UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE ......Aos meus colegas do Hospital Maria Alice...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

EFEITO ANTIINFLAMATÓRIO DE FUCANA EXTRAÍDA DA ALGA

PARDA Spatoglossum schroederii EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE

PERITONITE, CHOQUE NÃO SÉPTICO E COLITE.

ANA KATARINA ANDRADE SILVA

NATAL/RN

2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS




Ana Katarina Andrade Silva

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Orientador: Profª. Drª. Janeusa Trindade de Souto.

NATAL/RN

2011

Ana Katarina Andrade Silva




BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________________________

Profª Drª JANEUSA TRINDADE DE SOUTO – (Orientador)

Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN

_______________________________________________________________

Prof Dr PAULO MARCOS DA MATTA GUEDES – (Membro interno)

Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN

_______________________________________________________________

Prof. Dr. GEORGE JOÃO FERREIRA DO NASCIMENTO – (Membro externo)

Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - UFPE

NATAL/RN 2011

iii

A Deus, por ter me dado forças em todos os momentos e guiado os meus passos em cada decisão.

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me dado o dom da vida; por ter sido minha fortaleza nos momentos que eu busquei fé. Minha gratidão por ter me abençoado com tamanhas conquistas e jamais ter deixado de enviar seus anjos pra me proteger e me dar forças, sempre que

precisei.

Aos meus queridos pais, Antônio e Fátima, os meus verdadeiros alicerces e responsáveis por tudo que conquistei, e tudo que sou; que me ensinaram os primeiros passos,

palavras, assim como os valores humanos que adquiri ao longo de minha vida. Os meus amigos, entusiastas, que jamais deixaram de me incentivar, mesmo diante das minhas

idéias mais inusitadas. Tenho orgulho de ter vocês como meus pais, e não tenho palavras para expressar o quanto sou grata por tanta dedicação e amor! Amo muito

vocês!

Ao meu noivo Gustavo Bruno, por incansáveis momentos de dedicação, amor e paciência. A ele que me ajudou inclusive nos experimentos, que se horrorizava com as

injeções intravenosas (risos); que abdicou de tantos finais de semana pra eu não ir sozinha ao Centro de Biociências. Não bastasse tudo isso, jamais deixou de me

incentivar e dedicar tanto carinho. Você fez parte de mais essa conquista, e espero que faça parte pra sempre da minha vida! Amo meu “xinho”!

À toda minha família, minha irmã Kalinne, minhas avós Maria e Rogéria, minhas tias, primos; que cada um à sua maneira, me deram incentivo a continuar, que depositaram suas orações, muitas vezes até sem entender o que realmente eu fazia (risos), mas que

não mediram esforços pra me dar apoio, e torcer por minha felicidade.

À minha querida orientadora Janeusa Trindade de Souto, por ter sido sua “pupila”, e ter tido orgulho de ser sua orientanda. Agradeço por tanto ter se dedicado ao meu

trabalho, pela paciência aos meus “choros” e teimosias; e aproveito para pedir desculpas se tive de me dividir entre tantas atividades e mesmo assim ter tempo para

“importurnar” seus finais de semana (risos) e pedir tantos conselhos científicos. Levarei para o resto da minha vida... pessoal ou científica, tudo que aprendi com você.

Obrigada por tantas lições, obrigada por tudo!

Às minhas amigas queridas com as quais tive a dádiva de conviver no Laboratório de Imunofarmacologia – UFRN. À minha amiga Mariana Bitencourt (Marizinha) por tantos momentos de cumplicidade, congressos, experimentos exaustivos, conversas,

aflições, e muitas risadas! Obrigada por sua ajuda imprescindível. Vou sentir saudades! À Hylarina, apesar do pouco tempo do convívio pela companhia agradável e

as contagens exaustivas! (Risos). À Anaugusta pela ajuda, companhia nos experimentos e por ter ficado “expert” em retirar soro. (Risos). À Jessica Jales

(Jessicat!) por ter sido um anjo que apareceu no momento que mais precisava. Obrigada pelas conversas, faxinas (risos), e por momentos tão especiais.

v

Ao Professor Paulo Marcos da Matta Guedes, pelo aceite em fazer parte da banca de defesa; além de sua amizade em tantos momentos, e inclusive, ajuda valiosa em alguns

experimentos.

Ao Professor George J. F. do Nascimento, não apenas pelo aceite da banca de defesa, mas por sua amizade, seus conselhos (que antecederam ou não minha viagem à

Ribeirão), e exaustivos momentos de bom-humor (risos).

À Professora Regina dos Santos Braz, pelo aceite em participar da banca na qualificação, por ceder gentilmente seu laboratório sempre que precisei, pelas palavras

de incentivo e amizade.

Ao Professor Hugo Alexandre Rocha, por ter cedido gentilmente a fucana que é o alvo desse estudo, e sempre ter se rendido aos meus apelos e questionamentos (risos). Muito

obrigada pela paciência e confiança em mim depositadas.

À Professora Éricka Janine Dantas da Silveira, por ter se disponibilizado a compor a banca de qualificação, mesmo abdicando parte do seu precioso tempo ao lado do seu bebê, para realizar toda a análise histopatológica do meu trabalho. Muito obrigada

ainda pelas orientações imprescindíveis.

Às técnicas do laboratório de histologia – CB: Socorro e Mylena, pela ajuda nas amostras histológicas, e sempre por sua atenção e cordialidade. Vocês foram essenciais

meninas!

Ao Professor Ermeton Duarte, por sempre prestar seu incentivo de uma forma sempre tão descontraída. Agradeço pela sinceridade de pessoas assim especiais que torcem pelo

meu sucesso como você.

Aos demais professores do centro de Biociências, que me incentivaram sempre, e contribuíram assim para a realização desse trabalho. Em especial ao Professor Valter Ferreira, que não mediu esforços para que eu fosse bolsista do programa, sempre com

tamanha cordialidade seja em suas aulas, nas palavras de incentivo, ou qualquer outra ajuda que coubesse ao programa de pós-graduação.

Aos amigos do LBMG, GAGS; e ao laboratório de aulas práticas de Microbiologia, em especial à minha amiga “Alexandra” (Alessandra Marinho) por tantos auxílios e apoio

sempre; e tantos outros que sempre me ajudaram prontamente a utilizar qualquer equipamento que necessitei. Em especial ainda à Julianne, Dany e Lelinha, amigas do curso de pós-graduação, que levarei por toda minha vida. Sentirei saudades meninas!

vi

Aos amigos que fiz na USP - Ribeirão Preto:

Ao Professor Fernando Cunha – do laboratório de inflamação e dor, por ter me recebido de maneira tão cordial em seu laboratório; assim como as demais pessoas

iluminadas que conheci por lá.

A minha querida amiga Larissa (gêmea inversa), por ter me ajudado na padronização e no treinamento de experimentos, por sua atenção em todos momentos que precisei, e

mesmo a distância, por sua amizade sincera.

À querida Paulinha, pela amizade, pela dedicação, seja para lavar as roupas (risos) ou para me enviar os artigos; ou ainda diante de qualquer ajuda que precisei.

. Ao querido Spiller, pela atenção e por sempre me ajudar nos questionamentos sobre

sepse (risos); e pelas intermináveis palavras de incentivo.

À querida Fabi, pela excelência e prontidão em ajudar a quem precisa, sempre com um sorriso no rosto contagiante.

Aos meus queridos amigos e amigas:

Ana Cláudia, pelo simples fato de me entender em todas as aflições (risos) e pela amizade em todos os momentos. Anderson, pela amizade, apoio e conselhos

imprescindíveis em minha vida. Andréa, por tanto me ajudar com suas palavras contagiantes e conselhos inusitados (risos). Mirella, por sua amizade, e paciência

diante das tentativas incansáveis de me encontrar enquanto eu estava sempre “ausente” pelas atividades do mestrado. Marina, por sempre me dar forças, e torcer por cada conquista desde a monografia (risos). Luciana, por não importar o tempo que não temos uma pra outra (risos), mas sei que será sempre um alicerce e exemplo de amizade

eterna.

Ao amigo que mais me ajudou nas últimas apresentações de minha vida científica: Edilson Lobo. Agradeço pela imensa paciência e por se esforçar pra entender as minhas

idéias ilustrativas inusitadas, com tamanha riqueza de detalhes (risos).

ÀS PANDETES, minhas queridas amigas que encontrei na Biomedicina, pelos momentos eternizados que já vivemos, pela ajuda incontestável durante todo o período do mestrado. A Bibiana, Dayse Caroline, Priscila, Myrian e Tássia, agradeço a cada uma por sua contribuição imprescindível e única. Em especial a minha amiga Dayse

Santos (xafranga), mestranda como eu, que juntas pudemos compartilhar tantas aflições, angústias, mas também tantos momentos felizes, que só assim pude encontrar

forças pra continuar. Agradeço por tantos auxílios, nas vidrarias, na formatação, e ainda na caça a “Mr Jingles” (risos), ou em qualquer outra ajuda na qual nunca me foi negada. Tenho orgulho em ter uma amiga para sempre laureada e amiga pra vida toda!

vii

Aos meus colegas do Hospital Maria Alice Fernandes:

Ao Diretor técnico, Dr. Renilson, por sua cordialidade sempre, por ter liberado as folgas que precisei em um momento tão importante para conclusão do meu trabalho, e

pela expectativa e confiança depositadas em mim.

À Drª Narriman, pessoa iluminada que tanto foi paciente, generosa e compreensiva em todos os momentos que precisei.

Às bioquímicas Drª Selma, Drª Dayanne e Drª Lourdes, do setor de Análises Clínicas

que me ajudaram na realização das dosagens desse trabalho.

Às queridas Edinôra, Ana Maria, Drª Conceição e D.Graça, por tanto terem me ajudado direta ou indiretamente na finalização desse trabalho; além da companhia

agradável, dos conselhos e da dedicação.

À Dona Ana, bioterista do Centro de ciências da saúde – UFRN. Sem a sua prontidão e dedicação, não seria possível a execução desse trabalho ao ceder os pequenos seres

vivos que possibilitaram esse estudo - aos quais dedico todo meu respeito: os camundongos!

Aos meus queridos alunos, que tive a oportunidade de dar início à introdução à

docência, e que foram o ânimo para que eu continuasse em mais essa descoberta e vocação em minha vida.

À UFRN e aos funcionários, que individualmente contribuíram brilhantemente para a

produção desse trabalho.

Ao programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas da UFRN, pelo auxílio sempre que precisei e pelo título almejado.

Ao programa REUNI, na qual fui bolsista e me sinto satisfeita e realizada por ter

feito parte dessa equipe.

Àqueles na maioria, anônimos, e que fazem jus ao nome: Pacientes! A essas pessoas agradeço por enxergar a necessidade constante de novos estudos que não sirvam apenas para meras publicações; e sim para amenizar a aflição de tantos que dividem os leitos

do serviço de saúde, sejam privados ou públicos, do nosso país.

A todas as pessoas que não foram citadas, mas que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.

viii

“A vida é o dever que nós trouxemos para fazer em casa. Quando se vê, já são seis horas! Quando se vê, já é sexta-feira!

Quando se vê, já é natal... Quando se vê, já terminou o ano...

Se me fosse dado um dia, outra oportunidade, eu nem olhava o relógio. Seguiria sempre em frente e iria jogando pelo caminho a casca dourada e inútil das horas... E tem mais: não deixe de fazer algo de que gosta devido à falta de tempo. A única falta que terá será a desse tempo que, infelizmente, nunca mais voltará.”

Trecho de “O TEMPO” - Mário Quintana.

ix

RESUMO

Fucana é uma denominação utilizada para polissacarídeos sulfatados,

que tem como característica estrutural mais marcante a presença de L-fucose

sulfatada, sendo encontrados em algas pardas (Phaeophyceae) e em

equinodermos (ouriços e pepinos do mar). Esses polissacarídeos tem sido

descritos por possuir atividade anticoagulante, anti-tumoral, anti-viral, anti-

proliferativa e anti-inflamatória. Portanto, no presente estudo foi avaliado o

efeito da fucana da alga parda Spatoglossum schroederii em modelos de

peritonite e choque não séptico induzido por zimosan, bem como em um

modelo murino de colite induzida por DSS. Dessa forma, o tratamento de

camundongos pela via intravenosa com a fucana foi capaz de reduzir a

formação do exsudato e a migração celular no modelo de peritonite aguda

induzida por zimosan durante a cinética de 6, 24 e 48 horas. De maneira

semelhante, no modelo de choque não-séptico induzido por zimosan a fucana

demonstrou efeito protetor ao inibir a migração celular para o peritônio, diminuir

os níveis de IL-6 sérico e no exsudato peritoneal, ao atenuar a perda de peso

do animais, além de reduzir os níveis séricos das transaminases hepáticas,

assim como a lesão no fígado. No modelo murino de colite, o tratamento com a

fucana reduziu a perda de peso dos animais, diminuiu os níveis de IL-17 e IFN-

produzidos no intestino e diminuiu a lesão intestinal ocasionada pela DSS.

