MARIANA ALEJANDRA ROSAS FERNÁNDEZ

INTERFERÊNCIA DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR INTERMITENTE NA EXPRESSÃO

DOS FATORES LIPOGÊNICOS SREBP 1C E 2 E ACETIL-COA CARBOXILASE NO

HIPOTÁLAMO DE RATAS

MACAÉ

2017

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CAMPUS UFRJ-MACAÉ PROFESSOR ALOÍSIO TEIXEIRA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS BIOATIVOS E BIOCIÊNCIAS

MARIANA ALEJANDRA ROSAS FERNÁNDEZ

INTERFERÊNCIA DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR INTERMITENTE NA

EXPRESSÃO DOS FATORES LIPOGÊNICOS SREBP 1C E 2 E ACETIL-COA

CARBOXILASE NO HIPOTÁLAMO DE RATAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Produtos Bioativos e Biociências,

como requisito para a obtenção do grau de Mestre

em Ciências.

Orientadores: Profª Drª Kelse Tibau de Albuquerque

Prof. Dr. Leonardo Paes Cinelli

MACAÉ

2017

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CAMPUS UFRJ-MACAÉ PROFESSOR ALOÍSIO TEIXEIRA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS BIOATIVOS E BIOCIÊNCIAS

FOLHA DE APROVAÇÃO

MARIANA ALEJANDRA ROSAS FERNÁNDEZ

INTERFERÊNCIA DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR INTERMITENTE NA

EXPRESSÃO DOS FATORES LIPOGÊNICOS SREBP 1C E 2 E ACETIL-COA

CARBOXILASE NO HIPOTÁLAMO DE RATAS

Macaé, 15 de fevereiro de 2017

Profª Kelse Tibau de Albuquerque – Doutora em Ciências

Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus UFRJ-Macaé

___________________________________________

Profª Fátima Lúcia de Carvalho Sardinha - Doutora em Ciências

Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus UFRJ

___________________________________________

Profª Vivian de Oliveira Sousa Corrêa - Doutora em Ciências

Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus UFRJ-Macaé

___________________________________________

Profª José Roberto da Silva - Doutor em Ciências

Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus UFRJ-Macaé

___________________________________________

DEDICATÓRIA

A minha grande família, que na minha decisão de partir para longe de casa na busca dos

meus sonhos, sempre me apoiou e confortou entre brincadeiras e palavras de alento a

nunca me deixar cair.

Mãe, mulher forte e de palavra precisa, aprendi d e você a nunca me render, a que na vida,

é necessário parar para pensar, e que pode uma pessoa estar triste e chorar, mas logo

depois, tem que começar de novo e com mais força.

Papai, teu carinho e ternura estão sempre comigo e me confortam para seguir no meu

caminho, por acreditar em mim, ainda quando eu esteja duvidando.

Goyita e Peto, por serem também meus pais, que com o coração partido me deixaram

partir, pelo grande amor que nós temos. Os pais grandes que Deus me deu, avós que me

chamam de filha, e esta, sua neta, que lhes chama de pais, amo vocês.

Meus irmãos, doidos, lindos, queridos: Hugo, Caro, Queque, Ricar e Sofi, qualquer

momento simples, acaba sendo o melhor com vocês, numa coleção de lembranças que

nunca acabam e histórias para contar uma e outra vez.

Ao amor da minha vida, Josefito, por me mimar, por me querer, por me suportar, porque

chegamos sem ninguém, mas nunca ficamos sozinhos, sempre estivemos juntos, nos bons

e maus momentos, meu eterno companheiro.

AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a Deus, que permite todas as coisas que tem de acontecer, e

as que não, também, mas que sempre põe no meu coração a forca da qual preciso.

A minha querida orientadora, a Profa. Kelse Tibau de Albuquerque, porque sem me

conhecer me deu a oportunidade que eu precisava. Por cada momento de aprendizagem,

porque cheguei sabendo pouco, mas você nunca me deixou, estarei eternamente grata,

pela sua paciência comigo, seu carinho, sua confiança, por ser minha mestra e meu

modelo.

Ao professor Leonardo Cinelli, por me receber em seu nome no programa de pós-

graduação e contribuir para a realização do meu sono.

A meu professor e amigo, Leandro Oliveira Batista, porque você foi meu mestre desde o

primeiro dia que entrei no laboratório e com muita paciência me ensinou todas as coisas

que precisei para realizar meu projeto.

Por fim, meu respeito por seu sacrifício a aqueles que fizeram possível a realização deste

trabalho.

EPÍGRAFE

Algum dia tudo fará sentido. Enquanto isso, ria da confusão,

chore pouco, e entenda que tudo acontece por alguma razão.

Paulo Coelho.

RESUMO

A obesidade é um problema mundial que provoca graves consequências para a saúde. Na

tentativa de seu controle, a restrição alimentar intermitente (RAI) tem sido uma estratégia

amplamente utilizada pela população para a perda rápida de massa corporal. Contudo há

poucas evidências quanto aos efeitos desta estratégia no sistema nervoso central. No

presente trabalho, avaliamos em ratas saudáveis se a RAI promove alteração das proteínas

que integram a via lipogênica hipotalâmica. Sessenta fêmeas Wistar, com 67 dias de vida,

foram distribuídas nos grupos Controle (C, ração comercial ad libitum), Restrito 3 (R3,

mantido 2 dias com ração à 50% do C, seguido de 3 dias de realimentação ad libitum) e

o Restrito 5 (R5, mantido 2 dias com ração à 50% do C, seguido de 5 dias de

realimentação ad libitum) durante 6 semanas. Os grupos R3 e R5 mostraram menor

ingestão acumulada (R3: p=0,001; R5: p=0,006) no período, porém o consumo imediato

pós-restrição de ambos os grupos mostraram-se elevados vs. C (R3: p<0,0001; R5: p<

0,0001). O grupo R5 teve menor ganho de massa corporal total vs. C (p=0,0001). O teor

sérico de glicose aumentou em ambos os grupos (R3: p=0,007; R5: p=0,001), enquanto

a triacilglicerolemia (TG) e o teor de gordura mesentérica (MES) foram maiores no R3

(TG: p=0,018; MES: p=0,001) vs. C. No hipotálamo foram observadas diferenças

estatísticas na expressão dos fatores de transcrição, na proteína ligadora do elemento

regulado por esteróis (SREBP) 1c (C: 1,02 ± 0,18; R3: 0,72 ± 0,19; R5: 2,32 ± 0,43) do

grupo R5 vs. C (p<0,04) e vs. R3 (p<0,04) e do SREBP 2 (C: 0,72 ± 0,14; R3: 2,04 ±

0,47; R5: 2,06 ± 0,21) do grupo R5 e R3 vs. C (R3: p=0,42; R5: p=0,39). O teor da

enzima Acetil-CoA carboxilase (ACC) não diferiu entre os grupos. Concluímos que RAI

promoveu perda de massa corporal com prejuízos na glicose sérica e adiposidade visceral

e na expressão hipotalâmica do fator de transcrição lipogênico SREBP.

Palavras-chave: restrição alimentar intermitente, tecido adiposo visceral, ACC, SREBP,

hipotálamo.

ABSTRACT

Obesity is a worldwide problem, which causes serious health consequences. In an attempt

to control it, intermittent food restriction (IFR) has been a strategy widely used by the

population for the rapid loss of body mass. However there is little evidence with respect

to the effects of this strategy over the central nervous system. In the present work we

evaluated in healthy rats whether IFR could lead to alterations in the content of proteins

that integrate the hypothalamic lipogenic pathway. Sixty Wistar females rats, 67 days old,

were distributed in the Control (C, feed with Chow diet ad libitum), Restricted 3 (R3,

maintained 2 days with Chow diet at 50% C, followed by 3 days feeding ad libitum ) and

Restricted 5 (R5, maintained 2 days with Chow diet at 50% C, followed by 5 days feeding

ad libitum) for 6 weeks. The groups R3 and R5 showed lower cumulative food intake

(R3: p=0.001; R5: p=0.006) over the period of investigation, but the immediate post-

restraint consumption of both groups proved to be higher vs. C (R 3: p <0.0001; R 5: p

<0.0001). The R5 group had lower total body mass gain vs. C (p=0.0001). The serum

glucose increased in both groups (R3: p=0.007, R5: p=0.001), whereas triacylglycerol

(TG) and mesenteric fat depot (MFD) contents were higher in R3 (TG: p = 0.018; MFD:

p=0.001) vs. C. In the hypothalamus, statistical differences were observed in the

expression of the transcription factors SREBP-1c (C: 1.02 ± 0.18; R3: 0.72 ± 0.19; R5:

2.32 ± 0.43) in the R5 group vs. C (R5: p <0.04) and vs. R3 (p <0.04) and SREBP 2 (C:

0.72 ± 0.14; R3: 2.04 ± 0.47; R5: 2 , 06 ± 0.21) of the R5 group and R3 vs. C (R3: p=0.42,

R5: p=0.39) .The content of the ACC enzyme did not differ between groups. We conclude

that IFR led to loss of body mass with alterations of blood glucose level and visceral

adiposity and hypothalamic expression of the lipogenesis transcription factor SREBP.

