UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: 08/2014 a 08/2015 ( ) PARCIAL (X) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do projeto de pesquisa: Detecção de fraude por substituição de carne

bovina por bubalina, através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), em

cortes cárneos comercializados nos municípios de Belém e Castanhal, estado

do Pará.

Nome do Orientador: Carina Martins de Moraes

Titulação do Orientador: Doutor Instituto/Núcleo: Instituto de Medicina Veterinária/Campus Castanhal Laboratório: Higiene e qualidade de alimentos

Título do projeto de pesquisa: Detecção de fraude por substituição de carne

bovina por bubalina, através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), em

cortes cárneos comercializados nos municípios de Belém e Castanhal, estado

do Pará.

Nome do Bolsista: Andréia Silva da Silva

Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq – AF ( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA

( ) PIBIC/UFPA – AF (X) PIBIC/ INTERIOR ( )PIBIC/PARD ( ) PIBIC/PADRC ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ PIAD

( ) PIBIC/PIBIT

INTRODUÇÃO

A bubalinocultura foi introduzida no Brasil no final do século XIX e, durante

muito tempo, a finalidade desses animais consistia exclusivamente no uso para

trabalho pesado e tração, devido a sua resistência e rusticidade, sendo abatidos

somente no final da vida reprodutiva ou quando não apresentavam mais

condições para o trabalho. Com isso, a população não criou o hábito de

consumir a carne de búfalo, gerando uma ideia equivocada sobre sua qualidade

(SILVA et al., 2012).

O Brasil possui um rebanho efetivo de 1.261.922 cabeças de búfalos,

sendo que 36% desse rebanho encontram-se no estado do Pará, segundo os

dados divulgados pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE,

2012). Entretanto, a cadeia produtiva de carne bubalina ainda não se encontra

consolidada na região, devido em grande parte a questão cultural e a falta de

informações a cerca das propriedades nutricionais e funcionais que estimulem o

consumo entre a população (MARQUES, 2013). Além disso, informações

referentes à quantidade de animais abatidos na região e o destino que essas

carcaças recebem são escassas, sendo comumente relatada a venda de cortes

cárneos bubalinos como carne de outra espécie, principalmente a bovina.

De acordo com o Art. 322 do Regulamento da Inspeção Industrial e

Sanitária dos Produtos de Origem Animal – RIISPOA, entende-se por carne as

massas musculares e demais tecidos que as compõem, procedentes de

animais de abate sob inspeção sanitária oficial, submetidas ao processo de

frigorificação com reações bioquímicas e biofísicas necessárias à

transformação do músculo em carne (BRASIL, 1952). Já de acordo com a

Instrução Normativa (IN) N° 83 do Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (MAPA), de 21 de novembro de 2003, entende-se por carne

moída o produto cárneo obtido a partir da moagem de massas musculares de

carcaças de bovinos, seguido de resfriamento ou congelamento. A referida IN

acrescenta que esse regulamento aplica-se também ao produto obtido a partir

da carne de búfalos. O critério de Designação (Denominação de Venda)

determina que o produto deva ser designado de “Carne Moída”, seguido de

expressões ou denominações que o caracterizem de acordo com sua

temperatura e do nome da espécie da qual foi obtida (BRASIL, 2003).

Nos últimos anos, o interesse na autenticidade de carne tem aumentado

e, por esse motivo, muitos consumidores estão preocupados com a carne que

consomem. Dessa forma, a rotulagem precisa é importante, para esclarecer a

escolha do consumidor. Em virtude de ser amplamente consumida, torna-se

fundamental levantar as questões referentes a possíveis fraudes na

comercialização em carnes e derivados.

Em diversos países a carne de búfalo tem se tornado alvo de

investigações, devido às fraudes envolvendo esse produto por sua semelhança

com outras carnes principalmente quando comparada com a carne bovina

(BALLIN, 2010). A baixa aceitação do consumidor a adquirir a carne bubalina

compromete a produção, comercialização e o preço do produto, que é

comercializado hoje entre 15% a 20% menos quando comparado com preço

pago pela carne bovina (MARQUES, 2013). Desse modo, a substituição de

uma carne com baixo valor agregado por outra com alto valor comercial

juntamente com a rotulagem fraudulenta tornou-se uma prática comum na

indústria de carnes, uma vez que a simples observaçao do produto cárneo no

momento da compra nao permite o consumidor detectar carne/espécie

incorporada no produto.

Testes sensoriais realizados por MONTEBELLO & ARAUJO (2009)

demonstraram não haver diferenças acentuadas entre a carne bovina e

bubalina quanto às características organolépticas (sabor, odor, maciez e

suculência) destas carnes, o que pode favorecer a prática fraudulenta entre

produtos que possuem atributos semelhantes com objetivo de obter maiores

lucros, uma vez que o consumidor não consegue distingui-los observando

visualmente o corte cárneo a espécie de quem procede (MANE et. al., 2012).

Atualmente, fraudes relacionadas a produtos alimenticios vem se

tornando frequentes em diversos países, como o caso ocorrido em 2013 na

europa, onde foi detectada a presença de carne de cavalo em produtos que

deveriam ser constituidos exclusivamente de carne bovina. No Brasil esta

conduta é considerada crime ao consumidor, conforme a Lei N° 8.137/90 que

especifica que “Vender ou expor à venda mercadoria cuja embalagem, tipo,

especificação, peso ou composição esteja em desacordo com as prescrições

legais ou que não corresponda à respectiva classificação oficial” (BRASIL,

1990).

Dentre as técnicas utilizadas na atualidade para a detecção de fraudes,

a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) merece destaque, visto que esta

pode ser uma ferramenta de grande valia para o serviço de fiscalização devido

a sua rapidez e alta precisão, possibilitando a amplificação de um fragmento de

DNA pré-definido in vitro em quantidade suficiente para análise de forma

bastante eficiente, a partir de uma quantidade mínima de amostra. CALVO et al

(2002) alega que a PCR é uma técnica sensível e de alta especificidade na

detecção de DNA de tecido bovino in natura e em alimentos processados,

podendo detectar também contaminação de produtos com 0,005% de carne

bovina crua, demonstrando desse modo a eficácia da referida técnica na

detecção de fraudes.

JUSTIFICATIVA

A avaliação de autenticidade das carnes tornou-se um elemento vital em

procedimentos de controle da qualidade dos alimentos, devido à possiveis

adulterações e fraudes que podem ocorrer com a susbstituição de produtos

com baixo valor agregados por outros com maior valor de mercado. Em

diversos países a carne de búfalo tem se tornado alvo de investigações, devido

às fraudes envolvendo esse produto por sua semelhança com outras carnes

principalmente quando comparada com a carne bovina.

A Amazônia Oriental abriga o maior rebanho bublalino do Brasil,

representando aproximadamente 60% do rebanho brasileiro. Nesta região

descacam-se os estados do Pará. A distribuição geográfica da bubalinocultura

nestes estados aponta para um mercado promissor da carne desta espécie

animal. Nestes locais são poucas as regiões em que a cadeia produtiva se

encontra organizada e com estratégias de coordenação, o preço pago no

mercado pela carne de búfalo na região oscila entre 15 e 20% a menos quando

comparado com a carne bovina. Por esta razão, fraude por substituição destas

carnes pode ocorrer, já que no momento da compra a simples observação do

produto cárneo não permite ao consumidor a detecção de carne/espécie que

está incorporada no produto.

