UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA

MESTRADO PROFISSIONAL EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA

ELINE MANHÃES REID CALLEGARI

ESTUDO DE BIOMARCADORES RELACIONADOS À AGRESSIVIDADE E

INVASIVIDADE EM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL

VITÓRIA

2015



INVASIVIDADE EM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Clínica Odontológica do Centro de

Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito

Santo como requisito parcial para obtenção do título de

Mestre em Clínica Odontológica.

Orientadora: Profª. Drª. Letícia Nogueira da Gama de

Souza

Co-Orientadora: Profª. Drª. Liliana Aparecida Pimenta de

Barros

VITÓRIA

2015

Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)

(Biblioteca Setorial do Centro de Ciências da Saúde da Universidade

Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)

Callegari, Eline Manhães Reid, 1985 -

C157e Estudo de Biomarcadores Relacionados à Agressividade e

Invasividade em Carcinoma de Células Escamosas Oral / Eline

Manhães Reid Callegari – 2015.

126 f. : il.

Orientador: Letícia Nogueira da Gama de Souza.

Coorientador: Liliana Aparecida Pimenta de Barros.

Dissertação (Mestrado Profissional em Clínica Odontológica)

– Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da

Saúde.

1. Laminina. 2. Metaloproteinase 9 da Matriz. 3. Carcinoma de

Células Escamosas. I. Souza, Letícia Nogueira da Gama de. II.

Barros, Liliana Aparecida Pimenta de. III. Universidade Federal do

Espírito Santo. Centro de Ciências da Saúde.

IV. Título.

CDU: 616.314



INVASIVIDADE EM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Odontológica

do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo como

requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Clínica Odontológica.

Aprovada em 20 de novembro de 2015.

COMISSÃO EXAMINADORA

----------------------------------------------------

Profª.Drª. Letícia Nogueira da Gama de Souza

Universidade Federal do Espírito Santo

Orientadora

-----------------------------------------------------

Prof. Dr. Marcos da Silva Pacheco

Universidade Federal do Espírito Santo

Examinador Interno

----------------------------------------------------

Prof. Drª. Vanessa Morais Freitas

Universidade de São Paulo

Examinador Externo

DEDICATÓRIA

Ao meu eterno amor de alma, Kristian Callegari,

por seu incentivo constante!

A minha amada mãe e querido irmão.

Mas a vereda do justo é como a luz da aurora,

que vai brilhando mais e mais até ser dia perfeito

(Pv 4:18).

AGRADECIMENTOS

Ao Deus de amor e infinita bondade por todos os benefícios que me tens feito. Tu és

Digno de receber a glória, honra e poder, pois criastes todas as coisas e por tua

vontade elas existem e foram criadas.

Ao amor da minha vida e até a eternidade, Kristian Callegari. De todas as vitórias

que obtive na vida, você é a maior. Ao seu lado tive a certeza de que anjos podem

tomar a forma humana e habitar entre homens, vindo com a missão de nos proteger.

Obrigada por seu companheirismo, incentivo e paciência sem igual. A sua presença

alegra meus dias. Te amo!

A minha mãe, Eliane, e meu irmão, Marliére, que construíram um caminho para que

eu pudesse chegar até aqui. Obrigada pelas muitas orações e conselhos. Amo

vocês!

Ao meu pai Marliére Reid e meu avô Manoel Bento da Silva (in memorian), grandes

incentivadores dos meus estudos.

As tias Marline e Marli, pela presença constante em minha vida e amor, desde a

tenra idade.

A toda família que participou desta conquista.

A minha orientadora Prof. Letícia Nogueira por me conceder inúmeras oportunidades

de crescimento, nortear este trabalho e ser referência profissional para mim. Sua

paciência, inteligência, disponibilidade e capacidade ímpar me ajudaram a discernir

um professor de um mestre. O mestre nos ajuda a ir além do que podemos enxergar

e nos capacita em atividades que outrora desconhecíamos. Levarei este exemplo de

amor e dedicação para minha vida pessoal e profissional. Muito obrigada por tudo!

A minha co-orientadora Prof. Liliana Barros por ceder o material necessário para

realização do trabalho e por todas as considerações que enriqueceram o mesmo.

A Professora Vanessa por aceitar o convite para participação dessa banca.

Ao Prof. Breno Valentim que cedeu os equipamentos necessários para as análises

da pesquisa e por fazer parte da banca de qualificação.

A Prof. Karla Loureiro e ao Prof William Bautz que fizeram parte dessa trajetória e

empenharam muitos esforços para melhorar nosso ambiente de trabalho acadêmico.

A professora Daniela Nascimento que me recebeu na disciplina de Cirurgia/ UFES.

Ao Prof. Marcos Pacheco por me receber na disciplina de Histologia e me conceder

oportunidade para a prática profissional, além das contribuições na banca de

qualificação.

Aos professores do programa de Pós Graduação em Clínica Odontológica, que

contribuíram para meu aprendizado.

Às alunas Ana Flávia Lagassa e Izabela Sinara pela amizade e apoio nas horas

tristes e alegres, inestimáveis contribuições e disponibilidade ímpar em ajudar.

Aos colegas de turma, pelos momentos compartilhados, em especial as alunas

Carolina Santos e Isabela Yamashita, pelas horas de estudo que foram divididas,

apoio e companheirismo.

Ao Serviço de Anatomia Patológica Bucal (SAPB/ UFES), bem como ao Núcleo de

Diagnóstico Bucal, pelo material proveniente de seus pacientes.

Ao Laboratório de Ultraestrutura Celular Carlos Alberto Redins, pela disponibilidade

do espaço, equipamentos e a seus funcionários pela ajuda.

Ao Laboratório Histotécnico representado pelas técnicas Luciene e Rafaela que com

muita presteza contribuíram para este trabalho.

Ao Laboratório de Biologia do Desenvolvimento e Tumorigênese por permitir o

processamento dos experimentos e utilização dos equipamentos.

A FAPES, pelo apoio financeiro concedido através da bolsa ao longo do curso.

RESUMO

No processo de tumorigênese, a laminina-332 executa múltiplos processos

biológicos através de sua cadeia γ2 e a MMP-9 atua no processamento dos

componentes extracelulares. Nós propomos analisar o perfil molecular da cadeia γ2

e da MMP-9 em leucoplasias de alto risco, carcinomas in situ (CIS) e carcinomas de

células escamosas invasivos (CCEs) e estabelecer possíveis correlações

clinicopatológicas. As expressões da cadeia γ2 e de MMP-9 foram avaliadas por

imuno-histoquímica em 10 pacientes com lesões orais de alto risco de malignizaçāo

e 26 casos com CCE invasivos. Através de imunomarcação da cadeia γ2 foi possível

observar uma membrana basal contínua na maioria das lesões de alto risco de

malignizaçāo enquanto que uma membrana descontínua ou ausente predominou

nos casos de CCEs invasivos. Células do estroma de CCE invasivos apresentaram

expressão mais elevada de MMP-9 quando comparada aos casos de lesões de alto

risco. A associação entre o perfil clínico dos pacientes e os achados imuno-

histoquímicos demonstrou que fumantes com CCEs invasivos tiveram expressão

mais elevada da cadeia γ2 no compartimento epitelial e de MMP-9 nos fronts

invasivos. Ainda, aumento da expressão de MMP-9 no estroma foi associado aos

pacientes do sexo masculino com idade superior a 60 anos diagnosticados com

CCE invasivo. Nossos resultados indicam uma associação entre características

clínicas e microscópicas em lesões orais com alto potencial de malignização e nos

carcinomas orais, com uma mudança progressiva na expressão da cadeia γ2 e

MMP-9 durante o processo de tumorigênese.

Palavras-chave: laminina-332; cadeia γ2; metaloproteinase-9; carcinoma de células

escamosas oral.

ABSTRACT

In tumorigenesis process, laminin-332 performs multiple biologic effects by γ2 chain,

and MMP-9 acts disrupting extracellular components. We aimed to assess the

molecular profile of γ2 chain and MMP-9 in leukoplakias oral high-risk, carcinoma in

situ (CIS) and oral invasive carcinoma cell squamous (OSCC) and establish possible

associations with clinicopathologic features. γ2 chain and MMP-9 expression were

assessed by immunohistochemistry in 10 patients with high-risk malignancy lesions

and 26 cases of invasive OSCC. The immunostaining of γ2 chain in high-risk lesions

showed most cases with a continuous basement membrane, on the other hand the

majority of invasive OSCC had a discontinuous membrane or absence. OSCC

stromal cells showed a higher presence of MMP-9 compared to cases of high-risk

lesions. The association between clinical and expression profile demonstrated that

smokers with invasive OSCC had a higher expression of γ2 chain in epithelium and

MMP-9 in invasive fronts. A higher expression of MMP-9 in stromal cells was

associated with male patients, older than 60 years and diagnosed with invasive

OSCC when compared with high-risk lesions. Our results indicate an association

between clinical and microscopic features in oral lesions with high malignant potential

and oral carcinomas, with a progressive change in γ2 chain and MMP-9 expression

during tumorigenesis.

Keywords: laminin-332; γ2 chain; matrix metalloproteinase-9; oral squamous cell

carcinoma

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mesh/68020780

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Progressão de displasia epitelial em carcinomas invasivos com

metástase...................................................................................................................24

Figura 2- Isoforma da laminina 332............................................................................35

Figura 3- Dinâmica do processamento da membrana basal e seus componentes por

metaloproteinases de matriz......................................................................................43

Figura 4- Prancha de imuno-histoquímica para laminina 332 e MMP-9....................53

Figura 5- Gráficos de associação...............................................................................54

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Alterações teciduais e citológicas apresentadas no diagnóstico de

displasia oral...............................................................................................................21

Tabela 2- Isoformas das lamininas.............................................................................33

Tabela 3- Família das MMPs e sua implicação em doenças orais............................39

Tabela 4 Dados Clínicos............................................................................................49

Tabela 5- Perfil da expressão da cadeia γ2 da laminina-332 e MMP-9.....................51

LISTA DE SIGLAS

CCE - Carcinoma de Células Escamosas

CIS - Carcinoma in situ

CB - Camada Basal

SB - Camada Suprabasal

DCNTs - Doenças Crônicas Não Transmissíveis

DEO - Displasia epitelial oral

DOPMs - Desordens Orais Potencialmente Malignas

EUA - Estados Unidos da América

HE - Hematoxilina e Eosina

HPV- Papiloma vírus Humano

IARC - Agência Internacional de Pesquisa do Câncer

INCA - Instituto Nacional de Câncer

KCOTs - Tumores Odontogênicos Ceratocísticos

LAMγ2 - Cadeia γ2 da Laminina

MB - Membrana Basal

ME - Microscopia Eletrônica

MEC - Matriz Extracelular

MMP-9 - Metaloproteinase de Matriz Extracelular-9

MMPs - Metaloproteinases de Matriz

OMS - Organização Mundial de Saúde

TIMP - Inibidores Teciduais de Metaloproteinases

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................16

2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................18

2.1 LEUCOPLASIA E CARCINOMA IN SITU................................................18

2.2 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL.................................24

2.3 MATRIZ EXTRACELULAR E MEMBRANA BASAL................................29

2.4 LAMININA 332 E CADEIA γ2..................................................................31

2.5 METALOPROTEINASES DE MATRIZ (MMPS) E MMP-9......................38

3 OBJETIVOS............................................................................................................45

4 MÉTODOS..............................................................................................................46

4.1 PACIENTES E AMOSTRAS DE TECIDOS.............................................46

4.2 IMUNO-HISTOQUÍMICA.........................................................................46

4.3 ANÁLISE MICROSCÓPICA...............................................................47

4.4 ASSOCIAÇÃO ENTRE DADOS CLÍNICOS E

MICROSCÓPICOS...................................................................................48

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................................48

5 RESULTADOS........................................................................................................49

5.1 DADOS CLÍNICOS..................................................................................49

5.2 EXPRESSÃO DA CADEIA γ2 DA LAMININA-332 EMMP-

9.....................................................................................................................50

5.3 ASSOCIAÇÃO ENTRE OS DADOS CLÍNICOS E EXPRESSÃO DA

CADEIA γ2 E MMP-9............................................................................52

6 DISCUSSÃO………................................................................................................55

7 CONCLUSÃO.........................................................................................................59

8 REFÊRÊNCIAS.......................................................................................................60

9 APÊNDICE 1...........................................................................................................71

9.1 ARTIGO 1- ASSOCIATION OF LAMININ-332 AND MMP-9

EXPRESSION WITH CLINICOPATHOLOGICAL PARAMETERS IN

MALIGNANT TRANSFORMATION OF ORAL

LESIONS.................................................................................................71

10 APÊNDICE 2.........................................................................................................92

10.1 ARTIGO 2- ASSOCIAÇÃO ENTRE ASPECTOS

CLINICOPATOLÓGICOS E EXPRESSÃO DA CADEIA γ2 DA LAMININA

332 EM ESTRUTURAS VASCULARES DE CARCINOMA DE CÉLULAS

ESCAMOSAS ORAIS

............................................................................................................92

ANEXO I...................................................................................................................116

ANEXO II..................................................................................................................123

16

1 INTRODUÇÃO

Doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são a causa de um elevado

grau de morbidade e mortalidade em todo o mundo e neste contexto destacam-se as

neoplasias malignas. Somente na cavidade oral e faringe foram diagnosticados

42.440 novos casos de câncer e 8.390 mortes foram estimadas em 2014 nos EUA

(SIEGEL et al, 2014). O carcinoma de células escamosas oral (CCE) é o câncer

bucal mais comum, compreendendo 90-95% dos casos. Tem origem epitelial e

representa o sexto câncer mais frequente em homens e o oitavo em mulheres

(JOHNSON et al, 2011). O CCE pode surgir de desordens orais potencialmente

malignas (DOPMs), tais como leucoplasia e eritroplasia, cuja a taxa de

transformação maligna varia entre 2-3% por ano (VAN DER WAAL, 2014).