Key words: intermittent food restriction, visceral adipose tissue, ACC, SREBP,

hypothalamus.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Da Revisão de literatura

Figura 1 - Integração de sinais metabólicos periféricos e controle central da

homeostase energética

3

Figura 2 - Fatores de transcrição Sterol Regulatory Element-Binding Protein -

SREBP

6

Figura 3 - Efeito da obesidade sobre as adipocinas e desordens metabólicas 8

Figura 4 - Distribuição dos depósitos de gordura branco e marrom em humanos

e roedores

10

Do Material e métodos

Figura 5 - Esquema de tratamento dos grupos 18

Dos Resultados – Artigo

Figura 1 - Consumo alimentar, massa corporal e consumo pós-jejum 27

Figura 2 - Teor dos depósitos de gordura mesentérico, retroperitoneal e gonadal 28

Figura 3 - Concentração sérica de glicose e triacilglicerol 29

Figura 4 - Expressão hipotalâmica de fatores de transcrição SREBP e ACC 30

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACC Acetil coenzima A carboxilase

AgRP Proteína relacionada ao gene Agout

AGS Ácido graxo sintase

AMPK Proteína quinase ativada pelo AMP

ARC Núcleo arqueado

ATP Trifosfato de adenosina

C/EBPα Proteína vinculada ao potenciador CCAAT

CART Transcrito regulado por cocaína e anfetamina

EM Enzima málica

FOXO1 Forkhead box O 1

Fsp27 Proteína específica de gordura 27

HDL Lipoproteína de alta densidade

HLS Hormônio sensível à lipase

IL-6 Interleukina 6

IRS Substratos receptores de insulina

JACK2 Janus quinase 2

LDL Lipoproteína de baixa densidade

NPY Neuropeptídio Y

NTS Núcleo do trato solitário

ObRb Receptor específico de leptina

PI3q Fosfatidilinositol-3-quinase

PKA Proteína quinase A

PKB/Akt Proteína quinase B

POMC Proopiomelanocortina

PPARs Receptores ativados pelos proliferadores de peroxisomas

RAI Restrição alimentar intermitente

RNA Ácido ribonucleico

SNC Sistema nervoso central

SREBP Proteína ligadora do elemento regulado por esteróis

STAT3 Transdutor do sinal ativador de transcrição 3

TNF-α Fator de necrose tumoral α

UCP-1 Proteína desacopladora 1

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 01

2 REVISÃO DE LITERATURA 03

2.1 Regulação da ingestão alimentar 03

2.2 Tecido adiposo 07

2.3 Restrição alimentar intermitente 13

3 OBJETIVOS 16

3.1 Objetivo geral 16

3.2 Objetivos específicos 16

4 MATERIAL E MÉTODOS 17

4.1 Condições experimentais 17

4.2 Desenho experimental 17

4.3 Protocolo de intermitência alimentar 17

4.4 Avaliação de parâmetros nutricionais 18

4.5 Avaliação sérica 18

4.6 Avaliação da expressão hipotalâmica do SREBP e ACC 19

4.7 Análise de dados 20

5 RESULTADOS 21

Artigo 22

Resumo 22

Introdução 23

Material e Métodos 25

Resultados 27

Discussão 31

Referências 36

6 CONCLUSÕES 41

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42

ANEXO 48

1

1 INTRODUÇÃO

A obesidade é um problema mundial e frequentemente surgem estratégias para a

reversão ou controle da sua prevalência. Contudo, apesar de que levam à perda de massa

corporal, nem sempre dispõem de fundamentação científica. Nesta perspectiva, há muitos

anos a restrição alimentar intermitente é utilizada com vistas à redução da massa corporal

(TINSLEY & LA BOUNTY, 2015), mas ainda pouco se sabe sobre as repercussões dessa

estratégia sobre os mecanismos centrais de regulação da lipogênese e modulação da

homeostase energética.

A obesidade é uma desordem metabólica que reúne alterações periféricas e

centrais (CINTRA; ROPELLE & PAULI, 2011), e apesar de estudos demonstrarem que

a aplicação da restrição alimentar intermitente promove redução da massa corporal em

humanos (HARVIE et al., 2011; KLEMPEL et al., 2012) e roedores (KARBOWSKA &

KOCHAN, 2012), não se têm apontadas quais as alterações nos mecanismos de controle

da ingestão alimentar são revertidas por este método, de forma a induzir a perda de massa

e possivelmente limitar o crescimento compensatório (efeito “sanfona”), comum em

indivíduos com rápida perda de massa corporal.

A homeostase energética resulta da atuação integrada de vários fatores periféricos

e centrais e, dada a complexidade da regulação da integração destes mecanismos, os

estudos que buscam a compreensão da ação de fatores dietéticos sobre o desfecho

metabólico no controle da obesidade tornam-se relevantes.

A lipogênese é um processo ativo no desenvolvimento da obesidade. Contudo, o

tecido adiposo, nos últimos anos, assumiu papel importante na obesidade, tendo em vista

a sua distribuição anatômica e o perfil histológico, que confere a cada depósito de gordura

características peculiares e consequente participação em desordens metabólicas

(BJØRNDAL et al., 2011). É também o tecido alvo nos programas de redução da massa

corporal. Entretanto, a mobilização de seus estoques de gordura depende da atividade

integrada de enzimas lipogênicas, hormônios e fatores de transcrição nuclear (SANDERS

& GRIFFIN, 2016) que modulam o processo de lipogênese.

A investigação de alterações no sistema nervoso central, guardada as possíveis

análises por imagem ou de material periférico que permitem fazer relações centrais,

demanda metodologia invasiva e dessa forma estudos em modelo animal tem importante

papel científico na compreensão de mecanismos biológicos. Assim, a presente

2

investigação estabeleceu modelo de ratas saudáveis para aplicar o método de restrição

alimentar intermitente e avaliar as repercussões sobre a adiposidade e atividade da via

lipogênica hipotalâmica.

3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Regulação central da ingestão alimentar

O sistema nervoso central (SNC) é alvo de estudos na gênese da obesidade, porém

o controle da ingestão alimentar e do gasto energético é complexo e envolve diferentes

mensageiros (CINTRA; ROPELLE & PAULI, 2011; SCHWARTZ et al., 2000). O

cérebro integra sinais metabólicos provenientes de tecidos periféricos, como fígado,

pâncreas, tecido adiposo, intestino e músculo, o que promove ajustes no neurocircuito, e

as condições metabólicas percebidas em tempo real determinam a resposta sobre a

ingestão alimentar e o gasto energético (ROH; SONG & KIM, 2016) (Figura 1).

Figura 1. Integração de sinais metabólicos periféricos e controle central da

homeostase energética. No estado de jejum, o hipotálamo recebe sinais provenientes

da periferia e responde ativando neurônios orexígenos e inibindo os anorexígenos

(lado esquerdo). No estado pós-prandial o hipotálamo recebe sinais de saciedade

provenientes da periferia, e responde ativando neurônios anorexígenos e inibindo os

orexígenos (lado direito). Neuropeptídio Y (NPY), proteína relacionada ao gene

Agout (AgRP), proopiomelanocortina (POMC), transcrito regulado por cocaína e

anfetamina (CART), núcleo arqueado (ARC), polipeptido YY (PPY),

colecistoquinina (CCK). (Adaptado de ROH; SONG & KIM, 2016)

ESTADO DE JEJUM ESTADO PÓS-PRANDIAL

Nervo Vago

NPYAgRP

POMCCART

ARC

Grelina

Trato gastrointestinal

NPYAgRP

POMCCART

Insulina Nervo VagoPPY/

CCK

Trato gastrointestinal

Tecido adiposo

Leptina

ARC

Pâncreas

4

O hipotálamo é o centro de integração das informações periféricas e centrais, de

onde partem as respostas orexígenas ou anorexígenas de regulação energética (DAMIANI

& DAMIANI, 2011). Do ponto de vista morfológico, este centro é dividido em seis

regiões. Porém, o núcleo arqueado (ARC) no hipotálamo e o núcleo do trato solitário

(NTS), no tronco encefálico, são os principais locais de convergência e integração dos

sinais periféricos, como hormônios, nutrientes e adipocinas e os centrais, como

neuropetídeos (WATERSON; HORVATH, 2015).

No ARC, neurônios sensíveis ao estado de energia do organismo, seja este, jejum

ou pós-prandial, produzem neuropeptídio Y (NPY), proteína relacionada ao gene agout

(AgRP) e proopiomelanocortina (POMC), os quais promovem a regulação homeostática

de energia. As respostas orexígenas são determinadas pelo NPY e AgRP, bem como pelas

orexinas, galanina e noradrenalina; enquanto o estímulo anorexígeno decorre de ações da

POMC e também do transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART), interleucina

1β e serotonina (CORNEJO et al., 2016).

Dentre os sinais hormonais periféricos, estão os hormônios leptina e insulina, que

agem no SNC ativando POMC e CART. Ambos hormônios agem mediados por seus

respectivos receptores e desencadeiam uma sequência de sinais que resultam na sua

resposta hipotalâmica de inibição da ingestão (LAU & HERZOG, 2014; SOBRINO

CRESPO et al., 2014).

A ação da insulina, hormônio secretado pelo pâncreas, é mediada por seu receptor

transmembrana, que ao ligar-se ao hormônio se autofosforila e desencadeia uma

sequência de fosforilações dos seus substratos receptores (IRS) e da proteína Akt ou PKB,

a qual encerra a cascata e determina a resposta inibitória da alimentação (BOUCHER;

KLEINRIDDERS & KAHN, 2014). De forma semelhante, a leptina, hormônio secretado

pelo tecido adiposo proporcionalmente a sua massa total, é um mediador anorexígeno que

reduz a ingestão alimentar por agir por meio de receptor específico, o ObRb no

hipotálamo.