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Detectar fraude por substituição de carne bovina por bubalina através da

Reação em Cadeia da Polimerase em cortes cárneos comercializados nos

municípios de Belém e Castanhal, estado do Pará.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar a eficiência da PCR em detectar fraude por substituição de carne

bovina por bubalina;

- Gerar dados científicos para a produção de Trabalhos de Conclusão de

Curso, Congressos e Eventos de modo Geral;

- Gerar treinamento de discentes da Faculdade de Medicina Veterinária na área

de Microbiologia de Alimentos e Inspeção e Tecnologia de Produtos de Origem

Animal.

METODOLOGIA

Embora o plano de trabalho inicial determinasse que as amostras a

serem analisadas seriam coletadas apenas nos municípios de Belém e

Castanhal, durante o período de execução do trabalho foi estabelecido um

convênio com o serviço de Vigilância Sanitária do estado do Amapá e, por esta

razão, amostras do município de Macapá também foram incluídas no estudo.

Além disso, amostras de carne moída também foram acrescidas, visando a

ampliação das análises.

Para a realização do presente trabalho, amostras de carnes foram

adquiridas em diferentes estabelecimentos comerciais (supermercados, feiras,

lojas especializadas de carnes) localizados nos municípios de Belém e

Castanhal, estado do Pará e Macapá, estado do Amapá, sendo 84 amostras

coletadas no município de Belém (67 de carne moída e 17 do corte coxão

mole), 28 amostras em castanhal (coxão mole) e 28 amostras em Macapá (14

amostras de carne moída e 14 de coxão mole), totalizando 140 amostras.

Após coletadas, as amostras foram acondicionadas em caixas

isotérmicas e encaminhadas ao Laboratório de Higiene e Qualidade de

Alimentos (LHQA) da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade

Federal do Pará (UFPA) – Campus Castanhal, onde mantidas congeladas até a

extração de DNA.

A extração de DNA total das amostras foi realizada através da utilização

do kit da Promega, Wizard Genomic DNA Purification, segundo a

recomendação do fabricante, acrescentando 20 mg de Proteinase K ao

protocolo para otimização dos resultados. Para tal, 30mg da amostra foram

acondicionadas em microtubos de 1,5mL identificados e em seguida 600μL de

tampão Nuclei Lysis Solution sob refrigeração foram adicionados, sendo cada

reação homogeneizada em agitador orbital, por 10seg e posteriormente

encaminhada a banho-maria a 65ºC, durante a noite.

Após essa etapa foi adicionado a cada amostra 3μL de RNase solution e

a reação foi incubada a 37ºC, por 30min. Porteriormente, 200μL de Protein

Solution foram adicionados e a reação foi homogeneizada em agitador orbital e

conservada em gelo por 5min, sendo as amostras centrifugadas a 14000xg, por

4min e o sobrenadante transferido para um novo microtubo, contendo 600μL de

isopropanol. Após nova centrifugação (14000xg, por 1min), o sobrenadante foi

removido e adicionou-se 600μL de etanol 70%. As amostras foram

centrifugadas a 14000xg por 1min e, ao final, após remover o sobrenadante, os

microtubos foram mantidos abertos por aproximadamente 2 horas em

temperatura ambiente para evaporação total do etanol. Por fim, o pellet foi

eluído em 100μL de DNA Rehydration Solution e incubado a 65ºC, durante 1h,

para reidratação do DNA.

Após a extração, a amostra de DNA foi submetida à eletroforese em gel

de agarose. Para tal, gel de Agarose a 0,8% foi utilizada e 3 µL da amostra

foram avaliados. Após este processo, o gel foi mergulhado em cuba contendo

Brometo de etídio, por 45 minutos. A visualização foi realizada sobre luz

ultravioleta e a análise dos géis realizada com auxílio do Software específico

(Quantun Capt acoplado ao transilluminador).

A PCR foi realizada seguindo o protocolo de DARWISH et al.,(2009),

com modificações. Para tal, foram utilizados primers descritos previamente por

López-Calleja et. al (2005), que amplificam sequencias do RNA ribossomal

mitocondrial 12S específicos para bubalino (12SBT- REV2), para bovino

(12SBT- REV2) e primers que amplificam sequencias comuns as duas

espécies (12SM-FW), sendo que primers específicos para bubalino amplificam

fragmentos de 220 pares de base (pb) e primers específicos para bovinos,

fragmentos de 346pb. Os primers foram preparados de acordo com a instrução

do fabricante (Ludwing Biotec®), sendo cada primer diluído em Tampão Tris-

EDTA (TE) até a concentração de 100 pmol/µL. Como controle positivo formam

utilizados DNAs extraídos previamente de acordo com a metodologia descrita

acima, de amostras de carne bovina e bubalina, obtidas em matadouro-

frigorífico credenciado pelo Serviço de Inspeção Federal, localizado no

município de Castanhal, estado do Pará.

Para a realização da PCR, foram utilizados aproximadamente 80 ng do

DNA previamente extraído, 10pmol de cada um dos primers, solução tampão

para PCR contendo 1,25mM de KCl e 0,5mM de Tris-HCl (pH 8,4), 2,5mM de

cloreto de magnésio, 180μM de dNTPs mix, 1U de TaqDNA polimerase e água

ultrapura esterilizada, num volume de 25 μL por reação. O termociclador

(Applied Biosystems VERITI® 96) foi programado para 30 ciclos, onde as

temperaturas e os tempos utilizados para desnaturação, anelamento e

extensão foram, respectivamente, 93°C/30s, 56ºC/30s e 72°C/30s, acrescidos

de desnaturação inicial a temperatura de 93°C/3min e extensão final a 72°C/10

min. Os amplicons obtidos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose

a 1,0%, e em seguida o gel foi imerso no brometo de etídeo na concentração

de 5µg/mL, durante 30 minutos, sendo a análise dos resultados realizada com

um auxílio de um equipamento de fotodocumentação sobre luz ultravioleta

associado ao Software Total Lab. TL 100v. 2006.

RESULTADO E DISCUSSÃO

A semelhança entre as características organolépticas (aspecto, cor,

odor, maciez) e tipos de cortes padrão disponível no mercado da carne bovina

e bubalina dificulta a diferenciação pela observação visual, conforme verificado

na carne bovina e bubalina utilizada como controle positivo e negativo

empregado nesse trabalho.

Figura 1: Comparação entre a carne bovina e bubalina, utilizadas como

controle positivo bovino e bubalino no presente trabalho. Onde: A- corte cárneo

bovino, B- corte cárneo bubalino, C- carne moída bovina e D- carne moída

bubalina.

A figura 2 demonstra as bandas de DNA obtidas através da metodologia

de extração preconizada neste estudo, a partir de 8 das amostras coletadas.

Ao se avaliar a extração de DNA das amostras, através de eletroforese em gel

de agarose, pode-se observar que foi possível extrair DNA de todas as

amostras coletadas, assim como das amostras subsequentes. A partir destes

DNAs foram realizadas as reações de PCR para detecção de possíveis fraudes

e os resultados obtidos estão descritos nas Figuras de 3 a 8.

Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose a 0,8%, demonstrando a presença

de DNA extraído a partir de amostras de carne coletadas em estabelecimentos

comerciais especializados, localizados no município de Macapá, estado do

Amapá.

Figura 3 - Confirmação em gel de agarose a 1% da presença de fragmentos de

DNA bovino (346pb) e bubalino (220pb) de 14 amostras de cortes cárneos,

comercializadas e rotuladas como carne bovina em Macapá-AP. onde: pb-

Pares de base; M- Marcador Molecular com escalas de 100pb; 1- controle

positivo para carne bovina, 2-controle positivo para carne bubalina; 3 à 8 e 16:

amostras contendo DNA bubalino; 9 à 15: amostras contendo DNA bovino.

