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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL LUCIANA ELOÍSA DA SILVA CASTRO NÓBREGA AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE EM LESÕES DE LÍQUEN PLANO ORAL E PÊNFIGO VULGAR. Natal/RN 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
LUCIANA ELOÍSA DA SILVA CASTRO NÓBREGA
AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE EM LESÕES DE LÍQUEN PLANO ORAL E
PÊNFIGO VULGAR.
Natal/RN
2014
Luciana Eloísa da Silva Castro Nóbrega
AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE EM LESÕES DE LÍQUEN PLANO ORAL E
PÊNFIGO VULGAR ORAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Patologia Oral do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte
dos requisitos para obtenção do título de Mestre em
Patologia Oral.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa
Natal/RN
2014
DEDICATÓRIA
A DEUS, que sempre me conforta em oração nos momentos mais angustiantes e me abençoa
todos os dias.
“Não cai uma lágrima de nossos olhos, não tem um suspiro em nossos corações sem uma
resposta de DEUS”. (Bv. João XXIII)
Aos meus queridos pais, irmãos e sobrinha por todo amor, dedicação e por nunca deixarem
de acreditar em mim até nos momentos que nem eu mesma acredito. Amo vocês!
Ao meu amor, agora meu marido, José Newton Filho, por me tornar uma mulher plena,
realizada e sempre me apoiar em qualquer circunstância. Eu amo você para sempre!
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor, Antônio de Lisboa Lopes Costa, meu orientador, por sempre se
mostrar interessado nas minhas dúvidas e incertezas, dando-me segurança e orientando-me no
intuito de mostrar-me o melhor caminho nessa batalha. Exemplo de amor e dedicação não só
para a Patologia Oral, mas para toda a Odontologia, abraçando toda causa em prol do pleno
funcionamento da Faculdade de Odontologia da UFRN, tornando esta uma das melhores
faculdades da área do Brasil. Esse, sim, sábio Mestre! Eu sou só orgulho e admiração!
A toda a minha família, que torce e vibra com cada conquista minha desde os meus
primeiros passos.
Aos meus queridos amigos, que sentiram minha falta nos momentos que tive que me
ausentar, porém sempre entenderam que isso era preciso, torcendo com afinco para a minha
felicidade e realização.
À coordenadora, Profa. Dr
a. Lélia Batista de Souza, por toda a sua dedicação,
conhecimentos a mim transmitidos e por coordenar tão brilhantemente o Programa de Pós-
Graduação em Patologia Oral da UFRN.
Ser mestre não é apenas lecionar, ensinar não é apenas transmitir o conteúdo
programático. Ser mestre é ser orientador, guia e companheiro, é caminhar com o aluno passo
a passo. É transmitir a este os segredos da caminhada. Ser mestre é ser exemplo de dedicação,
de doação, de dignidade pessoal e de amor. Eu posso afirmar, com muito orgulho, que durante
o Mestrado eu tive mestres assim, todos bastante preocupados em nos transmitir o máximo de
conhecimento possível, com a melhor qualidade, sem demonstrar desânimo, entendendo os
limites de cada um. E é por isso, meus mestres, Profa. Dr
a. Roseana de Almeida Freitas,
Profa. Dr
a. Hébel Cavalcanti Galvão, Prof
a. Dra. Lélia Batista de Souza, Prof
a. Dr
a. Lélia
Maria Guedes Queiroz, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Profa. Dr
a. Éricka Janine Dantas
da Silveira, Profa. Dr
a. Márcia Cristina da Costa Miguel, Prof
a. Dr
a. Ana Miryam Costa
de Medeiros, e Profa. Dr
a. Patrícia Teixeira, que devo todo o conhecimento adquirido no
Mestrado da Patologia Oral para vocês. O meu muito obrigada, hoje e sempre!
A todos os meus colegas do Doutorado do Programa da Pós-Graduação em Patologia
Oral da UFRN, principalmente Roseane Vasconcelos, que desde o princípio deu-me forças
não me deixando desistir do Mestrado em nenhum momento; seu carinho, espontaneidade e
amizade me foram essenciais nessa trajetória. A todas as Chuchus, Denise Hélen, Ana Luiza
Andrade, Natália Guimarães, Clarissa Demeda e Bárbara Monteiro, sempre tão dispostas
a ajudar e ensinar tantas coisas que para mim eram tão desconhecidas. Agradeço em especial
e com lágrimas nos olhos a minha querida turma de Mestrado: Alice Helena, que passou tão
pouco tempo conosco, mas nos mostrou que tudo era possível; Tiago João, por ser sempre
tão “atrevido” e com tanto amor em fazer sempre o melhor; Maria Luiza, por sua dedicação
inspiradora e contagiante; Luiz Eduardo, por ser sempre tão correto e perfeccionista;
Andreia Do Carmo, por ser tão doce, emotiva e ao mesmo tempo muito sábia; Marcelo
Nascimento, pela sua dignidade e hombridade; Thaís Maciel, por ser tão encantadora e
batalhadora, Thâmara Manoela, por nos fazer chorar de rir, como todo bom cearense,
mesmo nos piores momentos e Viviane Alves, que logo de cara me identifiquei, por ser
sempre tão doce e corajosa. Eu não tenho palavras para dizer o quanto sou grata por tudo que
passamos juntos, sempre apoiando um ao outro, nunca deixando que o outro desista... Foi
lindo! Sem vocês não teria graça alguma!
Aos meus queridos amigos, que sentiram minha falta nos momentos que tive que me
ausentar, porém sempre entenderam que isso era preciso, torcendo com afinco para a minha
felicidade e realização.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN,
Gracinha, Lourdinha, Idelzuite, Sandrinha, Ricardo, Hévio e Patrícia da Clínica de
Estomatologia, obrigada pela paciência e disponibilidade em ajudar.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelos
auxílios financeiros que possibilitaram a realização deste trabalho.
RESUMO
RESUMO
O Líquen Plano Oral e o Pênfigo Vulgar são doenças imunológicas crônicas
mucocutâneas de etiologias desconhecidas que podem acometer a mucosa oral. Tão
importante quanto em neoplasias o papel da angiogênese na patogenia das doenças
inflamatórias crônicas é de apreciável interesse, podendo ser considerado um marcador da
atividade da doença. Ademais, com o estudo do processo angiogênico nessas lesões tem-se a
possibilidade de aprimorar o entendimento do mecanismo patogênico nas mesmas. Este
trabalho se propôs a avaliar a atividade angiogênica através da expressão imunoistoquímica
do anticorpo anti-CD34, utilizando a técnica da MVC, em 26 casos de LPO reticulares, 14
casos de LPO erosivos, 18 casos de PV e em 15 casos de mucosa oral normal. Os resultados
deste experimento foram submetidos a testes estatístico não-paramétricos com nível de
significância de 5%. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o
número médio de vasos obtidos pela MVC nas lesões. Todavia, foi observado que a mediana
dos casos de líquen plano oral foi maior que no grupo de pênfigo vulgar, que por sua vez
revelou mediana maior que nos casos de mucosa oral normal (p=0,280). No tocante a
contagem microvascular de CD34 em relação à forma clínica dos líquens planos orais
(reticular e erosivo), verificou-se uma mediana ligeiramente maior para a forma clínica
erosiva. Apesar de os testes estatísticos utilizados não demonstrarem diferença significativa
(p=0,720). Ainda que os resultados do presente estudo não permitam a afirmação contundente
da participação do processo angiogênico na patogênese e progressão das lesões de líquen
plano oral e pênfigo vulgar, sugerimos que este processo está presente em ambas as lesões,
porém outros estudos devem ser realizados a fim de que essa hipótese seja fundamentada.
Palavras-chaves: Líquen plano oral. Pênfigo vulgar. Doenças autoimunes. Angiogênese.
CD34. Imunoistoquímica.
ABSTRACT
ABSTRACT
Oral lichen planus and pemphigus vulgaris are chronic diseases mucous membrane
immune of unknown aetiology that can be observed affecting to the oral mucous. A relevant
as regards neoplasies the role angiogenesis in the inflammatory chronic disease pathogenesis
as it provides a substancial interest can be considered as being an activity diseases marker;
besides being through specialised research of this angiogenic process to improve of
understanding pathogenic mechanism. This research proposes to assess angiogenic active
through of antibody immunohistochemistry expression antiCD34 antibody in 26 OLP of
reticular cases, 14 OLP erosives cases, 18 of PV cases and 15 specimens of normal oral
mucosa. The result was submitted non-parametric tests of 5% significance level. It is not
statistically significant correlacion was seen regarding between average vessels. However,
only be effectively observed the median of OLP cases was larger than pemphigus vulgaris in
fact proved average larger than oral normal mucosa (p=0,280). Regarding the microvascular
count of CD34 concerning clinic form oral lichen planus (reticular and erosion) increased
emphasis is more cross-border average for the form erosion clinic. Despite of the statistic tests
could not be more effective (p=0,720). Even though, the results of the research is not
sufficient to enable to consider of angiogenic process in the pathogenesis and lesions
progression of oral lichen planus and pemphigus vulgaris, we suggest this process is present
in both forms lesion, however, more studies must be made in the near future in order to
prepare a well-founded proposal.
Keywords: Oral lichen planus. Pemphigus vulgaris. Autoimmune diseases. Antigens CD34.
Angiogenesis. Immunohistochemistry.
LISTA DE
ILUSTRAÇÕES
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 - Especificação, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação
do anticorpo primário utilizado................................................................ 37
Gráfico 1 - Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão analisada.
Natal/RN................................................................................................... 40
Gráfico 2 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com o tipo de
lesão avaliada. Natal/RN, 2014................................................................ 42
Gráfico 3 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com a forma
clínica de líquen plano oral. Natal/RN, 2014........................................... 43
Figura 1 - Fotomicrografia do espécime de LPO exibindo hiperparaceratinização,
epitélio de revestimento atrófico, áreas de perda de nitidez da camada
basal, projeções epiteliais e infiltrado inflamatório linfocítico
subepitelial (H/E, 200X)........................................................................... 44
Figura 2 - Fotomicrografia do espécime de PV exibindo separação intraepitelial,
acima da camada de células basais do epitélio, acantólise, células de
Tzanck e um infiltrado leve de células inflamatórias crônicas no tecido
conjuntivo (H/E, 200X)............................................................................ 44
Figura 3 - LPO Reticular. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos
sanguíneos e células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X)..................... 45
Figura 4 - LPO Reticular. Marcação imunoistoquímica para o anticorpo anti-
CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais em meio ao infiltrado
inflamatório linfocítico (LSAB, 100X).................................................... 45
Figura 5 - LPO Erosivo. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do
anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados (LSAB,
100X)......................................................................................................... 46
Figura 6 - LPO Erosivo. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em
múltiplos vasos sanguíneos (LSAB, 100X).............................................. 46
Figura 7 - Pênfigo Vulgar. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação
do anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados e em
células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X)........................................... 47
Figura 8 - Pênfigo Vulgar. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos
sanguíneos e células endoteliais na lâmina própria principalmente em
região justaepitelial (LSAB, 100X)........................................................... 47
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular do
CD34 de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal/RN, 2014............... 41
Tabela 2 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e
significância estatística para a contagem microvascular entre as lesões
de LPO, PV e os espécimes de MON. Natal/RN, 2014............................ 42
Tabela 3 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos,
estatística U e significância estatística para a contagem microvascular
entre os tipos de lesões de líquen plano oral.Natal/RN,2014.................... 43
LISTA DE
ABREVIATURAS
LISTA DE ABREVIATURAS
APC Antigen-Presenting Cell – Célula Apresentadora de Antígeno
CD Cluster of Diferentiation – Unidade de Diferenciação
CD62L L-Selectina
CD62E E-Selectina
CD62P P-Selectina
Dsg Desmogleína
ELAM-1 Molécula de Adesão doTipo 1
FvW Fator de Von Willebrand
GlyCAM-1 Molécula de Adesão do Tipo 1 que contém Glicano
H/E Hematoxilina e Eosina
HEV Vênula Especializada de Endotélio Alto
HIV Human Immunodeficiency Virus – Vírus da Imunodeficiência Humana
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
INF-γ Interferon gama
KDa Kilodalton
LP Líquen Plano
LPO Líquen Plano Oral
MDV Microvessel Density - Microdensidade Vascular
MHC Major Histocompatibility Complex – Complexo Principal de
Histocompatibilidade
MMP Matrix Metalloproteinases – Metaloproteinanses da Matriz
mRNA Menseger Ribonucleic Acid – Ácido Ribonucleico Mensageiro
MVC Microvessel Count – Contagmem Microvascular
MVV Microvessel Volume – Volume Microvascular
OMS Organização Mundial da Saúde
P53 Proteína 53
PV Pênfigo Vulgar
RL Reação Liquenóide
Th T Helper – Células T Auxiliares
TGF-β Transforming Growth Factor beta – Fator Transformador do
Crescimento beta
TGFβ-RI Receptor I para o Fator Transformador do Crescimento beta
TGFβ-RII Receptor II para o Fator Transformador do Crescimento beta
TNF-α Tumor Necrosis Factor alfa – Fator de Necrose Tumoral alfa
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor – Fator de Crescimento Endotelial
SUMÁRIO
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 14
2.1 LÍQUEN PLANO ORAL...................................................................................... 14
2.1.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia............................... 14
2.2 PÊNFIGO VULGAR............................................................................................ 19
2.2.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia............................... 19
2.3 ANGIOGÊNESE................................................................................................... 23
2.3.1 Considerações Gerais........................................................................................... 23
2.3.2 Mensuração da Angiogênese................................................................................ 24
2.3.3 O Processo Angiogênico nas Lesões Crônicas Inflamatórias (Líquen Plano
Oral e Pênfigo Vulgar)......................................................................................... 26
2.4 BIOMARCADOR ANGIOGÊNICO – CD34..................................................... 28
3 PROPOSIÇÃO..................................................................................................... 31
4 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 33
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS............................................................................... 33
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO................................................................... 33
4.3 POPULAÇÃO........................................................................................................ 33
4.4 AMOSTRA............................................................................................................ 33
4.4.1 Critérios para seleção da amostra....................................................................... 34
4.4.2 Caracterização da amostra.................................................................................. 34
4.5 ESTUDO CLÍNICO E MORFOLÓGICO........................................................... 35
4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO...................................................................... 35
4.6.1 Método Imunoistoquímico................................................................................... 35
4.6.2 Análise do Perfil Imunoistoquímico.................................................................... 37
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................... 38
5 RESULTADOS..................................................................................................... 40
5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS..................................................................... 40
5.2 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS.......................................................... 41
5.2.1 Análise Quantitativa da Marcação Imunoistoquímica pelo anticorpo anti-
CD34.......................................................................................................................