A ligação da leptina com seu receptor permite o recrutamento de um segundo

receptor próximo, formando assim uma estrutura temporalmente dimérica. Essa

modificação transitória, induz a atividade catalítica da enzima JACK2 (Janus quinase 2),

a qual se autofosforila em resíduos tirosina quinase, ativando o domínio SHP2 (CINTRA;

ROPELLE & PAULI, 2011), que por sua vez ativa AMPK e a STAT3 (transdutor do sinal

5

ativador de transcrição 3), que migra ao núcleo controlando a expressão de

neurotransmissores que respondem à leptina. Além disso, a JACK2 fosforila os substratos

do receptor de insulina (IRS), sobretudo IRS2, potencializando o sinal da insulina por

ativar a proteína 3 quinase (PI3q) e Akt/PKB. Desta forma, a insulina e a leptina atuam

em associação no controle da ingestão alimentar, uma vez que regulam a expressão e

liberação de neurotransmissores no ARC do hipotálamo (KWON; KIM & KIM, 2016).

Modelos específicos de camundongos com ausência do receptor de leptina apresentam

comportamento hiperfágico, são obesos e diabéticos (NIKI et al., 2015).

O SNC apresenta enzimas lipogênicas, porém este não é caracterizado como tecido

lipogênico, mas sim, está relacionado com o controle da ingestão alimentar. No

hipotálamo, o teor tanto dos intermediários como dos produtos finais da via lipogênica,

são determinantes no controle da homeostase energética (KARAMI et al., 2006). O

incremento dos níveis de malonil CoA no hipotálamo indica que há um excedente de

energia no organismo, o que leva a uma rápida regulação da oxidação de ácidos graxos

no musculo esquelético. Assim, os teores de malonil CoA serão decisivos no destino dos

ácidos graxos, seja para serem oxidados ou para serem estocados (SWIERCZYNSKI et

al., 2008).

A enzima envolvida na conversão de acetil CoA em malonil CoA é a acetil CoA

carboxilase (ACC). Existem duas isoformas diferentes dessa enzima lipogênica, sendo a

isoforma ACC1 expressa principalmente no tecido adiposo e no fígado, que apresentam

maior atividade lipogênica, enquanto a isoforma ACC2, expressa no hipotálamo,

apresenta função mais relacionada com o sinal de saciedade. Os níveis de malonil CoA

caem uma vez que a enzima ácido graxo sintase (AGS), utiliza este substrato para a

conversão dos ácidos graxos. Inibidores da AGS, administrados via

cerebrointraventricular, levaram à diminuição da ingestão alimentar com a diminuição de

NPY/ AgRP e o aumento de POMC/CART (CHEN et al., 2014).

O organismo possui sistemas que regulam a homeostase energética e a adiposidade

e ambos os processos envolvem a participação de vários fatores de transcrição nuclear

incluindo SREBP-1c e 2, envolvidos na via lipogênica (FERRÉ & FOUFELLE, 2007;

XIAO & SONG, 2013).

6

O fator de transcrição nuclear “proteína ligadora do elemento regulado por esteróis”

(SREBP) compreende uma família de fatores que ativam genes que codificam enzimas

reguladoras da biossíntese de ácidos graxos (XIAO & SONG, 2013) (Figura 2). Dentre

as isoformas do SREBP, a 1c aumenta preferencialmente a transcrição de genes

envolvidos na síntese de ácidos graxos, enquanto a SREBP 2 ativa genes da via de síntese

de colesterol. Portanto, a isoforma 1c desempenha papel fundamental no metabolismo de

ácidos graxos. Contudo, há estudos que relatam que a atividade do SREBP 2 pode

compensar falhas no 1c, e suprir o déficit daquele fator de transcrição (HORTON, 2002).

Figura 2. Fatores de transcrição nuclear Proteína ligadora do elemento

regulado por esteróis (SREBP). Família de fatores que ativam genes que

codificam enzimas reguladoras da biossíntese de ácidos graxos (SREBP-1c e 1a) e colesterol (SREBP-2).

A inflamação de baixa intensidade é característica na obesidade, uma vez que o

adipócito hipertrofiado é mais propenso a hipóxia e apoptose. Esse quadro leva à

infiltração de monócitos e aumento no acúmulo de macrófagos, iniciando o processo

inflamatório de baixo grau, com a produção de citocinas pró-inflamatórias, responsáveis

pela gênese de distúrbios metabólicos, principalmente pela resistência à insulina (CHEN

et al., 2015). Da mesma forma, o hipotálamo pode se ver afetado por este processo

inflamatório, que leva a defeitos na transdução de sinal da insulina e leptina, gerando

SREBP

Proteína ligadora do elemento regulado por esteróis

7

distúrbios na sinalização de neurônios especializados no controle da fome, saciedade e

termogênese (KÄLIN et al., 2015).

Consequências da inflamação, ainda mais críticas, produzidas por adipocinas, como

a apoptose de células neuronais, acabam levando a prejuízos, quando situações de fome

tornam-se impossíveis de controlar, o que leva a ciclos repetidos de respostas orexígenas

e o aumento descontrolado da massa corporal (PUIG et al., 2015).

2.2 Tecido adiposo

O tecido adiposo, além da função de reservatório de energia, é considerado o

maior órgão endócrino ativo, secretando vários fatores bioativos, denominadas

adipocinas (HARWOOD, 2012). A epidemia da obesidade tem levado à ampliação das

características biológicas e metabólicas associadas a este tecido, bem como a clareza

sobre a interação com outros órgãos e tecidos, o chamado crosstalk inter-órgão, como o

fígado, músculo esquelético, pâncreas e coração (KIM & MOUSTAID-MOUSSA, 2000)

(Figura 3). A unidade celular endócrina e funcional do tecido é o adipócito, o qual atua

de forma parácrina e autócrina para a regulação tanto das células do tecido quanto no

crosstalk e, assim, emite sinais que integram o controle da homeostase energética

(SMITKA & MAREŠOVÁ, 2015).

8

Figura 3. Efeito da obesidade sobre as adipocinas e desordens

metabólicas (Adaptado HARWOOD, 2012). Ácidos graxos livres

(AGL), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), interleuquina 6

(IL-6), lipídios de muita baixa densidade (VLDL)

De fato, durante períodos de balanço energético negativo, vários mecanismos são

ativados para a preservação dos estoques de energia e, dada a complexidade desta

regulação, o tratamento da obesidade é difícil. Os prejuízos da obesidade e síndrome

metabólica parecem depender da distribuição da gordura corporal e evidências mostram

que a localização da gordura abdominal é mais fortemente correlacionada com a síndrome

metabólica do que a gordura periférica (HARWOOD, 2012).

Para que os adipócitos se tornem funcionais, devem passar pelo processo de

adipogênese, o qual é controlado por fatores de transcrição encarregados da diferenciação

dos pré-adipócitos em adipócitos. Este processo pode ser afetado de forma positiva ou

negativa por sinais hormonais e nutricionais (ALZAMENDI et al., 2016; ZUBIRÍA et al.,

2016). A participação de proteínas, como os receptores ativados pelos proliferadores de

Tecido adiposo gordo

Ingestão alimentar

Gasto energético

Produção glicose hepática

Disfunção endotelial

Adesão vascular

Aterosclerose

Hipernutrição

Expansão do tecido adiposo

Infiltração de macrófago

Aumento do nº e tamanho do adipócito

Inflamação

Oxidação de lipídios

Esteatose

Resistência à insulina

Glicogenólise

Gliconeogênese

Produção de glicose

Produção de VLDL

Glicemia Dislipidemia

Inflamação - Oxidação de AG

Capitação de glicose

Resistência à insulina

Secreção de insulina

Função células-beta

Falha de células-beta

Secreção desregulada de adipocinas:

ADIPÓCITOS MACRÓFAGOS

Adiponectina Resistina TNF-alfa

Leptina AGL IL-6

RESISTÊNCIA SISTÊMICA À INSULINA SÍNDROME METABÓLICA DIABETES TIPO 2 DESORDEM CARDIOVASCULAR

Tecido adiposo magro

9

peroxissomos (PPARs) e fatores de transcrição nuclear, como o SREBP-1c, torna-se

indispensável neste processo e, mudanças na expressão dessas proteínas podem

influenciar tanto a diferenciação, como a função metabólica da célula adiposa (MOSETI;

REGASSA & KIM, 2016; LEFTEROVA et al., 2014).

Nos mamíferos, o tecido adiposo apresenta diferenças histológicas dos seus

adipócitos, sendo reconhecido como tecido adiposo marrom e branco e, mais

recentemente, o bege. Inicialmente, acreditava-se que o tecido adiposo marrom estava

presente unicamente em recém-nascidos e crianças, mas estudos recentes mostram que

este tecido segue funcional em adultos. É um tecido especializado na produção de calor,

o que guarda forte relação com o grande número de mitocôndrias contendo UCP-1

(proteína desacopladora 1). A UCP-1 impede a formação de ATP permitindo que a

energia seja dissipada em forma de calor (termogênese) (BETZ & ENERBÄCK, 2015).

A alta concentração da enzima citocromo oxidase na mitocôndria do adipócito contribui

para sua cor escura (FONSECA-ALANIZ et al., 2007).

O tecido adiposo marrom, apesar de escasso em adultos, encontra-se localizado nas

regiões cervical, supraescapular, axilar e paraventral, enquanto em crianças recém-

nascidas se concentra nas regiões interescapular e perirrenal. Nos roedores localiza-se nas

áreas cervical, interescapular, axilar e mediastinal e cumpre função similar a dos humanos

(CHOE et al., 2016) (Figura 4). Indivíduos com tecido adiposo marrom mostraram

aumento do gasto energético em repouso, melhora na disponiblidade de glicose, assim

como melhora na resistência à insulina (BLONDIN et al., 2014; CHONDRONIKOLA et

al., 2014).

10

Painel A – Humanos

Painel B - Roedores

Figura 4. Distribuição dos depósitos de gordura branco e

marrom em humanos (Painel A) e em roedores (Painel B)

(adaptado de CHOE et al., 2016).