O tabaco é o principal fator de risco, mas o uso abusivo de álcool e infecções

pelo HPV estão ligados à indução do CCE oral, embora outros fatores estejam

sendo estudados (TORRE et al, 2012). A detecção precoce permanece um desafio

uma vez que a lesão caracteriza-se por um elevado grau de invasão local e

metástases para os nódulos linfáticos cervicais (FELLER, LEMMER, 2012).

Um passo importante na progressão do câncer são as alterações que afetam

a membrana basal, uma estrutura dinâmica que consiste em colágeno tipo IV,

proteoglicanos e uma densa rede de glicoproteínas (KULASEKARA et al, 2009). A

laminina-332 é uma glicoproteína extracelular de alto peso molecular (400-900 kDa)

presente na membrana basal de células epiteliais. Esta molécula desempenha

múltiplas funções biológicas como adesão celular, migração, diferenciação e

proliferação (TRINGLER et al, 2007). A laminina tem sido associada com a

progressão do tumor em uma variedade de neoplasias epiteliais malignas (IMURA et

al, 2012).

Estudos recentes têm mostrado que a atividade biológica da laminina-332 é

modulada pelo processamento da cadeia γ2 (SATO et al, 2014; MARANGON

JUNIOR et al, 2014), pela ação de enzimas proteolíticas, denominadas

metaloproteinases de matriz (MMPs). Estas enzimas atuam processando

componentes extracelulares promovendo mudanças na interação célula-célula e

célula-matriz (THOMAS; LEWIS; SPEIGHT, 1999). A alta expressão de MMPs tem

sido evidenciada e relacionada ao mau prognóstico em diversos tipos de carcinomas

17

(NABESHIMA et al, 2002; REIS et al, 2012; YANG et al, 2014; APARNA et al, 2015).

Entre os vários tipos de MMPs, MMP-9 se destaca no contexto da tumorigênese.

Estudos mostraram que a enzima está intimamente associada com a invasão de

células tumorais, metástase e angiogênese (IIZASA et al, 1999; CHU et al, 2011).

Ainda, as MMPs foram consideradas como novos biomarcadores para diferentes

tipos de câncer, incluindo o câncer da mama (MMP-1, -9 -13,), pulmão (MMP-1, -7, -

9), colo-retal (MMP-1, -2, -7, -9, -13), ovário (2, -9, -14) (WU et al, 2008; JUMPER et

al, 2004; LENGYEL et al, 2001; CHO et al, 2007). Deve-se destacar que a MMP-9

estava presente em cada um dessas neoplasias.

A gradação histológica tem sido definida como parâmetro para diagnósticar o

câncer de boca durante anos. No entanto, é importante ressaltar que seu valor

prognóstico ainda é considerado controverso. Portanto, para uma melhor

compreensão dos mecanismos envolvendo o epitélio na transformação maligna e a

invasividade, a pesquisa de biomarcadores e alterações genéticas se torna

necessária para o melhor entendimento da carcinogênese oral (TAGHAVI, YAZDI,

2015).

18

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Leucoplasias e Carcinoma in situ

Desde o ano de 1978, o conceito de lesões e condições orais pré-malignas é

estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS). Contudo, em 2005 a OMS

recomendou a utilização do termo “desordens orais potencialmente malignas”

(DOPMs) para as lesões que possuem predisposição para transformação maligna

(VAN DER WAAL, 2009). Essas desordens evidenciam-se por alterações na

morfologia tecidual com risco para o desenvolvimento do câncer de boca se

comparado ao tecido sadio.

Em relação às DOPMs, a leucoplasia ganha destaque por ser a desordem

cancerizável mais prevalente na cavidade oral. Segundo Napier e Speight (2008) ela

afeta 1% a 5% da população mundial. Contudo, estes valores podem sofrer grande

variação, estando relacionados diretamente a cultura e aos hábitos populacionais.

O termo leucoplasia foi utilizado pela primeira vez em 1877 por Schwimmer.

Representavam lesões brancas na mucosa oral sem causa estabelecida

(GRINSPAN, 1973). Em 1978, a leucoplasia foi definida pela OMS como uma

mancha branca não removível à raspagem, presente na mucosa e que só poderia

ser diagnosticada depois de descartada outras possibilidades que se assemelhavam

clinicamente às placas brancas (RODRIGUES et al., 2000).

No entanto, uma gama de lesões apresenta aspecto esbranquiçado, o que

exige portanto, diagnóstico diferencial. Entre as possíveis lesões estão: candidíase

pseudomembranosa, lúpus discóide eritematoso, lesão friccional, leucoplasia pilosa,

lesão associada com restauração (lesão galvânica), leucoedema, líquen plano

reticular, linha alba, morsicatio buccarum, papiloma, sífilis secundária, lesões

induzidas por tabaco e nevo esponjoso (VAN DER WAAL et al., 1997). Para a

realização do diagnóstico da leucoplasia preconiza-se a exclusão de fatores

etiológicos prováveis durante o período de duas a quatro semanas. Se não houver o

desaparecimento, a biópsia torna-se imperativa para confirmação histológica

(LÓPEZ-LÓPEZ; OMAÑA-CEPEDA; JANÉ-SALAS, 2015).

19

O aparecimento da leucoplasia geralmente ocorre em homens de meia

idade, sendo a faixa etária mais acometida entre 40 a 60 anos, mas a prevalência

aumenta consideravelmente tanto em homens quanto em mulheres com mais de 70

anos (DOST et al., 2013; NEVILLE et al., 2009).

Há dois tipos de leucoplasias que podem ser distinguidas clinicamente: não-

homogêneas e homogêneas. As homogêneas apresentam transformação maligna

relativamente baixa, em contrapartida, as de aspecto não-homogêneo apresentam

uma prevalência maior de transformação (WARNAKULASURIYA et al., 2008).

Segundo Van der Waal (2014) a chance de transformação maligna é inferior a 2-3%

ao ano.

A localização das desordens e o aspecto são considerados fatores de risco.

Quanto à localização os sítios mais frequentes são mucosa jugal, vermelhão de lábio

e gengiva, representando dois terços dos locais acometidos. Porém, as lesões no

assoalho da boca com aspecto não homogêneo e presença de displasias epiteliais

são as que apresentam maior risco de transformação (NEVILLE; DAY, 2002;

MORTAZANI et al., 2014; DOST et al., 2013). Outros fatores que devem ser

observados atentamente com relação à transformação maligna são: sexo

(particularmente mulheres), período em que a lesão está presente, leucoplasias

idiopáticas e presença de Candida albicans (LIU et al., 2010).

Os fatores etiológicos fortemente associados a esta condição são tabaco,

álcool, e associação dessas duas drogas. Em pacientes tabagistas, há 6 vezes mais

risco de acometimento do que em não fumantes (VAN DER WAAL, 2009). Além

disso, existe possível relação com HPV, deficiência de vitamina A, B12 e C, e ácido

fólico que podem influenciar no seu aparecimento (RAMASWAMY et al., 1996).

Histopatologicamente, a leucoplasia não apresenta aspecto específico. Suas

principais características são: atrofia e hiperplasia com ou sem hiperceratose no

epitélio, podendo também apresentar áreas displásicas (WARNAKULASURIYA et

al., 2008). A displasia epitelial oral (DEO) é caracterizada por variação de mudanças

morfológicas e celulares nos tecidos que são similares àquelas que acontecem no

CCE. São restritas ao epitélio e permanecem como uma condição não invasiva. Ela

é considerada um diagnóstico histopatológico que descreve um estágio pré-

canceroso e sua avaliação histopatológica é um fator preditivo para a transformação

20

maligna de DOPMs (DOST, et al, 2013). A taxa de alterações malignas e displasias

epiteliais em leucoplasias orais varia entre 15,6 a 39,9 % (NEVILLE; DAY, 2002).

A evidenciação da presença de DOPMs e o risco para desenvolvimento de

câncer têm sido realizados pelo método padrão de gradação da displasia epitelial

oral. Porém, este método é considerado subjetivo, já que depende da interpretação

do patologista (TABOR et al., 2003). Pela diversidade de aspecto clínico, ausência

de sintomatologia e dificuldade quanto à tomada de decisão, o diagnóstico da

leucoplasia se mostra complexo e perpassa por um caminho considerado confuso

(DOST et al., 2013). Quando lesões leucoplásicas apresentam DEO e não são

interceptadas precocemente, podem evoluir para carcinoma in situ e até mesmo

CCE (WARNAKULASURIYA et al., 2008).

Em relação ao Carcinoma in situ (CIS), são lesões classificadas

histologicamente como CCE com displasia severa envolvendo toda a extensão

epitelial, porém ao contrário de CCEs invasivos, o CIS está restrito ao epitélio

(ONOFRE; SPOSTO; NAVARRO, 2001).

Embora o CIS de outras regiões do corpo, como no colo uterino há

possibilidade de regressão, na mucosa oral esse fato é desconhecido. Além disso,

há muita dificuldade de acompanhamento e precisão do momento exato do período

de transição de um CIS para um carcinoma invasivo (WALDRON, SHAFER, 1975).

Essa verificação é realizada muitas vezes por profissionais inexperientes e com

lâminas coradas por hematoxilina e eosina (HE). Com a introdução de muitos

recursos científicos nos serviços de patologia, a utilização apenas de HE já não

parece ser suficiente para o diagnóstico final do CIS oral (YURCHENCO, 2011).

Com o objetivo de simplificar o reconhecimento dessas lesões, a OMS

recomendou em 2005 critérios para a gradação de lesões limítrofes (incluindo CIS e

displasias epiteliais severas) da mucosa oral. Nessa edição houve a recomendação

de verificar toda a espessura ou a proliferação de células anômalas com mitoses

atípicas na espessura total do tecido epitelial para o diagnóstico final de CIS. Este

critério minimiza as dificuldades encontradas por patologistas para o reconhecimento

diferencial de suas características morfológicas (KOBAYASHI, 2010).

21

A classificação de displasia epitelial continua a ser um assunto muito

debatido. Isso não se restringe à cavidade oral, mas também em outras partes do

corpo como: neoplasia intraepitelial vulvar, esôfago de Barret e neoplasia

intraepitelial cervical (KUJAN et al., 2006). Há insuficiência de critérios morfológicos

e relativos à natureza biológica de displasia epitelial que já foram validados, além

disso, vários sistemas estão atualmente sendo usados e testados devido à ausência

de um consenso (BOSMAN, 2001; FLESKENS; SLOOTWEG, 2009; MCLAREN et

al., 2000; WARNAKULASURIYA et al., 2008).

Segundo a OMS (2005), a avaliação dos fatores displásicos pode seguir

critérios relacionados à arquitetura tecidual e citológicas (Tabela 1).

Tabela 1- Alterações teciduais e citológicas apresentadas no

diagnóstico de displasia epitelial.

Alterações teciduais Alterações Citológicas

Mitoses superficiais anormais Hipercromatismo

Aumento do número de figuras mitóticas Aumento do número e tamanho de

nucléolos

Hiperplasia de células basais Células com mitoses atípicas

Perda de polaridade de células basais Aumento da relação núcleo citoplasma

Pérolas córneas Pleomorfismo celular

Ceratinização prematura de células

individuais

Anisocitose (variação quanto ao

tamanho da célula)

Estratificação epitelial irregular Pleomorfismo nuclear

Formação em gota Anisonucleose (variação anormal do

tamanho do núcleo)

Fonte: WARNAKULASURIYA, BOUQUOT, DABELSTEEN, 2008

Com base nessas alterações a OMS propôs em 2003 uma classificação para

as displasias epiteliais. Elas foram definidas em hiperplasia, displasia leve, displasia

moderada, displasia severa e carcinoma in situ (BARNES et al., 2005).