41
41
5.2.2 Análise Estatística da Contagem de Microvasos Marcados pelo Anticorpo
Anti-CD34.............................................................................................................. 42
6 DISCUSSÃO.......................................................................................................... 49
7 CONCLUSÕES...................................................................................................... 57
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 59
APNEXOS................................................................................................................. 70
APÊNDICE............................................................................................................. 74
INTRODUÇÃO
11
1 INTRODUÇÃO
O Líquen Plano Oral é uma doença imunológica crônica mucocutânea, de etiologia
desconhecida e mediada por células T inflamatórias a qual apresenta uma vasta gama de
manifestações clínicas, afetando comumente o epitélio escamoso estratificado. Trata-se da
doença não infecciosa mais comum da mucosa oral e atinge 1 a 2% da população adulta
acima de 40 anos de idade, embora adultos jovens e crianças possam desenvolver a doença
(SOUSA; ROSA, 2008).
O pênfigo é uma doença autoimune individualizada pela formação de bolhas em pele
ou em mucosas, que pode ser subclassificado em seis tipos: vulgar, vegetante, eritematoso,
foliáceo, paraneoplásico e o IgA pênfigo. O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de
pênfigo, tratando-se de uma doença crônica mucocutânea autoimune de etiologia
desconhecida que inicialmente se manifesta na forma de lesões intraorais, as quais se
dispersam para outras membranas mucosas e pele. Essa doença é caracterizada por uma
formação de bolhas ou vesículas de diâmetros variáveis que uma vez rompidas originam
erosões superficiais irregulares de sintomatologia dolorosa, as quais logo são recobertas por
um tipo de pseudomembrana e circundadas por um eritema difuso (AMORMINO;
BARBOSA, 2010). É uma doença rara, a qual acomete apenas de 1 a 5 pacientes por
milhão/ano (NEVILLE et al., 2009); e dentre as pessoas afetadas a maioria são mulheres
adultas com idade entre 40 a 60 anos. As lesões do PV podem incidir qualquer sítio da
cavidade oral, sendo que os mais comumente afetados são palato, mucosa jugal e lábios. O
diagnóstico é geralmente baseado nas manifestações orais, entretanto é raro o paciente relatar
a presença de bolhas ou vesículas intraorais devido à rápida ruptura do teto fino e friável das
bolhas. Por isso a confirmação é fornecida por achados histológicos que mostram a presença
de bolhas intraepiteliais, acantólise e células de Tzanck (DAGISTAN et al., 2008; NEVILLE
et al., 2009; TAMGADGE et al., 2011).
A angiogênese consiste no crescimento de novos vasos a partir de uma rede vascular
pré-existente, a qual desenvolve um importante papel na progressão do tumor fornecendo
nutrientes e fatores de crescimento (MENAKURU et al., 2008; SCARDINA et al., 2009). No
líquen plano oral, a angiogênese ocorre provavelmente como uma reação ao efeito da hipóxia
na região estromal, onde a reação flogógera ocorre devido ao aumento dos linfócitos
proliferantes dessa lesão (SCARDINA et al., 2009). Por outro lado, até os dias atuais, nenhum
dado existe a respeito da avaliação da angiogênese no pênfigo vulgar, porém alguns estudos
relatam sobre o tratamento dessas lesões usando a Talidomida, uma droga com importantes
12
efeitos anti-angiogênicos comprovados, apesar de se desconhecer por quais mecanismos a
Talidomida inibe esse processo.
Um das técnicas mais utilizados para se observar a angiogênese é a contagem
microvascular (MVC), uma importante ferramenta para quantificar esse processo a qual
possui importante potencial para ser usado como um marcador de prognóstico, sendo avaliada
quando se lança mão de marcadores de células pan-endoteliais, como o anti-CD34.
Destarte, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a angiogênese através da expressão
imunoistoquímica do anticorpo monoclonal anti-CD34 em uma série de casos previamente
selecionados de líquen plano oral e pênfigo vulgar na tentativa de melhor compreender o
papel da angiogênese tanto na patogênese quanto na progressão e autoperpetuação dessas
doenças autoimunes crônicas inflamatórias.
13
REVISÃO DE LITERATURA
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LÍQUEN PLANO ORAL
2.1.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia
O líquen plano oral é uma doença mucocutânea crônica autoimune, relativamente
comum, com prevalências relatadas que variam de 0,5 a 4% (SURGERMAN et al., 2002;
EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007). É mais comumente observada em pessoas de
meia idade, com picos de prevalência entre a quinta e sexta décadas de vida. Além disso,
ressalta-se uma forte predileção para o sexo feminino (CARBONE et al., 2009; CARROZZO,
THORPE, 2009; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; EBRAHIMI; NYLANDER; VAN
DER WAAL, 2011). Também pode ser observado em crianças, embora seja raro
(LAEIJENDECKER et al., 2005)
Além da mucosa oral, o líquen plano pode acometer pele, mucosa genital, unhas e
couro cabeludo (SURGERMAN et al., 2002). Na maioria dos casos, o LP cutâneo é auto-
limitado e causa prurido, sendo as lesões descritas como pápulas pruriginosas arroxeadas e
poligonais, as quais são normalmente encontradas nas superfícies flexoras das extremidades
(EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007; ANURADHA et al., 2008; CARBONE et al.,
2009). No couro cabeludo pode provocar áreas de alopecia e nas unhas podem produzir o
adelgaçamento e separação das mesmas (SCULLY; CARROZZO, 2008). O envolvimento da
mucosa oral pelo LP é muito comum, podendo ser tanto uma região de apresentação inicial
dessa desordem bem como o único local de acometimento (JAAFARI-ASHKAVANDI et al.,
2011; ANURADHA et al., 2011).
Existem seis formas de apresentação clínica do LPO descritas na literatura, as lesões
brancas: reticular, em placa e papular; e as lesões vermelhas: atrófico, erosivo e bolhoso.
Algumas variantes podem co-existir em um mesmo paciente. Sensação de queimação e
usualmente dor podem acompanhar as lesões de LPO do tipo erosivo, atrófico e bolhoso,
enquanto que a forma reticular é geralmente assintomática e os portadores podem nem
perceber a presença das lesões (ANDREANSEN, 1968).
O tipo mais comum de LPO é a de padrão reticular, podendo se apresentar como
pápulas, placas e com um rendilhado entrelaçado de linhas ceratóticas conhecidas como
“estrias de Wickham”, as quais se apresentam tipicamente simétricas e bilaterais. Qualquer
sítio da mucosa oral pode ser afetado por esse tipo de LPO, embora seja mais frequentemente
15
encontrado na mucosa jugal (EINSEN, 2002; INGAFOU et al., 2006; KALMAR, 2007). A
forma erosiva ainda que não seja tão comum quanto a reticular, é mais incômoda para o
paciente, pois as lesões são comumente sintomáticas. De forma geral, são difusas,
avermelhadas que exibem estrias ceratóticas esbranquiçadas circundando-as. Essas estrias
irradiam perifericamente e são usualmente evidentes nas margens das zonas atróficas da lesão
(KALMAR, 2007; ANURADHA et al., 2008). Algumas vezes, a atrofia e a ulceração estão
confinadas à mucosa gengival, produzindo um padrão de reação chamado “gengivite
descamativa”. Todavia, em alguns casos, se o componente erosivo for muito intenso, poderá
haver separação do epitélio, resultando em uma forma relativamente rara da doença,
conhecida como líquen plano bolhoso (EDWARDS; KELSCH, 2002, NEVILLE et al., 2009).
As lesões de LPO atrófico podem apresentar-se como uma mistura de subtipos clínicos
de líquen plano. Alternativamente, uma área central de ulceração pode exibir sua superfície
coberta por um exudato firinopurulento, circundado por uma área de eritema (SILVERMAN;
GORSKY; LOZADA-NUR, 1985).
O LPO também pode ocorrer sob a forma de placas esbranquiçadas que se assemelham
a leucoplasia oral, cujo aspecto pode variar de ligeiramente elevadas e suaves a levemente
irregulares e multifocais. As lesões do tipo placa abrangem apenas 7% dos casos e são mais
comuns em fumantes. Além disso, semelhante ao tipo reticular, geralmente é assintomático
(ANURADHA et al., 2008). As lesões do tipo papular se apresentam como pequenas pápulas
brancas (0,5mm a 1mm) com finas estriações na periferia da lesão e usualmente coexistem
com outras lesões de líquen plano. É bastante raro e não é difícil de ser negligenciado no
exame clínico devido ao pequeno tamanho da lesão (BRICKER, 1994).
Geralmente as lesões de líquen plano podem acometer qualquer região da cavidade
oral, mas a mucosa jugal posterior é o local mais comum de acometimento, seguido pelas
bordas laterais da língua, gengiva, mucosa labial e vermelhão do lábio inferior, apresentando-
se como lesões bilaterais, simétricas ou múltiplas. São raras as lesões no palato, lábio superior
e assoalho bucal (CARROZZO; THORPE, 2009; ROOPASHREE, et al., 2010; EBRAHIMI;
NYLANDER; VAN DER WAAL, 2011).
As lesões de LPO persistem por muitos anos com períodos de exacerbação e
quiescência. Durante o período de exacerbação a área de eritema e erosão aumentam, com
concomitante aumento de dor e sensibilidade. Já no período de quiescência a área de eritema e
ulceração diminuem e, consequentemente a dor e a sensibilidade também. A exacerbação do
líquen plano tem sido associada a períodos de estresses psicológicos, ansiedade e trauma
mecânico (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007).
16
Os aspectos clínicos característicos do líquen plano oral são, na maioria das vezes,
suficientes para o diagnóstico correto da doença. Em lesões clássicas é possível fazer o
diagnóstico baseado apenas nas características clínicas (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007).
Ainda assim, a biópsia associada ao exame histopatológico é recomendada para confirmar o
diagnóstico clínico e, principalmente, para excluir a presença de atipias epiteliais ou mesmo
indícios de malignidade (EISEN et al., 2005).
Dentre as desordens que podem se assemelhar tanto clínica quanto histologicamente às
lesões de LPO se destacam as reações liquenóides (RL), porém estas reações possuem uma
etiologia identificável. Usualmente, ocorrem em regiões da mucosa oral que se encontra em
íntimo contato com restaurações de amálgama, restaurações de resina ou próteses dentárias.
As RL provavelmente sejam o resultado da hipersensibilidade de contato da mucosa oral com
esses materiais dentários (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007). Além disso, exposição sistêmica
a algumas drogas também podem resultar em lesões de RL. Dentre as drogas mais comumente
associadas com o surgimento de tais reações destacam-se anti-hipertensivos, anti-
inflamatórios não-esteroidais e anti-retrovirais utilizados na terapia do HIV. Certos tipos de
alimentos como a canela também podem provocar lesões semelhantes às reações liquenóides,
porém com aspectos histopatológicos que podem auxiliar a diferenciar do LPO, como a
presença de um infiltrado inflamatório mais profundo e perivascular. Na maioria das vezes a
causa das lesões de RL não pode ser identificada, desse modo o diagnóstico de exclusão
dessas lesões é considerado “líquen plano oral de causa idiopática” (SUGERMAN et al.,
2002). Diferentemente do LPO, a maioria das reações liquenóides regridem após a remoção
do agente causador (AL-HASHIMI et al., 2007; SCULLY; CARROZZO, 2008;
SCHLOSSER, 2010; MÜLLER, 2011).