O tecido adiposo branco é o mais abundante no corpo humano e sua função

principal é reserva de energia, além de oferecer também proteção mecânica aos órgãos e

vísceras (SETHI & VIDAL-PUIG, 2007). De acordo com a anatomia, o tecido adiposo

branco está amplamente distribuído entre as vísceras (adiposo visceral), como os

depósitos de gordura mesentérico, retroperitoneal, perirrenal e gonadal (epididimal e

periovário), e sob a pele, como tecido subcutâneo, tipo anterior e posterior, o qual

TECIDO ADIPOSO MARROM

TECIDO ADIPOSO BRANCO VISCERAL

TECIDO ADIPOSO BRANCO SUBCUTÂNEO

SupraclavicularParavertebral

PerirenalRetroperitonealOmentalMesentérico

AbdominalGlutealFemoral

TECIDO ADIPOSO MARROM

TECIDO ADIPOSO BRANCO VISCERAL

TECIDO ADIPOSO BRANCO SUBCUTÂNEO

PerirenalRetroperitonealMesentérico Gonadal (epididimal e periovárico)

CervicalInterescapular

AxilarMediastinal

Anterior

PosteriorDorsolombar

InguinalGlúteo

11

apresenta 3 importantes depósitos: inguinal (abdominal), glúteo e dorsolombar (área

femural) (CHOE et al., 2016). Os adipócitos brancos são rodeados por tecido conectivo

altamente vascularizado e inervado e contêm fibroblastos, macrófagos e pré-adipócitos,

além de outros tipos de células (AHIMA, 2006).

Os adipócitos possuem enzimas e proteínas reguladoras da síntese de ácidos graxos

(lipogênese), que são armazenados na forma de triacilgliceróis nos períodos de abundante

oferta de energia, ou degradados a ácido graxo e glicerol (lipólise), quando a demanda

energética supera a oferta. Este tecido é facilmente modificado, e mudanças na

alimentação, tais como jejum, realimentação e composição da dieta, podem influenciar a

lipogênese e lipólise (PROENÇA et al., 2014).

Do ponto de vista energético, durante o jejum, os ácidos graxos liberados do tecido

adiposo branco são parcialmente oxidados pelo músculo esquelético e fígado, gerando

corpos cetônicos que servem como substrato energético para o cérebro e também órgãos

periféricos (AHIMA, 2006). Além disso, o tecido adiposo branco apresenta excepcional

atividade secretória, liberando na circulação adipocinas que participam do metabolismo

energético por regular processos em tecidos periféricos como no fígado e músculo, e no

SNC como no hipotálamo (GALIC; OAKHILL & STEINBERG, 2010).

Os adipócitos dos diferentes depósitos de gordura, apresentam participação

específica sobre a expressão de genes, o que pode explicar, em parte, a diferença na

distribuição de gordura nos diferentes tipos de obesidade e no desenvolvimento de

desordens metabólicas (TRUJILLO & SCHERER, 2006). O tecido adiposo bege situa-se

entre o tecido adiposo branco e o marrom, apresenta características de ambas as células

adiposas, brancas e bege, e sua função ainda não está totalmente esclarecida. Sugere-se

que sob de baixas temperaturas, a célula bege, pode escurecer e adquirir características

morfológicas e funcionais similares ao tecido marrom (CEDIKOVA et al., 2016).

Do ponto de vista endócrino, as diferenças funcionais mais conhecidas dos

adipócitos dos diferentes depósitos são relacionadas a fatores extrínsecos. O efeito da

insulina sobre o metabolismo e função endócrina dos adipócitos é mais prevalente no

subcutâneo do que no visceral, enquanto que o efeito das catecolaminas e glicocorticóides

são maiores no visceral vs. subcutâneo (MARCADENTI & DE ABREU-SILVA, 2015).

Tais diferenças parecem ser atribuídas ao número de receptores para estes hormônios,

como pode ser devido à redução da sensibilidade dos próprios receptores como

12

demonstrado com a insulina. O fato é que alterações das respostas hormonais resultam

em mobilização mais elevada de ácidos graxos livres dos depósitos viscerais do que do

subcutâneo (HARWOOD, 2012).

A síntese ou oxidação de ácidos graxos depende do período alimentar no qual o

organismo se encontra, pós-prandial ou jejum. Desta forma, a lipogênese, será ativada no

período pós-prandial, na presença de carboidratos ou outras fontes de energia da dieta, e

inibido em condições de jejum. Aumento nas concentrações circulantes de insulina,

induzem a atividade de enzimas relacionadas a lipogênese, tais como ácido graxo sintase

(AGS), acetil coenzima A carboxilase (ACC) e a enzima málica (EM), assim como o

aumento da expressão gênica destas enzimas, uma vez que estimula o fator de transcrição

SREBP-1c, fundamental na regulação da expressão das enzimas lipogênicas. A expressão

do fator de transcrição SREBP-1c no tecido adiposo encontra-se aumentada em período

de realimentação, a qual é promovida pela insulina, que ativa a lipogênese e inibe a

lipólise. (SANDERS & GRIFFIN, 2016).

Em condições de jejum, as enzimas lipolíticas são ativadas no tecido adiposo. A

lipólise é estimulada pela ação do glucagon e catecolaminas nos adipócitos mediante a

ativação da proteína quinase A (PKA), a qual inibe a ação da perilipina e ativa a lipase

hormônio sensível (HLS). Esta cascata resulta na mobilização de ácidos graxos, os quais

serão transportados aos diferentes tecidos para serem oxidados. A geração de glicose

ocorre a partir do glicerol, por meio da gliconeogênese (SAPONARO et al., 2015).

A leptina e a adiponectina atuam na regulação do balanço energético, podendo a

leptina aumentar o gasto e diminuir o consumo energético, (PARK & AHIMA, 2015) e a

adiponectina diminuir a esterificação dos triacilgliceróis e aumentar a oxidação de ácidos

graxos (LEE & SHAO, 2014). Outras secreções do tecido adiposo, como o fator de

necrose tumoral α (TNF-α), a interleucina 6 (IL-6) e o proteína quimiotáctica de

monócitos 1 (RODRÍGUEZ et al., 2015) exercem respostas pró-inflamatórias ou

migração celular, além de outras proteínas com funções biológicas, tais como resistina,

inibidor do ativador do plasminogénio 1, proteína de ligação ao retinol 4 e outras

envolvidas nos efeitos sistêmicos (SMITKA & MAREŠOVÁ, 2015).

No curso da obesidade, o adipócito sofre perda de suas capacidades, o que tem sido

relacionado com a hipertrofia do adipócito, desequilíbrio entre a lipogênese e lipólise,

falta da sensibilidade a sinais externos, assim como falha no processo de transdução de

13

sinais (RUTKOWSKI; STERN & SCHERER, 2015). Tais eventos modificam a utilização

dos ácidos graxos, conduzindo a lipotoxicidade em tecidos não adiposos, como o fígado,

pâncreas, coração entre outros (JUNG et al., 2015).

2.3 Restrição alimentar intermitente

Durante anos foram utilizadas diferentes abordagens dietéticas para o tratamento da

obesidade, mas há consenso entre diversas sociedades científicas de que a dieta

hipocalórica tradicional segue como a mais eficaz para a perda de massa corporal. Em

geral, este regime, recomenda diminuição de 500-1000 kcal, com oferta não inferior a

800 kcal diárias, além de ser equilibrada e manter a quantidade recomendada de

macronutrientes para a população geral (FESNAD-SEEDO, 2011).

A dificuldade da permanência numa dieta do tipo hipocalórica, seja pela pouca

adesão, como o escasso tempo para sua realização, por causa do estilo de vida atual, faz

com que esta estratégia de perda de massa corporal seja difícil de ser mantida (FESNAD-

SEEDO, 2011; KOEHNLEIN; SALADO & NUNES, 2008). Nesse cenário surgem

padrões alimentares que propõem reproduzir efeitos similares da dieta hipocalórica

(HOFMEKLER, 2007; SWEETSER, 2010; HARRISON, 2013; SKINNER, 2013).

Conhecido como jejum ou restrição alimentar intermitente, essa regime recomenda

a realização de jejum total ou parcial em dias alternados, deixando livre a escolha do(s)

dia(s) na semana para a realização do jejum ou restrição. O indivíduo pode optar por

suprimir uma refeição diária, seja o café da manhã, o almoço ou o jantar, sendo o mais

recomendado pular o café da manhã no caso da diminuição da frequência alimentar

(TINSLEY & LA BOUNTY, 2015). Desta forma, torna-se acessível para a população,

que poderá escolher o tipo de jejum mais adequado ao seu estilo de vida.

Pesquisas realizadas em humanos mostraram benefícios, tais como a perda de

massa corporal, tanto em pessoas saudáveis (HEILBRONN et al., 2005), como naquelas

com sobrepeso e obesidade (HARVIE et al., 2011; KLEMPEL et al., 2012). Outros

estudos concordam com a diminuição da concentração sérica de glicose e melhora na

resistência à insulina; mas não mostraram perda de massa corporal (HALBERG, 2005),

nem alterações nos parâmetros séricos para triacilgliceróis, colesterol-LDL e colesterol-

HDL (BENLI AKSUNGAR et al., 2005; BHUTANI et al., 2010; ESHGHINIA &

14

MOHAMMADZADEH, 2013) em indivíduos que realizaram restrição alimentar

intermitente total ou parcial.

Karbowska e Kochan (2012) replicaram a estratégia alimentar em modelo animal e

mostraram diminuição da massa corporal, de triacilgliceróis circulantes, assim como dos

depósitos de gordura epididimal de camundongos submetidos a 8 ciclos de restrição

alimentar intermitente, 3 dias de restrição total, seguido de 3 dias de realimentação ad

libitum. Foi observado, entretanto, aumento na expressão do RNA de genes diretamente

envolvidos na síntese e armazenamento de triacilgliceróis no tecido adiposo branco, a

proteína específica de gordura 27 (Fsp27), receptor ativado por proliferador de

peroxissoma γ 2 (PPARγ2) e as proteínas de ligação ao intensificador CCAAT α

(C/EBPα) no tecido adiposo epididimal quando comparados ao grupo controle.