22

A displasia leve apresenta alterações limitadas à camada basal e parabasal.

Exibe mínimas alterações arquiteturais. Em relação à alterações citológicas,

apresenta atipias celulares geralmente leves, com pleomorfismo brando das células

e núcleos. As mitoses não estão presentes de forma difusa e quando aparecem

estão localizadas na porção basal.

A displasia moderada apresenta alterações na camada basal até terço

médio da camada espinhosa. Mudanças na arquitetura podem ser observadas no

terço epitelial inferior podendo haver perda da polaridade basal. A estratificação

tecidual apresenta-se relativamente normal, mas com frequente hiperceratose. No

entanto, pode-se observar alterações citológicas como: hipercromatismo, variação

quanto ao tamanho da célula, pleomorfismo nuclear, mitoses anormais podem estar

presentes, mas geralmente localizadas na camada basal.

Finalmente, a displasia severa demonstra alterações que se iniciam na

camada basal e até um nível posterior ao terço médio do epitélio. As alterações da

arquitetura são graves, muitas vezes com perda completa de estratificação e com

profunda queratinização anormal. Algumas lesões podem apresentar acantólise. O

epitélio pode apresentar acentuada atrofia (SPEIGHT, 2007).

Contudo, a avaliação destes critérios é subjetiva e tem sido objeto de

questionamentos em função de variações de diagnóstico entre patologistas.

Portanto, novas classificações têm surgido com intuito de definir com mais cautela

os critérios dessas lesões.

Um novo sistema proposto por Kujan e colaboradores (2006), denominado

novo sistema binário, avaliou as alterações arquiteturais e citológicas, seguindo os

mesmos critérios estabelecidos pela OMS (2005), graduando as lesões em baixo

risco e alto risco. Essa classificação se estabelece com base em uma pontuação por

critérios. Para as lesões de baixo risco foram utilizadas menos do que 5 alterações

citológicas e 4 mudanças arquiteturais. As de alto risco foram avaliadas com base

em no mínimo 5 mudanças citológicas e 4 arquiteturais.

Nesse estudo as lesões de alto risco apresentaram maior potencial para

transformação maligna e as lesões de baixo risco, menor potencial. De fato, 33 dos

68 casos foram designados como lesões de baixo risco (hiperplasia e displasia leve)

23

e somente 5 casos evoluíram para CCE. Por outro lado, 35 casos foram agrupados

em lesões de alto risco (displasia severa e CIS) e 27 casos progrediram para um

carcinoma. Logo, esse sistema mostrou alta taxa de especificidade e sensibilidade

(80% e 85% respectivamente) (KUJAN et al., 2006).

Os casos de displasia moderada, que geralmente entravam na categoria de

acompanhamento clínico puderam ser revisados. Dos 16 casos de displasia

moderada, 14 sofreram transformação maligna. Essas displasias podem então ser

subdivididas de acordo com a pontuação em lesões de baixo risco ou de alto risco, o

que confere um melhor prognóstico e manejo clínico do paciente (KUJAN et al.,

2006). Portanto, o sistema binário mostrou-se superior ao sistema estabelecido pela

OMS.

Liu e colaboradores (2011), utilizando o sistema binário de gradação

proposto por Kujan e colaboradores (2006), observaram que 26,8% dos casos

acompanhados em um período de 4,6 anos progrediram para câncer. Lesões de

baixo grau de displasia sofreram 2,78 vezes menos transformação maligna quando

comparada com lesões de alto risco.

Nankivel e colaboradores (2013) objetivando validar sua reprodutibilidade e

capacidade prognóstica do sistema binário, avaliaram 141 biópsias de displasias

epiteliais orais e concluíram similaridade em relação ao valor prognóstico entre o

sistema OMS e o binário. Porém superioridade deste último, segundo este estudo,

estava principalmente em relação concordância entre dois especialistas quanto ao

diagnóstico de uma lesão (NANKIVELL, 2013).

Dada a falta de uma correlação fidedigna entre gradação da displasia

epitelial e transformação maligna e a abordagem atual mandatória de “ver e esperar”

empregada em lesões “leves”, é imperativo um novo olhar e uma nova abordagem

na tomada de decisão quanto ao tratamento das DOPMs (DOST et al., 2013).

Portanto, a utilização de gradações mais simples e precisas associadas ao uso de

marcadores moleculares têm se mostrado um recurso promissor para lesões que

mostram diferentes gradações quanto à displasia epitelial e predição para

transformação maligna, como demonstrado na Figura 1.

24

Figura 1- Progressão da displasia epitelial em carcinomas invasivos com

metástase. A sequência mostra tecido epitelial e conjuntivo sem alterações que

começam a ser perceptíveis no processo de displasia ocupando, por sua vez, todo o

epitélio no CIS, em todos esses tecidos não ocorre rompimento da MB. No entanto,

a partir do carcinoma invasor fica evidente o rompimento da MB. Sem essa

importante barreira as células tumorais podem adentrar em vasos, alcançando

posteriormente órgãos distantes. Fonte: SCANLON et al, 2013/ adaptado.

2.2 Carcinoma de Células Escamosas Oral

Doenças crônicas não transmissíveis constituem um problema de saúde

pública alcançando em muitos países proporções epidêmicas. Essas doenças têm

causado altas taxas de morbimortalidade contando com 60% de todas as mortes no

mundo (DAAR et al, 2007). Entre essas doenças, o câncer é a segunda causa mais

comum de mortalidade em países desenvolvidos e está entre as 10 mais comuns

nos países em desenvolvimento (MATHUR et al., 2007).

Essa condição vem progredindo e destaca-se como principal fator de

mortalidade em muitos países. Segundo um levantamento realizado em 2012 pela

Agência Internacional de Pesquisa do Câncer (IARC), existe ao redor do mundo

mais de 14 milhões de pessoas com câncer, acometendo tanto homens quanto

mulheres (IARC, 2012).

25

Pode-se definir câncer como crescimento e proliferação celular

desordenados, que tem como característica alto poder de invasão tecidual. O

surgimento pode ocorrer por meio de estímulos físicos, químicos ou biológicos,

provocando mutações no DNA celular. Essas alterações originam células que não

respondem aos sinais regulatórios intra e extracelulares que comandam a

proliferação, diferenciação e apoptose (INCA, 2014; SHAFER et al., 2005).

O desenvolvimento tumoral ocorre mediante características sequenciais:

potencial replicativo ilimitado, autossuficiência em sinais de crescimento, ausência

de resposta aos sinais anti-crescimento, inexistência de resposta à apoptose,

aumento da angiogênese, invasão e metástases (HANAHAN; WEINBERG, 2000).

Os tipos de câncer mais frequentes na população masculina em países

desenvolvidos são próstata, pulmão, cólon e reto, e entre as mulheres, mama, colón

e reto e pulmão. Em relação ao câncer de boca, está entre os 5 mais incidentes em

homens e 12 entre as mulheres no ano de 2014. No Brasil, nas regiões Sudeste e

Nordeste é o quarto mais frequente em homens e o nono entre as mulheres.

Somente em 2014, houve no Brasil o surgimento de 11.280 novos casos em homens

e mais de 4 mil em mulheres (INCA, 2014).

O CCE também conhecido como carcinoma epidermoide, ou ainda

carcinoma espinocelular, é a neoplasia maligna de origem epitelial com maior índice

de ocorrência na cavidade oral, ocupando aproximadamente 90-95% de todas as

neoplasias nessa região (JOHNSON et al., 2011). Pode desenvolver-se a partir do

CIS ou DOPMs, como leucoplasia e eritroplasia, apresentando graus de

diferenciação histológica (BARNES et al., 2005; SATO et al., 2014) (Figura 1).

O CCE pode se localizar em qualquer sítio da boca como: dois terços

anteriores da língua, vermelhão dos lábios, palato duro, assoalho de boca, mucosa

jugal, processo alveolares superiores e inferiores, gengiva, e o trígono retromolar

(dobra mucosa estendendo-se posteriormente à partir do último molar) (MAUND;

JEFFERIES, 2015). No entanto, língua, lábio inferior e assoalho bucal são locais de

maior ocorrência. Nestes locais há grande abundância de vasos sanguíneos,

facilitando a disseminação das células tumorais para linfonodos regionais e tecidos

subjacentes (SIEGEL; MILLER; JEMAL, 2015). Os aspectos clínicos variam desde

uma lesão exofítica, endofítica, leucoplásica, eritroplásica e leucoeritroplásica, ou

26

apresentando, por vezes uma borda em rolete resultante da invasão do tumor para

os tecidos subjacentes e para as laterais abaixo do epitélio (NEVILLE, et al., 2009).

Muitos fatores de risco estão associados ao aumento de sua incidência. O

hábito de fumar e o consumo de álcool são fatores bem reconhecidos pela literatura.

Isolados, esses fatores podem aumentar de duas a três vezes o risco de CCE.

Ainda, para regiões como boca e laringe, o risco aumenta em mais de 15 vezes

quando há combinação entre o fumo e o álcool (NEVILLE; DAY; 2002; SHENOI et

al., 2015)

A fumaça do cigarro compreende mais do que 4000 substâncias, dentre as

quais 70 são carcinogênicas (THOMSON, 2012). Em países em que o tabaco é

amplamente consumido em suas variadas formas, como a Índia, o câncer de boca é

a neoplasia mais comumente observada entre os homens e a terceira mais

prevalente entre as mulheres (MATHUR et al., 2007).

Somado ao tabaco, o consumo crônico de álcool induz à proliferação celular

nas camadas mais profundas do tecido epitelial, favorecendo a ocorrência de

mutações e danos cumulativos deixando os tecidos mais vulneráveis a ação de

carcinógenos (CARRARD et al, 2008; KIGNEL et al., 2007). Outros fatores

reconhecidos e que influenciam o processo de carcinogênese são: radiação

ultravioleta e agentes biológicos (Papiloma Vírus Humano, fatores intrínsecos,

incluindo estado imunológico e alimentares, ativação de oncogenes e fatores

socioeconômicos (SAITO; NAKAJIMA; MOGI, 1999).

Em contrapartida, existe uma série de fatores que ainda merecem discussão

quanto à sua influência na carcinogênese. São eles: fatores étnicos, higiene oral

deficiente, candidíase crônica e trauma crônico na mucosa oral

(WARNAKULASURIYA et al., 2008).

O CCE oral atinge preferencialmente os pacientes do sexo masculino com

faixa etária entre 50 e 70 anos, fumantes, de cor branca e baixa condição

socioeconômica. Há estudos que relatam que pacientes com CCE associado ao

HPV são do sexo masculino, brancos fumantes e/ou que fazem uso de bebida

alcoólica, jovens e com nível socioeconômico elevado (CHATURVEDI et al., 2008).

27

Pacientes que apresentam CCE oral frequentemente são diagnosticados

tardiamente. Na fase inicial a dor é inexistente ou mínima, o que pode explicar a

morosidade na busca por cuidados profissionais (NEVILLE et al., 2009). Ainda,

quando diagnosticados em estágios tardios, 50% dos pacientes tem uma sobrevida

de 5 anos, prognóstico bem pior quando comparado ao câncer de mama e

melanoma (DÖBRÓSSY, 2005). O reconhecimento e a detecção do CCE oral não

garantem um aumento nas taxas de sobrevivência, mas trazem benefícios

concernentes à qualidade de vida, resultando em menor mutilação e custos do

tratamento (DOWNER et al., 2006).

Mais do que 50% apresentam recidiva local, enquanto 25% desenvolvem

metástases à distância. O padrão de invasão reflete mecanismos biológicos de

malignidade tais como perda de adesão e consequente aumento de motilidade em

células tumorais (DISSANAYAKA et al., 2012). Ainda, 10-35% destes pacientes

correm o risco de desenvolverem um segundo tumor no trato aerodigestivo superior

(BARNES et al., 2005).

Um dos principais fatores de prognóstico para o CCEs é o comprometimento

de linfonodos cervicais. A disseminação metastática ocorre para os linfonodos

ipsilateias, preferencialmente através dos vasos linfáticos. Esses apresentam-se

aumentados, indolores e com consistência firme à pétria (NEVILLE, et al., 2009).

Broglie e colaboradores (2012) salientaram o risco de metástases ocultas para

linfonodos em pacientes com CCEs ainda em estágios iniciais.

Em 1971, foi publicado pela OMS e desenvolvido por Wahi, um sistema de

classificação baseado nos aspectos histológicos e citológicos dos tumores. Assim,

foram estabelecidos os seguintes tipos de CCE (BRENER et al., 2007; LEEMANS et

al., 1994).

Grau 1 - Carcinoma de células escamosas bem diferenciado: apresenta

formação de pérolas córneas, número de mitoses menor do que 2 por campo e raras

mitoses atípicas, pleomorfismo nuclear e celular reduzidos, células e tecidos se

aproximam da configuração da mucosa oral não alterada.