Atualmente a precisa etiologia do líquen plano oral ainda é incerta. Sabe-se que o
estresse é amplamente conhecido por ser um importante fator etiológico para o LPO, porém
outros estudos devem ainda ser feitos para comprovar essa hipótese. Ainda não foi
determinado se alterações psicológicas observadas em paciente com LPO são fatores
etiológicos diretos ou se representam apenas uma consequência do desconforto crônico
causado pelas lesões do LPO nesses pacientes. Por si só, este desconforto pode ser o causador
do estresse e, parcialmente explicar essa associação. Entretanto, observa-se notadamente que
pacientes portadores de LPO apresentam tendência a depressão (CARROZZO; THORPE,
2009).
Muitos estudos suportam a evidência do importante papel da desregulação
imunológica na etiopatogenia do líquen plano oral, especificamente envolvendo a parte
17
celular do sistema imune. Além disso, sabe-se que ambos os mecanismos antígenos
específicos e não específicos estão envolvidos no LPO. Estes mecanismos associados
levariam então ao acúmulo de linfócitos T na lâmina própria subjacente ao epitélio,
rompimento da membrana basal, migração de linfócitos T intra-epitelial e apoptose dos
ceratinócitos, achados característicos do líquen plano (SUGERMAN et al., 2002).
A resposta imune específica para o antígeno desconhecido que desencadeia a resposta
imune do LPO consiste em três passos: (1) a migração dos linfócitos citotóxicos TCD8+ para
o epitélio; (2) a apresentação de antígenos pelos ceratinócitos basais e, (3) a ativação destes
linfócitos, que uma vez ativados, destroem os ceratinócitos basais (SUGERMAN et al., 2002;
ROOPASHREE et al., 2010).
As células basais são os principais alvos de destruição no LPO e o mecanismo do dano
causado está relacionado ao processo imune mediado por células, que envolve as células de
Langerhans, linfócitos T e macrófagos (ANURADHA et al., 2008). É bem evidente a
presença de um infiltrado epitelial de células TCD8+ citotóxicas próximos aos ceratinócitos
basais apoptóticos e um infiltrado de células TCD4+ na lâmina própria. Contudo, o fator
desencadeante da apoptose e o mecanismo destas respostas imunes ainda permanecem
desconhecidos. Sugere-se que os linfócitos TCD8+
presentes nas lesões de LPO podem ser
ativados por um antígeno presente nos ceratinócitos basais associados ao MHC de classe I,
consequentemente promovendo a apoptose dos ceratinócitos (FAHRI; DUPIN, 2010).
As células de Langerhans e os ceratinócitos basais podem apresentar um antígeno
associado ao MHC de classe II para as células TCD4+
auxiliares, que secretam IL-2 e INF-γ, e
a produção local de INF-γ pode manter a expressão do MHC de classe II pelos ceratinócitos,
contribuindo assim para a cronicidade do LPO. Além disso, a expressão antigênica, a co-
expressão de CD40 e CD80 e a secreção de IL-12 pelas células que apresentam antígeno
(APC’s) via MHC de classe II aos linfócitos TCD4+, podem produzir uma resposta TCD4
+
do tipo Th1, com produção de IL-2 e INF-γ (LODI et al., 2005).
As quimiocinas, a degranulação de mastócitos, a ativação das metaloproteinases de
matriz (MMP’s) e a perda da integridade da membrana basal epitelial são mecanismos não
específicos na patogenia do LPO (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010). As
quimiocinas são citocinas pró-inflamatórias produzidas por várias células, incluindo
mastócitos, linfócitos ativados e ceratinócitos basais. Acredita-se que as quimiocinas
secretadas pelas células epiteliais lesionais do LPO possam atrair mastócitos e,
subsequentemente, estimular sua degranulação. Os mastócitos degranulados liberam TNF-α e
quimase, que regulam positivamente a secreção de quimiocinas pelos linfócitos T lesionais do
18
LPO. Esse mecanismo cíclico seria mais uma explicação para a cronicidade do LPO. Além
disso, a quimase, que é uma protease dos mastócitos, é uma conhecida ativadora de MMP’s
(SUGERMAN et al., 2002; ZHAO et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010).
MMP’s atuam produzindo a degradação proteolítica dos componentes da matriz
extracelular do tecido conjuntivo e induzindo a perda da integridade da membrana basal,
encontrada nas lesões de LPO. A perda desta integridade favorece a morte dos ceratinócitos,
que em situação de normalidade, secretam colágeno IV e V, que são essenciais para a
manutenção da integridade da membrana basal. Por sua vez, a membrana basal íntegra envia
sinais de sobrevivência para os ceratinócitos. Portanto, a membrana basal íntegra é necessária
para a sobrevivência dos ceratinócitos e os ceratinócitos são essenciais para a produção
normal da membrana basal íntegra (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010).
Apesar de o líquen plano oral ter sido considerado pela Organização Mundial da Saúde
(OMS) como uma condição cancerizável, esse assunto ainda suscita inúmeras discussões. O
potencial maligno das lesões de líquen plano oral ainda permanece controverso e diferentes
grupos têm apresentado distintas abordagens e interpretações (MITTAL; SHANKARI;
PALASKAR et al., 2012). Sousa et al. (2005) concordam com Eisenberg e Krutchkoff (1992),
os quais apontaram para o fato de que muitas das lesões diagnosticadas como LPO seriam na
verdade displasias liquenóides, lesões essas de caráter eminentemente pré-maligno. Por outro
lado, Tanda et al. (2000) observaram uma hiperexpressão da proteína p53 no LPO, fato
confirmado por Valente et al. (2001), que relacionaram essa ocorrência a um risco maior de
malignização, uma vez que esse aumento da expressão do p53, via de regra, significa
alteração na sua atividade.
A transformação maligna em casos de LPO é relatada ocorrer em 0,3 a 3% dos casos
sendo mais comum em casos de líquen plano erosivo. Assim o aumento da MDV nos casos de
LPO erosivo quando comparado com os casos de LPO reticular pode ser sugerido como um
dos fatores que contribuem para o alto potencial de malignidade nas lesões erosivas
(MITTAL; SHANKARI; PALASKAR, 2012).
Em um estudo retrospectivo no qual foi avaliado a transformação maligna em 23 casos
de LPO realizado por Fang e colaboradores (2009), observou-se que os sintomas mais
frequentemente encontrados eram a erosão e a dor, concordando com a literatura (VOUTE et
al., 1992; MARKOPOULOS et al., 1997; RAJENTHERAN et al., 1999; SILVERMAN,
BAHL, 1997; LANFRANCHI-TIZEIRA; AGUAS; SANO, 2003). Sendo a dor severa uma
consequência da erosão. Tendo em vista esse e outros estudos que observam a transformação
maligna nessas lesões, acredita-se que as lesões de LPO que têm uma maior tendência de
19
sofrer transformação maligna são as do tipo erosivas. Isso é justificado pelo fato de que as
formas erosivas deixam a mucosa com uma maior predisposição para sofrer danos por agentes
carcinogênicos (VAN DER MEIJ; SHEPMAN; VAN DER WAAL, 2003).
2.2 PÊNFIGO VULGAR
2.2.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia
O pênfigo é a designação de um conjunto de entidades patológicas de etiologia
autoimune, de incidência rara, caracterizada pela formação de bolhas intraepiteliais na pele e
em mucosas (nariz, conjuntiva, genitálias, esôfago, faringe e laringe), sendo encontrada
principalmente em pessoas de meia idade e idosos (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005).
O epitélio é uma estrutura complexa fazendo-se necessária a presença de uma grande
quantidade de moléculas a fim de manter a sua integridade e saúde. O epitélio oral consiste
essencialmente em ceratinócitos aderidos uns aos outros por desmossomos e, através de
hemidesmossomos estes se aderem à membrana basal epitelial, que também está aderida à
lâmina própria subjacente. Desmossomos são proteínas de adesão que funcionam tanto quanto
um complexo adesivo como também um sítio de ligação à superfície celular para os
filamentos intermediários de queratina do citoesqueleto (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY,
2005). No pênfigo, os desmossomos são danificados por anticorpos dirigidos contra os
domínios extracelulares das moléculas de adesão celular epitelial do tipo caderina – as
desmogleínas (Dsg) provocando depósitos imunes intraepiteliais e perda do contato célula-
célula (acantólise), levando a formação de bolhas intraepiteliais (NISHIKAWA et al., 1996).
O epitélio oral é muito semelhante à pele, mas difere em alguns aspectos como na
constituição dos componentes desmossomais. As moléculas de adesão do tipo caderina Dsg1
e Dsg3 são ambas expressas na pele, porém, no epitélio oral apenas a Dsg3 é expressa
(SHIRAKATA et al., 1998). O dano à área intercelular leva à acantólise, que embora típica do
pênfigo pode ser observada em outras condições como na doença de Darier, dermatose
acantolítica transiente, disqueratoma warty, impetigo, em infecções virais e no carcinoma.
Existem diferentes variantes do pênfigo descritas na literatura, apresentando distintos
perfis de autoanticorpos e manifestações clínicas. Os quatro tipos principais são: foliáceo,
eritematoso, vulgar e vegetante (NEVILLE et al., 2009; CAMACHO-ALONSO; LÓPEZ-
JORNET; BERMEJO-FENOLL, 2005; BLACK; MIGNAGNA; SCULLY 2005), além dos
tipos paraneoplásico e IgA pênfigo (TAMGADGE et al., 2011). Usualmente o indivíduo
20
desenvolve uma única variante do pênfigo, embora casos tenham sido descritos de transição
para outra variante (ISHII et al., 2000), além de casos em que as manifestações clínicas de
uma única variante poder mudar ao longo do tempo (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY,
2005). Esta mudança pode estar relacionada às alterações nas proporções dos autoanticorpos
contra as desmogleínas 1 e 3 (HARMAN et al., 2001).
O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de pênfigo. Entretanto, sua ocorrência é
rara, com incidência estimada na população geral de um a cinco casos por milhão de pessoas
diagnosticadas a cada ano (ROBINSON; LOZADA-NUR; FRIEDEN, 1997). Este tipo ocorre
raramente antes da terceira década de vida, sendo a média de idade no momento do
diagnóstico de 50 anos, embora casos raros possam ser vistos na infância. Afeta ambos os
sexos igualmente, ainda que alguns autores tenham reportado uma maior prevalência em
mulheres. O PV é a forma de pênfigo que afeta com maior frequência a mucosa oral, e na
maioria dos casos as lesões orais precedem as manifestações cutâneas. O curso é crônico e o
envolvimento sistêmico pode ocorrer se o tratamento adequado não for fornecido
(CAMACHO-ALONSO; L[OPEZ-JORNET; BERMEJO-FENOLL, 2005).
Embora a etiologia do pênfigo vulgar ainda não esteja esclarecida, sabe-se que um
mecanismo autoimune com o envolvimento de autoanticorpos pode alterar as junções
epiteliais intercelulares. Segundo Azulay e Azulay (1999), a sede primária da doença seria o
cimento intercelular da camada espinhosa de Malpighi, embora não se saiba o motivo pelo
qual esse cimento se torne antigênico e induza à produção de autoanticorpos, principalmente
do tipo IgG. Esses autoanticorpos, mais especificamente o IgG1 e o IgG4, agem contra as
glicoproteínas desmogleína 1 e desmogleína 3, pertencentes à família das cadeínas, as quais
estão localizadas nos desmossomos do epitélio da pele, mucosas ou no soro dos paciente
afetados. Tais anticorpos promovem a ruptura das pontes intercelulares e, consequentemente
as células perdem a sua adesão, o que caracteriza o fenômeno de acantólise, provocando a
formação de fendas intraepiteliais. A ligação antígeno-anticorpo induz a ativação de
proteinases, dentre elas destaca-se o plasminogênio ativado, que após liberado pelos
ceratinócitos transforma-se em plasmina, a qual promove a lise da substância intercelular
(WILLIAMS, 1989; HASHIMOTO, 2003; JOLLY et al., 2010).
Fatores genéticos também podem estar envolvidos na etiologia do PV, uma vez que
certos grupos étnicos - judeus e populações do mediterrâneo – são particularmente suscetíveis
ao pênfigo vulgar. A literatura também descreve casos familiares dessa doença (STANLEY,
1993; DELGADO et al., 1996). Estudos mostram que a expressão do antígeno de
histocompatibilidade HLA-A26 parece predispor ao desenvolvimento da doença. Contudo,
21
para que o PV possa se desenvolver é necessária à presença de fatores endógenos como
defeitos imunológicos, e exógenos como vírus e agentes físicos (CAMACHO-ALONSO;
LÓPEZ-JORNET; BERMEJO-FENOLI, 2005; SCULLY; CHALLACOMBE, 2002; JOLLY
et al., 2010).