Conclui-se então, que a fucana usada nesse estudo apresentou efeito protetor

significativo diante dos modelos murinos de inflamação.

Palavras-chave: Fucana, zimosan, peritonite, MODS, colite.

x

ABSTRACT

Fucans is a name used for sulfated polysaccharides, which is most

characteristic structure of the presence of sulfated L-fucose, are found in brown

seaweed (Phaeophyceae) and echinoderms (sea urchins and sea cucumbers).

These polysaccharides have been reported to possess anticoagulant, anti-

tumor, anti-viral, anti-proliferative and anti-inflammatory activities. Therefore, in

the present study was evaluate the effect of the fucan from the brown seaweed

Spatoglossum schroederii in models of peritonitis and non-septic shock induced

by zymosan, as well as in a murine model of colitis induces by DSS. So, the

mice treatment by intravenous route with the fucan was able to reduce the

exudate formation and the cell migration in the model of acute peritonitis

induced by zymosan during the kinetic of 6, 24 and 48 hours. Similarly, in the

model of non-septic shock induced by zymosan the fucan demonstrated a

protector effect to inhibited the cellular migration to the peritoneo, to decrease

the levels of IL-6 in the serum and in the peritoneal exudate, to attenuate the

lose of weight in the mice; beside to reduce the serum levels of hepatic

transaminases and as well as the liver injury. In the model of murine colitis, the

treatment with the fucan reduced the lose of weight of the animals, decreased

the levels of IL-17 and IFN- produced in the gut and decrease the intestinal

lesion induced by DSS. In conclusion, the fucan used in this study presented a

significant protector effect in the murine models of inflammation.

Keywords: Fucan, zymosan, peritonitis, MODS, colitis.

xi

SUMÁRIO

RESUMO ........................................................................................................................ ix

ABSTRACT .................................................................................................................... x

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... xiii

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. xiv

LISTA DE QUADROS ............................................................................................... xvi

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 17

2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................... 30

3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 31

3.1. - OBJETIVO GERAL: ..................................................................................... 31

3.2. - OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ....................................................................... 31

3.2.1. - Avaliar a atividade de fucana na cinética da migração celular em

modelo de peritonite aguda induzida por zimosan. ........................................................ 31

3.2.2. - Avaliar o efeito de fucana em modelo experimental de choque não

séptico induzido por zimosan. ........................................................................................ 31

3.2.3. - Avaliar o efeito de fucana em modelo experimental de colite. ............ 32

3.2.4. - Avaliar a produção de citocinas em modelos de choque não séptico e

colite. 32

4. MATERIAS E MÉTODOS ............................................................................... 33

4.1. Extração da FUCANA ..................................................................................... 33

4.2. Animais de experimentação ............................................................................. 33

4.3. Comitê de ética ................................................................................................ 33

4.4. Modelo de peritonite aguda induzida por zimosan .......................................... 33

4.5. Modelo murino de choque não séptico induzido por zimosan ........................ 35

4.5.1. Avaliação de toxicidade média ............................................................... 36

4.5.2. Dosagem sérica das transaminases hepáticas ......................................... 37

4.6. Modelo experimental de colite induzida por dextrana-sulfato (DSS) ............. 37

4.6.1. Obtenção de sobrenadante de cultura de intestino no modelo

experimental de colite induzida por DSS ....................................................................... 38

4.7. Dosagem de citocinas ...................................................................................... 39

4.8. Estudo morfológico .......................................................................................... 39

xii

4.9. Análise estatística ............................................................................................ 39

5. RESULTADOS .................................................................................................. 40

5.1. Efeito da fucana obtida da alga parda Spatoglossum schröederi sobre a

cinética de peritonite aguda experimental induzida por zimosan ............................... 40

5.1.1. Efeito da fucana de S. schroederi sobre exsudato peritoneal obtido do

modelo murino de cinética de peritonite aguda induzida por zimosan .......................... 40

5.1.2. Efeito da fucana de S. schroederi na migração celular para a cavidade

peritoneal em modelo murino de peritonite aguda induzida por zimosan. ..................... 40

5.2. Efeito de fucana da alga parda Spatoglossum schröederi em modelo de choque

não séptico induzido por zimosan .............................................................................. 41

5.2.1. - Efeito do tratamento da fucana sobre a perda de peso e toxicidade

sistêmica induzida por zimosan ...................................................................................... 41

5.2.2. - Efeito de fucana de S. schroederii na migração celular para cavidade

peritoneal no modelo murino de choque não séptico induzido por zimosan. ................ 45

5.2.3. - Efeito de fucana de S. schroederii sobre a concentração de IL-6 no soro

e no lavado peritoneal de camundongos submetidos ao choque não séptico ................. 49

5.2.4. - Efeito de fucana de S. schroederii sobre o dano hepático em modelo

murino de choque não séptico induzido por zimosan..................................................... 49

5.3. Avaliação do efeito da fucana extraída da alga parda Spatoglossum schröederi

em modelo experimental de colite induzida por dextrana sulfato de sódio (DSS)..... 54

5.3.1. – Efeito do tratamento de camundongos BALB/c com a fucana sobre a

perda de peso no modelo de colite induzida por DSS .................................................... 54

5.3.2. – Efeito de fucana sobre os níveis de citocinas obtidas em sobrenadante

de cultura de intestino no modelo murino de colite........................................................ 56

5.3.3. – Atividade da fucana de S. schroederii sobre o dano intestinal de

camundongos submetidos ao modelo de colite induzido por DSS ................................. 58

6. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 60

7. CONCLUSÕES ................................................................................................. 72

REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 73

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

ALT Alanino amino-transferase

AST Aspartato amino-transferase

COX Enzima ciclooxigenase

DII Doença inflamatória intestinal

DSS Dextrana sulfato de sódio

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay – Ensaio Imunoenzimático

LPS Lipopolissacarídeo

MN Mononuclear

MODS Síndrome de disfunção múltipla de órgãos

MOF Falência múltipla de órgãos

PBS Tampão fosfato-salino

PGD2 Prostaglandina D - 2

PGE2 Prostaglandina E - 2

PGI2 Prostaciclina I - 2

PMN Polimorfonuclear

TGF- Fator de crescimento tumoral beta

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

Treg Linfócito T regulatório

ZIGI Inflamação generalizada induzida por zimosan

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Processo de captura, rolamento e migração transendotelial de

leucócitos ao longo do vaso sanguíneo. ..................................................... 22

Figura 2. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a produção de exsudato

peritoneal em camundongos inoculados com zimosan ............................. 42

Figura 3. Efeito da fucana de S. schröederi na cinética de migração celular

para o peritônio de camundongos inoculados com zimosan .................... 43

Figura 4. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a cinética de migração

de PMN e MN em modelo de peritonite aguda induzida por zimosan ....... 44

Figura 5. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a toxicidade média

apresentada em camundongos submetidos ao choque não séptico

induzido por zimosan .................................................................................... 46

Figura 6. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a perda de peso em

camundongos submetidos ao choque não séptico induzido por zimosan

......................................................................................................................... 47

Figura 7. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a migração celular para

o peritôneo em camundongos submetidos ao choque não séptico


Figura 8. Efeito da fucana de S. schröederi sobre os níveis séricos e

peritoneais de IL-6 em camundongos submetidos ao choque não séptico


Figura 9. Efeito da fucana de S. schröederi sobre os níveis séricos de

enzimas hepáticas em camundongos submetidos ao choque não séptico


xv

Figura 10. Histologia do fígado de camundongos BALB/C submetidos ao

modelo de choque não séptico induzido por zimosan, efeito da fucana da

alga S. schroederi .......................................................................................... 54

Figura 11. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a perda de peso em

camundongos submetidos à colite induzida por DSS ................................ 55

Figura 12. Efeito da fucana de S. schröederi sobre os níveis de IFN- e IL-

17 em sobrenadante de cultura de intestino em camundongos submetidos

à colite induzida por DSS .............................................................................. 57

Figura 13. Histologia do cólon de camundongos, em modelo de colite

induzida por DSS 3% em camundongos BALB/C, avaliação do efeito da

fucana da alga S. schroederi ......................................................................... 59

xvi

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Distribuição dos grupos em modelo de cinética de peritonite

induzida por zimosan - 6, 24 e 48 horas após estímulo .............................. 35

Quadro 2 – Distribuição dos grupos em modelo de choque não séptico


Quadro 3 – Distribuição dos grupos em modelo de colite induzida por

DSS .................................................................................................................. 38

Ana Katarina Andrade Silva 17

1. INTRODUÇÃO

As fucanas são polissacarídeos sulfatados, encontradas em algas

pardas (Phaeophyceae) e em equinodermos (ouriços e pepinos do mar). A

família das fucanas de algas pode ser dividida em três grandes grupos de

polissacarídeos: os fucoidans, cuja fucose perfaz ou quase perfaz a totalidade

do polissacarídeo; as xilofucoglucuronanas e as glucuronogalactofucanas ou

glucuronofucogalactanas (KLOAREG & QUATRANO, 1988). Esses dois últimos

grupos são formados por fucanas bastante heterogêneas, cuja proporção de

fucose e outros açúcares, como galactose, xilose, glicose, manose e ácido

glucurônico, variam muito. A estrutura desses polissacarídeos sulfatados varia

de acordo com a espécie de alga de onde são extraídos, e essa estrutura tem

muita relação com sua atividade biológica (CAMARA et al., 2011). Desde sua

primeira descrição, as fucanas de algas marinhas tem sido alvos de muitos

estudos, demonstrando que estes polissacarídeos apresentam um grande

espectro de propriedades biológicas como, por exemplo, atividade anti-tumoral

(RIOU et al., 1996), anti-proliferativa (RELIGA et al., 2000), anti-inflamatória

(DAVENPECK et al., 1997; ANASTASE-RAVION et al., 2001; MACHELSKA et

al., 2004), anti-ulcerativa (NAGAOKA et al., 2000), anti-coagulante

(ALBUQUERQUE et al., 2004), anti-trombótica (BOISSON- VIDAL et al., 2000;

ROCHA et al., 2005), anti-viral (PREEPRAME et al., 2001), bloqueadora de

selectinas (MACHELSKA et al., 2004), moduladora de citocinas e quimiocinas

(SWEENEY et al., 2002; MYTAR et al., 2004) e da ativação do sistema

complemento (ZVYAGINTSEVA et al., 2000). Também previnem hepatopatias,

renalpatias e uropatias (CAMARA et al., 2011).


Relativo à ação de fucana em células do sistema imune, estudos

realizados por Heinzelmann e colaboradores (1998) e Anastase-Ravion e

colaboradores (2001) reportam a indução de citocinas pró-inflamatórias tais

como TNF- (Fator de necrose tumoral alfa), IL-1 (Interleucina 1), IL-6

(Interleucina 6) e da quimiocina IL-8/CXCL8 em monócitos humanos cultivados

com fucoidan, que é uma fucana comercial extraída da alga Fuccus

vesiculosus. Um dado interessante observado em um desses estudos foi que o

co-cultivo de monócitos humanos com fucoidan e lipopolissacarídeo (LPS) da

parede de bactérias Gram negativas, causa diminuição na produção de IL-8

/CXCL8 (ANASTASE-RAVION et al., 2001), sugerindo uma ação regulatória do

fucoidan sobre a indução dessa quimiocina quimioatraente de neutrófilos. No

entanto dados do nosso laboratório mostram que uma fucana obtida da alga

Spatoglossum schroederi não induz a produção de TNF ou IL-6 por macrófagos

murinos, nem inibe a capacidade do LPS em estimular a produção dessas

citocinas (SILVA et al., 2011).

Além disso, tem sido demonstrado que o fucoidan da alga F. vesiculosus

regula não somente a produção de quimiocinas, mas também a expressão de

alguns de seus receptores (DING et al., 2003). Esse polissacarídeo é capaz de

se ligar a L-selectina dos linfócitos do sangue periférico com consequente

aumento na expressão de CXCR4 (o receptor da quimiocina CXCL12). Isso

ocorre através da mobilização e inibição da internalização da L-selectina na

superfície de linfócitos humanos promovendo um aumento na ativação de

integrina e migração celular, em resposta à quimiocina CXCL12. Essa sua

capacidade reguladora pode ser um importante mecanismo de controle da

migração celular em uma resposta inflamatória (DING et al., 2003).


Estudos têm reportado que polissacarídeos sulfatados extraídos de

algas marinhas são capazes de reduzir o rolamento de leucócitos, resultando

em um significante decréscimo na adesão e migração dessas células

(SWEENEY et al., 2000; WOODMAN et al., 2000; ZHANG et al., 2001).

Ostegaard e colaboradores (2000) mostraram que o tratamento intravenoso

com fucoidan reduz o recrutamento de leucócitos para o fluido cérebro espinhal

em coelhos com meningite, sendo sugerido que o tratamento com esse

polissacarídeo sulfatado pode ser mais benéfico que o tratamento convencional

com antibióticos, uma vez que esses fármacos promovem a liberação de

produtos bacterianos no espaço subaracnóide, ampliando a inflamação e

recrutamento de leucócitos - que é bastante prejudicial no curso da doença.