Grau 2 - Carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado:

ausência ou raridade para encontrar pérolas córneas, número de mitoses entre 2-4

28

por campo, algumas mitoses atípicas, pleomorfismo celular e nuclear moderado,

processo de ceratinização e pontes entre células aparente.

Grau 3 - Carcinoma de células escamosas pouco diferenciado ou

indiferenciado: não há muita semelhança citológica e histológica entre epitélio

escamoso estratificado normal da mucosa oral e o epitélio modificado pelas células

tumorais. Pérolas córneas incomuns, pontes celulares inexistentes, mitoses por

campo maior do que 4, muitas mitoses atípicas, grande pleomorfismo nuclear e

celular, e frequência de células gigantes multinucleadas.

O perfil morfológico dos CCEs em HE, representa para os profissionais um

desafio na detecção de invasões iniciais e locais, uma vez que os tecidos podem se

apresentar bastante desorganizados e/ou remodelados dificultando a identificação

desses processos. Ainda, muitos tumores recebem a mesma classificação

histopatológica, mas podem apresentar comportamento e evolução diferentes de um

paciente para outro. Diante dessa circunstância, a utilização de outras técnicas que

permitem análise mais específica das lesões, se tornou essencial para auxiliar e

melhorar o entendimento do comportamento da doença e consequentemente o

diagnóstico. O estudo de marcadores teciduais por imuno-histoquímica figura

atualmente como ferramenta auxiliar de grande valor, pois permite a detecção de

proteínas importantes do processo da carcinogênese.

Algumas moléculas que estão envolvidas na transformação maligna de

diferentes lesões orais (TIMP-1, Patched e beta-catenina) têm sido estudadas por

nosso grupo nos últimos anos. Para TIMP-1 os achados demonstraram que o

padrão da expressão teve relação com aspectos celulares displásicos, como

hiperplasia das células em leucoplasias e nos casos de CCEs com perda da

polaridade independente dos graus (NASCIMENTO, et al 2012). Em relação a

análise de Patched em tumores odontogênicos ceratocísticos (KCOTs), grande parte

dos sindrômicos e não sindrômicos exibiu forte marcação nas camadas epiteliais

basais e intermediárias quando comparadas à camada superficial, o que indica uma

ação de Patched na renovação celular que ocorre nestes estratos. A forte expressão

epitelial da proteína em KCOTs indica um papel importante para a patogênese

destes tumores, especialmente quando observada em regiões de brotamento e

cistos-filha (MILHOLLI et al, 2014). Quando analisada a expressão citoplasmática da

29

beta-catenina em ameloblastomas, ficou evidente o seu acúmulo no citoplasma

sugerindo alterações em vias de sinalização, ao passo que, o declínio na marcação

da membrana indicou alteração na adesão celular (ROCHA, 2012).

2.3 Matriz Extracelular e Membrana Basal

As células tumorais estão envoltas em maior ou menor quantidade pela

matriz extracelular (MEC). A MEC pode ser dividida em matriz intersticial, que

abrange o espaço existente entre as células mesenquimais e membrana basal, que

é uma especialização da MEC em forma de lâmina (ALBERTS et al., 2004).

A membrana basal (MB) originalmente começou a ser descrita pela

microscopia de luz e foi definida pela primeira vez por Bowman em 1840 como uma

“bainha membranosa de primorosa delicadeza”. Após essa descoberta, vários

pesquisadores encontraram a membrana basal em proximidade com muitos tecidos.

(YURCHENCO, 2011).

A MB é uma rede tridimensional de macromoléculas essencial para tecidos

epiteliais e células funcionais. Historicamente é conhecida como uma barreira

protetora contra a invasão do câncer como um obstáculo a ser superado pelo

carcinoma in situ com a finalidade de invadir tecidos subjacentes (LIOTTA; RAO;

WEWER, 1986). No entanto, trabalhos demonstraram que a MB é uma estrutura

bastante dinâmica no processo tumoral (LOHI, 2001). Ela está entre as células

epiteliais, endoteliais e mesoteliais, e o tecido conjuntivo. Também é encontrada ao

redor de células musculares e de Schwann (TRINGLER et al., 2007). São

componentes que fazem parte da MB: colágeno tipo IV, laminina, perlecan, nidogen

(entactina), colágeno tipo VII e algumas outras moléculas específicas

(KULASEKARA et al., 2009).

Essa estrutura participa de desenvolvimento tecidual, crescimento,

manutenção, reparo e regeneração celular, mantém a polaridade e a diferenciação

dos estratos celulares da pele (MARINKOVICH, 2007). Ainda, é capaz de influenciar

no metabolismo celular, organizar as proteínas a ela adjacentes, promover a

30

sobrevivência, proliferação e diferenciação celular e atuar como uma via de

migração celular (ALBERTS et al., 2004).

A MB funciona como um complexo de proteínas ligantes e fatores de

crescimento que influencia no comportamento do microambiente. A interação entre

este complexo proteico e fibroso, proteínas solúveis e receptores de superfície

existentes age em muitos eventos celulares como: migração, proliferação, estágio de

diferenciação e apoptose (BORNSTEIN; SAGE, 2002). Há evidências de que

componentes da MB não são apenas processados durante a progressão tumoral,

mas também novamente sintetizados e depositados na frente invasiva do tumor


Células malignas dependem das diferentes moléculas da MB, que são

preferencialmente usadas como substratos para invasão e proliferação. Logo,

mudanças proteolíticas na MB ocorrem à medida que o câncer evolui

(MARINKOVICH, 2007). Assim, seus componentes podem revelar alterações

genéticas e moleculares relacionadas às diferentes fases da carcinogênese. Desde

a inicial, intermediária e final do processo (FERRARI et al., 2009).

A passagem de células pela MB ocorre de forma generalizada em algumas

condições fisiológicas e na migração de leucócitos, mas essa circulação celular

ocorre de maneira desregulada em algumas condições como em desordens auto-

imunes e neoplasias (YURCHENCO, 2011).

Nguyen-Ngoc e colaboradores (2012) constataram que a migração celular e

disseminação de células tumorais para tecidos subjacentes não depende somente

de fatores genéticos. Enquanto a MB está íntegra, esses fatores permanecem em

estado de latência, entretanto quando a membrana encontra-se descontínua há

indução de comportamentos celulares protrusivos e rápida disseminação das células

cancerosas.

Hagedorn e colaboradores (2013) mostraram através de marcação de

componentes da MB, especialmente laminina e colágeno tipo IV, que essa estrutura

se desloca fisicamente na invasão de células tumorais no processo de metástase

em vez de ser dissolvida. Embora não descartem a ação de proteases, sugerem que

31

a invasão tumoral acontece em vários passos interligados, os quais acontecem

mediante ao rompimento, remoção e passagem por essa barreira.

Em geral, a MB sofre uma desorganização na maioria dos carcinomas

invasivos. Quando em fase inicial, de DOPMs e CIS, ela se apresenta de maneira

contínua e íntegra. Sua alteração em decorrência da evolução do processo de

carcinogênese tem sido analisada e utilizada para detecções precoces de invasões

locais, assim como também orientado para o tipo de tumor e seu comportamento

biológico (BOSMAN, 2001; D’ARDENNE, 1989). A invasão local e o

desenvolvimento de metástase em carcinomas de cabeça e pescoço estão

associados diretamente à MEC, incluindo alterações na MB e indução na produção

de suas diversas proteínas (KOIVISTO et al., 2000).

Quando CCEs estão em estágio de progressão, o tecido adjacente sofre

inúmeras modificações como lise do estroma e alterações na MB. Esses aspectos

são considerados o caminho preparatório para invasão tumoral (LIOTTA, 1986;

THOMAS; LEWIS; SPEIGHT, 1999). A relação entre as células do estroma

(fibroblasto, células inflamatórias e células endoteliais) e as células malignas que

estão ao seu redor pode estabelecer um ambiente favorável, possibilitando o

crescimento e metástase tumorais (HUA et al., 2011). O processo inicialmente

ocorre quando há perda das estruturas de adesão celulares, provocando a

separação das células epiteliais vizinhas (CHAMBERS; MATRISIAN, 1997).

Outro aspecto já relatado na literatura é que tumores invasivos podem

conservar a síntese de componentes da MB. Estes componentes podem, inclusive,

estar aumentados ou diminuídos dependendo da evolução tumoral (WILSON et al.,

1999). Atualmente, componentes da MB são cada vez mais estudados com o

objetivo de detectar os primeiros estágios de transformação maligna no epitélio oral.

Funcionam como biomarcadores que podem aperfeiçoar a capacidade de

prognóstico, diagnóstico e até mesmo tratamento de CCE orais.

2.4 Laminina-332 e Cadeia γ2

A laminina-332 é uma grande glicoproteína extracelular e importante

componente da MB (AUMAILLEY et al., 2005). Está envolvida em muitos processos

32

biológicos significativos, incluindo desenvolvimento tecidual, reparo de feridas,

manutenção da polaridade das células, separação de compartimentos teciduais,

organização tecidual e celular, proteção e aderência de células (MINER;

YURCHENCO, 2004).

A molécula de laminina é um heterotrímero em formato de cruz, consistindo

de três cadeias polipeptídicas ligadas por pontes dissulfeto: uma cadeia pesada (α) e

duas cadeias leves (β e γ). A primeira laminina isolada, atualmente conhecida como

laminina-111 (α1β1γ1), foi descoberta em 1979, depois de ser isolada e purificada

de um sarcoma em camundongo, no entanto, esta proteína é raramente detectada

em humanos adultos (WANG et al., 2004).

Até o presente momento, 17 isoformas foram identificadas com as seguintes

possibilidades de cadeias: α (1-5), β (1-3), e γ (1-3) (Tabela 2). Dependendo da

posição espacial adotada por cada subunidade, uma isoforma diferente pode ser

identificada assumindo diferentes estruturas e funções (MORI et al., 2010; SATO et

al., 2014). As lamininas apresentam sítios de ligação para diferentes receptores

presentes na superfície celular, como as integrinas, e ainda podem formar um

complexo adesivo com outros componentes da MB, entre eles: colágeno IV e

entactina (ROSS; PAWLINA, 2008).

33

Tabela 2. Isoformas das lamininas.

Nomenclatura das 17 lamininas

Cadeia Abreviação Nomenclatura anterior

α1β1γ1 111 1

α2β1γ1 211 2

α1β2γ1 121 3

α2β2γ1 221 4

α3Aβ3γ2 332 ou 3A32 5 ou 5ª

α3Bβ3γ2 3B32 5B

α3Aβ1γ1 3A11 6 ou Ä

α3Aβ2γ1 3A21 7 ou 7ª

α4β1γ1 411 8

α4β2γ1 421 9

α5β1γ1 511 10

α5β2γ1 521 11

α2β1γ3 213 12

α4β2γ3 423 14

α5β2γ2 522 -

α5β2γ3 523 15

α3Bβ1γ1 3B11 -

Fonte: SATO et al., 2014

Nos braços longos podem ser encontradas todas as três cadeias, nos braços

curtos podem ser encontradas as cadeias separadas α, β e/ou γ (OGAWA et al.,

2004; OGAWA et al., 2007).

Ainda hoje, não existem descrições de todas as funções biológicas das

diferentes cadeias da laminina, mas tem sido demonstrado que algumas delas

34

diferem no que diz respeito à sua distribuição nos tecidos, podendo representar

diversidade nas funções in vivo (OGAWA et al., 2004). Por exemplo, já foi

comprovado que a laminina mantém a coesão epitélio-mesênquima em tecidos

normais expostos a grandes forças disruptivas, incluindo pele, mucosa estratificada

pavimentosa, âminion e córnea (SAITO; NAKAJIMA; MOGI, 1999).

No final da década de 80, vários homólogos foram isolados, revelando uma

heterogeneidade antes impensada a respeito das lamininas (MARINKOVICH, 2007).

Em 1993 a laminina-332 foi isolada, recebendo algumas designações como:

laminina-5, kalinina, niceína, ladsina e epilegrina (RYAN; CHRISTIANO, 1996;

WANG et al., 2004). Como as isoformas das lamininas são denominadas de acordo

com a composição de suas cadeias a laminina-332 recebeu este nome porque é

formada pelas cadeias α3β3γ2 (AUMAILLEY et al., 2005).

Em relação à laminina-332, trabalhos vêm demonstrando que essa molécula

desempenha papel importante na adesão celular, posicionando células epiteliais.

Sua ligação com a integrina α6β4 forma hemidesmossomos compondo assim uma

estrutura estável e firme com intensa estabilidade na superfície basal do tecido

epitelial (KARIYA et al., 2003; TSURUTA et al., 2010).