Além disso, o pênfigo também pode ser induzido por drogas. Na realidade, qualquer
droga que apresentar uma substância contendo um grupamento –til ativo na sua estrutura
molecular é considerada capaz de induzir a doença (MUTASIM; PELC; ANHALT, 1993).
Alguns agentes conhecidos como indutores do pênfigo vulgar são as sulfonamidas, as
penicilinas e as drogas antiepilépticas. Porém, Camacho-Alonso, López-Jornet e Bermejo-
Fenoli (2005) reportaram 14 casos de pênfigo vulgar, e afirmaram que nenhum dos pacientes
relatou fazer uso de qualquer droga com possível efeito indutor do pênfigo. Tem sido sugerido
que membros da família botânica Allium, incluindo cebola, alho e alho-poró podem induzir
tais lesões (BRENNER; WOLF, 1994).
Com relação às manifestações clínicas, aproximadamente 75% dos casos de PV
revelam-se inicialmente na mucosa oral, cujas lesões precedem as cutâneas em um período de
até um ano ou mais (ROBINSON; LOZADA-NUR; FRIEDEN, 1997; ENDO et al., 2005).
Ao exame físico é observada a formação de bolhas e vesículas de diâmetros variáveis, de
ocorrência superficial ou profunda, de conteúdo seroso claro, purulento ou sanguinolento, que
uma vez rompidas originam erosões superficiais irregulares, com coloração avermelhada,
sintomatologia dolorosa, sendo logo recobertas por um tipo de pseudomembrana e
circundadas por um eritema difuso. Todavia, é raro o paciente relatar a presença de bolhas ou
vesículas intraorais, e as lesões dificilmente podem ser detectadas pelo exame clínico devido à
rápida ruptura do teto fino e friável das bolhas (SCULLY, CHALLACOMBE, 2002;
NEVILLE et al., 2009). Tais lesões podem ser localizadas em qualquer região na da cavidade
oral, porém são encontradas com maior frequência em áreas mais sujeitas ao trauma
friccional, como mucosa jugal, língua, palato e lábio superior (LASKARIS;
SKALAVOUNOU; STRATIGOS, 1982). O aumento da salivação e o incômodo ao mastigar,
ao engolir e ao falar são as principais queixas dos pacientes com lesões de pênfigo vulgar oral,
além de ardor intenso e odor fétido (SCIUBBA, 1996; SCULLY; CHALLACOMBE, 2002).
O elemento semiotécnico para um diagnóstico mais simples do pênfigo vulgar é a
verificação do sinal de Nikolsky. Este é positivo quando ocorre a formação de uma bolha ao
se friccionar o epitélio nas proximidades das lesões já existentes, devido à facilidade de
separação das células epiteliais. Embora esse sinal seja de grande valia, não é patognomônico
22
do pênfigo vulgar, podendo ser observado na grande maioria das lesões vesículo-bolhosas
(HEAPHY; ALBRECHT; WERTH, 2005; NEVILLE et al., 2009; JOLLY et al., 2010).
O diagnóstico geralmente é baseado nas manifestações orais, enquanto a confirmação é
fornecida pelos achados histológicos. Os espécimes da biópsia do tecido perilesional
caracterizam-se microscopicamente por uma separação intraepitelial (vesícula ou bolha
intraepitelial) acima da camada basal das células do epitélio, sendo que esta permanece
aderida à lâmina própria subjacente. No espaço vesicular são encontrados, com frequência,
grupos de células que apresentam alterações degenerativas tais como tumefações dos núcleos,
perda dos desmossomos, formato arredondado ou ovóide e hipercromatismo, sendo
denominadas de células de Tzanck, as quais são resultantes da acantólise celular em
decorrência do edema pré-vesicular. No tecido conjuntivo podem ser encontrados leucócitos
polimorfonucleares e linfócitos em número variados. Ao contrário da maioria das doenças
bolhosas, o pênfigo vulgar é caracterizado por escassez de infiltrado inflamatório no líquido
da vesícula, exceto nos casos onde existe infecção secundária (WILLIAMS, 1989;
WEINBERG; INSLER; CAMPEN, 1997; NEVILLE et al., 2009). A avaliação da
imunofluorescência direta do espécime de biópsia de tecido perilesional fresco revela IgG ou
IgM e fragmentos de complemento no espaço intercelular, sendo esse método de diagnóstico
também considerado essencial, juntamente com o exame histopatológico, para a confirmação
do diagnóstico (CALVANICO; ROBLEDO; DIAZ, 1991; BLACK; MIGNOGNA; SCULLY,
2005).
O pênfigo vulgar, sendo uma doença autoimune sistêmica, deve ser tratado
primeiramente com corticosteroides sistêmicos, visando inibir a produção dos autoanticorpos
agressores (CHRYSOMALLIS et al., 1994; ENDO et al., 2005; NEVILLE et al., 2009). De
acordo com Lee (2011), a combinação de corticosteroides com drogas imunossupressoras é a
linha terapêutica mais usada para tratar o pênfigo vulgar. Esta doença não tem cura, apenas
controle. Quanto maior a precocidade do diagnóstico, mais cedo o tratamento poderá ser
iniciado, permitindo a administração de doses menores de corticosteroides para controlar a
doença, reduzindo, desse modo as reações adversas e melhorando o prognóstico (BLACK;
MIGNOGNA; SCULLY, 2005 AMORMINO; BARBOSA, 2010).
23
2.3 ANGIOGÊNESE
2.3.1 Considerações Gerais
A formação de novos vasos sanguíneos pode ocorrer pelos processos de vasculogênese
ou angiogênese. A vasculogênese consiste no surgimento de vasos sanguíneos de novo a partir
de precursores celulares, os quais se diferenciam em células endoteliais, formam lúmens e
originam uma rede vascular primitiva. Por sua vez, a angiogênese representa a formação de
novos vasos sanguíneos a partir da migração e proliferação de células endoteliais da
vasculatura pré-existente (CLAPP et al., 2009; NIKITENKO, 2009; UCUZIAN et al., 2010).
O surgimento de novos vasos sanguíneos é um processo altamente complexo e
coordenado, envolvendo a atuação de fatores pró e antiangiogênicos. Em adultos, sob
condições fisiológicas, a angiogênese ocorre apenas durante processos relacionados ao ciclo,
gestação e reparo tecidual. Dessa forma, normalmente, fatores antiangiogênicos mantêm o
endotélio em um estado quiescente. Porém, em processos patológicos como artrite
reumatoide, psoríase, retinopatia diabética, doença hepática policística, degeneração macular
relacionada à idade, asma, aterosclerose e câncer, o delicado balanço entre fatores pró e
antiagniogênicos é alterado em favor da formação de novos vasos sanguíneos (LALLA et al.,
2003; KYZAS et al., 2005; FABRIS et al., 2006; CLAPP et al., 2009; NIKITENKO, 2009;
GORDON; MENDELSON; KATO, 2010). Por sua vez, outras patologias, como isquemias
cerebral e cardíaca e doenças neurodegenerativas, estão caracterizadas por angiogênese
insuficiente e/ou regressão vascular anormal (CLAPP et al., 2009).
A angiogênese in vivo pode ocorrer por dois processos. Um dos processos é a
intussuscepção, que envolve a formação de pilares teciduais transluminais no interior dos
capilares os quais se fusionam dando origem a novos vasos sanguíneos (MAKANYA;
HLUSHCHUK; DJONOV, 2009; RIBATTI; NICO; CRIVELLATO, 2009; GORDON;
MENDELSON; KATO, 2010). O outro processo envolve o brotamento de células endoteliais
a partir de estruturas vasculares pré-existentes para tecidos circunvizinhos (ADAMS;
ALITALO, 2007; UCUZIAN et al., 2010).
Por muito tempo acreditou-se que a angiogênese a partir de células endoteliais de
vasos pré-existentes fosse o único mecanismo pelo qual novos vasos sanguíneos seriam
formados em adultos (RISAU, 1997). No entanto, Asahara et al. (1997) identificaram células
presentes na circulação periférica as quais eram mobilizadas a partir da medula óssea e
endereçadas à sítios angiogênicos, sugerindo um envolvimento potencial destes tipos celulares
24
na angiogênese. A descoberta destes precursores revolucionou o campo da biologia vascular e
impulsionou a identificação de outros tipos celulares capazes de dar origem às células
endoteliais. Dessa forma, verificou-se que células-tronco mesenquimais localizadas em
diversos órgãos e tecidos como no tecido adiposo, parede de vasos sanguíneos, baço, fígado e
intestino podem se diferenciar em células endoteliais, constituindo um verdadeiro pool de
precursores endoteliais (ZAMPETAKI; KIRTON; XU, 2008; TILKI et al., 2009)
2.3.2 Mensuração da Angiogênese
Diversos métodos podem ser empregados para se mensurar a angiogênese nos tecidos.
Estudos in vivo relatam a utilização de métodos não invasivos como a ressonância magnética
com contraste aumentado, a tomografia computadorizada com emissão de pósitrons e a
tomografia computadorizada com emissão de fóton único (PERINI et al., 2008). Em
pesquisas ex vivo, como nos estudos realizados com materiais biológicos provenientes de
biópsias, a atividade angiogênica de um tecido pode ser mensurada pela determinação de um
índice angiogênico obtido por meio da contagem dos microvasos presentes no espécime (EL-
GAZZAR; MACLUSKEY; OGDEN, 2005; FREITAS et al., 2005). Neste caso, as técnicas
existentes se baseiam na avaliação microscópica dos tecidos com o auxílio de anticorpos
capazes de reconhecer epítopos expressos por células endoteliais como o FvW, o CD31, o
CD34 e o CD105 (VERMEULEN et al., 2002; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007).
Em relação às técnicas de mensuração da angiogênese empregadas na avaliação dos
tecidos submetidos ao processamento imunoistoquímico, a análise dos trabalhos existentes na
literatura revela que as mais frequentemente utilizadas são a da densidade microvascular
(MVD), do volume microvascular (MVV) e da contagem microvascular (MVC) (HANNEN;
RIEDIGER, 2004; EL-GAZZAR; MACLUSKEY; OGDEN, 2005; FREITAS et al., 2005;
SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007; DAVEY et al., 2008).
A técnica da MVD foi descrita por Weidner et al. (1991) em um estudo com carcinoma
de mama. Sob microscopia de luz, com aumentos de 40x e 100x, são identificadas cinco áreas
de maior vascularização no espécime. Em sequência, sob aumento de 200x, são quantificados
os microvasos presentes em cada uma dessas áreas. O resultado, designado de MVD alta,
consiste no maior número de microvasos em uma dessas áreas. Dessa forma não é
estabelecido um valor médio, sendo o resultado apresentado sob a forma de microvasos/mm2.
Além de estabelecerem a técnica da MVD, Weidner et al., (1991) explicitaram
parâmetros para nortear o processo de quantificação dos microvasos. De acordo com os
25
autores, deveriam ser considerados como um único microvaso as células endoteliais isoladas
ou grupos de células endoteliais claramente separadas de microvasos adjacentes ou de outros
tipos celulares do tecido conjuntivo. Além disso, grupos de células endoteliais isoladas que
poderiam constituir secções distintas de um mesmo microvaso deveriam ser consideradas
como microvasos distintos. Lúmens vasculares, embora geralmente identificáveis, não seriam
necessários para definir uma estrutura como um microvaso.
Posteriormente, com base na metodologia descrita por Weidner et al., (1991), foi
proposta uma avaliação da MVD alta, designada de MVD média (SCHOR et al., 1998a;
SCHOR et al., 1998b). Nesta técnica, sob aumento de 200x, são quantificados os microvasos
em 10 – 15 campos microscópicos aleatórios. Com os valores obtidos em cada um destes
campos é estabelecido o número médio de microvasos do espécime. Na análise MVD média,
os resultados são apresentados sob forma de média de microvasos ± desvio padrão.
O MVV consiste em uma técnica estereológica para a determinação do volume dos
microvasos. Neste processo, sob microscopia de luz (aumento de 200x), com o auxílio de uma
ocular contendo um retículo com 100 pontos marcados, são avaliados 15 campos
microscópicos aleatórios, perfazendo um total de 1.500 pontos. Em cada um destes campos
são quantificados os vasos que coincidem com os pontos do retículo. Ao final, o resultado é
expresso em porcentagem de volume (PAZOUKI et al., 1997; SCHOR et al., 1998a).