Nesse mesmo estudo, observou-se que o tratamento com fucoidan resultou em

um decréscimo nos níveis da IL-1, e em menor proporção uma diminuição nos

níveis de TNF- no fluido cérebro espinhal de coelhos com meningite, devido

ao bloqueio da entrada de leucócitos nesse fluido (OSTEGAARD et al., 2000).

Os resultados desse estudo sugerem que polissacarídeos sulfatados, que

bloqueiam o rolamento dos leucócitos, são agentes importantes na redução de

danos ao sistema nervoso central causados pela bactéria Streptococcus

pneumoniae (causadora da menigite peneumocócica). Esse dados corroboram

com dados do nosso laboratório onde foi observado que a fucana da alga S.

schroederi reduz significativamente a migração de neutrófilos em modelos

murinos de perotonite e injúria pulmonar aguda induzida por LPS (SILVA et al.,

2011).

Por outro lado, o estudo realizado por Verdrengh e colaboradores

(2000), mostrou que o tratamento com fucoidan embora previna os sintomas


severos nos estágios precoces de artrite induzida por Staphylococcus aureus

em camundongos, acarreta em um atraso no recrutamento de fagócitos ao sítio

de inflamação diminuindo dessa forma a mortalidade dos patógenos invasores.

Isso se deve ao fato dessas células serem importantes na captura e destruição

dessas bactérias, e uma vez que sua migração foi prejudicada pelo tratamento

com o fucoidan, as bactérias tem a chance de proliferarem no tecido infectado,

agravando a doença. Contudo, outro estudo relata que a perfusão com esse

biopolímero sulfatado pode reduzir a infiltração de neutrófilos e

consequentemente a injúria miocárdica após uma isquemia (OMATA et al.,

1997).

O processo inflamatório consiste de uma intrincada, altamente

regulada e coordenada ação de várias moléculas e tipos celulares. Dessa

forma, esse processo quando devidamente regulado protege o hospedeiro de

infecções e permite o remodelamento da estrutura e re-estabelecimento da

função dos tecidos danificados após o processo de injúria (YAN e HASSON,

2007). Isso acontece porque após o contato inicial com o agente causador da

injúria tecidual, células da imunidade inata, como os fagócitos, produzem

citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF- e IL-1 que agem sobre os vasos

sanguíneos mais próximos ativando-os (LUSTER, 1998). Essa ativação

vascular promove a expressão de moléculas de adesão (selectinas e

integrinas) importantes no processo de rolamento e adesão de células

sanguíneas que precisam migrar do sangue para os tecidos injuriados

(CHATTERJEE et al., 2005). Os eventos de captura e rolamento de leucócitos

ao longo do vaso sanguíneo (Figura 1) acontecem devido a ligações

reversíveis de glicoproteínas adesivas transmembranas chamadas selectinas


(BEVILACQUA e NELSON, 1993), encontradas na maioria dos tipos celulares

de origem hematopoiética e em células endoteliais e vasos linfáticos

(WAGNER et al., 2000). Em poucos minutos de exposição das células

endoteliais a mediadores inflamatórios como produtos do complemento,

radicais livres derivados do oxigênio, ou citocinas como TNF- e IL-1

(WAGNER et al., 2000), observa-se que a P-selectina é mobilizada para a

superfície do endotélio vascular, onde pode interagir com seu respectivo

receptor, glicoproteína ligante-1 de P-selectina (PSGL-1; CD162), presente nos

leucócitos sanguíneos; sendo que destes, o primeiro a fazer essa interação,

são os polimorfonucleares (PMNs). Em seguida, a função da E-selectina

compreende manter o rolamento dos leucócitos já iniciado através da P-

selectina, visto que seu pico de atividade e expressão em células endoteliais in

vitro é de 4 a 6 horas após a exposição à citocinas inflamatórias (KLEIN et al.,

1995; SCHOLZ et al., 1996).

As citocinas TNF e IL-1 produzidas no sítio de inflamação irão agir no

endotélio vascular estimulando a síntese de quimiocinas por essa células

(WAGNER et al., 2000), essas quimiocinas por sua vez agem nos leucócitos

em rolamento no endotélio, ativando a expressão de integrinas da alta avidez.

A expressão das integrinas de alta avidez permite a interação firme do

leucócito com o endotélio vascular e sua passagem para os tecidos. Além de

mediar a ligação célula a célula, as integrinas também estão envolvidas nas

interações celulares com proteínas extracelulares como a laminina,

fibronectina, vitronectina e fibrinogênio, de modo a participarem na

transmigração celular de PMNs do endotélio para a matrix extracelular

(WAGNER et al., 2000). As primeiras células a chegarem ao sítio de injúria são


os fagócitos polimorfonucleares, em seguida aparecem os monócitos, que nos

tecidos viram macrófagos, que tem um importante papel na fagocitose e

eliminação dos antígenos, através dos mecanismos microbicidas, inerentes a

essas células (ZARBOCK e LEY, 2008). Em um período mais tardio, migram os

linfócitos, células da imunidade adquirida, que auxiliam de modo direto ou

indireto as células da imunidade inata num mecanismo de amplificação da

resposta imune.

Figura 1. Processo de captura, rolamento e migração transendotelial de leucócitos ao

longo do vaso sanguíneo. FONTE: Murphy et al., 2010.

Essas células agem em conjunto para debelar a causa desse processo

inflamatório, e uma vez que o agente causador da injúria é eliminado, o sistema

volta à sua homeostasia, através da produção de substâncias anti-inflamatórias

e de remodelamento tecidual, como é o caso da IL-10, TGF-beta e lipoxinas

(SERHAM et al., 2008).


No entanto, uma inflamação exagerada e desregulada pode levar a

vários processos inflamatórios agudos e crônicos sérios, tais como peritonite,

sepse, e danos teciduais observados nas doenças autoimunes, como na

doença de Crohn (SERHAM et al., 2008).

A sepse, quando acompanhada por falência múltipla de órgãos, contribui

para ser a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva (MARTIN

et al., 2003). A falência sequencial de órgãos sistêmicos, que geralmente

ocorre diante de um período de latência de dias ou semanas após vários

insultos fisiológicos - que pode incluir pancreatite, trauma, queimaduras,

choque, infecções severas, aspirações, transfusões múltiplas de sangue, ou

complicações pulmonares - anteriormente conhecida como "Falência múltipla

de órgãos" (MOF), evoluiu para "Síndrome de disfunção múltipla de órgãos”

(MODS) (PAOLA et al., 2006). A MODS é definida como a presença de

disfunção de órgãos em pacientes gravemente doentes, na qual a homeostase

não pode ser mantida sem intervenção clínica (AMERICAN COLLEGE OF

CHEST PHYSICIANS CONFERENCE, 1992), e tipicamente consiste na

disfunção sequencial de diversos órgãos sistêmicos, envolvendo inicialmente

os pulmões e evoluindo com disfunções hepáticas, intestinais, renais,

hematológicas e enventualmente cardíaca, embora a ordem exata possa variar

em função de doenças preexistentes ou naturalmente do insulto da qual foi

originada (DEITCH, 1992; REGEL et al., 1996). Mesmo após mais de três

décadas da sua descrição inicial (TILNEY et al., 1973), a mortalidade por

MODS permanece praticamente inalterada e a elucidação de mecanismos

envolvidos no seu desenvolvimento necessitaria de uma extensa coleção de


amostras teciduais e atuação de procedimentos invasivos, que reduzem as

possibilidades de pesquisa em humanos (VOLMAN et. al., 2005).

Assim, foi observado que a inoculação de altas doses de zimosan pode

reproduzir um modelo de inflamação generalizada em camundongous ou ratos,

chamada ZIGI, que é acompanhado por dano múltiplo de órgãos

(CUZZOCREA et al., 1999; HOU et al., 2009; VOLMAN et al., 2005; HOU et al.,

2009; MARZOCCO et al., 2004; PAOLA et al., 2006). Esse modelo murino

ainda é caracterizado por uma toxicidade sistêmica e significativa perda de

peso (PAOLA et al., 2006); e foi descrito desde 1986, tendo sido reconhecido

como aquele que mais se assemelha a MODS humana (GORIS et al., 1986),

tendo sido denominado como choque não séptico induzido por zimosan

(PAOLA et al., 2006; MARZOCCO et al., 2004). O zimosan é uma substância

derivada da parede celular do fungo Saccharomyces cerevisiae, e é composto

por cadeias polissacarídicas de vários pesos moleculares, contendo

aproximadamente 73% de polissacarídeos, 15% de proteínas e 7% de lipídios

e componentes inorgânicos (FITZPATRICK et al., 1964). Quando injetado em

animais promove a inflamação por uma larga produção de mediadores

inflamatórios, tais como componentes ativados do sistema complemento

(PILLEMER et al., 1941), prostraglandinas e leucotrienos (HUMES et al., 1982),

fator de agregação plaquetária (ROUBIN et al., 1982), reativos de oxigênio

(NAUSSEF et al., 1983), enzimas lisossomais (BONNEY et al., 1978); pode

agir diretamentamente ativando macrófagos (UNDERHILL, 2003), que após

fagocitar esse produto, produzem citocinas como, TNF- interleucina (IL)1-,

IL-6 e IL-8 (BONDESON et al., 1999). A produção excessiva desses

mediadores resulta em aumento de dilatação periférica, ativação celular


leucocitária e endotelial, excessiva permeabilidade microvascular, e acentuada

coagulação microvascular (DAVIE et al., 1997), que somadamente contribuem

para o desenvolvimento de profundas mudanças em vários órgãos que podem

eventualmente levar à MODS (YAO et al., 1998; SHARMA et al., 2003).

Em modelos de inflamação aguda, como a MODS, bem como em

doenças crônicas ou autoimunes como nas doenças inflamatórias intestinais

(DIIs), os neutrófilos exercem um papel importante na patogênese, e sendo

assim, drogas que controlem o influxo dessas células para os sítios

inflamatórios, com pouco ou nenhum efeito colateral para os pacientes, podem

ser de grande auxílio no tratamento dessas doenças. Assim, diversos modelos

inflamatórios são adotados com o objetivo de avaliar a atividade anti-migratória

de diversas substâncias (HU et al., 2008; CUMASHI et al., 2007;

POCHECHUEVA et al., 2003). Os processos inflamatórios agudos como a

sepse pode levar o hospedeiro à morte; e inflamações crônicas, como as DIIs,

geram danos teciduais que podem ser irreparáveis com perda da função do

tecido ou órgão afetado.

A colite ulcerativa, assim como a doença de Crohn, são exemplos de

doenças inflamatórias intestinais (DIIs) e são manifestações de numerosas

desordens imunológicas associadas com resposta imune celular e humoral.

Apesar de sua etiologia e patogênese ainda não serem bem definidas, sabe-se

que fatores genéticos em combinação com fatores ambientais contribuem para

a iniciação dessas doenças (CHEN, et al; 2008), que se caracterizam por

sintomas como perda de peso, diarréia acompanhada de sangue e/ou muco,

febre, desmotilidade gástrica e dor abdominal (KWON, et al, 2007; YOON, et al,

2008).


O desenvolvimento das DIIs atinge primariamente a camada superficial

da mucosa do cólon, onde análises histológicas mostram extenso dano às

criptas e ao epitélio, significante infiltração de granulócitos e células

mononucleares, edema tecidual e muitas vezes ulceração (STROBER et al,

2002). Evidências em modelos animais indicam que a falha nos mecanismos

de supressão da imunidade para antígenos intestinais estranhos ao organismo

leva a essa desordem inflamatória. Por exemplo, ativação de células imunes

como neutrófilos, macrófagos e células T citotóxicas, causa agressão e

destruição da barreira intestinal, quer seja através do contato direto ou indireto,

através da liberação de citocinas como TNF-α, IL-1-β e IL-6 (SARTOR, 2006;

PAPADAKIS e TARGAN, 2000).

Apesar da doença de Crohn e da colite ulcerativa apresentarem

semelhanças na resposta a antígenos na mucosa intestinal, essas duas

doenças apresentam fisiopatologia consideravelmente diferentes. Estudos

mostram que a doença de Crohn está associada a uma resposta mediada por

células Th1 (FICHTNER-FEIGL et al., 2005), promovendo um perfil de citocinas

(IFN-, IL-2 e TNF-α) que gera uma forte resposta imune celular; sendo essa

resposta geralmente observada em casos clínicos de inflamação crônica e

implicada tanto no desenvolvimento da doença de Crohn como na esclerose

múltipla e artrite (BONDER et al., 2005). Por outro lado, a colite ulcerativa está

associada a uma resposta Th2, mediada por células especializadas, como as

células T NK e secreção de IL-13 e IL-4 (FICHTNER-FEIGL et al., 2005; SHIG

e TARGAN, 2008). Acredita-se ainda que um fator que leva ao

desenvolvimento da colite ulcerativa é o desequilíbrio da resposta imune

Th1/Th2, tendo nesse tipo de doença predominância da resposta Th2 (IHARA


et al, 2009), em que a liberação de citocinas, por exemplo, IL-4 e IL-13, esteja

associada com a hipercontratilidade do músculo liso intestinal, porém esse

mecanismo ainda não está totalmente esclarecido (AKIHO et al., 2005; IHARA

et al, 2009 ).