Figura 4 - Gel de agarose 1%, demonstrando a presença de fragmentos de

DNA bovino (346pb) e bubalino (220pb) em carnes moídas coletadas no

município de Macapá-AP comercializada rotuladas como carne bovina. Onde:

M - Marcador Molecular 1kb; 1- controle bovino (346 pb); 2 – controle bubalino

(220 pb); 3 a 9 e 16: amostras contendo fragmento de DNA bovino; 10 a 15:

amostras contendo fragmento de DNA bubalino, caracterizando fraude.

Figura 5 – Gel de agarose 1%, demonstrando a presença de fragmentos de

DNA bovino (346pb) e bubalino (220pb) em cortes cárneos no município de

Belém-PA comercializados rotulados como carne bovina. Onde: M- Marcador

Molecular 1kb; 1- Controle Bovino (346pb); 2- Controle Bubalino (220pb); 3 a

17 e 19: amostras contendo fragmento de DNA bovino; 18: amostra contendo

fragmento de DNA bubalino, caracterizando fraude.

Figura 6 - Gel de agarose 1%, demonstrando a presença de fragmentos de

DNA bovino (346pb) e bubalino (220pb) em carnes moídas coletadas no

município de Belém-PA comercializadas rotuladas como carne bovina. A: M:

marcador molecular 1kb; 1: controle bovino; 2: controle bubalino; 3 a 6: fraude

por substituição com DNA bubalino (220pb). B: M: marcador molecular 1kb; 1:

controle bovino; 2: controle bubalino; 3 a 7: ausência de fraude com DNA

bovino (346pb).

Figura 7 – Gel de agarose 1%, demonstrando a presença de fragmentos de

DNA bovino (346pb) em cortes cárneos coletados no município de Castanhal-

PA comercializada rotuladas como carne bovina. Onde: M - Marcador

Molecular 1kb; 1- controle bovino (346 pb); 2 – controle bubalino (220 pb); 3 a

16: amostras contendo somente DNA bovino.

Figura 8 - Gel de agarose 1%, demonstrando a presença de fragmentos de

DNA bovino (346pb) em cortes cárneos coletados no município de Castanhal-

PA comercializada rotuladas como carne bovina. Onde: M - Marcador

Molecular 1kb; 17- controle bovino (346 pb); 18 – controle bubalino (220 pb); 19

a 32: amostras contendo apenas DNA bovino.

De acordo com os resultados das análises (figuras de 1 a 6) pode-se

afirmar que 50% (7/14) das amostras de cortes cárneos e 43% (6/14) das

amostras de carne moída adquiridas no comércio de Macapá como sendo de

origem bovina apresentaram DNA bubalino, caracterizando fraude, bem como

6% (1/17) das amostras de carne inteira e 6% (4/67) das amostras de carne

moída caracterizaram fraude adquiridas no município de Belém, comprovando

que a prática fraudulenta é frequente na região por substituição de carne

bovina por bubalina, não sendo evidenciada em nenhum momento presença do

DNA das duas espécies na mesma amostra, nas carnes moídas analisadas. No

total, 12,85% (18/140) de amostras fraudadas foram identificadas através da

realização deste trabalho.

Resultados diferentes foram obtidos no município de Castanhal, onde

não se observou fraude em nenhuma das 28 amostras de cortes cárneos

analisadas rotuladas como carne bovina, conforme demonstram as figuras 7 e

8.

A fraude por substituição envolvendo a carne de búfalo nos municípios

de Belém e Macapá podem estar ocorrendo de maneira frequente em virtude

destes estados serem os maiores produtores de búfalos do Brasil (IBGE, 2012)

e nessas regiões a cadeia produtiva da carne encontra-se desestruturada,

sendo pouco observada presença de carne bubalina expostas à venda no

comércio local, gerando questionamento a respeito da comercialização

indevida deste produto.

De acordo com BERNARDES (2007) são poucas as regiões no Brasil

onde a cadeia produtiva da carne bubalina encontra-se organizada, pois

embora a criação de búfalo esteja voltada para produção de carne e leite,

muitos consumidores ainda apresentam relutância em adquirir carne de origem

bubalina. Desta forma, búfalos vem sendo abatidos e comercializados como

bovinos, alternativa esta inadequada e adotada pelo comércio para distribuir a

população carne bubalina sem rejeição, como observado em Macapá e Belém.

Resultados semelhantes aos apresentados neste relatório foram

relatados por SAKALAR e ABASIYANIK (2011), envolvendo fraudes por adição

e substituição em produtos cárneos comercializado em Istambul rotuladas

como sendo exclusivamente de origem bovina. Das 42 amostras coletadas por

estes autores, em 19 foi observada a adição de carne de aves e em 2 amostras

apenas carne de aves. Já nos produtos rotulados como sendo exclusivamente

de carne de aves foi detectado simultaneamente carne bovina, confirmando

que a prática fraudulenta ocorre também em outros produtos de origem animal

e não somente entre carnes com características semelhantes, como a bovina e

bubalina, o que pode ser esclarecido pelo fato da matéria-prima utilizada ser

submetida a processamentos durante a fabricação, o que dificulta a distinção

carne/espécie.

Em regiões em que a cadeia produtiva encontra-se organizada, o preço

pago pela carne de búfalo chega a ser até 20% menor quando comparado a

carne bovina (MARQUES, 2013). Embora seja comprovada cientificamente que

a carne bubalina é a carne vermelha mais saudável, por possuir menos

quantidade de colesterol, teor de gordura e calorias, e maiores quantidade de

proteínas e minerais que a carne bovina (MONTEBELLO & ARAÚJO, 2009), os

consumidores ainda apresentam relutância em adquirir esse produto, pois

durante muito tempo no Brasil esses animais eram utilizados principalmente

para trabalho pesado. Este fato demonstra a deficiência de estratégias que

estimulem e fortaleçam o consumo do produto pelos consumidores da região.

Embora no Brasil sejam escassos trabalhos envolvendo detecção de

fraudes em cortes cárneos, FONSECA (1987) apud TONHATI E FASCIOLA

(2004) a mais de duas décadas autores já relatavam essa prática em São

Paulo, afirmando que frigoríficos abatiam búfalos sem qualquer identificação

especial que os diferenciasse dos bovinos, sendo a carne destinada ao

comércio juntamente com a carne bovina sem nenhuma distinção que pudesse

auxiliar o consumidor no momento da compra. Casos como esse ainda são

frequentes nos dias atuais, onde os búfalos são criados e abatidos como

búfalos e comercializados como bovinos, conforme o observado nos municípios

de Belém-PA e Macapá-AP, causando sérios prejuízos na cadeia produtiva da

carne bubalina pela ausência de demanda especifica, redução do preço

comercial da carne, falta de incentivos para os criadores.

Atualmente a autenticidade do produto juntamente com a rotulagem

correta vem sendo exigida pelo consumidor contemporâneo, como medidas

preventivas de possíveis fraudes, pressionando a cadeia produtiva da carne a

cumprir os requisitos estabelecidos na Resolução RDC n° 259, 20 de setembro

de 2002 (BRASIL, 2002), através dos órgãos de fiscalização para assegurar os

direitos dos consumidores.

MANE et al., (2012) ressaltam que as fraudes ocorrem geralmente entre

produtos de aspectos semelhantes e distintos valores agregado, assim como

de acordo com a disponibilidade do mesmo na região. De acordo com o

verificado no presente trabalho, a disponibilidade abundante de búfalos no Pará

juntamente com a dificuldade de comercialização desse produto pode estar

fazendo com que as carnes de búfalos sejam comercializada sem nenhuma

identificação especial que a diferencie da carne bovina, propiciando o

escoamento da carne sem rejeição.