A técnica da MVC foi descrita por Maeda et al., (1995) em um estudo com carcinomas
gástricos. Sob microscopia de luz, com aumento de 40x, são identificadas cinco áreas de
maior vascularização no espécime. Em sequência, sob aumento de 200x, são quantificados os
microvasos presentes em cada uma dessas áreas. Nesta análise, o resultado obtido é
apresentado como um número médio de microvasos em cada secção histológica. Além de
constituir uma técnica de fácil execução (FREITAS et al., 2005), a MVC se destaca por
apresentar relevância prognóstica em diversos tumores (NANASHIMA et al., 2008;
NANASHIMA et al., 2009).
A MVD em tumores tem sido avaliada pela imunomarcação dos tecidos por anticorpos
pan-endoteliais contra antígenos como o CD34, CD31 e fator de Willebrand. Entretanto,
sabendo-se que as células endoteliais são altamente heterogêneas, surge um questionamento
sobre se um marcador pan-endotelial é um reagente ideal para avaliar a MVD de um tumor.
Tomando isso como base, muitos autores relatam que os anticorpos anti-CD105, ao contrário
dos marcadores pan-endoteliais, ligam-se preferencialmente às células endoteliais ativadas in
vitro e em tecidos participando da angiogênese (WANG et al., 1993; WESTPHAL et al.,
1993; WANG et al., 1995; SEON et al., 1997). Além disso, após a imunomarcação em vários
26
tipos histológicos de tumores humanos, o CD105 foi que esteve mais fortemente expresso nas
células endoteliais dos vasos sanguíneos tumorais, todavia foi indetectável ou esteve
fracamente presente em vasos sanguíneos de tecidos normais (WANG et al., 1993; WANG et
al., 1995; DERBYSHIRE; THORPE, 1997). Por outro lado, evidências sugerem que a
expressão do CD105 pode refletir a atividade metabólica dos tecidos, não estando
necessariamente relacionado à formação de novos vasos sanguíneos (DAVEY et al., 2008).
O grau de vascularização (medido quantitativamente pela MDV) tem potencial para ser
usado como fator de prognóstico (FIDLER; ELLIS, 1994; FOX; GATTER; HARRIS, 1996).
A extensa neovascularização em carcinomas de mama invasivos é um fator preditor de
metástase independente tanto para linfonodos axilares quanto para sítios distantes ou ambos
(WEIDNER, 1993; GASPARINI; POZZA; HARRIS, 1996; FOX; GATTER; HARRIS,
1996). Subsequentemente, muitos pesquisadores têm demonstrado que a alta microdensidade
vascular (MDV) é um fator de prognóstico independente em muitos outros tipos histológicos
de tumores humanos, enquanto outros autores têm falhado em encontrar tal relação (KUMAR
et al., 1999).
2.3.3 O Processo Angiogênico nas Lesões Crônicas Inflamatórias (Líquen Plano Oral e
Pênfigo Vulgar)
O processo angiogênico é considerado fundamental em muitos processos fisiológicos e
patológicos e, em ambos os tipos o início da resposta angiogênica ocorre com uma ativação
das células endoteliais devido à liberação de citocinas como resposta à hipóxia ou à isquemia
(SCARDINA et al., 2009). A angiogênese está diretamente relacionada a uma alteração na
microcirculação local, que consiste basicamente em um aumento no número de vasos em uma
determinada área e uma alteração morfológica dos mesmos, culminando na expressão in vivo
da neoformação de vasos sanguíneos (SCARDINA et al., 2007).
Além de a angiogênese ter sido atualmente relacionada com a patogenia e atividade de
uma série de condições crônicas inflamatórias, incluindo artrite reumatoide, psoríase e
osteoartrite; outros dados sugerem que a angiogênese pode desempenhar um papel importante
na persistência e cronicidade de algumas lesões do líquen plano oral, podendo, desse modo,
ser utilizado como um marcador de atividade da doença (TAO et al., 2007).
Uma relação de feedback positivo, em que um estado inflamatório promove a
angiogênese e esta facilita a inflamação crônica foi observada em doenças crônicas
inflamatórias, bem como em LPO’s (CREAMER et al., 2002). Por esse motivo é necessário
27
elucidar o papel da angiogênese na patogênese da LPO a fim de se melhor compreender o seu
mecanismo para que sejam desenvolvidas novas estratégias de tratamento (TAO et al., 2007).
O LPO caracteriza-se por uma ciclicidade, com fases de remissão e recrudescência,
desse modo, modificações na microcirculação local podem ser associadas a uma maior ou
menor intensidade do fenômeno flogógero, e, por conseguinte, a uma maior ou menor
atividade da doença (SCARDINA et al., 2007). Dados da literatura indicam que na presença
da LPO, os vasos sanguíneos encontram-se dilatados, portanto eles ocupam um espaço
relativamente maior, todavia isso não corresponde a um aumento do número dos mesmos
(SCARDINA et al., 2007). Entretanto, SCARDINA et al., 2009, afirmam que, no momento,
na literatura ainda não há estudo algum satisfatório que compare o fenômeno da angiogênese
nas lesões de líquen plano oral.
Tal como uma doença autoimune de origem inflamatória e progressão crônica, o líquen
plano oral satisfaz todos os pré-requisitos de hipóxia que são essenciais na angiogênese.
Macrófagos e outras células do sistema imune produzem o fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF), que estimula a degradação, proliferação e migração das células endoteliais
e regula a permeabilidade vascular, importante na iniciação da angiogênese (MITTAL;
SHANKARI; PALASKAR, 2012). O VEGF é considerado um dos mediadores mais potentes
da angiogênese, uma vez que se trata do fator de maior estimulação específica da célula
endotelial. Tem sido demonstrado que as lesões de LPO apresentam um aumento significativo
de VEGF quando comparado à mucosa oral normal (TAO et al., 2007).
Alguns estudos em pacientes afetados pelo líquen plano oral sugerem que o aumento
da densidade de mastócitos na lâmina própria próximo à camada basal do epitélio e o aumento
de número de fatores proangiogênicos e angiogênicos, tais como histamina, heparina, VEGF e
TGF-β produzidos por essas mesmas células podem influenciar o endotélio vascular de um
modo crítico, além de possuir um papel importante na formação da lesão (MICHAILIDOU;
MARKOPOULOUS; ANTONIADES, 2008; SCARDINA et al., 2009). Ao mesmo tempo,
pesquisas revelaram uma série de citocinas proangiogênicas, incluindo fator de necrose
tumoral (TNF), interleuninas 1, 6 e 8 presentes em quantidades significantes nos tecidos da
lesão, no sangue periférico e em diferentes fluidos orais de pacientes com LPO (RHODUS et
al., 2005). Esses resultados, portanto, indicam que existe angiogênese no microambiente de
lesões de LPO, embora alguns estudos ainda considerem necessário o fornecimento de mais
evidências para que isso seja estabelecido de fato (MIGNOGNA et al., 2004).
Os estudos de Mittal, Shakari e Palaskar (2012) indicam que a angiogênese é
significativamente elevada em lesões de LPO quando comparados à mucosa oral normal e
28
também em lesões de LPO erosivo quando comparados com lesões de LPO reticular; o que
sugere que a angiogênese é um dos principais fatores que contribuem na progressão do LPO.
Cunha et al. (2004) e Lee (2011) observaram em seus respectivos casos clínicos
relatados uma significativa remissão das lesões de pênfigo vulgar após o uso oral da
talidomida; sendo notado também o retorno das mesmas quando o uso desse medicamento era
interrompido. Porém, os mecanismos pelos quais a talidomida age no pênfigo ainda não estão
esclarecidos. Especula-se que esse medicamento exerce seus benefícios clínicos no PV
através dos efeitos citocinas-moduladores e que agentes imunossupressores podem interferir
nesses efeitos da talidomida.
Tem sido observado em modelos animais que a talidomida apresenta propriedades
antiangiogênicas, porém o mecanismo pelo qual isso acontece é desconhecido (D’AMATO et
al., 1994). Uma vez que se observou que essa inibição ocorre apenas após a administração
oral da talidomida, surgiu a hipótese de que um metabólito ativo é formado in vivo
(MATHEWS; MCCOY, 2003). A talidomida suprime, nos macrófagos, a produção de TNF-α,
que é fracamente angiogênico in vivo; e age secundariamente induzindo uma inflamação.
Hipotetizou-se, então, que a talidomida inibe diretamente um componente essencial da
angiogênese, e não opera através do efeito da produção de TNF-α. (D’AMATO et al., 2004).
Somando-se a isso, Kruse et al. (1998), relataram que a talidomida inibiu a angiogênese
induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),o qual é um potente mediador
da angiogênese (TAO et al., 2007).
2.4 BIOMARCADOR ANGIOGÊNICO – CD34
Ao longo dos anos um grande esforço tem sido feito para encontrar marcadores
específicos para células endoteliais angiogênicas. Embora um marcador estritamente
específico para a vasculatura tumoral provavelmente não exista, uma variedade de candidatos
com viável potencial terapêutico estão ainda sob investigação (BREKKEN; LI; KUMAR,
2002). Estes podem ser categorizadas em marcadores de ativação e proliferação de células
endoteliais, marcadores de estresse hipóxico, receptores de fatores de crescimento, antígenos
celulares endoteliais indefinidos e proteínas que são expressas em membrana basal recém-
formada ou remodelada. A pesquisa por esses marcadores é importante, uma vez que estes
podem ser usados nos exames de imagem do tumor, no monitoramento e eficácia da terapia
angiogênica e na predição da progressão tumoral (BREKKEN; LI; KUMAR, 2002;
SANCHEZ-ELSNER et al., 2002).
29
O CD34 é um marcador de células endotelias, caracterizado como uma glicoproteína
transmembrana de 105-120 kDa que possui alta especificidade, principalmente para células
endoteliais de vasos sanguíneos e precursores de células hematopoiéticas (YOSHIDA et al.,
1999; ABBAS; LICHTMAN, 2005).
Este imunomarcador atua na adesão célula a célula ao se ligar com domínios existentes
nas selectinas, chamadas de CD62L. A adesão e a transmigração leucocitária são reguladas
principalmente pela ligação de moléculas de adesão pertencentes aos leucócitos e na
superfície endotelial e pelos mediadores químicos (quimiotaxinas e citocinas) que afetam
esses processos modulando a expressão na superfície ou a avidez dessas moléculas de adesão.
Os receptores de adesão envolvidos pertencem a quatro famílias moleculares como as
selectinas, as quais possuem um domínio N-terminal extracelular, compreendendo a E-
selectina (CD62E) ou molécula endotelial de adesão de leucócitos tipo 1 (ELAM-1),
confinada ao endotélio; a P-selectina (CD62P), presente no endotélio e plaquetas; e por
último, a L-selectina (CD62L) ou molécula de adesão de leucócitos tipo 1 (LAM-1), a qual é
expressa na maioria dos tipos de leucócitos (ABBAS; LICHTMAN, 2005; KUMAR;
ABBAS; FAUSTO, 2005).
A L-selectina serve de receptor de endereçamento para os linfócitos entrarem nos
linfonodos ligando-se às vênulas especializadas de endotélio alto (HEV’s). Ela liga, ainda, os
neutrófilos às células endoteliais ativadas pelas citocinas nos locais de inflamação. Pelo
menos três ligantes das células endoteliais podem ligar-se à L-selectina: a molécula de adesão
do tipo 1, que contém glicano (GlyCAM-1), uma proteoglicana encontrada nas HEV’s dos
linfonodos; a molécula de adesão celular adressina da mucosa do tipo 1 (MadCAM-1),
expressa pelas células endoteliais no tecido linfoide associado às mucosas; e a glicoproteína
CD34 (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
O CD34 é um dos principais ligantes das células endoteliais que podem unir-se às L-
selectinas, e segundo a literatura é fortemente expresso em diversas neoplasias como
leucemias, além de lesões vasculares, sugerindo, dessa forma, que sua imunomarcação seja
utilizada como critério de diagnóstico e prognóstico nessas lesões (HEIMBURG et al., 1999;
YOSHIDA et al., 1999; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
30
PROPOSIÇÃO
31
3 PROPOSIÇÃO
Este trabalho teve como objetivo avaliar o processo angiogênico por meio da contagem
microvascular (MVC), com o auxílio do marcador imunoistoquímico CD34 em uma série de
casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar na tentativa de melhor compreender o papel da
angiogênese tanto na patogênese quanto na progressão dessas doenças autoimunes crônicas
inflamatórias.
32
MATERIAIS E MÉTODOS
33
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A presente pesquisa foi registrada na Plataforma Brasil e submetida a análise do seu
conteúdo pelo Comité de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(CEP/UFRN).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O presente estudo caracterizou-se como uma pesquisa descritiva, comparativa e
retrospectiva constituída pela observação, análise e registro dos índices angiogênicos obtidos
a partir da apreciação quantitativa dos vasos sanguíneos imunomarcados pelo anticorpo anti-
CD34 em uma série de casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar previamente selecionados.