Dorighello et al. (2014) submeteram camundongos hipercolesterolêmicos a

restrição alimentar, utilizando o dia de jejum alternado (dia de jejum total, seguido de um

dia de realimentação ad libitum) por 12 semanas; os resultados mostraram perda de massa

corporal, porém, aumento do conteúdo gorduroso da carcaça, aumento do tecido adiposo

epididimal, perda da massa magra, aumento do tamanho dos adipócitos subcutâneos,

assim como aumento sérico de leptina e adiponectina quando comparados com o grupo

controle.

Condutas alimentares restritivas levam ao organismo a permanecer sem alimento

por longos períodos de tempo e, nesse cenário, a regulação metabólica pode ser afetada,

produzindo distúrbios na regulação energética (HAN et al., 2014). Um dos grandes

problemas no tratamento da obesidade não é a redução da massa corporal, mas sim

controlar a recuperação após um programa para perda de peso (LUOTOLAHTI;

VIIKARI & KANTOLA, 2015; MARCHESINI et al., 2016).

Foi verificado que o intestino é capaz de elevar a taxa de absorção e transporte de

nutrientes durante restrição alimentar crônica e que este é possivelmente um mecanismo

envolvido na resistência à perda de peso corporal e aumento da recuperação do mesmo,

visto que redução na quantidade de alimento ingerido pode resultar em aumento do apetite

(ZHANG et al., 2012).

Zhao et al. (2013) verificaram que ratos submetidos a restrição alimentar e

realimentação apresentaram aumento dos depósitos de gordura e maior ingestão de

energia, estes achados evidenciam o fato de que a restrição, e realimentação, pode levar

15

a um rápido crescimento compensatório por promover aumento na ingestão alimentar e

eficiente estoque de energia. A restrição alimentar intermitente parece promover

distúrbios na função hipotalâmica, aumentando a expressão dos neurotransmissores

orexígenos AgRP e NPY, o que poderia explicar as diferenças na massa corporal e na

ingestão energética (CHAUSSE et al., 2014).

Considerando os frequentes programas de restrição alimentar e realimentação e

suas consequências sobre o crescimento compensatório, o presente estudo visa investigar

se fatores lipogênicos hipotalâmicos, incluindo proteína e fatores de transcrição, são

afetados pela prática do jejum intermitente e, assim, contribuem para o rompimento da

homeostase energética e favorecimento da obesidade.

16

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar em fêmeas Wistar saudáveis se a restrição alimentar intermitente regula a

massa corporal e exerce efeito sobre proteínas da via lipogênica hipotalâmica.

3.2 Específicos

1. Mensurar o consumo alimentar e a massa corporal;

2. Quantificar depósitos do tecido adiposo branco visceral;

3. Determinar a glicemia e triacilglicerolemia;

4. Avaliar, no hipotálamo, a expressão dos fatores de transcrição SREBP-1c e 2 e da

enzima ACC.

17

4 MATERIAL E MÉTODOS

4,1 Condições experimentais

Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética e Uso de Animais

– CEUA/Macaé da Universidade Federal de Rio de Janeiro – campus Macaé (MAC030).

Os animais foram mantidos sob condições controladas de luz, ciclos de 12h claro/escuro,

e temperatura ambiente média de 24 + 1°C. Os animais tiveram livre acesso a água e

ração comercial (Nuvilab, Brasil), a partir do 67º dia de vida desenvolveu-se a

programação de intermitência alimentar.

4.2 Desenho experimental

Sessenta ratas fêmeas Wistar de 67 dias de vida foram distribuídas aleatoriamente

em três grupos: grupo Controle (C), n=20, o qual teve livre acesso a água e ração

comercial e dois grupos de tratamento, o grupo Realimentado-Restrito 3:2 (R3), n=20 e

Realimentado-Restrito 5:2 (R5), n=20, ambos submetidos a restrição alimentar

intermitente (RAI) a 50% do consumo do C. Os animais foram mantidos em gaiolas

individuais durante 6 semanas de tratamento.

4.3 Protocolo de intermitência alimentar

O Restrito 3:2 (R3) foi alimentado por três dias com acesso ad libitum à ração,

seguido de RAI a 50% do consumo do C durante dois dias, e o Restrito 5:2 (R5) que teve

acesso ad libitum à ração durante 5 dias, para logo ser submetido à RAI a 50% do

consumo do C durante dois dias. O grupo C recebeu ração comercial ad libitum durante

todo o período (Figura 5).

18

4.4 Avaliação de parâmetros nutricionais

A ingestão alimentar e a massa corporal foram avaliadas diariamente durante todo

o tratamento. Os grupos tratados foram colocados em jejum a 50% vs. C por um período

de 24 horas (8h00 até às 8h00) durante dois dias seguidos, de acordo com o protocolo de

intermitência alimentar estabelecido para cada grupo. A medida do consumo e do peso,

foi realizada todo dia as 8h30, utilizando balança analítica (BEL Engineering) para a ração

e balança comercial (Toledo Prix) para o peso dos animais.

Os depósitos do tecido adiposo branco mesentérico (MES), retroperitoneal (RET)

e gonadal (GN) (perirrenal + periovário) foram retirados e pesados em balança analítica

(BEL Engineering) na 7ª semana de tratamento, dia da eutanásia.

4.5 Avaliação sérica

Utilizamos sangue coletado de animais submetidos a jejum de 12h. O sangue foi

coletado da aorta no dia da eutanásia e centrifugado a 2.500 r.p.m. durante 15 minutos a

Figura 5. Esquema de tratamento dos grupos. Alimentado

(A) e restrição alimentar intermitente (RAI)

Modelo experimental e grupos

19

4°C e separado o soro para as análises. A concentração de glicose foi determinada pelo

método enzimático, com limite de detecção de 0,41 mg/ dL (Glicose PAP Liquiform,

Labtest Diagnostica, BH-MG) e o teor sérico de triacilgicerol foi determinado por método

colorimétrico (Triglicérides Liquiform, Labtest Diagnostica, MG-Brasil). Ambas as

avaliações foram realizadas utilizando kit comercial. Para o protocolo foram pipetados

2µL de soro e 200µL de reagente e, após incubação a 37°C a 5 minutos, a leitura das

absorbâncias foi feita em comprimento de onda 505nm (Biochrom Asys UVM 340) e os

resultados foram expressos em mg/dL.

4.6 Avaliação da expressão hipotalâmica do SREBP e ACC

Aos 109 dias de vida, e, após jejum de 12h, os animais foram eutanasiados, e o

hipotálamo retirado rapidamente e colocado em reagente Trizol para a extração do RNA

total, para o qual foi adotado o protocolo do fabricante (Invitrogen, Thermo Fisher

Scientific). O cDNA foi sintetizado por meio de kit comercial High-Capacity cDNA

(Applied Biosystems). Foi utilizado 10 µL de mastermix (2 µl de 10X RT Buffer, 2 µL de

10X RT Random, 0,8 µL de 25X dNTP Mix, 1µL de MultiScribe RT e 4,2 µL de água

livre de nucleases) e 10 µL de amostras de RNA normalizada entre 1 e 3 µg/RNA por

amostra. A placa foi, em seguida, selada e levada a centrifugação por 5 minutos e,

posteriormente, colocada no termociclador a 25°C, 37°C, 85°C e 4°C durante 10, 120, 5

e ∞ minutos respectivamente. Para a amplificação do mRNA, foi utilizada a técnica de

PCR (Real Time PCR ou reação em cadeia de polimerase) em tempo real por meio do

aparelho StepOne Plus (Applied Biosystems). Foi usado 1 µL dos iniciadores desenhados

para os genes SREBP-1c, SREBP2, ACC e 18S, 9 μL de cDNA sintetizado e 10 μL de

mastermix TaqMan (Applied Biosystems). Após o preparo das reações, a placa foi selada

e centrifugada a 2.500 r.p.m. por 5 minutos para eliminação de bolhas de ar e carregadas

no aparelho a 50° C durante 2 minutos para a incubação, seguido de 95°C durante 10

minutos para ativação da polimerase e PCR (40 ciclos) a 95° C por 15 segundos para

desnaturar e 60° C por 1 minuto para extensão. As análises foram realizadas em triplicata

e os resultados foram analisados em ΔΔCT (LIVAK K. & SCHMITTGEN T., 2001). Os

dados de expressão foram comparados com o gene 18S como gene de referência.

20

4.7 Análise de dados

Os dados foram apresentados como média e erro padrão da média. A análise

estatística foi realizada utilizando-se o software SPSS® versão 20.0. Para as variáveis de

comparações múltiplas foi utilizado análise de variância de uma via (ANOVA de uma

via), seguida do teste de Bonferroni. Foi adotado nível de significância p<0,05.

21

5 RESULTADOS

Os dados obtidos foram organizados para constituir um manuscrito e assim serão

apresentados os resultados.

22

Restrição alimentar intermitente afeta a expressão do RNAm do SREBP-1c e 2 no

hipotálamo de ratas

Resumo

Objetivo: Avaliar em ratas saudáveis se a restrição alimentar intermitente (RAI) altera

proteínas da via lipogênica hipotalâmica. Métodos: Sessenta fêmeas Wistar, 67 dias de

vida compuseram por 6 semanas os grupos Controle (C, ração comercial ad libitum),

Restrito 3 (R3) e 5 (R5) mantidos 2 dias com ração à 50% do C, seguido de 3 ou 5 dias

de realimentação ad libitum respectivamente, com livre acesso à agua. Resultados: Os

grupos R3 e R5 mostraram menor ingestão acumulada [R3: p=0,001; R5: p=0,006],

porém no dia pós-restrição ambos os grupos tratados apresentaram consumo elevado vs.