Tem sido mostrado também que o desequilíbrio da resposta das células

T leva a uma alteração na expressão de citocinas na mucosa e células

dendrídicas tem sido caracterizadas como células produtoras de citocinas (IL-6

e TGF-) que induzem um padrão de resposta imune Th17, que atua como

participante dessa reação inflamatória (TAKEDATSU et al, 2008). Afirma-se

também que a composição da microbiota intestinal é regulada pelo balanço

entre as células Th17 e T regulatórias (Treg) na lâmina própria e que o

desequilíbrio da expressão dessas células, com o consequente aumento das

células Th17 leva a susceptibilidade de um processo inflamatório, podendo

assim levar ao desencadeamento da colite (IVANOV et al, 2009). Células Th17

participam de respostas inflamatórias e têm funções essenciais na defesa do

hospedeiro contra patógenos, como bactérias e fungos, particularmente

aqueles encontrados nas mucosas. Também estão envolvidas no

desenvolvimento de doenças autoimunes como a colite ulcerativa, uma vez que

essas células produzem citocinas quimioatraentes de neutrófilos, sabidamente

envolvidos na fagocitose dos patógenos (AUJLA et al. 2008).

O tratamento das doenças inflamatórias intestinais (DII) só pode ser

iniciado a partir do diagnóstico do tipo de enfermidade. O diagnóstico assim

como diferenciação entre doença de Crohn e colite ulcerativa pode ser feito de

maneira precisa na maioria dos pacientes, baseado no histórico do paciente,

exame físico, ileocolonoscopia, exame por enema de duplo-contraste de bário,


biopsia e análise microbiológica (BOUSSUYT et al., 2006). Dentre as

substâncias mais empregadas no tratamento de DIIs, destacam-se os

derivados do ácido 5-aminosalicílico, corticosteróides, imunossupressores e,

mais recentemente, as chamadas terapias biológicas, envolvendo o uso de

anticorpos anti-TNF (infliximab, adalimumab, certolizumab), anticorpos

bloqueadores de quimiocinas e moléculas de adesão (natalizumab), anticorpos

monoclonais anti-IL-12/IL-23 p40 (ustekinumab e ABT-874) e anti-IL-6

(tocilizumab), anticorpo anti-CD25 de células T (basiliximab), proteínas de

fusão que bloqueiam moléculas co-estimulatórias, como CD80/CD86

(abatacept), IL-10 humana recombinante (STALLMACH et al., 2010). O

tratamento convencional envolve uso de aminossalicilatos, corticosteróides e

imunossupressores, que demonstram eficácia na maioria das vezes, mas nem

todos os pacientes podem fazer uso desses medicamentos

concomitantemente, sendo uma alternativa o uso da terapia biológica com os

anticorpos (STALLMACH et al., 2010). De maneira geral, estes medicamentos

apresentam diversos efeitos colaterais, são de alto custo, na maioria das vezes

são ineficazes quando empregados isoladamente e a administração

concomitante pode elevar o número de efeitos colaterais (infecções, tumores),

sem considerar que existe uma alta taxa de reincidência da doença após a

realização do tratamento com tais fármacos (STALLMACH et al., 2010; CAO et

al., 2005).

No modelo de colite induzido por DSS (dextrana-sulfato), a patogênese

envolve a presença no epitélio intestinal de um infiltrado de células como

neutrófilos e macrófagos na resposta aguda, assim como um infiltrado de

linfócitos em uma resposta mais tardia (DIELEMAN et al., 1998).


Em função disso, substâncias que possam controlar esses processos e

evitar danos teciduais e/ou morte do hospedeiro, causada por respostas

inflamatórias intensas são alvo de intenso estudo. E assim, baseado em todos

os estudos citados anteriormente que indicam o potencial de fucanas como um

possível agente regulador de processos inflamatórios, nos propomos a avaliar

a ação imunofarmacológica de fucana extraída da alga Spatoglossum

schroederi nos modelos de peritonite, choque não séptico e colite .


2. JUSTIFICATIVA

Tendo em vista que previamente estudos vêm sendo realizados em nosso

laboratório na tentativa de analisar as atividades da fucana extraída da alga parda

Spatoglossum schröederi sobre células do sistema imunológico e em modelos de

inflamação, e que relatos na literatura sobre as atividades biológicas de

polissacarídeos sulfatados se limitam a uma preparação comercial do fucoidan

extraído da alga Fuccus vesiculosus, justifica-se a tentativa de avaliar a aplicação

desse polissacarídeo sulfatado como possível intervenção farmacológica em

algumas doenças de difícil tratamento - utilizando para isso primariamente modelos

murinos que mimetizam as patologias acometidas em humanos. Assim sendo, é

preocupante a ação inflamatória exacerbada ou prejudicial do sistema imunológico

na patogênese de diversas doenças e a resultante dificuldade de sua terapia, seja

em enfermidades agudas, como sepse ou crônicas, como asma e doenças

autoimunes. Em consequência disso, a descoberta de novos fármacos poderia (i)

melhorar a eficácia da terapia, (ii) minimizar os efeitos colaterais encontrados nos

tratamentos convencionais, ou ainda (iii) prover a sua utilização como adjuvantes em

tratamentos não responsivos. Dessa forma, a fim de garantir uma análise

abrangente da fucana, buscamos avaliar os distintos aspectos que envolvem a

manifestação das respostas imunológicas - em modelos murinos - seja em

síndromes agudas (peritonite, choque não-séptico) ou em enfermidades, que se

assemelham, às crônicas (colite) acometidas em humanos.


3. OBJETIVOS

3.1. - OBJETIVO GERAL:

O objetivo geral desse estudo foi avaliar os efeitos imunofarmacológicos de

fucana extraída de alga marinha Spatoglossum schröederi obtida no litoral do Rio

Grande do Norte em modelos murinos de inflamações agudas e crônicas.

3.2. - OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

3.2.1. - Avaliar a atividade de fucana na cinética da migração

celular em modelo de peritonite aguda induzida por zimosan. Uma vez que a

atividade inibitória da fucana inoculada subcutaneamente sobre a migração celular

foi evidenciada em outros modelos murinos inflamatórios previamente realizados em

nosso laboratório (peritonite, inflamação em bolha de ar) (ANDRADE et al., 2011),

nesse estudo foi avaliado o efeito desse polissacarídeo em cinética de peritonite

induzida por zimosan quando inoculada intravenosamente.

3.2.2. - Avaliar o efeito de fucana em modelo experimental de

choque não séptico induzido por zimosan. Baseando-se em sua atividade

inibitória sobre a migração celular em modelos de inflamação agudos já descritos, foi

avaliado o efeito da fucana em um modelo de choque não séptico, induzido pela

injeção intraperitoneal de altas doses de zimosan, que mimetiza uma síndrome

aguda que gera consequências danosas em humanos através da produção


excessiva de mediadores inflamatórios - conhecida como síndrome de disfunção

múltipla de órgãos (MODS).

3.2.3. - Avaliar o efeito de fucana em modelo experimental de

colite. Uma vez que tem sido mostrado que neutrófilos tem um papel relevante na

patologia dessa doença, e uma vez que já foi observado que a fucana em estudo

inibe migração de neutrófilos (Silva et al., 2011), foi pesquisado o efeito da fucana da

alga S. schröederi sobre a evolução dessa doença, bem como sobre o infiltrado

celular presente na mucosa intestinal nesse modelo estudado.

3.2.4. - Avaliar a produção de citocinas em modelos de choque

não séptico e colite. Para avaliar o efeito da fucana na resposta imune nos

modelos de choque e colite, foi pesquisada a produção de citocinas pró-

inflamatórias, tais como IL-6 no soro e no lavado peritoneal em animais submetidos

ao choque não séptico e citocinas imunoestimulatórias como IFN- (Th1), IL-4 (Th2)

e IL-17 (Th17), no sobrenadante de cultura de intestino nos animais submetidos à

colite.


4. MATERIAS E MÉTODOS

4.1. Extração da FUCANA: a fucana foi obtida através extração a partir da

alga marinha Spatoglossum schröederi de acordo com a metodologia proposta em

Leite et al. (1998). Representante da classe Phaeophycea, e da ordem dictyotales,

essa alga foi coletada no litoral de Natal-RN, Brasil. A fucana foi fornecida

gentilmente pelo Profº Dr. Hugo A. de Oliveira Rocha, do Departamento de

Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Antes de cada

experimento, a fucana foi diluída em solução salina 0,9% nas doses desejadas e

filtrada em filtros de 0.22 m.

4.2. Animais de experimentação: foram utilizados camundongos BALB/c

com seis a oito semanas de idade, obtidos no biotério da Faculdade de Farmácia –

UFRN, os quais foram mantidos no biotério do centro de biociências com livre

disponibilidade de alimentação e água.

4.3. Comitê de ética: Os experimentos foram aprovados de acordo com a

comissão de ética no uso animal (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte (Protocolo nº 008/2010).

4.4. Modelo de peritonite aguda induzida por zimosan: os animais foram

inoculados intraperitoneamente (i.p.) com zimosan (1mg/ml) e tratados

intravenosamente (i.v.) com fucana diluída em salina (0,9%) na dose de 20mg/Kg de

animal ou (i.p.) com 0,5 mg/Kg de dexametasona (DEXA) trinta minutos após

estímulo. Após 6, 24 e 48 horas, os camundongos foram sacrificados por


deslocamento cervical, previamente anestesiados com a solução anestésica de

xilazina-ketamina via i.p., e o exudato peritoneal foi colhido pela injeção de 5 ml de

solução salina 0,9 % refrigerada para todos os grupos testados e foi mensurado

através do volume aspirado final. O exsudato obtido foi centrifugado a 250 X g, a

4ºC, durante 10 minutos, o sobrenadante colhido e congelado, e o botão celular foi

ressuspendido em 1 ml de solução salina 0,9 %. A concentração celular foi

determinada em câmara de Neubauer utilizando-se o corante azul de Turk. Foi

determinada a contagem total e diferencial de leucócitos. As lâminas para contagem

diferencial foram preparadas por citocentrifugação de uma alíquota (50 l) do lavado

peritoneal e coradas pelo corante panótico rápido (LaborClin; Brasil). As células

foram examinadas em microscópio óptico através da objetiva de imersão em óleo

(aumento de 100x). Foram então contadas 100 células por lâmina, diferenciando-se

dois tipos celulares: mononucleares e polimorfonucleares. Para o controle negativo,

camundongos BALB/c de mesma idade e condições foram inoculados tanto pela rota

intravenosa como intraperitoneal, com solução salina 0,9 %. Para o controle positivo,

o tratamento via intravenoso foi realizado com uso do veículo (solução salina 0,9 %)

e o estímulo peritoneal foi induzido por zimosan de modo semelhante aos animais-

teste.


Quadro 1 – Distribuição dos grupos em modelo de cinética de peritonite induzida por zimosan

- 6, 24 e 48 horas após estímulo. Foram realizados 3 experimentos. n = 5 animais/grupo. IV =

intravenoso. IP = intraperitoneal.

GRUPOS TRATAMENTO i.v. ou i.p. ESTÍMULO i.p.

Grupo 1 100l Salina 0,9% i.v. 1 ml Salina 0,9%

Grupo 2 100l Salina 0,9% i.v. 1 ml zimosan (1mg/ml)

Grupo 3 100l Fucana (20mg/Kg i.v.) 1 ml zimosan ((1mg/ml))

Grupo 4 Dexametasona (0,5mg/Kg i.p.) 1 ml zimosan ((1mg/ml))

4.5. Modelo murino de choque não séptico induzido por zimosan: A

metodologia utilizada foi modificada de Paola et al. (2006). Camundongos BALB/c de

6-8 semanas de idade e de 20-25 (g) de peso foram randomicamente distribuídos

nos grupos demonstrados no quadro 2.Os grupos 2, 3, 4 e 5 foram estimulados pela

via intraperitoneal com 500 mg/Kg de zimosan. O grupo controle (Grupo 1) recebeu

apenas solução salina 0,9% como tratamento i.v. e estímulo i.p. Os grupos tratados

receberam diferentes doses de fucana pela rota intravenosa (20, 10 e 5mg/kg) uma

hora antes e 6 horas após receberem o estímulo com zimosan. Após 18 horas da

administração de zimosan, os camundongos foram anestesiados com a solução

anestésica de xilazina-ketamina via i.p.,o sangue foi colhido pelo plexo retro-orbital

para obtenção do soro e posterior dosagem de citocinas. Em seguida os animais

foram sacrificados por deslocamento cervical e o exsudato peritoneal de todos os

grupos testados foi colhido através da injeção de 5 ml de solução salina 0,9 %


refrigerada na cavidade peritoneal. O exsudato obtido foi centrifugado a 250 X g, a

4ºC, durante 10 minutos. O sobrenadante foi colhido e estocado a -20°C, para

posterior dosagem de IL-6, e o botão celular foi ressuspendido em 1 ml de solução

salina 0,9 %. A concentração celular foi determinada em câmara de Neubauer

utilizando-se o corante azul de Turk. Em outra série de experimentos (n=10 por

grupo), os animais tratados com a fucana apenas na maior dose (20mg/Kg) foram

randomicamente distribuídos e monitorados quanto à perda de peso por 15 dias

após inoculação de salina ou zimosan.