Ainda, foi relatado um comportamento distinto para cada cadeia encontrada

na laminina-332. A cadeia α3 é a maior com 190 kDa. Após clivada em um domínio

LG C-terminal, gera uma cadeia α3 de 160 kDa. A cadeia β-3 existente tem em torno

de 140 KD, mas parece não desempenhar atividade biológica considerável por

clivagem. Já a cadeia γ2 tem aproximadamente 150 kDa e, após clivagem, gera uma

cadeia com 105 kDa (GIANNELLI et al., 1997; VEITCH et al., 2003). Estudos

recentes têm indicado que a atividade biológica da laminina-332 é modulada pelo

processamento da cadeia γ2, ou seja, a clivagem dessa cadeia gera uma isoforma

com atividade celular aumentada (OGAWA et al., 2004). Esta glicoproteína pode

atuar sob certas circunstâncias como um elemento chave para adesão celular, mas

em outras vezes como promotor de motilidade (PATARROYO et al., 2002).

35

Figura 2: Isoforma da laminina 332. Formada por braços curtos, cadeias

e γ enovelam-se no braço longo. A clivagem da cadeia y2 tem sido associada à

motilidade celular em CCEs invasivos. Fonte: (NATARAJAN et al., 2005).

Outro fator que foi observado é a mudança na distribuição da laminina-332

em condições neoplásicas. Verificou-se uma relação entre sua perda local na MB e

deposição no estroma próximo às células neoplásicas invasivas quando a lesão

apresenta comportamento agressivo (BERNDT et al., 2001). Ademais, estimula

células tumorais humanas na formação de finas saliências no bordo dianteiro das

membranas, formando uma protrusão do citoesqueleto denominada “lamellipodia”.

36

Análises in vitro demonstraram que as protrusões conduzem ao aumento da

migração e invasão celulares em tecidos subjacentes (FUKUSHIMA et al., 1998;

KARIYA et al., 2003). Outro aspecto relacionado a essa glicoproteína é sua

capacidade em promover potente migração celular. No reparo de feridas, por

exemplo, ela é sobre-expressa pelos queratinócitos (GOLDFINGER; STACK;

JONES, 1998; NGUYEN; GIL; CARTER, 2000). Também foi observado o aumento

de sua expressão na invasão tumoral. No entanto, não se sabe que mecanismo

ocorre regulando esses dois aspectos paradoxais presentes na mesma molécula,

(adesão/migração) de células consideradas estáveis (PYKE et al., 1995).

Estudos mostraram que em CCEs orais ocorre perda significativa da

expressão da laminina-332 e seus receptores do tipo integrinas, quando

comparadas com lesões pré-malignas e processos inflamatórios (THORUP et al.,

1998). Por outro lado, existem trabalhos que demonstraram correlação positiva

entre a sua expressão e a progressão tumoral em neoplasias malignas (HAAS,

2001; IMURA et al., 2012).

Ressalta-se o fato de ocorrer uma inclinação para a descontinuidade linear,

tanto da laminina como do colágeno IV, durante o aumento gradativo dos aspectos

displásicos das lesões. Isto acontece preferencialmente na periferia de áreas de

invasão tumoral do que em regiões centrais ou superficiais dos tumores (TOSIOS;

KAPRANOS; PAPANICOLAOU, 1998).

Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que CIS frequentemente

depositam laminina-332 em estruturas neoplásicas próximas à MB enquanto que as

células tumorais se infiltram nos tecidos estromais, causando elevada expressão da

cadeia γ2 (MIYAZAKI, 2006). Yamamoto e colaboradores (2001) encontraram

padrão de expressão pronunciado da laminina no front invasivo de carcinomas de

esôfago na profundidade de áreas invasivas e nas metástases em linfonodos.

Maragon Junior e colaboradores (2015) através de técnica de imuno-

histoquímica, demonstraram que a expressão com alta intensidade de laminina-332

estava associada a projeções tumorais e alta densidade de miofibroblastos no

estroma, condições que estão relacionados a um fenótipo invasivo e pior

prognóstico.

37

Haas e colaboradores (2001) analisaram a expressão da laminina-332 na

MB através de imunofluorescência confocal em epitélio normal e em CCEs. Seus

resultados mostraram que na mucosa bucal a marcação por imunofluorencência foi

de 99% a 100%, por outro lado em CCEs essa marcação variava de 35-74% e esse

declínio teve correlação com a gradação do tumor.

A expressão da cadeia γ2 parece estar relacionada a condições piores na

evolução da doença, como mau prognóstico, recorrência e metástase (ONO et al.,

1999; TAKAHASHI et al., 2002; YAMAMOTO et al., 2001). Na invasão tumoral, esta

cadeia seria formada através da proteólise da laminina-332 presente na MB

(HINTERMANN; QUARANTA, 2004), ou por meio da síntese no citoplasma das

células neoplásicas (HINTERMANN; QUARANTA, 2004; KATAYAMA; SEKIGUCHI,

2004; MIYAZAKI, 2006). Uma hipótese que tem sido levantada é a de que a cadeia

γ2 promove aumento da invasão tumoral, uma vez que, essa cadeia não contém

qualquer local de ligação à integrina, dessa forma, não seria responsável pela

adesão celular (MIYAZAKI, 2006). A sobre-expressão da cadeia γ2 por células

tumorais, bem como a expressão reduzida ou prejudicada da cadeia α3 e/ou β3,

pode contribuir para a perda de estruturas da MB em carcinomas invasivos

(BRENER et al., 2007).

A clivagem da cadeia γ2 é fundamental para migração da célula e

remodelação tecidual. Sua presença tem sido obervada em células cancerígenas

localizadas na interface tumor/estroma em alguns tipos de carcinomas. Portanto,

essa cadeia parece exercer importante função na motilidade celular. Esses achados

sugerem que aumento na sua expressão pode estar associado ao potencial invasivo

dos tumores. Esse efeito já foi observado em carcinomas colo-retal e

adenocarcinoma cervical (ANDERSSON et al., 2005; ONO et al., 1999). Estudo

realizado por SALO e colaboradores (1999) analisou o potencial migratório da

cadeia γ2 e revelou que a cadeia, quando isolada do restante da laminina-332, não

promove adesão celular.

Além disso, outro estudo demonstrou que genes associados à proliferação,

migração e invasão tem expressão amplamente modificada pela presença cadeia

γ2, ocorrendo uma redução na migração e invasão de células que foram tratadas

com silenciamento de LAMγ2 nas células passando de uma fase de duplicação do

38

DNA (S) para uma fase G1 (GARG et al, 2014). Esses dados em conjunto

demonstram que a cadeia γ2 tem papel crucial na carcinogênese e pode indicar uma

chave para a terapia de alguns tipos de câncer, incluindo CCEs.

Portanto, estudos que buscam analisar o perfil da expressão isolada da

cadeia γ2 da laminina-332 podem contribuir para melhor entendimento da dinâmica

existente no microambiente tumoral em lesões precursoras e o próprio CCE oral, o

que irá favorecer o diagnóstico e prognóstico para melhor atendimento do paciente

acometido.

2.5 Metaloproteinases de Matriz (MMPs) e MMP-9

A degradação da MEC se constitui em um evento essencial em muitos

processos fisiológicos, entre eles: o período de implantação e desenvolvimento do

embrião, morfogênese, remodelação óssea e angiogênese (IIZASA et al., 1999). Por

outro lado, sua excessiva degradação pode acarretar no desenvolvimento de várias

condições patológicas, dentre as quais, inflamação, artrite reumatoide, osteoartrite,

aterosclerose, periodontite e doenças autoimunes (HU et al., 2007; NEWBY, 2012;

RIVERA et al., 2010; ROSENBERG, 2009; SBARDELLA et al., 2012;

WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999). Ainda, dentro do contexto das neoplasias, esse

processo está diretamente relacionado à invasão e metástase tumorais, o que

representam importantes fatores prognósticos para os pacientes (CHAMBERS;

MATRISIAN, 1997).

O processamento da MEC pode ocorrer por ação de enzimas proteolíticas,

denominadas de metaloproteinases da matriz (MMPs), que atuam desorganizando a

MEC através de mudanças nas interações célula-célula e célula-matriz (THOMAS;

LEWIS; SPEIGHT, 1999).

Essas MMPs formam uma importante família de endopeptidases metal-

dependentes, secretadas na forma inativa com zinco no sítio ativo (OVERALL;

LÓPEZ-OTÍN, 2002; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999). Em geral, a estrutura das

MMPs tem um “sinal” peptídeo N-terminal que conduz a proteína para a inserção na

membrana plasmática ou para a via secretora. Este pró-domínio confere latência a

39

esta enzima e, seu domínio catalítico tem ligações íons zinco e íons cálcio na zona

ativa (VILEN et al., 2013). Atualmente existem no mínimo 25 tipos de MMPs, sendo

que 24 são encontrados em mamíferos (PAL et al., 2014), e estão agrupados de

acordo com a estrutura e substrato específico. Estão divididos em: colagenases

(MMP-1, -8 e 13), estromelisinas, gelatinases (MMP-2, -9), metaloproteinases

ligadas à membrana plasmática (NABESHIMA et al., 2002; WARNAKULASURIYA et

al., 2008) e metaloproteinases não classificadas (Tabela 3).

Tabela 3. Classificação das MMPs e sua implicação em doenças orais.

Metaloproteinases de Matriz envolvidas em doenças orais

Tipos de MMPs Família Envolvimento em doenças orais

MMP-1 Colagenases:

clivagem de

colágeno tipo I, II, III

Em câncer oral: aumento da expressão

visto em tecido conjuntivo fibroso

adjacente ao tumor (THOMAS et al.,

1999).

MMP-8 Biomarcador para a doença periodontal.

MMP-13 Câncer oral, expressa por células

epiteliais nos fronts invasivos e por

fibroblastos no estromais (JOHANSSON

et al.,1997).

MMP-18 Aumento da expressão em

condrossarcomas e melanoma maligno.

MMP-2-

Gelatinase A

Gelatinases:

clivagem do

colágeno:

colágenos tipo III,

tipo IV, laminina.

Encontrado nas fases inciais de

destruição da membrana basal e ainda no

processamento de componentes da MEC

em carcinoma oral de células escamosas

(THOMAS et al., 1999).

Correlacionada com capacidade de

invasão no câncer oral (SORSA et al,

2004).

Promove angiogênese em vasos

sanguíneos do tumor.

Aumento dos níveis em lesões de cárie

em dentina na forma pró e ativa

40

(TJADERHANE et al., 1998).

MMP-9-

Gelatinase- B

Aumento dos níveis de cárie em dentina

(CARON et al., 2001).

Pode ser importante na redução do tecido

inflamatório da polpa dentária humana

(GUSMAN et al., 2002).

Expresso em células endoteliais

vasculares de tumores.

Relacionada à invasão tumoral de células

malignas e sua expressão é

inversamente relacionada com o

prognóstico.

Suprime a proliferação de linfócitos T

auxiliando as células cancerosas na

supressão da resposta do hospedeiro.

MMP-3 Estromelisinas Induz expressão nos tumores de MMP-9

em sua margem invasiva (KUSUKAVA et

al., 1995)

Pode atuar como um promotor da

migração em células de tumor e invasão

(AMALINEI et al., 2010).

Possui atividade pró-apoptótica em

células epiteliais (FOLGUERAS et al.,

2004).

MMP-10 Sobre-expressão está correlaciona à

diferenciação tumoral e a invasividade

local.

MMP-11 Suprime a apoptose de células tumorais

Diminui a sensibilidade de células

tumorais às células NK pela produção de

um inibidor de proteinase-α1

(FOLGUERAS et al., 2004).

MMP-7 Matrilisinas:

Processamento de

fibronectina,

Pode ser usado como marcador para o

fenótipo agressivo e alvo terapêutico em

câncer de cabeça e pescoço (PACHECO

41

laminina, nidogênio,

tipo IV colágeno,

proteoglicano,

integrina β4

(AMALINEI et al.,

2010)

et al., 2002).

Expressão em células epiteliais em fronts

invasivos e ninhos tumorais em CCE

(IMPOLA et al., 2004).

MMP-26 Localizado na periferia de ninhos tumorais

em tumores bem diferenciados (IMPOLA

et al, 2004).

MT1-MMP: MMP-

14

MMPs tipo

membrane.

Compostos por 6

tipos. Capazes de

pró ativação de

MMP-2 ( exceto a

MT4- MMP)

Expresso por células do estroma e depois

tomados por células tumorais do

carcinoma de células escamosas de

cabeça e pescoço (THOMAS et al., 1999).

MT2-MMP: MMP-

15

MT3- MMP:

MMP-16

MT4-MMP: MMP-

17

MT5-MMP: MMP-

24

MT6-MMP: MMP-

25

MMP-12: Outras MMPs.

MMP-19

MMP-20 Amelogênese imperfeita devido a

mutações em locais de clivagem da MMP-

20.