C [R3 e R5: p<0,0001]. O grupo R5 [p<0,0001] teve menor ganho de massa corporal

total vs. C. O teor de glicose aumentou em R3 e R5 [R3: p=0,007; R5: p=0,001] e do

triacilglicerol apenas no grupo R3 [p=0,018]. O tecido adiposo mesentérico (TAM) foi

maior no R3 [p=0,001] vs. C. No hipotálamo foram observadas diferenças na expressão

hipotalâmica do fator de transcrição SREBP 1c no grupo R5 vs. C [p=0,04] e vs. R3

[p=0,04] e no SREBP 2 nos grupos R3[p<0,04] e R5 [p<0,03] vs. C. A expressão da

enzima ACC não diferiu entre os grupos. Conclusão: A restrição alimentar intermitente

(RAI) em ratas alterou a expressão de fatores lipogênicos da família SREBP no

hipotálamo, promoveu perda de massa corporal com aumento da adiposidade visceral e

prejuízo na glicemia e triacilglicerolemia.

Palavras chave: Restrição alimentar intermitente, SREBP, ACC, hipotálamo.

23

Introdução

A regulação da homeostase energética e lipogênica nos organismos

desenvolvidos, especialmente mamíferos, envolve complexa integração entre

mecanismos periférico e central. Dadas as constantes mudanças na alimentação, tanto na

composição quanto na quantidade de alimentos ingerida, tais mecanismos sofrem

constantes ajustes a fim de manter a função adequada dos sistemas que integram a

regulação da ingestão alimentar e a adipogênese e, assim, controlar a massa corporal

(LONGO & MATTSON, 2014). O estoque de gordura é depositado em decorrência de

excessivo suprimento alimentar e mobilizado em períodos de jejum, na forma de ácidos

graxos e glicerol.

A restrição alimentar intermitente (RAI), utilizada como estratégia de

emagrecimento, expõe periodicamente o organismo a ciclos repetidos de jejum e livre

acesso à alimentação (TINSLEY & LA BOUNTY, 2015). Esses ciclos provocam

mudanças hormonais (BONAKDARAN, 2016; HEILBRONN et al., 2005) e ativação e

ou inibição repetida de proteínas relacionadas à lipogênese e à regulação da ingestão

(ZHAO et al., 2013), de forma que o organismo, para exercer eficientemente o controle

lipogênico, depende de mudanças na expressão gênica (LIANG et al., 2002; GRIFFIN &

SUL, 2004; OKAMOTO et al., 2006). Portanto, alterações na expressão gênica podem

decorrer da dieta e são importantes para composição da resposta de diversos tecidos à

alteração da condição nutricional.

O hipotálamo é importante centro regulador da homeostase energética e sensível

a hormônios, como a insulina e leptina, cuja secreção é modulada pela adiposidade, e

exercem efeito central anorexígeno (HUYNH et al., 2016). O estado nutricional no qual

o organismo se encontra leva à ativação de neurônios orexígenos ou anorexígenos,

resultando no aumento ou diminuição do apetite (ROH; SONG & KIM, 2016). Apesar de

ser difundido que a RAI promove perda de massa corporal (HEILBRONN et al., 2005;

HARVIE et al., 2011; KARBOWSKA & KOCHAN, 2012; KLEMPEL et al., 2012

DORIGHELLO et al., 2014), e que há forte relação entre dieta, expressão gênica e

adipogênese, não tem sido demonstrado se a prática de RAI afeta a via lipogênica

hipotalâmica, importante para a homeostase energética. No hipotálamo, esta via integra

a regulação da homeostase energética por meio da ação de enzima acetil-CoA carboxilase

24

e do produto da sua ação sobre o acetil-CoA, o malonil-CoA, que promovem aumento da

resposta anorexígena, iniciada pela leptina (SONE et al., 2016).

As proteínas SREBPs são os principais fatores de transcrição que regulam a

expressão de genes envolvidos na biossíntese de colesterol, ácido graxo e triacilglicerol

(YE & DEBOSE-BOYD, 2011). O SREBP-1c tem como função principal a síntese de

ácidos graxos, pela sua capacidade de aumentar a expressão das enzimas lipogênicas

acetil-CoA carboxilase e ácido graxo sintase, enquanto o SREBP-2 está relacionado com

a síntese do colesterol (XIAO & SONG, 2013). Embora o SREBP-1c seja expresso no

cérebro, pouco se sabe sobre sua ação na lipogênese hipotalâmica.

Elevação da concentração de insulina no período pós-prandial promove

fosforilação do SREBP-1c e sua consequente translocação do citoplasma para o núcleo,

iniciando a atividade lipogênica, enquanto a atividade diminui durante o jejum em

resposta à diminuição da insulina (OKAMOTO et al., 2006).

Vários fatores no organismo são regulados de forma dependente da glicose ou

insulina, de maneira que oscilações na concentração de insulina e glicose, decorrentes dos

ciclos de jejum e realimentação podem determinar regulação de fatores de transcrição

lipogênicos e tal evidência pode revelar importante adaptação à intermitência alimentar e

modulação de genes envolvidos. Nesta perspectiva demonstramos que a expressão

hipotalâmica dos fatores de transcrição SREBP-1c e 2 foi alterada em resposta a RAI em

ratas saudáveis, porém a expressão da enzima acetil-CoA carboxilase parece não ser

afetada pelos ciclos de jejum e realimentação. Tais dados demonstram que estes fatores

de transcrição são sensíveis aos repetidos ciclos de supressão alimentar.

25

Material e métodos

Animais e desenho experimental

Sessenta ratas fêmeas Wistar foram mantidas durante 6 semanas em gaiolas

individuais, e ciclos claro/escuro (12/12h) e temperatura ambiente média de 24 + 1°C e

aos 67 dias de vida foram agrupadas como: Controle (C), animais com livre acesso à agua

e ração comercial; o Restrito 3:2 (R3) alimentado por três dias com acesso ad libitum à

ração, seguido de RAI a 50% do consumo do C durante dois dias, e o Restrito 5:2 (R5)

que teve acesso ad libitum à ração durante 5 dias, para logo ser submetido à RAI a 50%

do consumo do C durante dois dias. Todos os procedimentos foram aprovados pela

Comissão de Ética e Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Rio de Janeiro

– Campus Macaé (MAC030).

Consumo alimentar e composição corporal

O consumo alimentar e a massa corporal foram monitorados diariamente durante

todo o período de tratamento. Os grupos tratados foram colocados em jejum a 50% do C

por 24 horas (8h00 às 8h00) durante dois dias consecutivos, após os quais receberam

ração ad libitum segundo o protocolo de RAI do grupo (3 ou 5 dias). No dia do

experimento as ratas foram eutanasiadas e coletados os depósitos de gordura mesentérica

(MES), retroperitoneal (RET) e gonadal (GN) (perirrenal + periovário) e avaliados

gravimetricamente.

Avalições séricas

O sangue foi coletado da aorta no dia da eutanásia, após 12 h de supressão

alimentar, e centrifugado a 2.500 r.p.m. durante 15 minutos a 4°C para separação do soro.

Para as análises utilizou-se microensaio com kit comercial. A concentração de glicose foi

determinada pelo método enzimático, com limite de detecção de 0,41 mg/ dL (Glicose

PAP Liquiform, Labtest Diagnostica, BH-MG) e o teor sérico de triacilgicerol com kit

colorimétrico (Triglicérides Liquiform, Labtest Diagnostica, MG-Brasil). Na microplaca

foram pipetados 2μL de soro e 200μL de reagente e após incubação a 37°C por 15 minutos

a leitura das absorbâncias a 505nm foi realizada no (Biochrom Asys UVM 340). As

26

concentrações de glicose e triacilglicerol foram determinadas seguindo os protocolos dos

fabricantes a partir das absorbâncias das amostras.

Determinação dos teores hipotalâmicos dos fatores de transcrição

O mRNA total foi extraído das amostras de hipotálamo com reagente Trizol, de

acordo com instruções do fabricante (Invitrogen, Thermo Scientific), enquanto a

quantificação e qualidade do RNA total foram avaliadas com a utilização de aparelho

fluorímetro Nanodrop (Thermo Scientific), considerada melhor relação nos

comprimentos de onda A260/280 entre 1,90 e 2,09. As amostras de RNA foram estocadas

em freezer até a síntese de cDNA. O cDNA foi sintetizado do RNA total (2mg) em 20 uL

de reação utilizando o kit comercial High-Capacity cDNA (Applied Biosystems),) em

termociclador a 25°, 37°, 85° e 4° durante 10, 120, 5 para as 3 primeiras e em ciclo infinito

para a última. Uma vez obtido o cDNA, foi quantificada a expressão gênica mediante a

amplificação pela técnica de PCR (Real Time PCR ou reação em cadeia de polimerase)

em tempo real por meio do aparelho StepOne Plus (Applied Biosystems). Foram

utilizados iniciadores customizados SREBP-1c, SREBP-2, ACC e 18S. As reações foram

realizadas com 10 μL TaqMan Universal mastermix TaqMan (Applied Biosystems), 1μL

do iniciador e 9μL do cDNA sintetizado. A placa foi selada e centrifugada a 2.500 r.p.m.

por 5 minutos para eliminação de bolhas de ar e carregadas no aparelho a 50° C durante

2 minutos para a incubação, seguido de 95° C durante 10 minutos para ativação da

polimerase e PCR (40 ciclos) a 95° C por 15 segundos para desnaturar e 60° C por 1

minuto para extensão. As análises foram realizadas em triplicata e os resultados foram

analisados em ΔΔCT, os dados de expressão foram comparados com o gene 18S como

gene de referência.