Quadro 2 – Distribuição dos grupos em modelo de choque não séptico induzido por zimosan. Foram realizados 3 experimentos. n = 5 animais/grupo. IV = intravenoso. IP = intraperitoneal.

GRUPOS TRATAMENTO I.V. ESTÍMULO i.p.

Grupo 1 100l Salina 0,9% 250 l Salina 0,9%

Grupo 2 100l Salina 0,9% 250 l zimosam (500mg/Kg)

Grupo 3 100l Fucana (20mg/Kg) 250 l zimosam (500mg/Kg)

Grupo 4

100l Fucana (10mg/Kg) 250 l zimosam (500mg/Kg)

Grupo 5 100l Fucana (5mg/Kg) 250 l zimosam (500mg/Kg)

4.5.1. Avaliação de toxicidade média: A severidade clínica da injúria

sistêmica ocasionada pelo modelo de choque não séptico foi analisada de acordo

com Paola et al. (2006) com modificações. Uma escala de parâmetros clínicos foi

observada subjetivamente após 6 horas da injeção de zimosan: pêlo eriçado,

prostração e diarréia. Para cada parâmetro foi estipulado um score 1 (uma


característica), 2 (duas características) ou 3 (três características), que somados

entre si foi estipulado para cada animal analisado. Esse período foi padronizado

como ideal para essa análise, visto que nesse modelo (ZIGI) os animais

curiosamente expressam esses sinais distintamente em três fases do choque: (i)

fase inicial aguda com evidência de sinais clínicos, nas primeiras 24 horas, (ii) fase

intermediária onde há remissão dos parâmetros, e aparente melhora na doença, e

por fim (iii) fase mais tardia do 7º ao 14º onde há agravamento dos sinais novamente

(VOLMAN, et. al., 2005).

4.5.2. Dosagem sérica das transaminases hepáticas: A dosagem

das enzimas hepáticas foi realizada no soro dos animais submetidos ao choque não

séptico, obtido 18 horas após a inoculação do zimosan. As amostras de soro foram

incubadas à temperatura ambiente durante uma hora para que houvesse retração do

coágulo. Em seguida, foram centrifugadas (1400 x g, 10’ a 4°C) e a dosagem das

enzimas hepáticas foi imediatamente realizada através dos kits de diagnóstico da

Labtest, expressas em UI/L.

4.6. Modelo experimental de colite induzida por dextrana-sulfato (DSS):

A colite experimental foi induzida através da administração de DSS diluída na água

de beber dos camundongos BALB/c, que são susceptíveis ao desenvolvimento da

colite, na concentração final de 3% (peso/volume) por 14 dias consecutivos, sendo

que no 15º, receberam apenas água. Os animais foram tratados pela via intravenosa

(i.v.) com a dose de 20 mg/kg da fucana a cada três dias durante o período

experimental. Os animais foram divididos em grupos que recebeu salina i.v. e bebeu

água normal, grupo que recebeu salina i.v. e bebeu água contendo dextrana, e o


grupo que recebeu tratamento com a fucana e recebeu água contendo dextrana 3%

como demonstrado no quadro 3. O consumo de líquido foi monitorado diariamente

para certificar que cada grupo está consumindo quantidades equivalentes de água.

Os animais ainda foram monitorados quanto à perda de peso durante 15 dias. Após

esse período, os animais foram eutanasiados, o intestino foi colhido, o cólon retirado

e lavado exaustivamente com salina 0,9% estéril. Partes do cólon foram usadas para

análise histológica e outra parte foi usada para cultura e dosagem de citocinas.

Quadro 3 – Distribuição dos grupos em modelo de colite induzida por DSS. Foram realizados 3 experimentos. n = 5 animais/grupo. IV = intravenoso. IP = intraperitoneal.

GRUPOS TRATAMENTO I.V. Água de beber

Grupo 1 100l Salina 0,9% Água

Grupo 2 100l Salina 0,9% Água + DSS (3%)

Grupo 3 100l Fucana (20mg/Kg) Água + DSS (3%)

4.6.1. Obtenção de sobrenadante de cultura de intestino no

modelo experimental de colite induzida por DSS: As partes do cólon removidas

de cada animal submetido à colite foram dispostas em placas de Petri plásticas

contendo salina 0,9% estéril contendo antibiótico gentamicina e lavadas

exaustivamente com essa solução para remoção de material fecal, em fluxo laminar.

As porções do cólon foram distribuídas (parte de cólon de cada animal/poço) em

placa de 24 poços contendo meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro

bovino fetal e antibiótico gentamicina (20 g/ml). A placa foi incubada em estufa


contendo 5% de CO2 umidificada por 24 horas. Após isso, os sobrenadantes foram

colhidos para determinação dos níveis de citocinas (IL-4, IL-17 e IFN-).

4.7. Dosagem de citocinas: A dosagem de citocinas foi realizada por

ELISA. Foras usados kits da Ebioscience para determinação dos níveis de IFN-, IL-

4 e IL- 17, seguindo o protocolo padrão fornecido pelo fabricante dos kits.

4.8. Estudo morfológico: Relativo ao modelo de choque não séptico, após

18 horas do inóculo do zimosan, os animais foram sacrificados como descrito acima,

partes do fígado, do rim e do baço dos animais de cada grupo, foram obtidos e

fixados em formol a 10% diluído em uma solução salina tamponada com fosfato

(PBS) – PBS-formol 10% - para posterior processamento histológico. No modelo de

colite induzido por DSS, as partes do cólon removidas foram lavadas com solução

salina 0,9% para remoção de todo material fecal e em seguida mantidas em solução

de PBS-formol a 10% para posterior processamento histológico. O material fixado foi

processado e emblocado em parafina, sendo posteriormente, feitos cortes de 5m

de espessura para coloração em H/E (Hematoxilina-Eosina). A análise morfológica

foi feita por um único observador em um estudo cego que analisou a estrutura do

parênquima e estroma dos órgãos comparando com o controle negativo.

4.9. Análise estatística: A análise estatística foi aplicada através da

análise de variância (ANOVA) e o método paramétrico de Tukey-Kramer para

determinar as diferenças entre os grupos experimentais. Esses métodos estatísticos

foram executados através do programa Graph-pad Prism – versão 5.0 (EUA).


5. RESULTADOS

5.1. Efeito da fucana obtida da alga parda Spatoglossum schröederi

sobre a cinética de peritonite aguda experimental induzida por zimosan.

5.1.1. Efeito da fucana de S. schroederi sobre exsudato peritoneal

obtido do modelo murino de cinética de peritonite aguda induzida por zimosan.

A análise inicial desse modelo experimental foi mensurar a formação de

exsudato na cavidade peritoneal em animais estimulados intraperitonealmente com

zimosan. Os resultados observados demonstram que a fucana de S. schroederi foi

capaz de reduzir a formação do edema, o que sugere que a mesma atua no passo

inicial do processo inflamatório, que remete ao aumento da permeabilidade vascular

e consequentemente ao extravasamento do plasma para o tecido inflamado (Figura

2). Em contrapartida, a dexametasona, um fármaco corticosteróide de uso comercial,

não foi capaz de reduzir significativamente a formação do exsudato peritoneal,

quando comparado ao controle positivo.

5.1.2. Efeito da fucana de S. schroederi na migração celular para a

cavidade peritoneal em modelo murino de peritonite aguda induzida por

zimosan.

Estudos prévios do nosso laboratório tem mostrado que a fucana de S.

schröederi injetada intravenosamente inibe a migração de células em modelos de

peritonite e de injúria pulmonar aguda induzida pelo LPS (SILVA et al., 2011). Essa

ação inibitória também foi observada em modelo de peritonite induzida por zimosan,

quando os animais foram tratados subcutaneamente (ANDRADE et al., 2011).


Prosseguindo esse estudo, foi avaliado o efeito da fucana de S. schroederii, após

tratamento intravenoso, sobre a cinética da migração celular em modelo de

peritonite induzido por zimosan. Os resultados obtidos (Figura 3) mostram que o

tratamento dos animais com a fucana inibiu de modo significativo a migração celular

para o peritônio, nos três tempos avaliados (6, 24 e 48 horas), similar ao que

aconteceu com grupo de animais tratados com a dexametasona (DEXA), que é um

agente antiinflamatório comercial que foi capaz de inibir a migração celular durante o

período estudado. Foi avaliado ainda o infiltrado celular peritoneal através da

contagem diferencial dos leucócitos que sofreram migração, e não foi encontrada

diferença no percentual de mononucleares e polimorfonucleares entre os grupos

controles e os animais tratados com a dexametasona e a fucana (Figura 4).

5.2. Efeito de fucana da alga parda Spatoglossum schröederi em

modelo de choque não séptico induzido por zimosan.

5.2.1. - Efeito do tratamento da fucana sobre a perda de peso e

toxicidade sistêmica induzida por zimosan.

Tendo em vista que na cinética de peritonite, o tratamento da fucana 30

minutos após a injeção i.p. de zimosan inibiu a migração celular nos três períodos

analisados, o próximo passo foi avaliar o efeito desse polissacarídeo em um modelo

de patologia aguda que mimetiza a síndrome de disfunção múltipla de órgãos em

humanos ou MODS. Com o intuito de analisar a ação da fucana sobre o choque não

séptico nesse modelo, nos propomos a investigar o papel desse polissacarídeo

sulfatado sobre o escore de toxicidade média através da análise de pêlo eriçado,

diarréia e prostração, nos animais submetidos a essa injúria sistêmica.


Figura 2. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a produção de exsudato peritoneal em camundongos inoculados com zimosan. Camundongos foram tratados com salina (SAL), fucana (FUC) na dose de 20mg/Kg i.v. ou dexametasona (DEXA) i.p. trinta minutos após injeção i.p. de zimosan (ZYM) (1 mg/ml) e sacrificados por deslocamento cervical nos períodos de 6, 24 e 48 horas após injeção de zimosan. Os controles receberam apenas solução salina 0,9% i.p. e i.v . O exsudato peritoneal foi mensurado após lavagem peritoneal e posterior aspiração local, através da diferença entre o volume de solução salina inoculada e aspirada. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. ** P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo. * P < 0,05 quando comparado ao controle positivo (ZYM).


Figura 3. Efeito da fucana de S. schröederi na cinética de migração celular para o peritônio de camundongos inoculados com zimosan. Camundongos foram tratados com salina (SAL), fucana (FUC) na dose de 20mg/Kg i.v. ou dexametasona (DEXA) i.p. trinta minutos após injeção i.p. de zimosan (ZYM) (1 mg/ml) e sacrificados por deslocamento cervical nos períodos de 6, 24 e 48 horas após injeção de zimosan. Os controles receberam apenas solução salina 0,9% i.p. e i.v. A migração de células foi analisada através de lavado peritoneal e posterior contagem de células em câmara de Neubauer. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. * P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo que recebeu apenas salina i.v. e i.p.


A

B

Figura 4. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a cinética de migração de PMN e MN em modelo de peritonite aguda induzida por zimosan. Camundongos foram tratados com salina, fucana (FUC) na dose de 20mg/Kg i.v. ou dexametasona (DEXA) i.p. trinta minutos após injeção i.p. de zimosan (ZYM) (1 mg/ml) e sacrificados nos períodos de 6, 24 e 48 horas após injeção de zimosan. A contagem diferencial das células foi realizada a partir do lavado peritoneal, através da confecção de lâminas, seguida da coloração com Panótico comercial. Contagem de polimorfonucleares (PMN) peritoneais (A); Contagem de mononucleares (MN) peritoneais (B). * P < 0,05 quando comparado ao grupo tratado com salina i.v.


Os resultados encontrados mostram que os animais que receberam zimosan

i.p. e foram tratados apenas com solução salina 0,9% i.v. apresentaram um escore

de toxicidade média estatisticamente semelhante àqueles animais que foram

tratados i.v. com a fucana nas diferentes doses de 20, 10 e 5mg/kg (Figura 5). Outro

parâmetro avaliado foi a perda de peso, que foi acompanhada até 15 dias após a

inoculação de zimosan, tendo sido avaliada apenas a dose de 20 mg/kg da fucana,

uma vez que representa a maior dose administrada comparada às demais.