42

Pode ser liberado durante a progressão da

lesão cariosa (por degradação de matriz).

MMP-23

MMP-27

MMP-28

Fonte: SAPNA, GOKUL, BAGRI-MANJREKAR et al, 2014

As MMPs são capazes de processar uma larga diversidade de substratos.

Sua síntese e atividade são mantidas sob controle nos mais diferentes níveis,

compreendendo transcrição, ativação, inibição, formação do complexo e localização.

Nos níveis de transcrição, a síntese de MMP é regulada pela interação célula-célula,

moléculas de MEC, fatores de crescimento, quimiocinas e citocinas (CLARK et al.,

2008; HADLER-OLSEN; WINBERG; UHLIN-HANSEN, 2013).

A elevada expressão das MMPs tem sido evidenciada e relacionada ao

prognóstico ruim em diversos tipos de carcinomas (NABESHIMA et al., 2002;

OVERALL; LÓPEZ-OTÍN, 2002). De Vicente e colaboradores (2005) encontraram

uma associação entre a expressão da MMP-9 e grau histológico de diferenciação do

tumor. No entanto, estudo realizado por Hong e colaboradores (2000) mostraram

que não existe correlação entre a gradação histológica de carcinomas e a expressão

das MMPs, sugerindo que a diferenciação histológica das células cancerosas não

interfere na expressão.

As MMPs também estão envolvidas na sinalização celular e são capazes de

ativar receptores celulares específicos e fatores de crescimento, que são liberados

na MEC, o que resulta em regulação de diferentes atividades celulares, como

crescimento celular, diferenciação, apoptose e migração (HOJILLA; WOOD;

KHOKHA, 2008).

A invasão tumoral sofre influência direta do microambiente, nessa

conjuntura, já foi observado que as MMPs podem ser sintetizadas tanto pelo

estroma tumoral como pelas próprias células neoplásicas (APARNA et al., 2015)

podendo interferir no processo de adesão célula-célula pela degradação da E-

caderina. Trabalhos realizados com células crescidas na presença de proteínas

43

intactas da MEC, como fibronectina ou laminina, demonstraram que essas

moléculas influenciam a expressão de MMPs (STACK; GRAY; PIZZO, 1991). O

aumento na produção enzimática tem sido correlacionado ao fenótipo invasivo em

vários tumores (THOMAS; LEWIS; SPEIGHT, 1999) (Figura 3).

Figura 3 - Dinâmica do processamento da membrana basal e seus

componentes por metaloproteinases de matriz. Aumento da expressão de

enzima proteolíticas, tais como MMPs, em tecido tumoral. Essas endopeptidases

agem no processamento de componentes da MB, promovendo a abertura de

caminho para a invasão de células tumorais. Fonte: COMOGLIO; TRUSOLINO,

2005; ALBERTS; BRAY, 2004,/ adaptado

Dentre os vários tipos de MMPs, a MMP-9 tem se destacado no contexto da

tumorigênese. Estudos com diferentes tipos de tumores demonstram que essa MMP

está presente em células cancerosas de diversos sítios como mama, estômago,

fígado e faringe. Ainda, sua expressão foi associada ao potencial maligno das

células tumorais e, portanto, ao pobre curso clínico das neoplasias (DAVIES et al.,

1993). Esse aspecto também foi detectado em CCEs orais quando as expressões

das MMP-2 e MMP-9 foram analisadas (HONG et al., 2000). A presença de MMP-9

foi associada ao potencial metastático desses carcinomas (DAVIES et al., 1993) .

44

A MMP-9, também conhecida como gelatinase B, tem 92 kDa e contêm em

seu domínio catalítico uma área específica para ligação ao colágeno. Ela participa

do processamento de diferentes componentes da MEC (LUBBE et al., 2006). É

secretada por células epiteliais e armazenada em grânulos secretórios de neutrófilos

e eosinófilos. A sobre-expressão dos genes que codificam as MMPs-2 e -9 está

intimamente relacionada com a angiogênese, invasão tumoral local, e metástase

ganglionar (HOFMANN et al., 2000; IIZASA et al., 1999; WESTERMARCK; KÄHÄRI,

1999). Além disso, indica mau prognóstico para lesões de CCEs orais

(BJÖRKLUND; KOIVUNEN, 2005; DE VICENTE et al., 2005; FAN et al., 2012;

MCCAWLEY; MATRISIAN, 2001; NAGASE; VISSE; MURPHY, 2006). Já foi sugerido

que os níveis séricos aumentados de MMP-9 no sangue periférico podem ser

utilizados para obtenção de prognóstico pré-operatório (TAN et al., 2007).

Em uma revisão de literatura sobre o papel específico das MMPs como

novos biomarcadores em diferentes tipos de cânceres, tais como o de mama (MMP-

1, -9, -13), pâncreas (MMP-2, -7, -9), pulmão (MMP-1, -7, -9), bexiga (MMP-2, -9),

colo-retal (MMP-1, -2, -7, -9, -13), ovário (2, -9, -14), próstata (MMP-2, -9) e cérebro

(MMP-2, -9), a MMP-9 esteve presente em cada uma das neoplasias e, por

conseguinte, tem sido proposta como um biomarcador global de câncer

(SBARDELLA et al., 2012; TAN et al., 2007). A conclusão resultante de metanálises

de 15 estudos que usaram técnica de imuno-histoquímica para MMP-9 em pacientes

com tumores, foi que as taxas de sobrevivência mais pobres foram detectadas em

pacientes com marcação acentuada da enzima (PENG et al., 2012).

Evidências cada vez maiores sugerem um papel mais complexo dessas

endopeptidases em etapas anteriores e posteriores ao processamento de diferentes

componentes da MEC. A melhor compreensão das mudanças que ocorrem na MEC

e expressão desses biomarcadores, por ação proteolítica da MMP-9, é fundamental

para entender a evolução das neoplasias. Em relação ao processamento de

isoformas de laminina, estudos observaram que o processamento da cadeia γ2 da

laminina-332 pode ser induzida por algumas MMPs, o que representaria

denominador comum para indução da migração celular epitelial não apenas na

carcinogênese, mas também na inflamação e outros processos fisiológicos (PIRILÄ

et al., 2003).

45

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Analisar o perfil molecular de cadeia γ2 da laminina-332 e de MMP-9 nas

leucoplasias com displasia severa, CIS e CCEs invasivos e avaliar a sua importância

na carcinogênese.

3.2 Específicos

1- Analisar a integridade da membrana basal através de imunomarcação para

glicoproteína laminina-332;

2- Analisar a expressão de laminina-332 e MMP-9 no compartimento epitelial;

3- Analisar a expressão de laminina-332 e MMP-9 em fronts invasivos de CCEs

invasivos;

4- Analisar quantitativamente a expressão de MMP-9 em células estromais;

5- Correlacionar os achados histopatológicos com os aspectos clínicos.

46

4 MÉTODOS

4.1 Pacientes e amostras de tecidos

O estudo retrospectivo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade

Federal do Espírito Santo(45995815.9.0000.5060- Plataforma Brasil).

Consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante e o estudo foi

realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki. Os blocos de parafina

compostos de diferentes locais da mucosa oral foram selecionados a partir dos

arquivos do Serviço de Anatomia Patológica Bucal do Curso de Odontologia/UFES

entre 2004-2011.

As amostram incluíam 36 lesões que foram divididas em dois grupos. O grupo

I foi formado por 10 lesões de alto risco de malignização de acordo sistema binário

proposto por Kujan e colaboradores (2006 ),(5 leucoplasias com displasia severa e 5

CIS) e o grupo II por 26 CCEs invasivos (9 bem diferenciados, 11 moderadamente

diferenciados e 6 indiferenciados). Hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI) foi incluída

como controle positivo. Os dados clínicos e histopatológicos foram coletados de

prontuários médicos e incluíram: sexo, idade, local da lesão e história de exposição

ao tabaco. Os critérios de exclusão foram: dados clínicos incompletos e insuficientes

para análise microscópica das amostras.

4.2 Imuno-histoquímica

Cortes histológicos de 3 µm foram submetidos ao método de

imunoperoxidase. Os anticorpos primários utilizados foram: anti-cadeia γ2 de

laminina-332 gerados em camundongos com a diluição de 1:100 (clone B-2: SC-

25341, Santa Cruz Biotechnology) e de coelho anti-MMP9 com diluição 1: 500 (clone

Abcam, molécula inteira ab-38898). A imunodetecção foi realizada com o Sistema

Reveal (Spring/Biogen SPB-999) utilizando 3,3'-diaminobenzidina como o

cromogéno. As secções foram contrastadas com Hematoxilina de Mayer. Tampão

citrato de pH 6,0 foi usado durante 30 minutos à 93°C durante recuperação

antigênica e 1% de albumina de soro bovino (BSA) foi aplicado durante 1h à

temperatura ambiente para bloquear antígenos não específicos. Os cortes foram

incubados com os respectivos anticorpos primários durante a noite numa câmara

úmida mantida a 4°C. A seguir, a peroxidase endógena foi consumida por incubação

47

durante 20 minutos com 3% de peróxido de hidrogênio em temperatura ambiente.

Subsequentemente, as amostras foram incubadas com sistema secundário de

detecção de anticorpo de acordo com as instruções do fabricante. Os cortes foram

lavados cuidadosamente com solução salina tamponada com fosfato durante

processo de imuno-histoquímica. As lâminas foram montadas com Erv-Mount 9 e

examinadas ao microscópio. Controles positivos (HFI) e negativos (omissão do

anticorpo primário) foram incluídos. Nenhuma marcação foi observada nos controles

negativos.

4.3 Análise microscópica

As lâminas imunomarcadas foram analisados e marcadas de forma cega em

relação à informação clínica por um único investigador, previamente calibrado

(kappa 0,8) usando microscópio Olympus AX70 (Olympus America Inc., NY, EUA)

com uma câmera digital acoplada Zeiss AxioCam ERC5s (Carl Zeiss Vision GmbH,

Alemanha) e programa de imagens Axio Vision 4.8 Release 4.8.2 (Carl Zeiss Vision

GmbH, Alemanha). A expressão da cadeia γ2 foi avaliada de acordo com os locais

de tecido: (1) membrana basal e (2) compartimento epitelial. Para o último, as

células foram separadas em uma camada basal (CB) e uma camada suprabasal

(SB). CB consistiu de 1-2 camadas de células que estavam mais próximos e

perpendicularmente organizadas na interface epitélio-conjuntivo. As demais células

epiteliais que se sobrepõem CB foram designadas como camada SB


A expressão nos carcinomas invasivos foi ainda analisada em fronts invasivos

e ninhos tumorais. Todas as lâminas foram avaliadas com uma ampliação de 100X.

Em relação à coloração da MB, os seguintes aspectos foram considerados:

ausência; continuidade; ou descontinuidade. Para análise de MMP-9, estroma e

epitélio (CB+SB) também foram considerados. O número de células do estroma

expressando a MMP-9 foi dividido pelo número de campos total (células/campos).

Após a contagem, 3 grupos foram estabelecidos: menos do que 25% das células

marcadas, 25-50% das células marcadas e mais do que 50% das células marcadas

(TAMAMURA, et al 2013).

48

4.4 Associação entre dados clínicos e microscópicos

Após a coleta de dados, as associações entre características microscópicas e

parâmetros clínicos foram estabelecidas. Os dados clínicos (idade, sexo, sítio da

neoplasia e exposição ao tabaco) foram examinados. Cada variável foi comparada

com o perfil de expressão das moléculas. Os dados coletados foram dispostos em

tabelas.

4.5 Análise estatística

GraphPad Software (La Jolla, CA, EUA) foi utilizado para a análise de dados e

construção de gráficos. Teste do qui-quadrado foi aplicado para avaliar análises

clínicas. A associação entre expressão da cadeia γ2 e MMP-9 com os dados clínicos

foi testado por Teste Exato Fischer. Os resultados foram considerados significativos

quando p <0,05.

49

5 RESULTADOS

5.1 Dados clínicos

O sexo masculino foi mais acometido nos dois grupos. No Grupo I os

pacientes com mais de 60 anos foram mais prevalentes e no Grupo II os com menos

de 60 anos. As lesões afetaram diferentes locais; contudo foram predominantes no

rebordo alveolar. Quanto aos hábitos, a maioria dos pacientes eram fumantes. A

Tabela 4 resume os dados clínicos.

Tabela 4- Dados clínicos.