Análise dos dados

Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média e a análise

estatística realizada utilizando-se o software SPSS® versão 20.0. Para as variáveis de

comparações múltiplas foi realizada análise de variância de uma via (ANOVA de uma

via), seguida do teste de Bonferroni. Foi adotado nível de significância p<0,05.

27

Resultados

Consumo alimentar e massa corporal

O consumo alimentar acumulado (Figura 1A) foi menor nos grupos restritos (R3: 312,96

± 3,45 g/100g; p=0,001; R5: 317,60 ± 3,54 g/100g, p=0,006) comparado ao C (341,37 ±

22,68 g/100g). O ganho de massa corporal (Figura 1B) do grupo R5 foi menor (38,89 ±

1,32 g/100g; p=0,0001) comparado ao C, enquanto o grupo R3 (52,22 ± 2,47 g/100g) não

diferiu dos grupos. A ingestão pós-jejum imediata (Figura 1C e 1D) foi maior nos grupos

restritos (p=0,0001, R3; p=0,0001 R5, respectivamente) em todo o período analisado vs.

C.

Figura 1. Consumo alimentar e massa corporal. Consumo

alimentar acumulado no período (A; n=10), massa corporal (B; n=10)

e consumo alimentar no pós-jejum imediato (C: R3; D: R5; n=10) de

fêmeas Wistar submetidas à restrição alimentar por 2 dias seguido de

realimentação por 3 (R3) ou 5 (R5) dias. Dados apresentados como

média ±EPM. p<0,05; * vs. C.

C O N S U M O P O S J E J U M

C i c l o s

g/1

00

g

1 2 3 4 5

0

5

1 0

1 5

C

R 5

C O N S U M O P O S J E J U M

C i c l o s

g/1

00

g

1 2 3 4 5 6 7 8

0

5

1 0

1 5

C

R 3

C O N S U M O A C U M U L A D O T O T A L

g/1

00

g

C R 3 R 5

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

G A N H O P E S O T O T A L

gr

am

as

C R 3 R 5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

A B

C D

*

* *

* * * * * * * * * * * * *

28

Teor dos depósitos de gordura visceral

O depósito mesentérico (MES) apresentou-se mais denso no grupo R3 (1,31 ±

0,26 g/100g, p=0,001) vs. C, porém não foram observadas diferenças nos demais

depósitos avaliados nem na gordura visceral total (Figura 2).

Figura 2. Teores dos depósitos de gordura. Depósitos

mesentérico (MES; n=10), retroperitoneal (RET; n=10), gonadal

(GN; n=10) e índice de adiposidade (IA; n=10) de fêmeas Wistar

submetidas à restrição alimentar intermitente por dois dias,

seguido de realimentação por 3 (R3) ou 5 (R5) dias. Dados

apresentados como média ± EPM. p<0,05; * vs. C.

T E C ID O A D IP O S O

g/1

00

g

M E S R E T G N T O T A L

0

2

4

6

C

R 3

R 5

*

29

Concentração sérica de glicose e triacilglicerol

A concentração sérica de glicose mostrou-se elevada em ambos os grupos

restritos (R3: 125,40 ± 7,92 mg/dL; p=0,007; R5: 135,74 ± 6,59 mg/dL; p=0,001 mg/dL)

(Figura 3A) comparado ao grupo C (92,72 ± 8,29 mg/dL). O teor de triacilglicerrideos

circulante (Figura 3B) foi maior no grupo R3 (119,26 ± 8,89 mg/dL; p=0,018) vs. C

(94,26 ± 1,19 mg/dL), enquanto R5 (107,94 ± 3,32 mg/dL) não apresentou diferença.

Figura 3. Parâmetros bioquímicos. Concentração sérica de glicose

(A) e triacilglicerol (B) de fêmeas Wistar submetidas à restrição

alimentar intermitente por dois dias, seguido de realimentação por 3

(R3) ou 5 dias (R5). Dados apresentados como média ± EPM; n=6

para ambas as avaliações. p<0,05; * vs. C.

T R IG L IC E R ID IO S

mg

/dl

C R 3 R 5

0

5 0

1 0 0

1 5 0

G L I C O S E

mg

/dl

C R 3 R 5

0

5 0

1 0 0

1 5 0

A B* *

*

30

Expressão gênica de proteínas hipotalâmicas

Os níveis de expressão do SREBP-1c (Figura 4A) do grupo R5 (2,32 ± 0,43) foi

maior comparado aos grupos C (1,02 ± 0,18; p=0,04) e R3 (0,72 ± 0,19; p=0,04).

Enquanto a expressão do fator de transcrição SREBP-2 (Figura 4B) foram mais elevados

nos grupos R3 (2,04 ± 0,47; p=0,04) e R5 (2,06 ± 0,21; p=0,03) vs. C (0,72 ± 0,14). Na

avaliação da expressão da enzima lipogênica acetil CoA carboxilase (Figura 4C) não foi

verificado diferença entre os grupos (C: 1,07 ± 0,14; R3: 1,17 ± 0,19; R5: 1,03 ± 0,16).

]

S R E B P 2

UA

C R 3 R 5

0

1

2

3

S R E B P 1 c

UA

C R 3 R 5

0

1

2

3

A C C

UA

C R 3 R 5

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

B

C

A * #

**

Figura 4. Expressão hipotalâmica de fatores lipogênicos. Expressão dos

fatores de transcrição SREBP 1c (A, n=6) e 2 (B, n=4) e da enzima ACC (C,

n=8) no hipotálamo de fêmeas Wistar submetidas à restrição alimentar

intermitente por dois dias, seguido de realimentação por 3 (R3) ou 5 (R5) dias.

Dados apresentados como média ± EPM. p<0,05; * vs. C e # vs. R3.

31

Discussão

A restrição alimentar intermitente (RAI) é uma estratégia de perda de massa

corporal conhecida e comprovada em humanos (HEILBRONN et al., 2005; HARVIE et

al., 2011; KLEMPEL et al., 2012) e animais (KARBOWSKA & KOCHAN, 2012;

DORIGHELLO et al., 2014). Contudo, não há muitas evidências se os mecanismos

lipogênicos e de regulação da ingestão alimentar hipotalâmicos podem ser rompidos

com a prática da RAI e contribuir para rápida e sucessiva recuperação da massa corporal.

Ciclos de jejum-realimentação promovem repetidas modificações nas secreções

hormonais e ativação ou inibição de neuropeptídios que atuam na homeostase energética

e controle da massa corporal (WATERSON & HORVATH, 2015). Demonstramos que a

RAI em ratas saudáveis reduziu a massa corporal, aumentou a glicose e triacilglicerol

séricos e o estoque de gordura mesentérica. No hipotálamo, o tratamento aumentou a

expressão dos fatores lipogênicos SREBP-1c e SREBP-2, mas sem repercussão sobre a

expressão da enzima acetil-CoA carboxilase.

Embora ambos os grupos restritos tenham consumido menos ração no período, a

restrição alimentar levou a perda de massa corporal no grupo R5 mas não no R3.

Comparado ao R3, o grupo R5 teve menor repetição de ciclos de jejum-realimentação e

ambos apresentaram maior ingestão alimentar no pós-jejum imediato. O jejum ativa sinais

de fome, como NPY e grelina, os quais podem estimular a atividade da dopamina,

envolvida com o comportamento alimentar (ROSEBERRY, 2015), pudendo ter

contribuído para a compulsão alimentar cíclica no pós-jejum imediato.

A liberação de dopamina na realimentação aumentou em animais com restrição

alimentar crônica (POTHOS; CREESE & HOEBEL, 1995; POTHOS; HERNANDEZ &

HOEBEL, 1995; CARR, 2007), também foi demonstrado que a liberação de dopamina

na restrição alimentar aguda (20h, com alimentação limitada) constitui mecanismo de

recompensa, eu leva ao aumento da motivação para a alimentação em períodos ad libitum

(FRANCE & MEISCH, 1979; CARROLL, 1985; CARROLL; JEWETT et al., 1995;

WILSON et al., 1995). Além disso, há evidências em modelo animal, de que a restrição

alimentar intermitente pode levar a distúrbios no consumo alimentar por determinar

resposta orexígena estimulada pelo NPY e AgRp (ZHAO et al., 2013).

32

O jejum induz a produção de glicose e acúmulo de lipídio hepático, produtos

consequentes à gliconeogênese e lipólise do tecido adiposo. Assim, os teores elevados de

glicose e triacilgliceróis séricos verificados decorrem de ajuste metabólico que pode ser,

inclusive, mecanismo de proteção à lipotoxicidade hepática (GEISLER et al., 2016).

A frequência de jejum foi maior no grupo R3, o qual teve ambos os parâmetros

bioquímicos alterados. A hiperglicemia comum aos grupos restritos pode ser

consequência tanto da exportação de produto da gliconeogênese hepática quanto de

resistência periférica à insulina. A RAI pode aumentar a resistência à insulina por

diminuir a sinalização da insulina e reduzir a expressão do hormônio e reduzir a expressão

da glicogênio fosforilase (PARK et al., 2017). Além disso, o cérebro possui mecanismo

de detecção de glicose-lactato por meio do qual regula a produção hepática de lipídio e

glicose (LAM, 2007). Portanto, as frequentes reduções da glicose sérica nos intervalos de

jejum do grupo R3 podem ter favorecido o rompimento da homeostase de forma mais

precoce comparado ao grupo R5 e determinado simultâneo aumento na produção de

glicose e triacilgliceróis naquele grupo.