Observou-se que nas primeira 18 horas, onde foram analisados os parâmetros da

toxicidade, não houve diferença de peso entre os grupos estudados. Essa diferença

tornou-se evidente após 24 horas da inoculação do zimosan. Sendo assim, foi

observado que a fucana (20mg/Kg) atenuou de modo discreto, mas estatisticamente

significante, a perda de peso característica nesse modelo murino de choque não

séptico (Figura 6).

5.2.2. - Efeito de fucana de S. schroederii na migração celular para

cavidade peritoneal no modelo murino de choque não séptico induzido por

zimosan.

Uma vez observado os efeitos da fucana na toxicidade sistêmica e perda de

peso dos animais causada pela injeção de altas doses de zimosan, o próximo passo

foi avaliar o efeito da fucana na migração celular para cavidade peritoneal dos

animais no modelo de ZIGI. Pode ser observado na figura 7 que o tratamento com a

fucana promoveu uma diminuição no número de células presentes na cavidade

peritoneal quando comparado com os animais que receberam zimozan i.p. e salina

i.v.. Foi observado que tanto a dose de 20mg/Kg, como a de 10mg/Kg de fucana,

foram eficazes na redução da migração celular.


Figura 5. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a toxicidade média apresentada em camundongos submetidos ao choque não séptico induzido por zimosan. Os camundongos foram tratados com fucana na dose de 20, 10 e 5mg/Kg i.v. uma hora antes e seis horas após injeção i.p de zimosan e sacrificados 18 horas após injeção de zimosan (500mg/Kg). Os controles receberam apenas solução salina 0,9% i.v. A toxicidade média foi calculada baseada na presença dos parâmetros pêlo eriçado, prostração e diarréia, através da denotação subjetiva variando de 0 a 3 de acordo com a presença das características analisadas, 6 horas após a indução do choque não séptico. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. * P < 0,05 quando comparado ao grupo tratado com salina i.v.


Figura 6. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a perda de peso em camundongos submetidos ao choque não séptico induzido por zimosan. O choque não séptico foi induzido através da inoculação intraperitoneal de zimosan (500mg/Kg). Os camundongos foram tratados com fucana na dose de 20mg/Kg i.v. uma hora antes e seis horas após injeção i.p de zimosan. Os controles receberam apenas solução salina 0,9% i.v. A perda de peso foi acompanhada durante 15 dias após a indução do choque e calculada de acordo com a média aritmética do peso de cada grupo analisado por dia. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. * P < 0,05 quando comparado ao grupo tratado com salina i.v. ** P < 0,05 quando comparado ao controle positivo (ZYM).


Figura 7. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a migração celular para o peritôneo em camundongos submetidos ao choque não séptico induzido por zimosan. A migração de células foi analisada através de lavado peritoneal após 18 horas da indução do choque não séptico por zimosan (500mg/Kg) i.p.. Os camundongos foram tratados com fucana na dose de 20, 10 e 5mg/Kg i.v. uma hora antes e seis horas após injeção i.p de zimosan. Os controles receberam apenas solução salina 0,9% i.v. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. * P < 0,05 quando comparado ao grupo tratado com salina i.v., ** P < 0,05 comparado ao controle positivo. *** P < 0,05 comparado ao controle positivo.


5.2.3. - Efeito de fucana de S. schroederii sobre a concentração

de IL-6 no soro e no lavado peritoneal de camundongos submetidos ao choque

não séptico.

Tem sido mostrado que, nos animais submetidos ao choque não séptico, o

zimosan induz a secreção de TNF-, Interleucina (IL)-1 IL-8 e IL-6 por macrófagos

(BONDESON et al., 1999). No intuito de continuar investigando a atuação

antiinflamatória desse composto de origem marinha, o passo seguinte foi avaliar o

efeito do tratamento da fucana nos animais submetidos ao choque não séptico

quanto aos níveis séricos e no exsudato peritoneal de IL-6, obtido desses animais

em experimentação. Sendo assim, os resultados apresentados na figura 8 mostram

que o tratamento com a fucana, na dose de 10, mas não de 20 mg/kg, diminuiu de

modo significativo os níveis séricos de IL-6 (A), enquanto que em nível de exudato

peritoneal (B) se observa uma inibição discreta da produção dessa citocina apenas

com a dose de 20 mg/kg. Apesar dessa inibição ter sido discreta, ela foi

estatisticamente significante.

5.2.4. - Efeito de fucana de S. schroederii sobre o dano hepático

em modelo murino de choque não séptico induzido por zimosan.

O passo seguinte foi avaliar a função de órgãos comprometidos no modelo

murino em estudo, na tentativa de confirmar o papel protetor e antiinflamatório da

fucana de S. schroederii. A administração de zimosan resulta em alterações

significativas nos níveis plasmáticos de bilirrubina, fosfatase alcalina, alanina amino-

transferase (ALT) e aspartato amino-transferase (AST), demonstrando o

desenvolvimento de injúria hepatocelular (PAOLA et al., 2006). Assim, em

camundongos controles, a administração i.p de salina 0,9% não resultou em


nenhuma alteração significativa nos níveis séricos de AST (Figura 9A) e ALT (Figura

9B). Quando comparados com os animais controles, a administração de zimosan

resultou em um significativo aumento dos níveis séricos das transaminases, o que

nos leva a predizer o dano hepático consequente. O tratamento com a fucana nas

duas doses analisadas (20 e 10mg/Kg) diminuiu significativamente os níveis séricos

das transaminases avaliadas e conseqüentemente o dano hepático que pode ser

constatado através do estudo morfológico (Figura 10). Morfologicamente evidenciou-

se que os animais tratados com fucana exibiram discretas alterações nos

hepatócitos sem haver desorganização do parênquima hepático quando comparado

ao controle positivo. Essa proteção foi melhor evidenciada nos animais tratados com

a fucana na dose 10mg/Kg (Figura 10-G e 10-H). Já nos animais que receberam o

tratamento com a maior dose de fucana (20mg/Kg), observou-se uma menor

proteção à injúria hepática (Figura 10-E e 10-F). Tal efeito protetor pôde ser melhor

evidenciado quando comparado ao controle positivo (Figura 10-C e 10-D). Neste

controle, os espécimes de fígado exibiram extensas áreas de necrose confluentes,

hepatócitos exibindo degeneração em balão, picnose nuclear e fragmentação de

cromatina.


A

B

Figura 8. Efeito da fucana de S. schröederi sobre os níveis séricos e peritoneais de IL-6 em camundongos submetidos ao choque não séptico induzido por zimosan. . Camundongos BALB/c foram tratados com fucana na dose de 20, 10 e 5mg/Kg i.v. uma hora antes e seis horas após injeção i.p de zimosan. O soro e o lavado peritoneal foram obtidos 18 horas após a indução do choque e mensuradas as concentrações de IL-6 do soro e do exudato peritoneal por ELISA. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. * P < 0,05 quando comparado ao grupo com salina i.v.. ** P < 0,05 comparado ao controle positivo (ZYM) (A). * P < 0,05 quando comparado ao grupo com salina i.v. *** P < 0,05 comparado ao controle positivo. ** P < 0,05 comparado ao controle positivo. (B).

SORO

LAVADO PERITONEAL LAVADO PERITONEAL


A

B

Figura 9. Efeito da fucana de S. schröederi sobre os níveis séricos de enzimas hepáticas em camundongos submetidos ao choque não séptico induzido por zimosan. Camundongos BALB/c foram tratados com fucana nas doses de 20, 10 e 5mg/Kg i.v. uma hora antes e seis horas após injeção i.p de zimosan. A dosagem das enzimas hepáticas foi realizada no soro dos animais submetidos ao choque não séptico, obtido 18 horas após a inoculação do zimosan. AST (aspartato amino-transferase) / TGO (A); ALT (alanino amino-transferase) / TGP (B). Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. * P < 0,05 quando comparado ao grupo com salina i.v. ** P < 0,05 comparado ao controle positivo (ZYM).


Figura 10. Histologia do fígado de camundongos BALB/C submetidos ao modelo de choque não séptico induzido por zimosan, efeito da fucana da alga S. schroederi. A: Histologia do fígado do grupo controle, tratado apenas com salina, apresenta normalidade em todos os contituintes hepáticos. (H/E, 100x) B: Detalhe do parênquima hepático do grupo controle. (H/E, 200x) C: Fotomicrografia de fígado em animal que recebeu zimosan (500mg/Kg) evidenciando parênquima desorganizado e vários hepatócitos alterados com vacuolização citoplasmática, perda nuclear e picnose. (H/E, 100x) D: Detalhe de área periférica do fígado exibindo hepatócitos com diversas alterações irreversíveis: apoptose, degeneração balonizante. Áreas de extravasamento hemorrágico. (H/E, 200x) E: Histologia do fígado do grupo que recebeu fucana 20mg/Kg, detectando-se a presença de vasos congestos, desorganização parenquimatosa e hepatócitos com dano. (H/E, 100x) F: Detalhe das alterações dos hepatócitos: presença de picnose (cabeças de seta), vacuolizações citoplasmáticas (setas). Sinusóides congestos também podem ser evidenciados. (H/E, 200x). G: Histologia do fígado do grupo que recebeu fucana 10mg/Kg exibindo-se morfologicamente normal. (H/E, 100x) H: Detalhe dos hepatócitos exibindo discretas alterações compatíveis com áreas de regeneração. (H/E, 200x) VCB = veia centro lobular, EP = espaço porta, S = sinusóide. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo.

5.3. Avaliação do efeito da fucana extraída da alga parda

Spatoglossum schröederi em modelo experimental de colite induzida por

dextrana sulfato de sódio (DSS).

5.3.1. – Efeito do tratamento de camundongos BALB/c com a

fucana sobre a perda de peso no modelo de colite induzida por DSS.

Em seguida, procuramos investigar se a fucana teria efeito protetor não

apenas em modelos agudos de inflamação, como também em doenças crônicas e

de caráter autoimunes, como num modelo murino que mimetiza uma doença

inflamatória intestinal (DII) humana. Um modelo experimental que se assemelha à

DII, em camundongos, é a colite induzida por DSS (DIELEMAN et al., 1998). Os

resultados demonstraram que os animais submetidos à ingestão de água com

dextrana-sulfato de sódio tiveram uma significativa redução de peso (Figura 11),

quando comparados aos animais controles. Em contrapartida, os animais que foram

tratados com a fucana (20mg/Kg) tiveram uma atenuada perda de peso, e assim

esse composto sulfatado mostrou ter efeito protetor no modelo experimental

apresentado.


Figura 11. Efeito da fucana de S. schröederi sobre a perda de peso em camundongos submetidos à colite induzida por DSS. O acompanhamento da perda de peso corporal foi realizado durante 15 dias após o início da ingestão de DSS em água. Os animais foram pesados diariamente e foi calculada uma média aritmética de cada grupo por dia analisado. A colite foi induzida por dextrana-sulfato de sódio (DSS) em camundongos que ingeriram água durante 14 dias. Os animais foram tratados com fucana na dose de 20mg/Kg i.v. uma hora antes e a cada três dias alternados após a ingestão de DSS. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. * P < 0,05 comparado com o grupo tratado com salina 0,9% i.v. ** P < 0,05 quando comparado ao grupo controle positivo (DSS).


5.3.2. – Efeito de fucana sobre os níveis de citocinas obtidas em

sobrenadante de cultura de intestino no modelo murino de colite.

Com o intuito de continuar investigando a atividade da fucana no modelo de

colite, foi pesquisado o perfil de citocinas envolvidas no modelo experimental

abordado. Assim, foi analisada a produção de IFN- (citocina Th1), IL-4 (citocina

Th2) e IL-17 (citocina Th17) no intestino dos animais submetidos ao modelo de colite

induzida por DSS. Nos resultados encontrados, não foram detectados níveis

significativos de IL-4 nos sobrenadantes de cultura de intestino em nenhum dos

grupos estudados (Figura 12-A). Por outro lado, foram detectados níveis altos de

IFN- (Figura 12-B) e IL-17 (Figura 12-C) no sobrenadante de cultura do intestino

dos animais que receberam DSS na água de beber e foram tratados com salina i.v.

De modo interessante, os níveis dessas citocinas aparecem bastante reduzidos no

sobrenadante de cultura do intestino dos animais tratados com a fucana i.v, níveis

esses similares ao controle negativo.


A

B

C

Figura 12. Efeito da fucana de S. schröederi sobre os níveis de IL-4, IFN-e IL-17 em sobrenadante de cultura de intestino em camundongos submetidos à colite induzida por DSS. A colite foi induzida por dextrana-sulfato de sódio (DSS) em camundongos que ingeriram água durante 14 dias. Após remoção de partes do cólon no 15º dia de experimento, essas amostras foram lavadas com salina 0,9% estéril, distribuídas em placa de 24 poços e submetidas à incubação em câmara de CO2 durante 24 horas. Após esse período o sobrenadante da cultura foi colhido e congelado para posterior dosagem das citocinas por ELISA, de acordo com as instruções do kit

comercial da Ebioscience. IL-4 (A); IFN- (B); IL-17 (C). ND: Não detectado. Foram realizados 3 experimentos independentes. n = 5 animais/grupo. * P < 0,05 comparado ao grupo que ingeriu água+ DSS, tratado com salina 0,9% i.v.