4.3 POPULAÇÃO
Todos os casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar diagnosticados e arquivados no
Setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de
Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
4.4 AMOSTRA
A amostra foi intencional, já que foram selecionados todos os casos diagnosticados
como LPO e PV, arquivados no serviço anteriormente referenciado, de acordo com a
quantidade e a qualidade do material disponível nos blocos de parafinas existentes, que
deveriam ser suficientes para o estudo morfológico e imunoistoquímico. Neste estudo foram
incluídos 73 espécimes teciduais orais, sendo selecionados 40 casos de LPO, dos quais 26
foram classificados como reticulares e 14 casos eram lesões erosivas, além de 18 casos de PV
e 15 espécimes de mucosa oral normal.
34
4.4.1 Critérios para seleção da amostra
4.4.1.1Critérios de inclusão
Foram incluídos na amostra:
Lâminas coradas em hematoxilina-eosina (HE), que tiveram diagnóstico
histopatológico de líquen plano oral reticular e erosivo e, pênfigo vulgar;
Casos cujos blocos em parafina apresentaram quantidade suficiente de material para
realização do estudo imunoistoquímico;
Casos cujas fichas apresentaram todos os dados necessários para a realização do
estudo clínico.
4.4.1.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos da amostra aqueles casos que não satisfizeram os critérios de inclusão
acima.
4.4.2 Caracterização da amostra
Neste estudo foram incluídos 73 espécimes teciduais orais emblocados em parafina
que foram divididos em três grupos: grupo I, grupo II e grupo III. O grupo I, o grupo controle,
consistiu em 15 casos de mucosa oral normal (retirado de cirurgia peridontal); o grupo II foi
constituído por 40 casos diagnosticados como líquen plano oral. Esse grupo foi ainda
subdividido em dois grupos: grupo IIA e grupo IIB. O grupo IIA conteve 26 casos
diagnosticados como líquen plano oral reticular e o grupo IIB, 14 casos diagnosticados como
líquen plano oral erosivo. Já o grupo III foi constituído por 18 casos diagnosticados como
pênfigo vulgar. Estes casos foram obtidos de blocos de casos previamente diagnosticados dos
arquivos do Setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento
de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
35
4.5 ESTUDO CLÍNICO E MORFOLÓGICO
A partir de fichas clínicas de requisições de biópsias arquivadas no Laboratório de
Anatomia Patológica do Departamento de Odontologia da UFRN, foram obtidas as
características clínicas das lesões, para que assim as lesões de LPO fossem classificadas como
LPO Reticular ou LPO Erosivo. As lesões de LPO foram consideradas reticulares quando
foram descritas nas fichas clínicas dos pacientes como: assintomáticas, com linhas brancas
entrelaçadas ou como pápulas e as erosivas como lesões eritematosas, ulceradas e com
sintomatologia associada (apresentando dor e/ou ardor), conforme Neville et al. (2009) e
Carrozzo e Thorpe (2009).
Os espécimes foram analisados sob microscopia de luz, através da análise de cortes
histológicos de 5μm de espessura, corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina. Em seguida
foi efetuada uma análise descritiva das características anátomo-patológicas inerentes a cada
lesão, onde foram selecionados apenas os casos que apresentaram aspectos morfológicos
padrões de líquen plano oral e pênfigo vulgar.
4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
4.6.1 Método Imunoistoquímico
Os espécimes fixados em formol a 10% e emblocados em parafina foram submetidos a
cortes histológicos de 3µm de espessura, que foram estendidos em lâminas de vidro,
previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo à base de Organosilano (3-
aminopropyltrietoxy-silano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Na técnica
imunoistoquímica foi empregado o complexo Avidina Biotina (Kit LSAB + HRP, DAKO
CYTOMATION, Carpinteria, CA, USA), utilizando o imunomarcador anti- CD34, seguindo
os seguintes passos laboratoriais descritos abaixo:
o Xilol I (30 minutos), estufa 59°C – Desparafinização;
o Xilol II (20 minutos), temperatura ambiente (TA) – Desparafinização;
o Etanol absoluto, I, II e III (05 minutos cada) – TA;
o Etanol 95° (5 minutos) – TA;
o Etanol 80° (5 minutos) – TA;
36
o Remoção de pigmento formólico com hidróxido de amônia a 10% em etanol a
95% (10 minutos) – TA;
o Lavagem das lâminas em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Recuperação antigênica (Quadro 1);
o Lavagem em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 volumes
(duas trocas 15 minutos cada);
o Lavagem em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Passagem em TRIS HCl (Tris (hydroxymethyl) aminomethane Hydrochlride)
pH 7,4 (duas trocas de 5 minutos cada);
o Incubação sem solução de BSA (albumina sérica bovina) a 1% e soro fetal
bovino (SFB) a 5% em TRIS HCl pH 7,4 por 60 minutos, para bloquear a
reação do anticorpo primário com proteínas inespecíficas teciduais;
o Retirar o excesso da solução dos cortes;
o Incubação dos anticorpos conforme a determinação do fabricante (Quadro 1);
o Passagem solução de Tween 20 a 1% em TRIS HCl pH 7,4 (duas trocas de 5
minutos cada);
o Incubação por 30 min nos reagentes do Kit LSAB (Dako Cytomation + and
LSAB®
+ Systems) para o anticorpo anti-CD34;
o Passagem em TRIS HCl pH 7,4 (duas trocas de 5 minutos cada);
o Incubação por 3 minutos em solução de di-aminobenzida (DAB) na
concentração de 30 mg em 10 ml de TRIS HCl pH 7,4 ativada por peróxido de
hidrogênio 10 volumes para revelação;
o Lavagem em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA;
o Lavagem em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Desidratação em etanol em cadeia crescente em 80° ao etanol absoluto (3
minutos cada);
o Diafanização em xilol (3 passagens de 10 minutos);
37
o Montagem da lâmina em resina Permount®
(Ficher Scientific, Fair Lawn, NJ,
USA) para observação em microscópio de luz.
Quadro 1 - Especificação, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação do anticorpo
primário utilizado.
Anticorpo
Clone
Especificidade Diluição
Recuperação
Antigênica
Incubação
CD34
(QBEnd 101)
Dako
Corporation
Células
endoteliais,
precursores das
células
hematopoiéticas.
1:100
Citrato Ph 6.0
Pascal, 30 min
Overnight
4°C
PPGO, 2014
4.6.2 Análise do Perfil Imunoistoquímico
As lâminas coradas pela técnica da imunoistoquímica com anticorpo anti-CD34 foram
analisadas sob microscopia de luz (OLYMPUS BX41) quantitativamente através do índice
angiogênico, por um examinador previamente treinado. O índice angiogênico foi delimitado
empregando-se a técnica da contagem microvascular (MVC), de acordo com a metodologia
de Maeda et al. (1995) modificada, em que foram selecionadas, de forma criteriosa e
subjetiva, cinco áreas bem significativas da lesão e com maior número de vasos (densidade
microvascular) sob aumento de 40x (x4 objetiva, x10 ocular). Em seguida, através do
aumento de 100x (x10 objetiva, x10 ocular) foram quantificados manualmente, com o auxílio
do programa ImageJ (Image Processing and Analysis in Java), objetivando evitar a
recontagem de estruturas. Desse modo, o resultado foi expresso pelo número médio de vasos
nestas áreas em cada amostra das lesões, para posterior comparação. Durante o procedimento,
qualquer célula ou grupo celular endotelial imunomaracado positivamente separados dos
microvasos adjacentes e de outros constituintes do tecido conjuntivo, assim como os vasos
contendo lúmen, foram considerados como vaso unitário. Foram contados como vasos, ainda,
estruturas ramificadas e com descontinuidade na sua conformação.
38
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Com o intuito de testar as hipóteses propostas no presente estudo, os resultados
obtidos foram submetidos a testes apropriados. Os dados obtidos foram digitados em planilha
eletrônica no programa Excel (Microsoft Office 2013® for Windows) e posteriormente
exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS versão 20.0;
Inc., Chicago, IL, USA), no qual foi inicialmente realizada a análise descritiva e em seguida
os testes estatísticos descritos abaixo.
Para comparar o índice angiogênico determinado pela contagem microvascular (MVC)
entre os diferentes tipos de lesões, categorizadas nos grupos líquen plano oral, pênfigo vulgar
e mucosa oral normal, fez-se uso do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Enquanto para
comparação da MVC entre a forma erosiva e reticular dos casos de líquen plano oral,
realizou-se o teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
O nível de significância adotado para todos os testes realizados foi de 5%.
39
RESULTADOS
40
5 RESULTADOS
5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS
No presente estudo, foram utilizados 40 casos de líquen plano oral, destes, 14 eram do
tipo erosivo e 26 do tipo reticular, 18 casos de pênfigo vulgar e 15 casos de mucosa oral
normal (Gráfico 1).
Gráfico 1 - Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão analisada. Natal, RN-2014.
PPGO, 2014
Ao exame histopatológico, os casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar, sob
microscopia de luz, em cortes de 5µm de espessura, corados pela técnica da Hematoxilina e
Eosina, revelaram para os diagnósticos histológicos as características inerentes às referidas
lesões.
Nas lesões de líquen plano analisadas constatou-se a presença de perda de nitidez da
camada basal acompanhada pelo intenso infiltrado inflamatório predominantemente
linfocítico, disposto em faixa, imediatamente subjacente ao epitélio, além da presença de
corpos colóides eosinofílicos na interface epitélio/tecido conjuntivo (Corpos de Civatte),
cristas epiteliais ausentes, hiperplásicas ou em forma de “dentes de serra”, variações da
espessura da camada espinhosa e graus variáveis de orto ou paraceratose.
Líquen Plano Oral
Pênfigo Vulgar
Mucosa Oral Normal
54,8%
24,7%
20,5%
41
No que concerne aos espécimes de pênfigo vulgar, pôde-se observar a existência de
separação intraepitelial, acima da camada de células basais do epitélio evidenciando-se a
presença de acantólise (separação das células da camada espinhosa do epitélio) e a presença
de células soltas, de forma arredondada, na camada espinhosa, chamadas de células de
Tzanck, além de um infiltrado leve a moderado de células inflamatórias crônicas no tecido
conjuntivo.
5.2 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS
A reatividade celular observada nos casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar foi
restrita ao citoplasma das células endoteliais de revestimento e aos grupamentos de células
endoteliais proliferantes sem lúmen, sendo representada pela coloração acastanhada
independente da intensidade da imunomarcação.
Foi ainda observado que o anticorpo anti-CD34 reagiu imunopositivamente em 100%
da amostra analisada.
5.2.1 Análise Quantitativa da Marcação Imunoistoquímica pelo anticorpo anti-CD34.
O número médio dos vasos sanguíneos determinados pela contagem microvascular
(MVC) nos espécimes de líquen plano oral, pênfigo vulgar e mucosa oral normal
imunomarcados para CD34 encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1 - Índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular do CD34 de acordo com o
tipo de lesão avaliada. Natal, RN-2014.
LESÃO Índices Angiogênicos
LPO
Erosivo 72,80 54,40 106,00 96,80 83,50 72,60 57,40 75,80 55,00 110,80 138,75 60,80 45,00 91,40
Reticular 94,00 75,60 128,20 75,20 66,00 73,40 87,40 72,40 66,80 41,00 60,80 157,20 65,00 97,00
65,60 94,20 40,00 73,80 46,20 58,40 58,00 78,60 88,00 82,20 62,00 57,60
PV 63,00 118,60 71,00 96,60 47,20 39,60 66,60 99,60 65,00 34,50 109,80 61,20 56,20 63,00
64,80 41,00 118,00 83,20
MON 68,60 43,80 80,60 88,40 128,00 51,60 37,00 37,60 101,40 50,60 55,20 76,80 83,60 31,50
44,75
Legenda: LPO, líquen plano oral; PV, pênfigo vulgar; MON, mucosa oral normal.
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.
42
5.2.2 Análise Estatística da Contagem de Microvasos Marcados pelo Anticorpo Anti-
CD34
Ao comparar a MVC entre diferentes lesões, observou-se que a mediana dos casos de
líquen plano oral foi maior que no grupo de pênfigo vulgar, que por sua vez revelou mediana
maior que nos casos de mucosa oral normal. O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis
demonstrou que essas diferenças não foram estatisticamente significativas (p=0,280) (Tabela
2) (Gráfico 2).
Tabela 2 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística
para a contagem microvascular entre as lesões de LPO, PV e os espécimes de MON. Natal, RN-2014.
Lesão n Mediana Q25-Q75 Média dos postos p(1)
LPO 40 73,10 59,00-90,55 40,15 0,280
PV 18 64,90 53,95-97,35 35,78
MON 15 55,20 43,80-83,60 30,07
Legenda: LPO, líquen plano oral; PV, pênfigo vulgar; MON, mucosa oral normal.