Grupo I (n=10) Grupo II (n=26)

Gênero

Masculino 70% (n=7) 88,4% (n=23)

Feminino 30% (n=3) 12,6% (n=3)

Sítios

Rebordo Alveolar 70% (n=7) 34,6% (n=9)

Assoalho bucal 0% (n=0) 30,8% (n=8)

Língua 20% (n=2) 19,2% (n=5)

Outros sítios 10% (n=1) 15,3% (n=4)

Idade

≤ 60 20% (n=2) 57,7% (n=15)

> 60 80% (n=8) 42,3% (n=11)

Hábitos

Fumante 50% (n=5) 76,9% (n=20)

Não Fumante 50% (n=5) 23,1% (n=6)

50

5.2 Expressão da cadeia γ2 da laminina-332 e MMP-9

Na membrana basal, imunomarcação da cadeia γ2 mostrou diferenças entre

os grupos. No Grupo I foram detectadas maior número de lesões com membrana

contínua (60%) e nenhuma lesão tinha membrana completamente ausente (Figura 4,

C). Por outro lado, no Grupo II maiores números de casos tiveram membrana

descontínua (69,2%) ou ausente (30,8%) (p=0,001). Sobre a expressão nas células

epiteliais, ambos os grupos apresentaram preferencialmente marcação

citoplasmática na CB + SB (Figura 4, D e E). A expressão da cadeia γ2 pode ser

detectada em células tumorais, predominantemente em células individuais, na

periferia de ninhos tumorais ou na interface entre tumor-estroma de fronts invasivos

(Figura 4, E). Todos os casos de CCE com fronts invasivos tiveram reação positiva

para a cadeia γ2. Quanto à imunoexpressão de MMP-9, os 3 grupos analisados (1-

CB, 2-SB e 3- CB +SB) demonstraram diferenças na marcação epitelial. CB

representou 50% das lesões de alto risco (Figura 4, G) e, marcação na CB + SB foi o

padrão principal em CCEs invasivos, também com 50%. No entanto, não houve

diferença significativa entre os grupos (p=0,4696). A análise das células do estroma

mostrou características importantes, com maior presença da expressão

citoplasmática (> 50% células/ campo) no Grupo II (Figura 4, H), quando comparado

com o Grupo I (p=0,0086). Os resultados de ambos os grupos são apresentados na

Tabela 5.

.

51

Tabela 5- Perfil da expressão da cadeia γ2 da laminina-332 e MMP-9.

Grupo I (n=10) Grupo II (n=26) P

Cadeia γ2 na MB

0,0001*

Contínuo 60% (n=6) 0

Descontínuo 40% (n=4) 69,2% (n=18)

Ausente 0 30,8% (n=8)

Expressão da cadeia γ2

em células epiteliais

0,4904

Basal 10% (n=1) 30,8% (n= 8)

Suprabasal 0 3,8% (n=1)

Basal+Suprabasal 90% (n=9) 65,4% (n=17)

Expressão da MMP-9

em células epiteliais

0,4696

Basal 50% (n=5) 27% (n=7)

Suprabasal 30% (n=3) 23% (n=6)

Basal+Suprabasal 20% (n=2) 50% (n=13)

Expressão de MMP-9

estroma/campo

< 25% células/campo 40% (n=4) 11,5% (n=3) 0,0086**

25- 50% células/campo 50% (n=5) 15,4% (n=4)

>50% células/campo 10% (n=1) 73,1% (n=19)

*P representa diferença entre os grupos quanto aos aspectos da membrana basal

**P representa diferença entre os grupos quanto a expressão de MMP-9 estroma/campo

52

Quanto à expressão da cadeia γ2 em HFI, foi possível observar uma

membrana basal contínua e linear (Figura 4, A). A expressão positiva de MMP-9 foi

principalmente observada no citoplasma das células endoteliais de estruturas

microvasculares e não houve expressão desta enzima em células do estroma

(Figura 4, F). Não foram encontrados grânulos de coloração acastanhada na CB e

SB.

5.3 Associação entre os dados clínicos e expressão da cadeia γ2 e

MMP-9

Em relação ao compartimento epitelial, quando pacientes fumantes de ambos

os grupos foram comparados, a expressão em CB e CB+SB foram maiores no

Grupo II (Figura 5, A. p<0,0001). Todos os pacientes do Grupo I que apresentaram a

membrana basal descontínua tinham mais de 60 anos (Figura 5, B. p<0,0001). Outro

dado significante foi a maior expressão de MMP-9 em fronts invasivos dos

tabagistas quando comparado com a ausência de fronts invasivos em não fumantes

(Figura 5, C. p=0,0225). Em relação a expressão de MMP-9 no estroma, pacientes

do sexo masculino do Grupo II tiveram maior número de células com marcação

citoplasmática do que pacientes do sexo masculino do Grupo I (Figura 5, D.

p=0,0054). O mesmo foi observado quando apenas pacientes com mais de 60 anos

foram analisados, o Grupo II obteve novamente maior número de células do estroma

com expressão de MMP-9 (Figura 5, E. p=0,0101). Ademais, a análise de expressão

de MMP-9 e γ2 no epitélio mostrou que no Grupo II as lesões com marcação de

laminina-332 em CB+SB tinham maior expressão de MMP-9 (Figura 5, F. P=0,003).

Figura 4: Expressão de cadeia γ2 (A-E) e MMP-9 (F-H) em lesões orais. Controle

negativo em CCE moderadamente diferenciado (A). O controle positivo de cadeia γ2

ao longo da interface epitelial-estromal em HFI, que mostra uma estrutura linear

(seta, B). Lesão de alto risco com MB contínua (seta, C). CCE bem diferenciado com

MB contínua (seta) e expressão da cadeia γ2 na camada SB (D). Front invasivo com

coloração citoplasmática de cadeia γ2 em CCE moderadamente diferenciado (E).

HFI com expressão de MMP-9 em células endoteliais (*, F). Lesão de alto risco com

expressão MMP-9 em CB+SB (G). Expressão da enzima em células do estroma em

torno de ninhos tumorais em CCE moderadamente diferenciado (*, H). Barra de

escala=20 µm.

Figura 5: Gráficos de associação entre dados clínicos e perfil imuno-histoquímico.

Pacientes fumantes do Grupo II com uma maior expressão de cadeia γ2 em CB e

SB+CB do que os fumantes do grupo I (A, p<0,0001). Paciente do Grupo I com >60

anos tiveram MB com aspecto descontínuo (B, p<0,0001). Expressão MMP-9 em

fronts invasivos de fumantes foi maior do que em não fumantes (C, p=0,0225). Maior

expressão de MMP-9 em estroma de pacientes do sexo masculino pertencentes ao

Grupo II (D, p=0,0054). O mesmo foi observado com os pacientes com mais de 60

anos (E, p=0,0101). O Grupo II com marcação da cadeia γ2 em CB+SB

apresentaram maior número de células estromais com expressão de MMP-9 (F,

p=0,003).

55

6 DISCUSSÃO

Este estudo analisou o perfil molecular da cadeia γ2 da laminina-332 e da

MMP-9 em lesões orais de alto risco de malignização e CCE invasivos. As

características microscópicas foram avaliadas, e possíveis associações entre os

fatores histológicos e clínicos da transformação maligna foram identificadas.

A maioria dos pacientes que participaram do estudo eram homens. Em

relação à idade, no Grupo I foram mais prevalentes indivíduos acima de 60 anos e

no Grupo II acima de 50 anos. Diferentes áreas da mucosa oral foram acometidas,

mas o rebordo alveolar foi o sítio mais frequente. Pacientes fumantes foram maioria

no Grupo II. Shenoi e colaboradores (2012), em estudo retrospectivo de 295 casos

de CCE invasivos, mostraram que 81% dos pacientes eram homens, com 51-60

anos e o principal hábito que levou ao desenvolvimento do câncer foi o consumo de

cigarros. O rebordo alveolar da mandíbula foi o sítio mais acometido. Dentro do

contexto das lesões de alto risco, a leucoplasia geralmente ocorre em homens de

meia idade (DOST et al. 2013) e a prevalência acentua-se consideravelmente em

pacientes com mais de 70 anos. Mucosa bucal, gengiva e vermelhão do lábio

caracterizam dois terços dos locais mais afetados (MORTAZANI et al, 2014; DOST

et al, 2013). Nossos resultados estão em concordância com os trabalhos

mencionados.

Mesmo com todo o desenvolvimento científico, o câncer permanece um

desafio a ser superado. Vários estudos têm sido realizados com o intuito de propor

novas terapias contra a progressão da doença, mas os vários tipos de câncer em

diferentes tecidos e, os muitos mecanismos utilizados pelas células tumorais tornam

difícil encontrar a chave que pode interromper o curso da doença. Porém, é

consenso que quando interceptado em estágio inicial, a grande parte dos tumores

tem prognóstico favorável. Um ponto relevante para melhorar o diagnóstico é o

desenvolvimento de biomarcadores que permitam a detecção de alterações

teciduais iniciais. As alterações na membrana basal representam passo importante

na progressão do câncer (KULASEKARA et al, 2009). Já foi relatado que a

carcinogênese depende de diferentes moléculas dessa estrutura, as quais são

preferencialmente utilizadas como substratos para a invasão e proliferação tumoral

(HIRASHIMA et al, 2013).

56

Assim, a análise da expressão da cadeia γ2 em tecidos de lesões de alto

risco e CCE demonstrou que o Grupo I apresentava a maioria das lesões com

membrana basal contínua, e nenhum caso com a membrana completamente

ausente. Por outro lado, no Grupo II os casos tiveram membrana descontínua ou

ausente. Esses achados estão em concordância com Imura e colaboradores (2012)

que destacaram em seus achados em adenocarcinoma que a membrana basal

permanecia contínua e linear enquanto a doença não alcançava estágios

avançados. Assim, pode-se sugerir que o perfil de expressão da cadeia γ2 se

modifica ao longo do processo de transformação e invasão tumoral.

No tecido conjuntivo, lesões do Grupo II mostraram expressão da cadeia γ2

na periferia de ilhas tumorais e alta concentração na interface tumor-estroma,

especialmente em fronts invasivos. Preferencialmente, a expressão dessa cadeia

em células de fronts invasivos foi associada à progressão do tumor e sugere que ela

desempenha papel na aquisição de um perfil migratório, característica que é um

requisito para a malignidade. Ainda, existe uma relação entre perda local da laminina

na membrana basal e sua deposição no estroma, perto das células invasivas, onde

o câncer tem um comportamento agressivo (BERNDT et al, 2001). Esse aspecto foi

descrito em diferentes carcinomas epiteliais, como em esôfago, região colo-retal e

pulmão (YAMAMOTO et al 2001; HLUBEK et al 2004; MOON et al. 2015).

Adicionalmente, laminina-332 estimula as células tumorais a formarem finas

projeções na borda frontal do citoesqueleto, levando a um aumento da migração e

invasão (FRANK; CARTER, 2004). A literatura vem associando proliferação,

migração e invasão com a cadeia γ2 quando profundamente alterada, fato

observado em recente estudo no qual houve redução nessas atividades em células

silenciadas para expressão de LAMγ2 (GARG et al, 2014). Quando as associações

foram analisadas, pode-se observar que a expressão da cadeia γ2 estava maior no

epitélio do Grupo II em comparação ao Grupo I, em se tratando de pacientes

fumantes. O tabaco é um fator de risco bem conhecido na carcinogênese, que

facilita a aquisição de motilidade em células tumorais (GASPARONI et al, 2007).

Motilidade esta que já foi relacionada com a presença da cadeia γ2 no citoplasma.

Assim, podemos considerar que expressão da cadeia contribui para um fenótipo

mais agressivo do tumor.

57

Em relação à MMP-9, os resultados demonstraram diferenças entre os grupos

e a marcação citoplasmática. Essa foi maior (mais do que 50% células/campo) em

pacientes com CCE invasivos quando comparadas às lesões de alto risco.

Tamamura e colaboradores (2013) encontraram em seus achados pouca ou

nenhuma expressão de MMP-9 em displasias epiteliais orais (DEOs) e em CIS. Por

outro lado, CCEs pobremente diferenciados tiveram elevada expressão da enzima.

Jordan e colaboradores (2004) encontraram alta expressão de MMP-1 e -9 em

DEOs e em CCEs invasivos, porém a expressão de MMP-9 mostrou-se presente em

maior quantidade e em 100% dos carcinomas, sendo associada com a progressão

tumoral. Achados semelhantes foram descritos por De Vicente e colaboradores

(2005), que encontraram associação entre expressão de MMP-9 e o grau histológico

das lesões. Em contrapartida, Kato e colaboradores (2005) mostraram que apesar

da expressão de MMP-9 estar elevada em CCEs invasivos, sua atividade no tecido

tumoral, analisada através de zimografia, era muito baixa impulsionando novos

estudos nesse sentido.

A síntese de MMP-9 por células tumorais desempenha um papel importante

na invasão do tecido subjacente, podendo representar a agressividade da doença

(APARNA et al, 2015). A elevada expressão de MMP-9 foi detectada em fronts

invasivos das amostras de fumantes. Esse achado corrobora com o fato de que

MMPs têm a capacidade de modular invasão tumoral, sendo bem reconhecida sua

expressão justamente nessas áreas de fronts tumorais (TAMAMURA et al., 2013).