5.3.3. – Atividade da fucana de S. schroederii sobre o dano

intestinal de camundongos submetidos ao modelo de colite induzido por

DSS.

Por fim, nos propomos a avaliar o efeito do tratamento dos animais com a

fucana sobre o dano tecidual ocasionado no intestino dos animais submetidos à

colite experimental. A fase aguda da colite induzida por DSS nos camundongos

BALB/c é caracterizada por lesões das criptas e inflamação secundária da mucosa e

submucosa, sendo mediada principalmente por neutrófilos e macrófagos produtores

de IL-6 e TNF-, onde a doença permanece localizada no cólon distal (DIELEMAN

et al., 1998). Nesse estudo foi observado que 14 dias de administração de DSS na

água que foi ingerida pelos camundongos resultou em uma inflamação aguda do

cólon (Figura 13 - C e D).

Os resultados obtidos demonstraram que o grupo controle que recebeu

apenas água apresentou uma morfologia de cólon normal (Figura 13 - A e B),

enquanto o grupo que recebeu DSS, na água de ingerir, apresentou intenso infiltrado

celular associado à formação de edema. Esse dano pode ser devido inicialmente à

DSS, que é tóxica para as células das criptas basais, causando uma completa

destruição (DIELEMAN et al., 1998), e em seguida favorecendo o recrutamento de

células inflamatórias ao foco da lesão. Sabe-se que os neutrófilos quando recrutados

podem causar danos teciduais, em diversas doenças. Sendo assim, podem

contribuir ativamente na lesão observada na colite. Nos resultados obtidos nesse

modelo estudado, os animais tratados com fucana apresentaram um reduzido

infiltrado celular e discreta formação de edema, quando comparado com o grupo não

tratado, resultando em um menor dano no cólon induzido por DSS (Figura 13 - E e

F).


Figura 13. Histologia do cólon de camundongos, em modelo de colite induzida por DSS 3% em camundongos BALB/C, avaliação do efeito da fucana da alga S. schroederi. A: Histologia do cólon do grupo controle, administrado apenas água, apresenta parênquima intestinal normal (H/E, 100x). B: Detalhe do parênquima intestinal do grupo controle (H/E, 200x). C: Fotomicrografia de intestino em animal que recebeu dextrana 3% na água de beber exibindo desorganização celular e destruição do parênquima, com presença de edema e infiltrado inflamatório mononuclear difuso (H/E,40x). D: Visão aproximada do infiltrado inflamatório mononuclear (H/E, 200x). E: Fotomicrografia de animal tratado com fucana exibindo escasso infiltrado inflamatório mononuclear de permio ao parêquima intestinal discretamente desorganizado (H/E, 100x). F: Detalhe da área acima do escasso infiltrado inflamatório mononuclear entre o parênquima no intestino tratado com a fucana (H/E, 200x).


6. DISCUSSÃO

Dentre os sinais cardinais da inflamação, o edema tem sido evidenciado como

primeiro sinal a surgir nesse processo (SUR et al., 2002). Nessa situação, os vasos

sanguíneos sofrem várias alterações que visam facilitar o movimento de proteínas

plasmáticas e células sanguíneas da circulação para o local da lesão ou da infecção.

Essas alterações são induzidas pela ação de vários mediadores, tais como

histamina, C5a, TNF, IL-1 e óxido nítrico, no músculo liso vascular; levando um

aumento no fluxo sanguíneo, seguida por um aumento da permeabilidade vascular

que leva ao extravasamento de líquido rico em proteína. O edema pode ser

consequência de diversas causas como obstrução linfática, insuficiência cardíaca e

mais comumente por patógenos causadores de enfermidades (FRACASSO, 2008).

Em estudos preliminares realizados em nosso laboratório, a fucana de S. schroederi

foi eficaz na redução do edema de orelha induzido por xilol em animais tratados

subcutaneamente e intravenosamente (ANDRADE et al, 2011). De tal modo, os

resultados obtidos nesse estudo (Figura 2) mostram que a fucana apresentou um

significante efeito na diminuição do exsudato peritoneal. Embora esse estudo não

tenha mostrado o mecanismo pelo qual a fucana está exercendo esse efeito, uma

possibilidade seria sua ação através da interferência com os mecanismos de

formação de fendas no endotélio venular que é geralmente reversível de curta

duração, conhecido como resposta imediata transitória; causados pela ligação de

mediadores químicos em seus receptores nas células endoteliais (FRACASSO,

2008) ou através da inibição da liberação de mediadores vasoativos presentes no

plasma ou produzidos por células teciduais (TEIXEIRA e HELLEWELL, 1997;

VILELLA et al., 2010) . Ainda pode ser descrita a função das prostaglandinas,


produtos da ação das enzimas ciclo-oxigenases (COX), na inflamação. Esses

produtos contribuem diretamente para a gênese dos quatro sinais cardinais de

Celsus (rubor, tumor, calor e dor). A PGE2 e PGI2, em conjunto com a PGD2 (o

metabólito principal da via da COX nos mastócitos), causam vasodilatação e

potenciam a formação de edema (COLLINS, 1999). Recentemente, um estudo

encontrou efeito anti-edematogênico de um polissacarídeo sulfatado da alga

marinha marrom Lobophora variegata, e nele afirmou-se que esse efeito parece

ocorrer via inibição da atividade das enzimas óxido-nítrico sintetase e ciclo-

oxigenase (SIQUEIRA et al., 2011). Os resultados seguintes demonstraram que a

fucana de S. scrhoederii apresentou efeito antimigratório representativo ao reduzir o

infiltrado celular do peritôneo dos animais tratados (Figura 3), sendo esse efeito

inibitório mantido durante a cinética (6, 24 e 48 horas) de peritonite aguda. Quando

analisada a contagem diferencial desse infiltrado celular – entre células

polimorfonucleares e mononucleares – a fucana foi capaz de diminuir a migração de

ambos os tipos celulares, o que também pode ser observado para a ação inibitória

da dexametasona (Figura 4).

Estudos preliminares realizados em nosso laboratório corroboram com os

aqui encontrados, pois demonstraram que a fucana de S. schroederi, administrada

subcutaneamente, foi capaz de reduzir significativamente o infiltrado na cavidade

peritoneal de animais submetidos à peritonite induzida por peptona, tioglicolato de

sódio e zimosan (ANDRADE et al., 2011). Portanto, tanto a administração

subcutânea, quanto a intravenosa, se mostra efetiva em controlar a migração celular

em modelo de peritonite induzida por zimosan. De fato, tem sido mostrado que

fucoidans de L. saccharina interferem com L e P-selectinas, e então promovem o

decréscimo da transmigração de PMN para a cavidade peritoneal e bloqueio da


indução de pertitonite aguda (USHAKOVA et al., 1999). Recentemente, outro

estudo, utilizando o mesmo modelo de peritonite aguda em ratos, explorou o efeito

de frações derivadas de L. saccharina na transmigração de PMN, onde se

demonstrou que ambas as frações polissacarídeas estudadas dessa alga inibiram o

influxo de PMN para a cavidade peritoneal dos ratos (CROCI et al., 2011).

Os polissacarídeos sulfatados por serem macromoléculas extremamente

ácidas, podem se ligar de forma inespecífica a qualquer domínio básico da

superfície de uma proteína em soluções com baixa força iônica, e o padrão de

sulfatação pode determinar diferentes afinidades desses polissacarídeos por

citocinas, fatores de crescimento e outras proteínas encontradas na superfície

celular e na matriz extracelular (MULLOY, 2005). Essas interações complexas entre

proteínas e carboidratos são capazes de influenciar a difusão de proteínas através

dos tecidos, bem como modelar a resposta celular a estas moléculas (MULLOY,

2005) e dessa forma contribuir para que esses compostos sulfatados possam

exercer diversas atividades biológicas (MCCAFFREY et al., 1992). Dessa forma, a

fucana foi capaz de diminuir a migração celular para o peritônio dos animais que

foram estimulados pelo zimosan, possivelmente ao interagir com receptores

celulares envolvidos no processo migratório de células do endotélio ao tecido alvo.

Assim, ao passo que o tráfico de leucócitos dos vasos sanguíneos até os sítios de

inflamação é um processo mútuo de cooperatividade envolvendo um rolamento

inicial de leucócitos no endotélio, mediado via família selectina de adesão molecular

(POCHECHUEVA et al., 2003), supõe-se que a fucana possa atuar como ligante de

L e P-selectinas (HEINZELMANN et al., 1998), e assim interferir com o rolamento

dessas células. No entanto novos estudos precisam ser realizados para se entender


o mecanismo pelo qual esse polissacarídeo está interferindo com a migração de

leucócitos para os sítios inflamatórios.

A partir dos resultados obtidos, o próximo passo foi investigar o efeito da

fucana em modelo de inflamação generalizada induzida por zimosan (ZIGI) – que

mimetiza MODS em humanos, uma vez que mesmo em período relativamente

prolongado na cinética de peritonite, a fucana conseguiu manter um efeito

antimigratório, similar aquele observado quando se usou uma droga antiinflamatória

de referência (dexametasona). Portanto, os dados apresentados no nosso estudo

mostraram que o tratamento com a fucana, no modelo de ZIGI, embora não tenha

apresentado redução da toxicidade média (Figura 5), atenuou a perda de peso

(Figura 6), diminuiu a migração celular para a cavidade peritoneal dos animais

estimulados com o zimosan (Figura 7), bem como causou redução nos níveis de IL-6

(Figura 8), AST e ALT (Figura 9) no soro dos animais; além de proteger os animais

do dano hepático (Figura 10). O que sugere que de uma maneira sistêmica, a fucana

exerceu efeito protetor em modelo de choque não séptico induzido por zimosan,

resultados esses inéditos na literatura quanto à ação de fucanas no modelo murino

em estudo.

O zimosan é uma preparação de parede celular de Saccharomyces

cerevisiae e tem sido usado a cerca de 50 anos em um modelo de estímulo

inflamatório e fagocítico, tanto in vivo quanto in vitro (DI CARLO e FIORE, 1958;

PILLEMER e ECKER, 1941). Quando injetado em animais, o zimosan ativa

macrófagos via receptor tipo Toll (TLR2) e induz inflamação por estimular uma larga

produção de mediadores inflamatórios como citocinas, componentes ativados do

sistema complemento, enzimas lisossomais e reativos do oxigênio. Em função dele

não ser degradado, a fagocitose por macrófagos resulta em uma prolongada


resposta inflamatória (VOLMAN et al., 2005), como observada no modelo de ZIGI.

Este agente indutor de inflamação é composto de -glucanas, mananas, quitinas, e

ativa diversos receptores de macrófagos, incluindo receptor de manose,

CD11b/CD18, TLR2 e dectina-1. Estes dois últimos receptores ativados,

sinergicamente, podem levar a um aumento da produção de TNF-, e atuar na

indução de IL-2, IL-10 e IL-6 (ROGERS et al., 2005).

Assim, possivelmente a fucana pode estar competindo antagonicamente com

alguns desses receptores, e dessa forma impedindo a transdução de sinais

estimulada pelo zimosan, impedindo sua ação como estímulo inflamatório no modelo

de choque não séptico.

Essas evidências sobre alguns receptores como ligantes de zimosan, podem

contribuir para explicar a redução dos níveis de IL-6 encontrados no soro de

camundongos tratados com fucana (10mg/Kg) (Figura 8 - A). Embora todas as

doses de fucana analisadas (20, 10 e 5mg/Kg) tenham causado uma diminuição

estatisticamente significante na dosagem de IL-6 no exsudato peritoneal, possa ser

que essa diminuição não tenha um efeito biológico relevante.

Como é possível então explicar esses achados? A primeira hipótese remete

(i) à ação da fucana como ligante de L e P-selectinas, como citado previamente, na

diminuição do recrutamento celular para o peritônio, o que ocasionaria - não

localmente devido ao excesso de mediadores inflamatórios produzidos - mas sim,

sistemicamente, uma redução de ativação de leucócitos e uma consequente

diminuição da produção de IL-6 no soro (Figura 8).

Ao passo que em um estudo revela-se que fucoidans inibem apoptose

induzida por ligantes do receptor de varredura SR-A em macrófagos, em cooperação


com o receptor tipo Toll 4 (TLR 4) (SEIMON et al., 2006), a segunda hipótese seria

que (ii) a fucana possivelmente também possa se ligar nesses tipos de receptores.

Assim, o comprometimento da ativação celular medeada por zimosan poderia

ocorrer através de uma possível ligação da fucana ao receptor TLR2 presente nos

fagócitos, já que o zimosan é seu principal ligante (SATO et al., 2003 ; KELLY et al.,

2008); além da possível habilidade em ligar-se aos receptores varredores

(scavenger) de macrófagos.