Em Castanhal os resultados das análises evidenciaram que as amostras

de carne analisadas eram realmente de bovino, estando em pleno acordo com

o descrito na rotulagem, não apresentando fraude por substituição ou

contaminação com carne bubalina em quantidades detectável pela PCR.

Conforme pesquisa realizada por CALVO et al., (2002), a PCR detecta até

0,005% de contaminação com carne bovina crua, desde modo, também capaz

de detectar contaminação com carne oriunda de outras espécies,

demonstrando ser uma técnica bastante precisa, rápida e eficiente na detecção

de fraudes. Já o fato de se ter observado fraude em 6% dos cortes cárneos e

6% das carnes moídas oriundas de Belém pode ser explicado pelo fato de

Belém estar localizados mais próximo à Ilha do Marajó, onde a pecuária

consiste exclusivamente da criação de bubalinos, facilitando o escoamento

dessa carne para a região.

A técnica da PCR multiplex vem sendo bastante utilizada em pesquisas

envolvendo detecção de fragmentos de DNA em vários produtos de origem

animal. LÓPEZ-CALLEJA et al (2005) propuseram o uso da PCR para

detecção de fraude em leite e queijos de búfalas. Os primers descritos por

esses autores foram utilizados neste trabalho e se mostraram eficientes na

detecção de fragmentos de DNA bovino e bubalino nas amostras de carne,

demonstrando que podem ser utilizados também para outros derivados de

bovino ou búfalo.

Portanto, embora os dados aqui demonstrados sejam de extrema

relevância, maiores estudos visando a quantificação de DNA bubalino em

amostras obtidas no comércio devem ser realizados, visando o emprego

rotineiro da metodologia em amostras em condições diferentes das propostas

neste experimento. Para tal, o uso de Real Time PCR vem sendo proposto por

diversos autores e pode ser uma alternativa viável para detecção de fraude em

produtos cárneos.

PUBLICAÇÕES:

Até o momento dois resumos completos relacionados ao tema do plano

de trabalho publicados no VII Congresso Latino-Americano e XIII Congresso

Brasileiro de Higienistas de Alimentos. Os referidos trabalhos foram

apresentados na forma de pôster no evento, que ocorreu entre os dias 28/04 a

01/05/2015, no Hotel Atlântico Búzios Resort (Búzios – Rio de janeiro). Os

artigos aceitos para a apresentação neste congresso foram também publicados

em uma edição suplementar da Revista Higiene Alimentar. Abaixo seguem as

referências dos trabalhos:

- DETECÇÃO DE FRAUDE POR SUBSTITUIÇÃO DE CARNE BOVINA POR CARNE MOÍDA BUBALINA ATRAVÉS DA PCR MULTIPLEX EM AMOSTRAS DE CARNE MOÍDA COMERCIALIZADAS NO MUNICÍPIO DE MACAPÁ, ESTADO DO AMAPÁ, BRASIL. (DETECTION OF FRAUD IN GROUND BEEF FOR REPLACEMENT WITH BUFFALO GROUND MEAT

THROUGH PCR MULTIPLEX IN GROUND MEAT SAMPLES COLLECTED IN MACAPA CITY, AMAPA STATE, BRAZIL). Andrey Carlos do Sacramento de Oliveira, Silvia Cristina da Silva Pedroso, Gabrielle Virgínia Lopes Ferreira,

Talita Bandeira Roos, Carina Martins de Moraes. - PADRONIZAÇÃO DE UMA PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE FRAUDE POR ADIÇÃO DE CARNE BUBALINA EM CARNE MOÍDA BOVINA. (PADRONIZATION OF A MULTIPLEX PCR FOR DETECTION OF FRAUD IN BUFFALOES MEAT ITEM IN GROUND BEEF MEAT). Andrey Carlos do Sacramento de Oliveira, Diogo José Cardilli, Andréia Silva da Silva,

Talita Bandeira Roos, Carina Martins de Moraes. Recentemente, um artigo científico referente ao tema foi aceito com

modificações para publicação na Revista do Instituto Adolfo Lutz, conforme

demonstra a referência abaixo:

-AVALIAÇÃO DA ESPECIFICIDADE, SENSIBILIDADE E REPRODUTIBILIDADE DE UMA PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE FRAUDE POR ADIÇÃO DE CARNE BUBALINA EM CARNE MOÍDA BOVINA (EVALUATION OF SPECIFICITY, SENSITIVITY AND REPRODUCIBILITY OF A MULTIPLEX PCR TO DETECT FRAUD BY ADDITION OF BUFFALO MEAT IN GROUND BOVINE BEEF). Andrey Carlos Do Sacramento de Oliveira, Bárbara Cristina Amorim Ferreira, Gabrielle Virgínia Ferreira Cardoso, Cleyzer Lopes Silva, Andréia Silva da Silva, Flávio da Silva, Rafael Monteiro de Melo, Diogo José Cardilli, Fábio Pereira Leivas Leite, Talita Bandeira Roos, Carina Martins de Moraes. CONCLUSÃO:

A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase - PCR multiplex proposta

nesse estudo foi eficaz e de alta sensibilidade, capaz de detectar de forma

precisa a presença de fraude em amostras de carnes bovinas pela substituição

ou incorporação de cortes cárneos e/ou carne moída bubalina, podendo ser

uma alternativa a ser utilizada na rotina de fiscalização oficial destes produtos.

REFERÊNCIAS

BALLIN, N.Z. Authentication of meat and meat products. Meat Science, V. 86,

n.3,p. 577-587, 2010.

BERNARDES, O. Bubalinocultura no Brasil: situação e importância

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em: 15 julho 2015.

DIFICULDADES: os principais entraves enfrentados foram relacionados a

dificuldade da coleta eficiente de amostras nos diferentes municípios. Como a

bolsista estuda em período integral na Faculdade de Medicina Veterinária, a

coleta de amostra só poderia ser realizada no período fora do horário

comercial. Esta situação foi contornada, pois várias coletas foram realizadas

durante os finais de semana e durante o período de férias da estudante.

PARECER DO ORIENTADOR: A bolsista desenvolveu com sucesso as

atividades propostas no projeto e trabalhou em outras atividades de pesquisa e

extensão desenvolvidas pelo grupo de trabalho ao qual está inserida,

demonstrando ótimo desempenho durante o período.

Castanhal, 09 de agosto de 2015.

Prof. Dr. Carina Martins de Moraes

Orientadora

Andréia Silva da Silva Bolsista

ANEXOS

AVALIAÇÃO DE UMA PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE FRAUDE POR ADIÇÃO DE CARNE BUBALINA EM CARNE MOÍDA BOVINA.

EVALUATION OF A MULTIPLEX PCR FOR DETECTION OF FRAUD BY ADDING OF

BUFFALOES MEAT IN GROUND BOVINE BEEF.

Andrey Carlos do Sacramento de Oliveira1, Diogo José Cardilli

2, Andréia Silva da Silva

3, Talita

Bandeira Roos4, Carina Martins de Moraes

4*.

1Discente do Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal na Amazônia (PPGSAAM).

Universidade Federal do Pará (UFPA), Campus Universitário de Castanhal; 2 Fiscal Agropecuário do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento;

3 Discente da Faculdade de Medicina Veterinária da UFPA – Campus Castanhal;

4Docente da Faculdade de Medicina Veterinária e do Programa de Pós-Graduação em Saúde

Animal na Amazônia (PPGSAAM).