(1): Teste Kruskal-Wallis.
PPGO, 2014
Gráfico 2 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal,
RN-2014.
PPGO, 2014
No tocante a contagem microvascular de CD34 em relação à forma clínica dos líquens
planos orais, verificou-se uma mediana ligeiramente maior para a forma clínica erosiva. O
teste não-paramétrico de Mann-Whitney demonstrou que esta diferença não foi
estatisticamente significativa (p=0,720) (Tabela 3) (Gráfico 3).
43
Tabela 3 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e
significância estatística para a contagem microvascular entre os tipos de líquen plano oral. Natal, RN-
2014.
LPO n Mediana Q25-Q75 Média dos
postos
Soma dos
postos
U p(1)
Erosivo 14 74,30 56,80-99,10 21,46 300,50 168,50 0,720
Reticular 26 72,90 60,20-87,55 19,98 519,50
Legenda: LPO, líquen plano oral.
(1): Teste Mann-Whitney.
Fonte: ?????
Gráfico 3 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com a forma clínica de líquen plano
oral. Natal, RN-2014.
PPGO, 2014
44
Figura 1 - Fotomicrografia do espécime de LPO exibindo hiperparaceratinização, epitélio de
revestimento atrófico, áreas de perda de nitidez da camada basal, projeções epiteliais e
infiltrado inflamatório linfocítico subepitelial (H/E, 100X).
PPGO, 2014
Figura 2 - Fotomicrografia do espécime de PV exibindo separação intraepitelial, acima da
camada de células basais do epitélio, acantólise, células de Tzanck e um infiltrado leve de
células inflamatórias crônicas no tecido conjuntivo (H/E, 100X).
PPGO, 2014
45
Figura 3 - LPO Reticular. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e
células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X).Fon
PPGO, 2014
Figura 4 - LPO Reticular. Marcação imunoistoquímica para o anticorpo anti-CD34 em vasos
sanguíneos e células endoteliais em meio ao infiltrado inflamatório linfocítico (LSAB, 100X).
PPGO, 2104
46
Figura 5 - LPO Erosivo. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do anticorpo
anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados (LSAB, 100X).
PPGO, 2014 Figura 6 - LPO Erosivo. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em múltiplos vasos
sanguíneos (LSAB, 100X).
PPGO, 2014
47
Figura 7 - Pênfigo Vulgar. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do anticorpo
anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados e em células endoteliais ocasionais
(LSAB, 100X).
PPGO, 2014
Figura 8 - Pênfigo Vulgar. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e
células endoteliais na lâmina própria principalmente em região justaepitelial (LSAB, 100X).
PPGO, 2014
48
DISCUSSÃO
49
6 DISCUSSÃO
O líquen plano oral é uma doença inflamatória crônica e imunomediada, na qual são
reconhecidas seis formas clínicas: reticular, papular, placa, atrófica, bolhosa e erosiva
(EDWARDS; KELSCH, 2002; AL-HASHIMI et al., 2007; CARBONE et al., 2009; NICO
FERNANDES; LOURENÇO, 2011). No entanto, a maioria dos autores consideram apenas
duas formas principais de apresentação clínica da doença: a reticular e a atrófica/erosiva,
sendo esta divisão utilizada em muitos estudos (KARATSAIDIS et al., 2003; SEOANE et al.,
2004; BRANT; VASCONCELOS; RODRIGUES, 2008; CHARAZINSKA-CAREWICZ et
al., 2008; LÓPEZ-JORNET; CAMACHO-ALONSO; MOLINA-MIÑANO, 2009).
Esta classificação foi utilizada no presente estudo devido, principalmente, ao
comportamento biológico diferente como se apresentam, que ressalta a importância de estudá-
las separadamente. Alguns autores sugerem, ainda, que as formas clínicas reticular e erosiva
do LPO devam ser consideradas entidades distintas (KARATSAIDIS et al., 2003; XIA et al.,
2005; LÓPEZ-JORNET; CAMACHO-ALONSO; MOLINA-MIÑANO, 2009;
FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2011).
Em relação aos achados morfológicos verificados nos casos de LPO analisados neste
estudo, todos estão em concordância com as citações de Sousa et al. (2009), Anuradha et al.
(2011), Fernández-González et al. (2011) e Navas-Alfaro et al. (2011), onde verificaram a
presença de hiperceratose, ausência de displasia, presença de projeções em “dentes de serra”,
sinais de degeneração da camada basal, presença de ceratinócitos apoptóticos, além de
ocasional acantose e hiperplasia. Podendo-se observar, ainda em região justaepitelial um
denso infiltrado inflamatório linfocítico.
O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de pênfigo, qualificada como uma doença
crônica, autoimune, mucocutânea, que inicialmente se manifesta na forma de lesões intraorais,
espalhando-se consequentemente para outras membranas mucosas e pele. É caracterizada
clinicamente pela formação de bolhas intraepiteliais resultante do colapso da adesão celular
entre as células epiteliais ( DAGISTAN et al., 2008).
O elemento semiotécnico para um diagnóstico mais simples do pênfigo vulgar é a
verificação do sinal de Nikolsky. Este é positivo quando ocorre a formação de uma bolha ao
se friccionar o epitélio nas proximidades das lesões já existentes, devido à facilidade de
separação das células epiteliais. Embora seja de grande valia, toda a literatura concorda que
este sinal não é patognomônico do pênfigo vulgar, uma vez podendo ser observado na grande
50
maioria das lesões vesículo-bolhosas ( HEAPHY; ALBRECHT; WERTH, 2005; NEVILLE et
al., 2009; JOLLY et al., 2010).
No que concerne aos achados histológicos do pênfigo vulgar pode ser observada
separação intraepitelial (vesícula ou bolha intraepitelial) acima da camada basal das células do
epitélio, sendo que esta permanece aderida à lâmina própria subjacente. No espaço vesicular
são encontrados, com frequência, grupos de células que apresentam alterações degenerativas
tais como tumefações dos núcleos, perda dos desmossomos, formato arredondado ou ovóide e
hipercromatismo, sendo denominadas de células de Tzanck, as quais são resultantes da
acantólise celular em decorrência do edema peri vesicular. Além disso, no tecido conjuntivo
podem ser encontrados leucócitos polimorfonucleares e linfócitos em número variados. Essas
características observadas nos espécimes de pênfigo vulgar analisadas neste estudo são
condizentes com os descritos na literatura (WILLIAMS, 1989; WEINBERG; INSLER;
CAMPEN, 1997; NEVILLE et al., 2009).
A angiogênese representa um ciclo de um processo vital que leva a formação de vasos
sanguíneos a partir de uma estrutura vascular pré-existente. Exceções fisiológicas em que este
processo ocorre sob forte regulação são encontradas no sistema reprodutivo feminino e
durante o processo de cicatrização de feridas. Por sua vez, a angiogênese não regulada
adequadamente pode resultar em diferentes patologias, tais como a artrite reumatoide, a
retinopatia diabética, a psoríase e o hemangioma juvenis. Além disso, sabe-se que o
crescimento tumoral também é dependente da angiogênese, uma vez que este necessita de
uma extensa rede de capilares sanguíneos para que sejam fornecidos ao tumor nutrientes e
oxigênio necessário para a sua sobrevivência e desenvolvimento. Desse modo, todo sistema
orgânico pode envolver doenças em que a angiogênese é um importante componente.
(HYDER; STANCEL, 1999; LIEKENS; DE CLERCQ; NEYTE, 2001).
Muitos estudos científicos (JAKOBSON; CLAESSON-WELSH, 2008) têm mostrado
a importância da angiogênese nos mecanismos crônicos inflamatórios, bem como tem-se
verificado a presença de neoangiogênese em patologias que apresentam essas características,
como aquelas doenças já citadas anteriormente.
Sabe-se que a angiogênese tem um importante papel nas doenças crônicas
inflamatórias, não apenas causando a geminação de novos vasos sanguíneos, que permite uma
melhor oxigenação e uma maior contribuição dos metabólitos para a proliferação tecidual,
mas também um notável aumento do complexo sistema de feed-back e turnover das células
envolvidas no processo inflamatório (MONACO et al., 2004). Além disso, foi estudado por
Monaco et al. (2004), durante a iniciação e progressão da aterosclerose e artrite reumatoide,
51
que o CD40L nos sítios inflamatórios estimula os fibroblastos e monócitos/macrófagos a
produzirem VEGF, levando a angiogênese, a qual promove a manutenção do processo crônico
inflamatório.
Como verificado na revisão de literatura deste estudo, a angiogênese pode ser avaliada
quantitativamente através de várias metodologias por meio da avaliação microscópica da
vascularização tumoral, lançando-se mão de anticorpos específicos para as células endoteliais,
como VEGF, CD31, CD34, CD44, CD105 e o fator von Willebrand (DUFF et al., 2003;
ABBAS; LICHTMAN, 2005; MINHAJAT et al., 2006; LIORCA et al., 2007; NETTO et al.,
2008).
Contudo, os autores são conflitantes na escolha do marcador imunoistoquímico que
oferece melhores resultados na avaliação da angiogênese. De um lado, alguns pesquisadores
como Martone et al. (2005), Chien et al. (2006), Chuang et al. (2006), Kyzas, Agnantis e
Stefanou (2006), Taskiran et al. (2006), Nikiteas et al. (2007), Soares et al. (2007) e Netto et
al. (2008) o CD105 é um excelente anticorpo para avaliação da angiogênese. Por outro lado,
Traweek et al. (1991), Costa e Guinee (2000), Lopez-Graniel et al. (2001), Di Carlo et al.
(2002), Teo et al. (2003), Guttman et al. (2004) e Ascani et al. (2005), recomendam para
análise da vascularização o CD34.
Desse modo, no estudo realizado, optou-se em avaliar de forma comparativa a
expressão imunoistoquímica do marcador CD34 em lesões de LPO reticular, LPO erosiva e
pênfigo vulgar, lesões estas produzidas por doenças automimunes, crônicas inflamatórias, de
mesmo nome, que mostram sinais e sintomas na mucosa oral nos portadores dessas doenças.
De acordo com Vermeulen et al. (2002), Freitas et al. (2005) e Souza, Freitas e
Miranda (2007) a quantificação de vasos sanguíneos em secções histológicas pode ser útil
como indicador de prognóstico em lesões de cabeça e pescoço. No entanto, a mesma pode ser
influenciada por vários fatores, incluindo o tipo de fixador utilizado, o pré-tratamento dos
espécimes antes da marcação, o método de quantificação empregado e o anticorpo
selecionado. Schor et al. (1998a) afirmaram que o pré-tratamento das secções histológicas é a
variável que mais exerce influência na estimativa da vascularização em espécimes teciduais.
Estes pesquisadores demonstraram, através de um estudo comparativo entre diferentes
metodologias destinadas à quantificação da angiogênese, que a variação no tipo de tratamento
dos espécimes teciduais (digestão enzimática e aquecimento) produzia diferentes valores de
índices angiogênicos colocando em questão o resultado da pesquisa. Perante estas
observações, no presente estudo, buscou-se seguir a reprodutibilidade das técnicas conforme
as determinações do fabricante do anticorpo utilizado (BOURNE, 1983), ressaltando-se, dessa
52
forma, a necessidade de se padronizar um protocolo para a determinação da angiogênese, pois
variações na metodologia poderiam ocasionar falhas na técnica de coloração e na obtenção do
índice angiogênico (DUFF et al., 2003; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007).
Devido às diferentes recomendações de técnicas destinadas à quantificação da
angiogênese (WEIDNER et al, 1991; PAZOUKI et al., 1997; MAEDA et al., 1995)
inicialmente foi realizada uma pequena avaliação da MVD, MVC e MVV e verificou-se que a
MVC foi o método de obtenção do índice angiogênico mais simples, efetivo e de fácil
aplicabilidade encontrado para a análise da angiogênese de tumores de cabeça e pescoço
(MAEDA et al., 1995; FRIDMAN et al., 2000; FREITAS et al., 2005; SOUZA; FREITAS;
MIRANDA, 2007).
Assim sendo, em relação ao método de contagem de microvasos, Jacquemier et al.
(1998) tentando estabelecer parâmetros comparativos de agressividade e sensibilidade
terapêutica em pacientes portadores de câncer de mama entre a determinação da MVC,
utilizando o anticorpo anti-CD31, e Erenoglu et al. (2000 buscando uma correlação e dados
clínicos patológicos do carcinoma gástrico, por intermédio da marcação do anticorpo anti-
fator VIII; certificaram que a MVC tem grande valor de prognóstico, especialmente na
indicação de pacientes com alto índice de recidiva e com necessidade de terapia pós-
operatória complementar. No entanto, Fridman et al. (1998) sugerem que essa técnica deve
ser bem mais estudada e otimizada antes de ser utilizada na rotina para a determinação
prognóstica nos mais variados tipos de cânceres humanos.