Durante períodos de restrição alimentar, é necessária a utilização de estoques de

energia, em primeiro lugar provenientes do glicogênio (SALTIEL, 2015;

BONAKDARAN, 2016; GEISLER et al., 2016), seguido do tecido adiposo, para garantir

a liberação de triacilgliceróis e produção de glicose a partir do glicerol (PERRY et al.,

2015; SHARABI et al., 2015). Na restrição alimentar aguda, dois dias de realimentação

não foram capazes de restabelecer o triacilglicerol sérico pós-jejum; porém, quatro dias

de realimentação foram suficientes para duplicar a concentração sérica (WRONSKA et

al., 2015), o que poderia, em parte, explicar a triacilglicerolemia do grupo R3, podendo

considerar três dias de realimentação similar ao estudo de Wronska et al., 2015.

Aumento na lipólise provoca incremento dos teores de diacilglicerol na célula, o

que eleva o conteúdo da proteína quinase C (SZENDROEDI et al., 2014). Entretanto, há

relação entre o aumento da proteína quinase C e resistência à insulina, já que esta enzima

inibe a fosforilação do substrato 1 do receptor de insulina (CHEN et al., 2015),

mecanismo, que pode também estar relacionado ao aumento na glicemia observado no

presente estudo.

O estresse pode induzir resistência tanto à insulina quanto à leptina o que pode

resultar em ganho de massa e gordura corporais (PARK et al., 2008; PARK; AHN & KIM,

33

2010), resultando em obesidade. O grupo R3 foi submetido a maior frequência de ciclos

de jejum e repetidos períodos de estresse por fome, que podem ter sido suficientes para

limitar a perda da massa corporal e, ainda, propiciar aumento do depósito de gordura

mesentérica. O mesmo não ocorreu com o grupo R5, submetido a menor número de ciclos

de jejum. Embora pouco se saiba sobre a relação entre a RAI e gasto energético de

repouso (GER), foi observado que o jejum intermitente em homens magros e saudáveis,

por 2 semanas, diminuiu o GER, sugerindo que este tipo de restrição alimentar

intermitente, pode alterar um dos principais componentes do gasto energético e

relacionado à massa corporal em humanos (SOETERS et al., 2009).

Estudos realizados em animais mostraram que a restrição alimentar intermitente

levou ao aumento dos depósitos de gordura (DORIGHELLO et al., 2014; ZHAO et al.,

2013). Embora no presente estudo, o teor total de gordura visceral não tenha se

modificado, foi observado aumento no depósito adiposo mesentérico do grupo R3.

Diferentes genes relacionados aos adipócitos são regulados pela dieta e parece que a RAI

pode promover incremento da incorporação de triacilgliceróis nos depósitos de gordura

visceral, visto que 3 dias de jejum e 3 de realimentação em machos Wistar determinou

aumento da expressão do gene Fsp2 no tecido adiposo branco epididimal, o qual está

envolvido na deposição de lipídios (KARBOWSKA & KOCHAN, 2012).

Não evidenciamos alteração na expressão hipotalâmica da enzima ACC pela RAI.

Foi observado que, o jejum agudo de 45h e realimentação por 3h não promoveu alteração

na expressão desta enzima no cérebro de machos Wistar (OKAMOTO et al., 2006). Além

disso, foi observado que a restrição alimentar aguda não alterou a expressão das enzimas

ácido graxo sintase e acetil-CoA carboxilase no cérebro (ELLIS; BOWMAN &

WOLFGANG, 2015; KIM & FREAKE, 1996). Contudo, a restrição alimentar durante 48

horas seguida de realimentação foi capaz de aumentar a atividade de enzimas lipogênicas

nos depósitos de gordura epididimal e retroperitoneal (WRONSKA et al., 2015). Além

disso, em outros estudos com modelo de jejum e realimentação, foi verificado, esteatose

hepática e aumento do mRNA de enzimas lipogênicas do tecido adiposo branco

(KARBOWSKA, KOCHAN & SWIERCZYNSKI, 2001; KARBOWSKA & KOCHAN,

2012; WRONSKA et al., 2015).

Ainda que o subproduto lipogênico, o malonil-CoA, seja regulador da ingestão

alimentar, o hipotálamo não é um centro de intensa síntese lipídica, portanto, mudanças

34

nutricionais, como intervalos de jejum e realimentação, podem vir a alterar mais

facilmente a expressão de enzimas lipogênicas em tecidos periféricos do que no

hipotálamo. Okamoto et al. (2006) sugerem que a expressão de enzimas lipogênicas no

cérebro não é regulada pelo estado nutricional periférico.

Okamoto et al. (2006), submeteram a animais, tanto magros como obesos, a

restrição alimentar aguda de 45h e realimentação por 3h, e observaram, que não houve

alterações no SREBP-1 no cérebro de ambos grupos tratados, o que indica, que pelo

menos de forma aguda, independente do estado nutricional, a restrição alimentar não

altera esse fator de transcrição central. O presente estudo, mostrou, que os grupos restritos

aumentaram a expressão do SREBP-2, e do SREBP-1c no R5. De todo modo, o fato do

grupo R3 não ter modificado SREBP-1c, mas somente o SREBP-2, pode ser que, mesmo

não tendo alterado a expressão da ACC, seja aquela alteração, um mecanismo para regular

a síntese de malonil-CoA e limitar a resposta anorexígena, uma vez que este grupo teve

maior frequência de jejum, o que se soma a maior concentração sérica de triacilglicerol

provavelmente decorrente de lipólise e síntese hepática.

O cérebro é rico em colesterol, majoritariamente formado pela síntese de novo,

uma vez que a barreira hematoencefálica limita sua captação a partir da circulação

(BJORKHEM & MEANEY, 2004; DIETSCHY & TURLEY, 2004). Dessa forma, a

expressão de SREBP-2 nos grupos restritos pode ser um mecanismo para compensar a

reduzida captação sérica, em função dos ciclos intermitentes de jejum e garantir a

manutenção de processos estruturais importantes no tecido hipotalâmico (KOTTI et al.,

2006; MITTER et al., 2003). Além disso, é sugerido que alterações na expressão de

SREBP-1c podem ser compensadas pelo SREBP-2 (LIANG et al., 2002), como

observada no grupo restrito 3. De fato, a expressão da acetil-CoA carboxilase não foi

afetada no R3, mesmo com menor expressão do SREBP-1c vs. R5.

Considera-se que o aumento do SREBP-1c é decisivo na transcrição e tradução

final da proteína lipogênica acetil-CoA carboxilase (GRIFFIN & SUL, 2004) e, com isso,

o aumento do seu produto malonil-CoA, que no hipotálamo pode levar à resposta

anorexígena. Estudos sugerem que a restrição alimentar crônica leve, conduz ao aumento

da fosforilação da AMPK e ACC, seguido da redução dos teores hipotalâmicos de

malonil-CoA (IIO et al., 2015). Este resultado sinaliza para possível reganho na massa

35

corporal ao longo prazo, visto que a redução de malonil-CoA limita a resposta

anorexígena.

Alterações transcricionais, sobretudo no hipotálamo, são prejudiciais ao balanço

energético, o que torna compreensível que tais mudanças possam ser observadas de forma

imediata à realização de restrição alimentar nos tecidos periféricos (KARBOWSKA;

KOCHAN & SWIERCZYNSKI, 2001; KARBOWSKA & KOCHAN, 2012; WRONSKA

et al., 2015); enquanto no SNC tais modificações são menos evidenciadas com a prática

aguda de restrição alimentar (KIM & FREAKE, 1996; ELLIS; BOWMAN &

WOLFGANG, 2015). Porém, o presente estudo, mostrou alterações transcricionais com

a pratica da RAI.

Os resultados obtidos no presente trabalho mostraram que a RAI promoveu menor

ganho de massa corporal favorecido pela menor frequência de jejum e maior de

realimentação, bem como, induziu aumento de glicose e triacilglicerol séricos e do

depósito mesentérico de gordura. Estas alterações poderiam se relacionar à resistência

insulínica e ao diabetes mellitus tipo II. Concluímos que a RAI em ratas saudáveis, afetou

a expressão de fatores de transcrição lipogênicos no hipotálamo e demonstrou ser efetiva

na perda de massa corporal, mas com consequências negativas relacionadas à resistência

à insulina e agravos nos mecanismos lipogênicos centrais.

36

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6 CONCLUSÕES

A RAI, em ratas saudáveis, durante 6 semanas, com intervalos de jejum de 2 dias,

e realimentação de 5 ou 3 dias:

1. Induziu menor ganho de massa corporal com menor frequência de ciclos de jejum

e maior de realimentação;

2. Determinou maior acúmulo de gordura visceral mesentérica com maior

frequência de ciclos de jejum;

3. Provocou mudança no metabolismo de lipídios e carboidratos, induzindo

hiperglicemia e hipertriacilglicerolemia e;

4. Regulou a expressão dos fatores de transcrição lipogênicos SREBP-1c e 2 no

hipotálamo sem alteração na expressão do mRNA da ACC.

Tomados juntos esses resultados permitem inferir que a frequência dos ciclos de jejum

e o tempo de realimentação podem determinar alterações metabólicas diferenciadas,

sendo observada melhor resposta periférica com a menor frequência de ciclos de jejum.

Porém, no hipotálamo, a regulação não foi influenciada por este fator. Contudo, a RAI

em ratas adultas e saudáveis, apesar de promover menor ganho de massa corporal,

desencadeia mecanismos de ajustes fisiológicos que, a longo prazo, podem promover

reganho de peso, com crescimento adiposo compensatório e prejuízos na via lipogênica

hipotalâmica.

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ANEXO