Resumo O presente trabalho buscou determinar a precisão e sensibilidade da técnica PCR multiplex para detecção de fraude por adição intencional de carne moída bubalina em carne moída bovina. Para tal, carnes moídas de bovinos contendo 10%, 25%, 50%, 75% e 90% de carne moída bubalina foram produzidas, bem como carnes moídas exclusivamente de cada uma das espécies (controles) e Reação em Cadeia da Polimerase foi realizada. Os resultados obtidos demonstraram que os primers utilizados neste trabalho foram capazes de detectar o incremento de todas as percentagens de carne moída bubalina nas carnes moídas bovinas experimentalmente fraudadas. Concluiu-se que a PCR multiplex é uma técnica eficaz e de alta sensibilidade, capaz de detectar fraude em carne moída bovina por adição de 10%, 25%, 50%, 75% 90% e 100% de carne moída bubalina. Palavras-chave: carne moída, fraude, PCR multiplex Introdução

De acordo com a Instrução Normativa (IN) N° 83 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), de 21 de novembro de 2003, entende-se por carne moída o produto cárneo obtido a partir da moagem de massas musculares de carcaças de bovinos, seguido de resfriamento ou congelamento. A referida IN acrescenta que esse regulamento aplica-se também ao produto obtido a partir da carne de búfalos. O critério de Designação (Denominação de Venda) determina que o produto deva ser designado de “Carne Moída”, seguido de expressões ou denominações que o caracterizem de acordo com sua temperatura e do nome da espécie da qual foi obtida (BRASIL, 2003).

A carne moída é um alimento que se destaca entre os demais produtos cárneos, especialmente por sua elevada aceitação pelo consumidor, ligada a sua praticidade e preços acessíveis (PIGARRO, SANTOS, 2008; MENDONÇA, SILVA, 2012). Nos últimos anos, o interesse na autenticidade de carne tem aumentado e, por esse motivo,muitos consumidores estão preocupados com a carne que consomem. Dessa forma, a rotulagem precisa é importante, para esclarecer a escolha do consumidor. Em virtude de ser amplamente consumida, torna-se fundamental levantar as questões referentes a possíveis fraudes na comercialização de tais produtos.

Segundo o Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA), entende-se por fraude a alteração ou modificação total ou parcial de um ou mais elementos normais do produto, quando as operações de manipulação e elaboração forem executadas com a intenção deliberada de estabelecer falsa impressão aos produtos fabricados, quando há supressão de um ou mais elementos e substituição por outros, ou ainda, quando há especificação total ou parcial na rotulagem de um determinado produto que não seja o contido na embalagem ou recipiente (BRASIL, 1997).

Mane et. al (2012), relatam que essa prática fraudulenta de produtos miscigenados é mais frequente entre alimentos que apresentam características organolépticas semelhantes, destacando a carne bovina e bubalina nessa questão. Segundo os dados mais recentes do

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2012), o Brasil apresentava um efetivo de rebanho de 1.261.922 cabeças, onde a região Norte apresenta o maior percentual de rebanho de bubalinos do país, sendo que o estado do Pará detém 36% e o estado do Amapá 20,1% de todo o plantel nacional. No entanto, a cadeia produtiva do búfalo não se encontra organizada no país, apresentando uma ausência de estratégias de coordenação. Apesar de percorrer diferentes níveis, esses não encontram-se integrados na referida cadeia produtiva, o que gera fragilidade no seguimento, aumentando a probabilidade de práticas fraudulentas (MARQUES et. al, 2013).

Por esta razão, o presente trabalho tem por objetivo avaliar a eficiência da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase multiplex para detecção de fraude por adição de carne moída bubalina à carne moída bovina, através da produção de carne moída experimentalmente fraudada contendo diferentes percentagens de carne moída bubalina. Material e Métodos

Para a realização do presente trabalho, carnes moídas bovinas fraudadas experimentalmente foram fabricadas no Laboratório de Higiene e Qualidade de Alimentos da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Pará – Campus Castanhal, através do incremento de 10%, 25%, 50%, 75% e 90% de carne bubalina e carnes moídas exclusivamente de cada uma das espécies foram produzidas para serem usadas como controle da técnica. Para a fabricação das carnes moídas fraudadas experimentalmente as amostras foram preparadas para um volume total de 100g. A sequência da moagem foi iniciada nas amostras com menor concentração de carne de búfalo e a manipulação das amostras foi feita com a utilização de lâminas de bisturi estéreis. Após o preparo da amostra com 90% de carne bubalina o moedor foi desmontado, higienizado adequadamente com detergente neutro seguido de exposição à luz UV durante 20 minutos.

Para a realização da PCR multiplex, o DNA das amostras foi extraído, segundo protocolo do kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega®), com modificações na etapa de lise inicial, relacionadas com a adição de 30 mg de Proteinase K e incubação overnight em banho-maria, a 65°C. As sete amostras de DNA foram submetidas a eletroforese em gel de agarose a 1% e em seguida o gel foi imerso em brometo de etídeo na concentração de 5µg/mL, durante 30 minutos. A análise dos resultados da eletroforese foi realizada com um auxílio de um equipamento de foto documentação sobre luz ultravioleta associado ao Software Total Lab. TL 100v. 2006.

Para a quantificação do DNA, usou-se o espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 UV-Vis, sendo o DNA de cadeia dupla quantificado de acordo com a lei de Lambert-Beer. Ainda, com o objetivo de se verificar a pureza das amostras, medição da absorbância a 280nm foi realizada, correspondendo ao pico de absorção de raios ultra violetas (UVs) de proteínas, e a 230nm, que corresponde ao pico de absorção de UVs de contaminantes orgânicos.

Para a realização das reações de PCR multiplex foram utilizados primers que amplificam sequências específicas para a espécie bubalina (Primer reverse 5’ TTCATAATAACTTTCGTGTTGTTGGGTGT 3’), para a espécie bovina (Primer reverse 5’ AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT 3’) e que amplificam sequencias comuns as duas espécies (Primer forward 5’CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATA 3’), descritos previamente por López-Calleja et al (2005), que amplificam sequencias de 200 pares de base (pb) para DNA bubalino e de 346 pb para bovinos. Os primers foram preparados de acordo com a instrução do fabricante (Ludwing Biotec®), sendo diluídos em TE pH 8,0, até a concentração de 100 pmol/µL. A metodologia foi realizada de acordo com o proposto por DARWISH et al (2009) com modificações, sendo o mix calculado para o volume final de 25 µL para cada reação. Para tal, foram utilizadas as seguintes concentrações dos reagentes: 2,5 μL de tampão 10X; 0,75 μL de MgCl2 50mM; 0,5 μL de dNTP 10mM; 1,0 μL de cada primer, na concentração de 10pmol/ μL; 2,0 μL de DNA na concentração de 4,1 ng/ μL; 0,5 μL de Taq DNA polimerase 500 U e 15,75 μL de água ultra pura. O termociclador (Applied Biosystems VERITI® 96) foi programado para 30 ciclos, onde as temperaturas e os tempos utilizados para desnaturação, anelamento e extensão foram, respectivamente, 93°C/30s, 56ºC/30s e 72°C/30s, acrescidos de desnaturação inicial a temperatura de 93°C/3min e extensão final a 72°C/10 min. Os amplicons obtidos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,0%, e em seguida o gel foi imerso no brometo de etídeo na concentração de 5µg/mL, durante 30 minutos, sendo a análise dos resultados realizada com um auxílio de um equipamento de fotodocumentação sobre luz ultravioleta associado ao Software Total Lab. TL 100v. 2006.