Essas suposições são reforçadas diante de estudos que reportam que o

fucoidan atua como ligante do SR-A, e induz a fosforilação de proteínas kinases,

atividade da proteína kinase C (PKC), e leva à secreção de citocinas inflamatórias

através de vias específicas de ativação (HSU et al., 1998; HSU et al., 2001). Além

disso, outro achado na literatura afirma que um dos mecanismos utilizados por

fucoidans nos processos inflamatórios ocorre através da inibição do acúmulo de

polimorfonucleares (PNMs) nos sítios inflamatórios, por interferência com a atividade

de ligação de receptores varredores (scavenger) de macrófagos (BEARTEAU e

MULLOY, 2003; USHAKOVA et al., 1999).

Uma terceira hipótese consiste na possibilidade (iii) da fucana ligar a outro

tipo de receptor para o zimosan, a dectina-1. Este receptor, uma lectina tipo C,

reconhece -glucanas presnetes no zimosan, sinaliza independentemente de TLR2,

levando a indução de IL-2 e IL-10 (ROGERS et al., 2005), assim como está

envolvido no aumento da produção de TNF-GANTNER et al., 2003; BROWN,

2003). No dano de órgãos induzido por zimosan, TNF- parece ter uma função

importante (VOLMAN et. al, 2005), e durante as primeiras 24 horas após a

administração de zimosan, os níveis plasmáticos de TNF- e IL-6 são encontrados

aumentados (JANSEN et al., 1996). Desse modo, a fucana hipoteticamente poderia


atuar como ligante de dectina-1 nos fagócitos, antagônico ao zimosan, interferindo

na produção de mediadores inflamatórios. De modo geral, a referida hipótese é que

a fucana possa estar ligando em um ou mais receptores celulares, impedindo a ação

inflamatória e o estímulo exercido pelo zimosan para a produção de IL-6.

Adicionalmente, no soro dos animais, apenas uma dose de fucana (10mg/Kg)

foi eficaz na redução dos níveis de IL-6 (Figura 8 - A), embora ao longo dos

resultados obtidos nesse estudo, até o presente momento as duas doses de fucana

(20 e 10mg/Kg) tenham apresentado uma resposta antiinflamatória equivalente. Em

um estudo, revela-se que a estimulação contínua de um receptor por um agonista

resulta em um estado de dessensibilização (também conhecido como

refratariedade). Neste estado o efeito obtido por exposição subsequente da mesma

concentração de droga é menor (GOZZANI, 1994). Diversos mecanismos podem ser

responsáveis por este fenômeno, tais como, alteração do receptor, sua destruição,

relocalização na célula (ROSSI et al., 1985). Assim, é possível que sistemicamente

esse polímero sulfatado possa apresentar esse fenômeno de refratariedade próximo

à dose da fucana de 20mg/Kg para o determinado receptor com o qual a fucana esta

ligando, não sendo observado efeito nos níveis séricos de IL-6 quando se usou essa

dose.

O dano hepático, por sua vez, pode ser mensurado através dos níveis das

enzimas hepáticas, onde os níveis séricos da aspartato amino-transferase (AST) e a

alanino amino-transferase (ALT) estão significativamente aumentados diante de uma

injúria hepática (HARGREAVES et al., 1961)..Assim, nos animais tratados com a

fucana nas duas doses (20 e 10mg/Kg) houve uma diminuição significativa nos

níveis séricos tanto da AST (Figura 9 - A), como da ALT (Figura 9 - B). A partir

desses resultados, pode-se sugerir mais uma vez a relação direta entre os níveis de


IL-6, bem como a liberação de outros mediadores inflamatórios, sobre o dano

hepático. A MODS causada por zimosan em animais caracteriza-se por mudanças

funcionais e estruturais no pulmão, intestino, rins e fígado (GORIS et al, 1991;.

DEMLING et al., 1994;. VAN BEBBER et al, 1989;. CUZZOCREA et al, 1997;.

DEITCH et al, 1990). De tal modo, os resultados obtidos (Figura 10) demonstraram

que houve significativa alteração histopatológica hepática indicativa do gradual

desenvolvimento da resposta inflamatória generalizada, com extensiva injúria

tecidual com pontos hemorrágicos, observados nos animais controles positivos,

estimulados com zimosan (Figura 10 – C e D). Contudo, os animais que receberam

tratamento com a fucana (10mg/Kg) obtiveram uma lesão hepática de menor

intensidade, demonstrando inclusive ausência de pontos hemorrágicos, e

integridade dos cordões de hepatócitos de uma maneira geral (Figura 10 – G e H)

quando comparados aos controles positivos; embora a fucana na dose mais alta

(20mg/Kg) não tenha apresentado efeito protetor similar. Esses dados mais uma vez

sugerem um efeito refratário dessa dose no tratamento dos animais submetidos ao

choque não-séptico. Assim, sabendo-se que até os dias atuais, o tratamento de

pacientes com sepse e choque séptico é feito por meio de antibióticos e fármacos

que atuam nas alterações cardiovasculares, não interferindo na resposta

inflamatória, essa pode ser uma das causas da alta mortalidade de pacientes com

choque séptico (FRACASSO, 2008), e o que torna a fucana supostamente um

potencial agente terapêutico, pelos mecanismos já discutidos acima.

Em seguida, uma vez que foi observado efeito protetor sobre essa síndrome

aguda, foi avaliada então a possível atuação da fucana em um modelo murino que

mimetiza uma doença inflamatória intestinal (DII), como a colite induzida por DSS.

Observou-se que nos animais tratados com a fucana, houve uma atenuação sobre a


perda de peso com significância estatística. Possivelmente, a ação da fucana sobre

o intestino ou sobre as células do sistema imune, impediu a agressão profunda da

mucosa que levou à desidratação e à dificuldade de absorção de nutrientes após

alimentação.

Para se comprovar esse efeito antiinflamatório, em seguida, procurou-se

analisar o efeito da fucana sobre o tipo de resposta imunológica apresentada na

colite induzida por DSS, através da produção local de citocinas, pela obtenção do

sobrenadante da cultura de intestino.

As citocinas desempenham um papel central na modulação do sistema imune

intestinal. Os níveis de muitas citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNF, IL-12, IL-6, IL-8)

e anti-inflamatórias (IL-4, IL-10, IL-1ra, IL-11) estão elevados em pacientes com

colite. A relação entre citocinas pró e antiinflamatórias é diminuída, levando a um

desequilíbrio, e ocasionando doenças inflamatórias do intestino (ROGLER, et al.,

2008). A expressão de citocinas tais como IL-6, IL-17 e IFN-, tem sido descritas por

participarem da patogênese da fase aguda no modelo de colite induzida por DSS

(ALEX et al., 2009).

Além disso, na doença inflamatória intestinal, ocorre um aumento dos níveis

de IL-1, TNF-, IL-6, IL-8, além de outras citocinas pró-inflamatórias, secretadas por

macrófagos, linfócitos e neutrófilos, cuja síntese é induzida pelo NF-kB, um fator de

transcrição envolvido na regulação de vários genes associados a inflamação

(ROGLER e ANDUS, 1998). As citocinas pró-inflamatórias são responsáveis por

determinar a natureza da resposta imune na colite ulcerativa, por estimular a rápida

síntese e secreção de mediadores inflamatórios, como as espécies reativas de

oxigênio, do nitrogênio, leucotrienos, fator de agregação plaquetária e

prostaglandinas (NEUMAN, 2007).


O IFN- e a IL-12 agem nas células T CD4+ induzindo sua diferenciação para

células T helper ou auxiliares do tipo 1 (Th1) secretoras de IFN-, enquanto o TGF-β

e a IL-6 promovem a diferenciação desse linfócitos para a subpopulação de células

Th17, que produzem IL-17 e expressam o receptor da IL-23 (IL23R). A IL-23

produzida pela ativação das células dendríticas sustenta a resposta Th17 e também

ativa células inatas, incluindo as células mielóides e células natural killer para

produzir citocinas inflamatórias, incluindo a IL-6, TNF-α e IL-17 que induz inflamação

intestinal. A IL-17 estimula a produção de citocinas pelos macrófagos ativados e

pode induzir à produção de citocinas e quimiocinas pelas células endoteliais,

levando ao recrutamento de neutrófilos (McGOVERN e POWRIE, 2007).

Dessa forma, os níveis reduzidos dessas citocinas que remetem a um padrão

de resposta Th1 (IFN-) e Th17 (IL-17) (Figura 12), demonstram que a fucana possa

influenciar a presença dessas populações celulares na resposta imune em nível de

mucosa, o que pode acarretar na visível reconstituição do parênquima intestinal

observado (Figura 13), uma vez que os padrões de resposta imune Th1 e Th17 tem

sido mostrados por serem importantes na patologia das DIIs (ALEX et al., 2009). De

modo interessante não se observou níveis detectáveis de IL-4 no sobrenadante das

culturas dos intestinos dos grupos em estudo (Figura 12 – A). Apesar da literatura

mostrar que pode haver produção de IL-4 nesse modelo (ALEX et al., 2009), nossos

dados corroboram com aqueles mostrados por Mechnga e colaboradores (2010),

onde não se observa produção dessa citocina em macerado do intestino após

desenvolvimento desse modelo de colite induzida por DSS. No entanto para se

entender melhor esse mecanismo de regulação, os níveis de citocinas regulatórias

como TGF- e IL-10, devem ser avaliados, bem como a presença no infiltrado


celular de células T regulatórias. Esses são alvos de estudos futuros do nosso

laboratório.

Uma vez determinado o perfil de citocinas no intestino no modelo de colite, o

próximo passo foi avaliar o dano intestinal ocasionado pela DSS, e a análise

histopatológica demonstrou efeito protetor da mucosa da fucana evidenciada nos

animais tratados, com redução visível do dano submetido à mucosa (Figura 13 - C).

Assim, pelos mecanismos já discutidos, a fucana pode estar atuando de

maneira protetora na colite, o que pode ser visualizado através da (i) redução da

perda de peso sofrida por estímulo da DSS, (ii) diminuição considerável nos níveis

de IFN- e IL-17 no sobrenadante de cultura intestinal, assim como no (iii) achado

histopatológico, onde nitidamente é observado a redução de infiltrado celular e a

manutenção da integridade dos componentes da mucosa, quando comparados aos

observados nos animais que ingeriram DSS apenas (Figura 13).

Dessa forma, de acordo com os resultados demonstrados, pode-se levantar

três hipóteses: que a fucana extraída da alga Spatoglossum schroederii possa atuar

na melhora do quadro da colite induzida por DSS (i) através da inibição da migração

celular, bem como (ii) na regulação do padrão de resposta imune de Th1 ou Th17

para um possível padrão T regulador ou (iii) ainda, hipoteticamente, através da

ligação direta em lectinas presentes na mucosa intestinal.

Lectinas são proteínas que têm afinidade por moléculas de carboidratos

específicos (ROOPASHREE et al., 2006) Elas se ligam às glicoproteínas no

revestimento intestinal e podem interromper o processo digestivo e de assimilação

de nutrientes (RANJEKAR et al., 2003). Lectinas são utilizados como um sistema

modelo para estudar as interações proteína-carboidrato, de tal modo a fucana de


acordo com sua natureza polissacarídea pode, eventualmente, atuar como uma

lectina revestindo a mucosa intestinal dos animais tratados, e assim levar à proteção

sobre o dano induzido na mucosa pela DSS - ou através dos mecanismos que

envolvem a ação dos componentes do sistema imunológico ou dessa possível ação

protetora direta.


7. CONCLUSÕES

7.1 – A fucana extraída da alga Spatoglossum schroederii, tratada

intravenosamente, foi capaz de reduzir a formação do exsudato peritoneal e inibir a

migração celular para a cavidade peritoneal de camundongos induzida por zimosan,

observada 6, 24 e 48 horas após o tratamento.

7.2 – No modelo murino que mimetiza a síndrome da disfunção múltipla de órgãos

em humanos, a fucana de S. schroederii, embora não tenha atuado na redução da

toxicidade sistêmica induzida por zimosan, foi capaz de atenuar a perda de peso,

assim como a migração celular para cavidade peritoneal; levou à diminuição da

concentração de IL-6 no soro e no exsudato peritoneal, bem como o dano hepático

ocasionado pelo choque não séptico, através dos níveis séricos das transaminases

hepáticas e análise histopatológica.

7.3 – Através do modelo de colite induzida por DSS, a fucana de S. schroederii foi

capaz de atenuar a perda de peso, reduzir os níveis de IFN- e IL-17 obtidas em

sobrenadante de cultura de intestino, além de reduzir o dano intestinal de

camundongos submetidos a essa patologia.

7.4 – De modo geral, pode-se concluir que de acordo com os resultados

apresentados, a fucana extraída da alga S. schroederii apresentou promissora

atividade imunofarmacológica, demonstrando assim significativa ação protetora anti-

inflamatória nos distintos modelos estudados, com perspectivas sobre sua possível

ação como fármaco terapêutico desde que novos estudos revelem o entendimento

do mecanismo de ação desse biopolímero sulfatado.


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