfise e redução da concentração óssea de cálcio. O
que sugere que a elevada ingestão de proteínas associada a restrição energética aumenta
os efeitos negativos desta dieta sobre o tecido ósseo, até mesmo em animais adultos,
devido ao estímulo da remoção do cálcio ósseo na tentativa de minimizar os efeitos da
acidose.
Alguns pesquisadores sugerem que a proteína da dieta em quantidades excessivas
parece exercer efeito negativo sobre o osso, apenas, em condições de baixa ingestão de
cálcio23, o que pode confirmar os efeitos negativos observados no grupo que recebeu a dieta
da proteína com restrição alimentar. Os ajustes fisiológicos que podem estar associados a
isto são a hipercalciúria, devido a redução da reabsorção tubular de cálcio em função da
acidose, aumento na reabsorção óssea e, consequentemente, desmineralização deste
tecido22,24.
No entanto, contrário aos nossos resultados, um estudo observou redução
significativa na DMO e CMO do fêmur em camundongos que receberam dieta hipocalórica25.
O que também sinaliza para possíveis efeitos negativos de dietas hipocalóricas com baixa
concentração de cálcio.
Estudos recentes mostram que os osteoblastos possuem receptores para insulina
aumentando a captação de glicose e a produção dos marcadores ósseos anabolizantes. É
conhecido que dietas pobres em carboidratos levam a menor liberação de insulina, podendo
refletir no metabolismo ósseo26; o que pode justificar os resultados negativos observados no
grupo que recebeu a dieta da proteína associada a restrição alimentar (HP2), pois a baixa
13
concentração de carboidratos desta dieta diminuiu o estímulo a produção de insulina e,
consequentemente de osteocalcina, devido ao menor estímulo para a atividade dos
osteoblastos, refletindo na diminuição da largura do fêmur.
Um estudo realizado em ratas mostra que a ingestão energética é um fator
determinante para a manutenção de concentrações adequadas de osteocalcina e para a
formação óssea27. Outro estudo enfatiza que dietas hiperlipídicas também são capazes de
inibir a formação óssea e bloquear a formação de osteoblastos28. Portanto, a dieta da
proteína apresenta duas características importantes que podem influenciar negativamente o
metabolismo e formação óssea: alta concentração de proteínas e lipídios. Contudo, os
mecanismos exatos através dos quais estas características promovem tais alterações ainda
necessitam ser melhor estudadas.
CONCLUSÃO
A partir dos resultados encontrados observa-se que a dieta da proteína promove
alteração óssea significativa no fêmur e na concentração dos hormônios relacionados à
formação e manutenção deste tecido.
Tais resultados podem sugerir que mulheres adultas, principalmente aquelas na fase
de pré-menopausa e menopausa, podem ter a expectativa de desenvolvimento de
osteopenia e osteoporose aumentadas, em função do consumo deste tipo de dieta.
Agradecimentos: Os autores agradecem a Pró-reitoria de Pesquisa, Pós-graduação e
Inovação da UFF pelo auxílio FOPESQ; a FAPERJ, ao CNPq/PIBIC pela concessão de
bolsas de iniciação científica; e aos coordenadores e técnico do Laboratório de Avaliação
Nutricional da UFF.
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ANEXO