Resultados e Discussão Os resultados observados demonstraram que DNA foi obtido através da técnica proposta com qualidade e quantidade suficientes para a execução da PCR. A partir da medição da absorbância a 260nm foi indicada a concentração de DNA das amostras (média de 4,1 ng/μL). A medição da absorbância a 230nm e 280nm apontou valores de 0,041 e 0,045, respectivamente. Em seguida calcularam-se as razões das absorbâncias (260/280= 2) e (260/230= 1,82) e, dessa forma, conclui-se que as amostras de DNA são consideradas puras em vista de apresentarem razão entre 1,8 e 2. Razões inferiores a esses valores indicam contaminação com proteínas, fenol ou outros contaminantes que absorvem intensivamente UV em 280ng (LEHNINGER et. al, 2004).

A figura 1 demonstra os resultados obtidos a partir da PCR multiplex realizada nas 7 amostras de carne moída experimentalmente fraudadas.

Figura 1: Gel de agarose 1,0% demonstrando a presença de fragmentos de DNA bovino (346pb) e bubalino (220pb) obtidos através de PCR multiplex realizada a partir de amostras de carne moída experimentalmente fraudadas com diferentes percentagens de carne moída bubalina, onde: M - marcador molecular 1kb; 1 – controle bovino (346 pb); 2 – controle bubalino (220 pb); 3 – carne moída 100% bovina; 4 - carne experimentalmente fraudada contendo 10% de carne moída bubalina; 5 - carne experimentalmente fraudada contendo 25% de carne moída bubalina; 6 - carne experimentalmente fraudada contendo 50% de carne moída bubalina; 7 - carne experimentalmente fraudada contendo 75% de carne moída bubalina; 8 - carne experimentalmente fraudada contendo 90% de carne moída bubalina e 9 - carne moída 100% bubalina.

Os resultados demonstraram que a PCR multiplex proposta mostrou-se eficaz para a detecção de incrementos de 10%, 25%, 50%, 75% e 90% de carne moída bubalina em carnes moídas bovinas.

Atualmente existem várias opções de técnicas disponíveis para a identificação de espécies que dão origem a carnes cruas e alimentos (determinação de proteínas, lipídios, compostos orgânicos voláteis, entre outras) e entre essas, as análises de DNA merecem destaque (ALI et al, 2012), como uma das alternativas mais viáveis para a detecção, identificação e, consequente, repressão de fraudes por substituição de produtos semelhantes (RODRIGUES et al, 2004). Diversos pesquisadores tem demonstrado a eficiência da utilização da técnica de PCR multiplex em identificar espécies diferentes em uma mesma reação. Kitpipit et al (2013), utilizaram primers para detecção de fraude por substituição e os resultados obtidos mostraram-se altamente específicos. Em 39 amostras analisadas foi possível a identificação de carne de suíno, ovino/caprino e de frango através da metodologia proposta por estes autores.

Os mesmos pesquisadores, no ano de 2014, incrementaram a pesquisa citada acima com a identificação de mais três espécies além das propostas anteriormente (carne de avestruz, equina e bovina), e a reação multiplex proposta foi capaz de identificar as seis espécies, em um total de 125 amostras de carne coletadas (KITPIPIT et al, 2014). MANE et al (2012), em outra pesquisa, testaram a técnica da PCR quanto à sua sensibilidade e especificidade para detectar a carne bovina misturada com a carne bubalina, suína, caprina e de frango. Os resultados evidenciaram que a PCR foi capaz de identificar a espécie alvo a um nível inferior a 1% de incorporação.

A PCR como método de detecção de fraude é possível devido a análise biomolecular das amostras. No presente trabalho a extração de DNA genômico das amostras das carnes moídas fraudadas possibilitou a amplificação da sequência de DNA específica, utilizando-se primers que codificam parte do gene de interesse. A utilização da PCR torna possível a identificação de componentes de uma espécie em diferentes produtos alimentares, detectando,

assim, uma possível adulteração (VELOSO et. al, 2002). Neste trabalho, através da fabricação de carnes moídas experimentalmente fraudadas com incremento de diferentes percentagens de carnes moídas bubalinas, observou-se que a PCR multiplex proposta foi capaz de detectar a incorporação de carne moída bubalina em percentagens que variaram de 10 a 100%, semelhante ao relatado por López-Calleja et. al (2005), que utilizaram os mesmos primers e propuseram o uso de uma PCR tradicional para detecção de fraude em queijos. Conclusão

Concluiu-se que a PCR multiplex proposta é uma técnica eficaz e de alta sensibilidade, capaz de detectar de forma precisa a presença de fraude em amostras de carnes moídas bovinas pela incorporação de 10%, 25%, 50%, 75% 90% de carne moída bubalina, podendo ser uma alternativa a ser utilizada na rotina de fiscalização oficial destes produtos. Referências ALI, M. E., KASHIF, M., UDDIN, K., HASHIM, U., MUSTAFA, S., & CHE MAN, Y. B. (2012). Species authentication methods in foods and feeds: the present, past, and future of halal forensics. Food Analytical Methods, 5(5), 935–955. BRASIL. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de origem Animal. Brasília: 1952. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e do Abastecimento. Instrução Normativa nº 83, de 21 de novembro de 2003. Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Carne Moída de Bovino. Diário Oficial da União, 24 nov. 2003, Seção 1, p.29. Disponível em: http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=4317. Acesso em: 20 nov. 2014. DALMASSO, A., CIVERA, T., LA NEVE, F., Maria Teresa BOTTERO, M.T. (2011). Simultaneous detection of cow and buffalo milk in mozzarella cheese by Real-Time PCR assay. Food Chemistry, 124, 362-366. DARWISH S.F., ALLAM H.A., AMIN A.S. Evaluation of PCR assay for derection of cow’s Milk in water buffalo’s milk.(2009). World applied Sciences Journal, 7(4): 461-7 INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA – IBGE (2012). Censo Agropecuário 2012. Disponível em: http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/ppm/2012/default_pdf.shtm. Acesso em: 25 nov. 2014. KITPIPIT, T., SITTICHAN, K., & THANAKIATKRAI, P. (2013). Are these food products fraudulent? Rapid and novel triplex-direct PCR assay for meat identification. Forensic Science International: Genetics Supplement Series, 4(1), e33–e34. KITPIPIT, T., SITTICHAN, K., & THANAKIATKRAI, P (2014). Direct-multiplex PCR assay for meat species identification in food products. Food Chemistry, 163, 77-82. LEHNINGER, L. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman & Co, 4 ed., pp. 1100, 2004. LÓPEZ-CALLEJA, I.; GONZÁLEZ, I.; FAJARDO, V.A.; RODRÍGUEZ, M.A.; HERNÁNDEZ, P.E.; GARCÍA, T.; MARTIN, R. PCR detection of cows’ milkin water buffalo milkand mozzarella cheese. International Dairy Journal 15 (2005) 1122–1129. MANE, B. G., MENDIRATTA, S. K., & TIWARI, A. K. (2012). Beef specific polymerase chain reaction assay for authentication of meat and meat products. Food Chemistry, 28, 246-249. MARQUES, M.W.; LIMA, N.B.; MORAIS JUNIOR, M.A.; BARBOSA, M.A.G.; SOUZA, B.O.; MICHEREF, S.J.; PHILLIPS, A.J.L.; CÂMARA, M.P.S. Species of Lasiodiplodia asociated with mango in Brazil. Fungal Diversity, v.61, p.181–193, 2013.

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DETECÇÃO DE FRAUDE POR SUBSTITUIÇÃO DE CARNE BOVINA POR CARNE MOÍDA BUBALINA ATRAVÉS DA PCR MULTIPLEX EM AMOSTRAS DE CARNE MOÍDA

COMERCIALIZADAS NO MUNICÍPIO DE MACAPÁ, ESTADO DO AMAPÁ, BRASIL.