Ressaltou-se, neste estudo, que a expressão imunoistoquímica do anticorpo anti-CD34
nas lesões de LPO e PV foi restrita ao citoplasma das células endoteliais de revestimento e
aos grupamentos de células endoteliais as quais não formavam lúmen sendo, dessa forma,
equivalente com os trabalhos que afirmam que o anticorpo CD34 possui afinidade por
epítopos específicos de células endoteliais (MARTONE et al., 2005; SOARES et al., 2007;
YANG et al., 2006; NETTO et al., 2008).
De acordo com Kyzas, Agnantis e Stefanou (2006), poucos estudos existem sobre a
marcação do anticorpo CD-34 em vasos linfáticos, no entanto, nesta pesquisa, é possível que
dentre os vasos imunomarcados existam alguns do tipo linfático, porém de pouca
significância na avaliação da angiogênese. Durante a análise dos resultados verificou-se, de
forma cautelosa, a morfologia dos componentes celulares imunomarcados, evitando, desse
modo, erro na contagem microvascular, podendo-se afirmar que a maior parte da marcação
ocorreu no endotélio vascular dos espécimes estudados.
53
Verificou-se ainda que o CD34 reagiu preferencialmente com 100% dos casos de LPO
- reticular e erosivo e de PV, demonstrando que este marcador apresenta alta sensibilidade de
imunomarcação, fato verificado em diversas condições tumorais, conforme observado por
Traweek et al. (1991) em angiossarcomas, sarcoma de Kaposi e hemangioendotelioma
epitelioóide; Guttman et al. (2004) em carcinoma epidermóide de língua e Yang et al. (2006)
em carcinoma hepatocelular.
Somando-se a isso, de acordo com Heimburg et al. (1999), Yoshida et al. (1999) e Di
Carlo et al. (2002), o CD34 é o anticorpo de eleição na avaliação da angiogênese. Tais
afirmações não são similares aos achados de Saad et al. (2004), em um estudo realizado em
câncer colorretal, que recomendam o uso do anticorpo CD105 como marcador endotelial ideal
para a mensuração da angiogênese, bem como valor preditor de metástase em comparação
com os marcadores pan-endoteliais. Entretanto, nesta pesquisa, apesar de não ter sido lançado
mão de outro marcador para possível comparação, os espécimes submetidos à marcação com
CD34, exibiram um padrão de marcação uniforme e de fácil interpretação.
No estudo de Tao et al. (2007), no qual o anticorpo anti-CD34 foi utilizado para
auxilar na determinação da microdensidade vascular em casos de LPO, observou-se uma alta
marcação citoplasmática no endotélio vascular de todos os espécimes por esse marcador.
Além disso, foi ressaltado que a MVD no grupo dos pacientes com LPO foi
significativamente elevada em relação aos grupos controles.
Ao que diz respeito às lesões de LPO, os resultados deste estudo não foram
concordantes com as poucas pesquisas que avaliam a angiogênese nessas lesões, uma vez que
pôde-se observar ausência de diferença estatística significativa na determinação das médias da
contagem microvascular (MVC), entre as lesões de LPO reticular e os espécimes de mucosa
oral normal e entre as lesões de LPO erosivo e os espécimes de mucosa oral normal. Contudo,
quando comparamos a mediana da MVC, nesta pesquisa, entre as lesões de LPO e os
espécimes de mucosa oral normal ressalva-se que esta mostrou-se maior nos casos de LPO
dos que nos espécimes de mucosa oral normal; e que a mediana nas lesões de LPO erosivo foi
ligeiramente maior do que nos casos de LPO reticular.
Estes resultados são contrários aos encontrados no estudo de Scardina et al. (2009), o
qual observou uma maior expressão de CD34 em amostras de LPO (54,3%), bem como de
outros marcadores como o VEGF (64,2%), VCAM-1 (32,5%) e ICAM-1 (29,7%), levando-os
a concluir que o número de vasos sanguíneos em biópsias de pacientes com LPO estava
significativamente elevado (média ± DP: 21,27 ± 4,85) quando comparado com indivíduos
saudáveis (média ± DP: 4,74 ± 0,97).
54
Nossos resultados também foram discordantes dos encontrados na pesquisa de Mittal,
Shankari e Palaskar (2012), uma vez que também avaliando o índice angiogênico (MDV) com
o auxílio do imunomarcador CD34, os mesmos observaram diferença estatística significativa
entre as lesões de LPO (97,24 ± 42,887) e o grupo controle (44,47 ± 9,942).
Por sua vez, os resultados do estudo de Khalili, Eshghyar e Asgari (2013) também
foram diferentes dos nossos encontrados, o qual mostrou que utilizando a imunomarcação do
CD34 e CD105, a MDV em amostras de LPO foi significativamente maior do que nos casos
de mucosa oral normal (6,05 ± 0,86).
Quanto à expressão do CD34 entre lesões de LPO reticular e erosivo, nossa pesquisa
não encontrou diferença estatisticamente significativa entre ambas as lesões na avaliação da
MVC. Este resultado discordou dos encontrados por Mittal, Shankari e Palaskar (2012) e
Khalili, Eshghyar e Asgari (2013), uma vez que estes pesquisadores certificaram-se que as
lesões de LPO erosivo - (129,71 ± 49,253), (31,8 ± 5,39) apresentavam um maior índice
angiogênico quando comparadas com as lesões de LPO reticular – (84,61 ± 33,724). Ambos
os estudos concluem com seus respectivos resultados que a angiogênese seria um dos
principais fatores que contribuem na patogênese e progressão do líquen plano oral.
No que concerne às lesões de pênfigo vulgar, os resultados do nosso estudo não
mostraram diferença estatística significativa quando comparamos a MVC nas lesões de PV
com os espécimes de mucosa oral normal. Entretanto, quando observamos as medianas em
ambos os casos, podemos perceber que esta é ligeiramente maior nos casos de PV do que nos
espécimes de mucosa oral normal. Do mesmo modo, não observamos, em nossos resultados,
diferença estatisticamente significativa entre as lesões de PV e os casos de LPO reticular, nem
mesmo entre as lesões de PV e os casos de LPO erosivo. Contudo, podemos observar que a
mediana da MVC das lesões de PV é ligeiramente menor do que nos espécimes de LPO, tanto
nas lesões reticulares quanto nas erosivas.
Como este foi o primeiro estudo que tentou avaliar a angiogênese nessas lesões não
podemos comparar nossos resultados para se chegar a uma conclusão sobre essa questão.
Contudo, Cunha et al. (2004) e Lee (2011) relataram em seus respectivos casos clínicos uma
significativa remissão das lesões de pênfigo vulgar após a administração oral da talidomida;
sendo notado também o retorno das mesmas quando o uso desse medicamento era
interrompido. Porém, os mecanismos pelos quais a talidomida age no pênfigo ainda não estão
esclarecidos. Estes pesquisadores especularam que tal medicamento exerce seus benefícios
clínicos no PV através dos efeitos citocinas-moduladores e que agentes imunossupressores
podem interferir nesses efeitos da talidomida.
55
Adicionalmente, D’amato et al. (1994) observaram em modelos animais que a
talidomida apresenta propriedades antiangiogênicas, porém o mecanismo pelo qual isso
acontece é desconhecido. Mathews e McCoy (2003) observaram que essa inibição ocorria
apenas após a administração oral da talidomida, sugerindo a hipótese de que um metabólito
ativo é formado in vivo.
Sabendo que a talidomida suprime nos macrófagos a produção de TNF-α, que é
fracamente angiogênico in vivo; e age secundariamente induzindo uma inflamação, D’amato
et al. (2004) hipotetizaram, então, que a talidomida inibia diretamente um componente
essencial da angiogênese e não agia através do efeito da produção de TNF-α. Somando-se a
isso, Kruse et al. (1998), relataram que a talidomida inibe a angiogênese induzida pelo fator
de crescimento endotelial vascular (VEGF),o qual é um potente mediador da angiogênese
(TAO et al., 2007).
Diante dos estudos supracitados, acreditamos que por o PV ser uma doença crônica
autoimune inflamatória, assim como o LPO, e por apresentarem remissão da doença após o
uso da talidomida, uma droga com possíveis propriedades antiangiogênicas; estas lesões
supostamente poderiam apresentar um índice angiogênico significativamente maior do que os
casos de mucosa oral normal. No entanto, diante dos nossos resultados, podemos concluir que
apesar de estas lesões terem apresentado leve aumento do número de vasos sanguíneos em
relação ao grupo controle a insignificância estatística, de fato, nos impede de afirmar que
existe angiogênese nas lesões de pênfigo vulgar pertencentes a amostra desta pesquisa.
Isto posto, destacamos que o papel exato da angiogênese nas lesões crônicas
inflamatórias, aqui estudadas, e sua relação com a progressão e o desenvolvimento destas
ainda necessita ser esclarecido, com o objetivo de que o processo angiogênico possa ser mais
um parâmetro seguro a ser utilizado como ferramenta na identificação do potencial biológico
e como adjuvante nas técnicas terapêuticas disponíveis.
56
CONCLUSÕES
57
7 CONCLUSÕES
Os resultados encontrados no presente estudo permitem concluir que:
Foram encontrados maiores índices angiogênicos, medidos por intermédio do
imunomarcador CD34 no grupo de LPO (reticular e erosivo) quando comparados aos
espécimes de mucosa oral normal. Assim como os índices angiogênicos nas lesões de
LPO erosivo apresentaram-se ligeiramente superiores aos encontrados nas lesões
reticulares.
Os achados encontrados nesta pesquisa, associados aos dados relatados na literatura,
sugerem uma possível participação do processo angiogênico na patogênese e
progressão das lesões de líquen plano oral.
Não foram encontradas diferenças dos índices angiogênicos, quantificados através da
imunomarcação do CD34, entre as lesões de PV e os espécimes de mucosa oral
normal. Porém, pôde-se perceber um ligeiro aumento no número de vasos nas lesões
de PV em relação aos espécimes de mucosa oral normal.
Uma ligeira diminuição do número de vasos sanguíneos foi observada em lesões de
PV quando comparadas com as lesões de LPO (tanto as erosivas quanto as
reticulares), apesar de não terem sido encontradas diferenças dos índices angiogênicos
entre ambas as lesões. Estes resultados sugerem uma possível presença do processo
angiogênico nessas lesões. No entanto, este foi o primeiro estudo com a finalidade de
avaliar a angiogênese em lesões de pênfigo vulgar, nos impossibilitando de concluir
que este processo, de fato, possui papel importante na patogênese e progressão dessas
lesões. Sugerimos, portanto, que outros estudos sejam realizados a fim de que essa
hipótese seja fundamentada.
58
REFERÊNCIAS
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69
APÊNDICE
70
APÊNDICE
Ficha de avaliação dos índices angiogênicos determinados pela contagem
microvascular (MVC) em Pênfigo Vulgar de acordo com a expressão
imunoistoquímica do anticorpo CD34.
ÍNDICES ANGIOGÊNICOS PÊNFIGO VULGAR
CAMPOS CAMPOS
CASO 1 2 3 4 5 N°
Médio
de
Vasos
CASO 1 2 3 4 5 N°
Médio
de
Vasos
01 10
02 11
03 12
04 13
05 14
06 15
07 16
08 17
09 18
Ficha de avaliação dos índices angiogênicos determinados pela contagem
microvascular (MVC) em Mucosa Oral Normal de acordo com a expressão
imunoistoquímica do anticorpo CD34.
ÍNDICES ANGIOGÊNICOS MUCOSA ORAL NORMAL
CAMPOS CAMPOS
CASO 1 2 3 4 5 N°
Médio
de
Vasos
CASO 1 2 3 4 5 N°
Médio
de
Vasos
01 09
02 10
71
03 11
04 12
05 13
06 14
07 15
08
Ficha de avaliação dos índices angiogênicos determinados pela contagem
microvascular (MVC) em Líquen Plano Oral Erosivo de acordo com a expressão
imunoistoquímica do anticorpo CD34.
ÍNDICES ANGIOGÊNICOS LÍQUEN PLANO EROSIVO
CAMPOS CAMPOS
CASO 1 2 3 4 5 N°
Médio
de
Vasos
CASO 1 2 3 4 5 N°
Médio
de
Vasos
01 08
02 09
03 10
04 11
05 12
06 13
07 14
72
Ficha de avaliação dos índices angiogênicos determinados pela contagem
microvascular (MVC) em Líquen Plano Oral Reticular de acordo com a expressão
imunoistoquímica do anticorpo CD34.
ÍNDICES ANGIOGÊNICOS LÍQUEN PLANO RETICULAR
CAMPOS CAMPOS
CASO 1 2 3 4 5 N°
Médio
de
Vasos
CASO 1 2 3 4 5 N°
Médio
de
Vasos
01 14
02 15
03 16
04 17
05 18
06 19
07 20
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