DETECTION OF FRAUD IN GROUND BEEF FOR REPLACEMENT WITH BUFFALO GROUND MEAT THROUGH PCR MULTIPLEX IN GROUND MEAT SAMPLES COLLECTED

IN MACAPA CITY, AMAPA STATE, BRAZIL.

Andrey Carlos do Sacramento de Oliveira1, Silvia Cristina da Silva Pedroso

2, Gabrielle Virgínia

Lopes Ferreira3, Talita Bandeira Roos

4, Carina Martins de Moraes

4*.

1Discente do Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal na Amazônia (PPGSAAM).

Universidade Federal do Pará (UFPA), Campus Universitário de Castanhal; 2 Médica Veterinária da Agência de Defesa Agropecuária do Estado do Amapá;

3 Discente da Faculdade de Medicina Veterinária da UFPA – Campus Castanhal;

4Docente da Faculdade de Medicina Veterinária e do Programa de Pós-Graduação em Saúde

Animal na Amazônia (PPGSAAM). Resumo O presente trabalho teve como objetivo testar a hipótese da existência de fraudes pela venda indevida de carne moída bubalina em substituição à carne moída bovina em estabelecimentos comerciais do município de Macapá, Amapá. Para tal, 14 amostras de carne moída foram coletadas em diferentes estabelecimentos, em parceria com o Serviço Oficial de Fiscalização local e análise por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) multiplex foi realizada em todas as amostras. Os resultados obtidos demonstraram fraude por substituição em 50% das amostras analisadas. Concluiu-se que a PCR multiplex é uma técnica eficaz e de alta sensibilidade, capaz de detectar fraude por substituição de carne moída bovina por carne moída bubalina e que há fraude por substituição na carne moída no comércio de Macapá. Palavras-chave: carne moída, fraude, PCR multiplex Introdução A carne moída é definida como o produto cárneo obtido a partir da moagem de massas musculares de carcaças de bovinos, seguida de resfriamento ou congelamento. A Instrução Normativa (IN) N° 83 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), de 21 de novembro de 2003, que fornece a presente definição, acrescenta que esse regulamento aplica-se também a carne moída obtida da moagem a partir da carne de outras espécies, determinando que o produto deva ser rotulado como “Carne Moída”, seguido de expressões ou denominações que o caracterizem de acordo com sua temperatura e ressalta que se deva explicitar a espécie animal da qual o produto foi obtido (BRASIL, 2003). De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) a Amazônia Oriental abriga o maior rebanho bubalino do Brasil, representando aproximadamente 60% do rebanho brasileiro, onde o Pará possui o maior rebanho bubalino, com 36% e o Amapá é o detentor do segundo maior plantel do território nacional, com aproximadamente 20,1% (IBGE, 2012). No estado do Amapá, são poucos os locais em que se observa uma cadeia produtiva bem consolidada em relação à produção de carne bubalina e o preço pago pela carne de búfalo nesse estado varia em torno de 15 e 20% a menos quando comparado com o valor pago pela carne bovina (MARQUES et al, 2013). Esses fatores evidenciam a fragilidade da cadeia produtiva bubalina no estado do Amapá, em toda a sua extensão, o que a torna vulnerável a práticas fraudulentas.

Na região norte do Brasil, a carne de búfalo vem sendo vendida rotulada como carne bovina. Um dos principais motivos apontados para o emprego dessa prática está relacionado à baixa aceitação do consumidor devido, em grande parte, a ausência de informações que estimulem um nicho de mercado considerável de consumo da carne bubalina, realidade que paises como a Itália e Austrália já vivenciaram e superaram com a implementação de campanhas publicitárias a respeito da carne bubalina (OHLY, 1997).

Embora a referida fraude seja relatada com frequência por consumidores e comerciantes de carne através de comunicações pessoais, poucos estudos científicos demonstram sua frequência nos diferentes estados brasileiros e, além disso, técnicas rápidas

que possam ser aplicadas na rotina dos serviços de fiscalização para a sua detecção ainda são pouco descritas. Por esta razão, o presente trabalho tem por objetivo verificar a eficiência da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase multiplex para detecção de possíveis fraudes por substituição de carne moída bovina por carne moída bubalina comercializada no município de Macapá, Amapá, Brasil.

Material e Métodos

Para a realização do presente trabalho, 14 amostras de carne moída com 50g cada foram adquiridas em 14 diferentes estabelecimentos comerciais localizados no município de Macapá, estado do Amapá. As amostras coletadas estavam disponíveis no local de venda rotuladas como carne moída bovina e em todos os pontos de coleta não foi encontrada nenhuma carne rotulada como sendo de carne moída bubalina, sendo a coleta das amostras realizada em parceria com o órgão oficial de fiscalização do Estado.

Para a realização da PCR multiplex, o DNA das amostras foi extraído, segundo protocolo do kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega®), com modificações na etapa de lise inicial, relacionadas com a adição de 30 mg de Proteinase K e incubação overnight em banho-maria, a 65°C. As amostras de DNA extraídas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose a 1% e em seguida o gel foi imerso em brometo de etídeo na concentração de 5 µg/mL, durante 30 minutos. A análise dos resultados da eletroforese foi realizada com o auxílio de um equipamento de foto documentação sobre luz ultravioleta associado ao Software Total Lab. TL 100v. 2006.

Para a realização das reações de PCR multiplex foram utilizados primers descritos previamente por López-Calleja et al (2005), que amplificam sequências específicas para a espécie bubalina (Primer reverse 5’ TTCATAATAACTTTCGTGTTGTTGGGTGT 3’), para a espécie bovina (Primer reverse 5’ AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT 3’) e primers que amplificam sequencias comuns as duas espécies (Primer forward 5’CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATA 3’), gerando sequencias de 200 pares de base (pb) para DNA bubalino e de 346 pb para bovinos. Os primers foram preparados de acordo com a instrução do fabricante (Ludwing Biotec®), sendo diluídos em TE pH 8,0, até a concentração de 100 pmol/µL. O mix da reação foi calculado para o volume final de 25 µL, sendo utilizadas as seguintes concentrações dos reagentes: 2,5 μL de tampão 10X; 0,75 μL de MgCl2 50mM; 0,5 μL de dNTP 10mM; 1,0 μL de cada primer, na concentração de 10pmol/ μL; 2,0 μL de DNA na concentração de 4,1 ng/µL; 0,5 μL de Taq DNA polimerase (500 U) e 15,75 μL de água ultra pura. O termociclador (Applied Biosystems VERITI® 96) foi programado para 30 ciclos, onde as temperaturas e os tempos utilizados para desnaturação, anelamento e extensão foram, respectivamente, 93°C/30s, 56ºC/30s e 72°C/30s; acrescidos de desnaturação inicial a temperatura de 93°C/3min e extensão final a 72°C/10 min. Os amplicons obtidos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,0%, e em seguida o gel foi imerso no brometo de etídeo na concentração de 5 µg/mL, durante 30 minutos, sendo a análise dos resultados realizada com um auxílio de um equipamento de foto documentação sobre luz ultravioleta associado ao Software Total Lab. TL 100v. 2006. Resultados e Discussão

A figura 1 demonstra os resultados obtidos a partir da PCR multiplex realizada nas 14 amostras de carne moída coletadas no município de Macapá-AP.

Figura 1: Gel de agarose 1,0% demonstrando a presença de fragmentos de DNA bovino (346pb) e bubalino (220pb), obtidos através de PCR multiplex realizada a partir de amostras de carne moída coletadas no município de Macapá-AP, onde: M - marcador molecular 1kb; 1 – controle bovino (346 pb); 2 – controle bubalino (220 pb); 3 a 8 e 16 – amostras contendo fragmentos de DNA bovino (346pb); 9 a 15 – amostras contendo fragmentos de DNA bubalino (220pb), caracterizando fraude.

De acordo com o resultado da análise pode-se afirmar que 50% das amostras de carne

moída adquiridas no comércio de Macapá-AP como sendo de origem exclusivamente bovina apresentaram DNA bubalino, caracterizando fraude por substituição. Em nenhuma das amostras de carne moída analisadas foi possível detectar a presença de DNA das duas espécies simultaneamente, o que demonstra que nos casos onde foi detectada a presença de DNA bubalino não havia mistura com a carne bovina ou não havia quantidades significantes de carne bovina adicionada ou contaminando a amostra.

Os resultados aqui demonstrados comprovaram que a fraude por substituição é uma realidade na região alvo do estudo, visto que a rotulagem do produto deve informar sua verdadeira origem. Esta prática é considerada crime, de acordo com a Lei Nº 8.137/90, Capítulo II, dos crimes contra a economia e as relações de consumo, onde o artigo VII, parágrafo II, informa que “Vender ou expor à venda mercadoria cuja embalagem, tipo, especificação, peso ou composição esteja em desacordo com as prescrições legais ou que não corresponda à respectiva classificação oficial” é considerado uma ilegalidade (BRASIL, 1990a,b).

Alguns autores relatam que bubalinos costumam ser abatidos e ter a sua carne rotulada e/ou comercializada como carne bovina, sem qualquer identificação especial e sendo destinada ao consumo juntamente com a carne bovina (JORGE, 2004; TONHATI E FASCIOLA, 2004). Este fato ocorre porque o valor comercial da carne de búfalo é significativamente inferior ao da carne bovina (BERNARDES, 2007).

A técnica da PCR vem sendo estudada por pesquisadores como uma ferramenta eficiente para a detecção de fraudes. Calvo et. al (2002), demonstraram a eficiência da PCR para detecção de DNA de tecido bovino in natura e em alimentos processados, e puderam concluir que a PCR é uma técnica poderosa para a identificação de DNA bovino, tendo alta especificidade e sensibilidade, podendo detectar 0,005% de contaminação com carne bovina crua sendo, portanto, capaz até de detectar contaminação com tecidos de outras espécies apenas pelo contato entre ambas durante a manipulação inadequada durante a fabricação do produto.

López-Calleja et. al (2005), desenvolveram um trabalho com PCR multiplex tendo como foco a detecção de fraudes em leite e queijo de búfala. Os primers desenhados pelos autores para detecção tanto de DNA bovino quanto bubalino em amostras de queijo e leite foram utilizados no presente trabalho e, como evidenciam os nossos resultados, estes oligonucleotídeos mostraram-se eficientes para amostras de tecido animal, no caso a carne. A prática de fraudes com produtos de origem bovina e bubalina é uma realidade em muitos mercados ao redor do mundo, e as consequências são graves e afetam governos, consumidores e produtores, sendo a semelhança entre a carne das espécies um fator que facilita tais fraudes tanto em produtos in natura (leite e carne) quanto de seus derivados. Por essa razão os dados aqui demonstrados apontam que a PCR proposta pode ser uma alternativa viável a ser adotada pelos órgãos de fiscalização, visando a defesa do consumidor. Conclusão

Concluiu-se que a PCR multiplex proposta é uma técnica eficaz e de alta sensibilidade e especificidade, capaz de detectar de forma precisa a presença de fraude em amostras de carnes moídas. Concluiu-se também, que há fraudes por substituição na carne moída no comércio de Macapá-AP e que essas carnes fraudadas são comercializadas livremente nos pontos de comercialização local, sendo necessário que se adotem medidas de controle pelos órgãos oficiais de fiscalização a fim de que o direito do consumidor seja garantido. Referências Bibliográficas BERNARDES, O. Bubalinocultura no Brasil: situação e importância econômica. Revista Brasileira Reprodução Animal, Belo Horizonte, v.31, n.3, p.293-298, jul./set. 2007. BRASIL. Ministérios da Justiça. Lei nº 8.078, de 11 de setembro de 1990- Código de defesa do consumidor. Dispõe sobre a proteção do consumidor e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília: 13 set. 1990b, Sec. 1, pt. 176. a.

BRASIL. Ministérios da Justiça. Li nº 8.137, de 27 de setembro de 1990- Define crimes contra a ordem tributária, econômica e contra as relações de consumo, e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília: 28 dez. 1990a, Sec. 1, pt. 25534. b. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e do Abastecimento. Instrução Normativa nº 83, de 21 de novembro de 2003. Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Carne Moída de Bovino. Diário Oficial da União, 24 nov. 2003, Seção 1, p.29. Disponível em: http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=4317. Acesso em: 20 nov. 2014. CALVO, J.H., RODELLAR, C., ZARAGOZA, P., OSTA, R. Beef and bovine derived material identification in processed and unprocessed food and feed by PCR amplification. J. Agric. Food Chem. 50, 2002. 5262–5264. INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA – IBGE (2012). Censo Agropecuário 2012. Disponível em: http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/ppm/2012/default_pdf.shtm. Acesso em: 25 nov. 2014. JORGE, A. M. Programa de qualidade na produção de carne de búfalos. In: Simpósio do Núcleo de Estudos em Bovinocultura, I, 2004. UNESP-FMVZ-Botucatu. Disponível em:<http://www.fmvz.unesp.br/bufalos/HPBufalos_files/Palestras/Prog%20Qual%20Prod%20Carne%20Bubalina.pdf>: Acesso em: 12 junho 2014. LÓPEZ-CALLEJA, I.; GONZÁLEZ, I.; FAJARDO, V.A.; RODRÍGUEZ, M.A.; HERNÁNDEZ, P.E.; GARCÍA, T.; MARTIN, R. PCR detection of cows’ milkin water buffalo milkand mozzarella cheese. International Dairy Journal 15 (2005) 1122–1129. MARQUES, C. S. S.; OAIGEN, R. P.; MORAES, C. M.; TAVARES, R. E. B.; LIMA, M. M.; MIRANDA, A. S. Caracterização da Cadeia Produtiva Bubalina no Brasil: Rebanho, Abates e Limitações. In: X CONGRESSO BRASILEIRO DE BUIATRIA, 2013, Belém. Anais...Belém: XXXVII Semana do Médico Veterinário do Pará- SEMAVET, 2013. p.173-188. OHLY, J. J.; Prova organoléptica com carnes bubalinas e bovinas de animais criados nas pastagens de várzeas da Amazônia central. Acta Amazônica 27 (1): 33-42. 1997. TONHATI, Humberto; FASCIOLA , Antonio. SIMCORTE, IV, 2004. Viçosa. Sistemas de Produção de Carne Bubalina no Brasil: Tecnologias e Informações para o Desenvolvimento Sustentável Disponível em: <http://www.simcorte.com/index/Palestras/q_simcorte/simcorte12.pdf> Acesso em: 31 agosto 2012. Autora a ser contactada: Dr. Carina Martins de Moraes, Professora Adjunta da Faculdade de Medicina Veterinária e do Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal (PPGSAAM), Universidade Federal do Pará (UFPA), Campus II. Endereço: BR 316, km 62, Bairro Saudade (entrada pelo Instituto Federal do Pará - IFPA), Castanhal, Pará. E-mail: carina_moraes@terra.com.br/carinamoraes@ufpa.br.