Além do hábito de fumar, idade e sexo são aspectos clínicos importantes no

desenvolvimento CCE invasivo. Quando pacientes com idade superior a 60 anos e

do sexo masculino de ambos os grupos foram comparados, o Grupo II apresentou

mais células com marcação citoplasmática de MMP-9 do que o Grupo I. O aumento

dos grânulos de MMP-9 foi associado a um comportamento mais agressivo em

pacientes do sexo masculino e idosos e, representou o aumento progressivo da

síntese da enzima durante o processo de transformação maligna. A correlação

positiva entre as duas moléculas (cadeia γ2 e MMP-9) foi demonstrada no epitélio do

Grupo II. Casos com marcação de laminina em CB+SB tinham mais células

estromais com expressão de MMP-9. Patel e colaboradores (2002) encontraram

aproximadamente 90% das células epiteliais da camada basal marcadas para

58

cadeia γ2, diferentemente do observado no tecido normal, onde não existia essa

expressão. Além disso, os autores encontraram MB descontínua em CCEs

moderadamente diferenciados e indiferenciados.

A MB é a primeira barreira para migração de células neoplásicas, de maneira

que sua perda pode ser associada ao processo de invasão e metástase. As MMPs

estão envolvidas na clivagem da MB e remodelação da MEC (APARNA et al, 2015;

FULLÁR et al, 2015). Além disso, o aumento de MMPs abre caminho para células

que estão em transição epitélio-mesenquimal. Siegel e colaboradores (2011)

relataram que 50% dos casos de CCE têm uma sobrevida de 5 anos e pior

prognóstico quando comparado ao câncer de mama e/ou melanoma.

A análise da expressão da cadeia γ2 da laminina-332 e da MMP-9 em lesões

de alto risco de malignizaçāo e em CCEs invasivos é fundamental para entender

melhor as diferentes fases da carcinogênese. Ainda, buscar associações do perfil de

expressão dessas moléculas com os dados clínicos permite compreender como

fatores de risco interferem no microambiente tumoral. Expressão de laminina e

MMPs pode representar uma ferramenta útil para predizer o comportamento da

doença e se tornarem biomarcadores do processo invasivo durante o

desenvolvimento do câncer de boca.

59

7 CONCLUSÃO

Os dados sugerem possíveis associações entre os aspectos clínicos e

microscópicos. Pacientes fumantes com diagnóstico de CCE invasivo apresentaram

expressão mais elevada da cadeia γ2 no compartimento epitelial, com membrana

basal descontínua e alta expressão MMP-9 em fronts invasivos. Ainda, a expressão

de MMP-9 no estroma foi prevalente em pacientes do sexo masculino e com mais de

60 anos também com diagnóstico de CCE invasivo. Embora ainda existam

controvérsias na literatura, é possível observar que as proteínas estudadas

apresentam mudanças no seu padrão na seqüência DEO-CIS-CCEs.

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71

9 APÊNDICE 1

9.1 Artigo 1

Title: Association of laminin-332 and MMP-9 expression with clinicopathological parameters

in malignant transformation of oral lesions

Eline Manhães Reid Callegari

Federal University of Espírito Santo, Health of Sciences Center, Department of Morphology,

Postgraduate Program in Dental Clinic (PPGCO). Marechal Campos av., 1468, Maruípe, Zip

code: 29.040-090, Vitória, ES, Brazil. +55273335735. E-mail address: [email protected]

Tel +55-27-33357358

Marcos da Silva Pacheco

Federal University of Espírito Santo, Health of Sciences Center, Department of Morphology.

Marechal Campos av., 1468, Maruípe, Zip code: 29.040-090, Vitória, ES, Brazil.

+552733357358. Email: [email protected]

Karla Loureiro Almeida Coburn



code: 29.040-090, Vitória, ES, Brazil. +552733357358. Email: [email protected]

Vanessa Morais Freitas

University of São Paulo, Institute of Biomedical Sciences, Department of Cell and

Developmental Biology. Lineu Prestes av., 1524, Cidade Universitária, São Paulo/SP. Brazil.


Willian Grassi Bautz

Federal University of Espírito Santo, Health of Sciences Center, Department of Morphology.



Faculty of Medicine, University of São Paulo, São Paulo, Brazil.

mailto:[email protected]



72

Liliana Aparecida Pimenta de Barros

Federal University of Espírito Santo, Health Sciences Center, Clinical Odontology

Departament, Postgraduate Program in Dental Clinic (PPGCO). Marechal Campos av., 1468,

Maruípe, Zip code: 29.040-090 Vitória/ES. Brazil. +552733357358. E-mail address:

[email protected]

Letícia Nogueira Gama-de-Souza



code: 29.040-090, Vitória, ES, Brazil. +552733357358. Email: [email protected]

Corresponding to: Professor Letícia Nogueira Gama-de-Souza, Federal University of Espírito

Santo, Department of Morphology, Postgraduate Program in Dental Clinic (PPGCO).





73

Abstract

Objectives:

In the context of tumorigenesis, laminin-332 performs multiple biologic effects by γ2 chain

processing and MMP-9 acts disrupting extracellular components. We aimed to assess

molecular profile of γ2 chain and MMP-9 in leukoplakias oral high-risk, carcinoma in situ and

oral invasive carcinoma (OSCC) and establish association with clinicopathologic features.

Materials and methods:

γ2 chain and MMP-9 expression was assessed by immunohistochemistry in 10 patients with

high-risk lesions and 26 with OSCC. Associations between microscopic features and clinical

parameters were established.

Results:

Immunostaining of γ2 chain in high-risk lesions were detected with a continuous basement

membrane and the majority of OSCC had a discontinuous membrane. OSCC stromal cells

showed a higher presence of MMP-9. The association between clinical and expression profile

demonstrated that smokers with OSCC had a higher expression of γ2 chain in epithelium and

MMP-9 in invasive fronts. A higher expression of MMP-9 in stromal cells was associated

with male patients, older than 60 years and diagnosed with OSCC compared with high-risk

lesions.

Conclusion:

Our results indicate an association between clinical and microscopic features in oral lesions,

with a progressive change in γ2 chain and MMP-9 expression during tumorigenesis.

Keywords: laminin-332; γ2 chain; matrix metalloproteinase-9; oral squamous cell carcinoma.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mesh/68020780

74

Introduction

Chronic non-communicable diseases (CNCDs) are the causes of a high rate of morbidity and

mortality throughout the world and in this context stands out malignant neoplasm. In oral

cavity and pharynx, 42,440 new cases of cancer were diagnosed and 8,390 deaths are

estimated in 2014, only in USA (Siegel et al, 2014). Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is

the most common oral cancer with 90-95% of cases, has epithelial origin and represents the

sixth more frequent cancer in men and eighth in women (Johnson et al, 2011). OSCC may

arise from potentially malignant oral disorders (PMODs), such as leukoplakia and

erythroplakia with a malignant transformation rate between 2-3% per year (Van der Waal,

2014). Tobacco is the main risk factor, but OSCC may be linked to excessive consumption of

alcohol and HPV infection (Torre et al, 2012). Early detection still remains a challenge and

the lesion is characterized by a high degree of local invasiveness and metastasis to cervical

lymph nodes (Feller and Lemmer, 2012).

One important step in cancer progression is the alterations that affect basement membrane, a

dynamic structure consists in type IV collagen, proteoglycans and a dense network of

glycoproteins (Kulasekara et al, 2009). Laminin-332 is a large extracellular glycoprotein

presents in basal lamina of epithelial cells. This molecule performs multiple biologic effects,

such as cell attachment, migration, differentiation and proliferation (Tringler et al, 2007). In

addition, it has been reported a correlation between laminin-332 expression and tumor

progression in a variety of malignant epithelial neoplasm (Imura et al, 2012).

Recent studies have shown that biological activity of laminin-332 is modulated by γ2 chain

process (Sato et al, 2014; Marangon Junior et al, 2014), by the action of proteolytic enzymes,

termed matrix metalloproteinases (MMPs). These enzymes act disrupting extracellular

components which result in changes of cell-cell and cell-matrix interactions (Aparna et al,

2015). High expression of MMPs has been evidenced and related to poor prognosis in several

kinds of carcinomas (Nabeshima et al, 2002; Reis et al, 2012; Yang et al, 2014; Aparna et al,

2015). Among the various types of MMPs, MMP-9 has been highlighted in the context of

tumorigenesis. Studies showed that enzyme is closely associated with the tumor cell invasion,

metastasis and angiogenesis (Iizasa et al, 1999; Chu et al, 2011) . MMPs were considered as

new biomarkers for different cancers, such as breast cancer (MMP-1, -9, -13) (Wu et al,

2008), lungs (MMP-1, -7, -9) (Jumper et al, 2004);, colo-rectal (MMP-1, -2, -7, -9, -13) (Cho

et al, 2007)), ovary (2, -9, -14) (Lengyel et al, 2001). From all mentioned MMPs, MMP-9

was present in each one of this neoplasm.

75

Clinic and morphologic parameters of OSCC are well defined by literature and histologic

grading has been applied to define oral cancer behavior for years, however, is important to

emphasize that its prognostic value is still considered controversial. So, for a better

understanding of the mechanisms involving epithelium in a malignant transformation, a

search for biomarkers and gene alterations is mandatory (Taghavi and Yazdi, 2015). Thus, our

objective was to assess the γ2 chain and MMP-9 expression in leukoplakia with severe oral

epithelial dysplasia, CIS and invasive OSCCs. Also, the microscopic features were associated

to patient’s clinical data and its possible implication in carcinogenesis. We believe that

identification of specific factors will improve the knowledge beyond oral cancer.

Materials and methods

Patients and tissue specimens

The retrospective study was approved by Ethics Committee of the Institution where it was

developed (45995815.9.0000.5060- Federal University of Espírito Santo/UFES, Brazil).

Written informed consent was obtained from each participant and the study was performed in

accordance with the Declaration of Helsinki. Paraffin blocks from different sites of oral

mucosa were selected from the archives of the Oral Pathology Laboratory of Dentistry

School/UFES between 2004-2011. The samples included 36 lesions divided into 2 groups.

Group I consisted of 10 high-risk lesions for malignancy (5 leukoplakia with severe dysplasia

and 5 CIS) according with binary agreement (Kujan et al, 2006) and Group II by 26 invasive

OSCCs (9 well differentiated, 11 moderately differentiated and 6 undifferentiated).

Inflammatory fibrous hyperplasia (IFH) was included as a positive control. Clinical and

histopathological data were collected from medical records and included: gender, age, lesion

site and history of tobacco exposure. Exclusion criteria were: incomplete clinical data and

insufficient sample for microscopic analysis.

Immunohistochemistry

For immunohistochemistry, 3-µm histological sections were submitted to the

immunoperoxidase method. The primary antibodies used were: mouse anti-γ2 chain laminin-

332 with dilution 1:100 (clone B-2: sc-25341, Santa Cruz Biotechnology) and rabbit anti-

MMP-9 with dilution 1:500 (clone Abcam, whole molecule-ab 38898). Immunodetection was

performed with the Reveal System (Spring/Biogen SPB-999) using 3,3′-diaminobenzidine as

the chromogen. The sections were counterstained with Mayer’s hematoxylin. Heat citrate

buffer ph 6.0 was used for antigen retrieval and 1% bovine serum albumin (BSA) was applied

for blocking non-specific antigens. The sections were incubated with the respective primary

76

antibodies overnight in a humidified chamber maintained at 4°C. Then, slides were depleted

of endogenous peroxidase by incubating for 20 min with 3% hydrogen peroxide in room

temperature. Subsequently, specimens were incubated with secondary antibody detection

system according manufacturer's instructions. The slides were washed thoroughly with

phosphate-buffered saline during immunohistochemistry process. Positive (IFH) and negative

controls (omission of primary antibody) were included. No significant staining was observed

in the negative controls.

Microscopic analysis

Immunostained sections were analyzed and scored in a blind manner with respect to clinical

information by a single investigator, previously calibrated (kappa 0.8) using Olympus AX70

microscope (Olympus America Inc.,NY, USA) with a digital camera Zeiss AxioCam ERC5s

(Carl Zeiss Vision GmbH, Germany) coupled and Axio Vision 4.2 Release 4.8.2 images

program (Carl Zeiss Vision GmbH, Germany). The expression of γ2 chain was evaluated

according to tissue sites: (1) basement membrane and (2) epithelial compartment. For the last

one, cells were separated into a basal layer (BL) and a suprabasal layer (SL). The BL

consisted of one to two cell layers that were closest and perpendicularly organized on the

epithelial–matrix interface. The rest of the epithelial cells overlying BL were designated as SL

(Kulasekara et al., 2009). Expression was still analyzed in invasive front and tumor nests. All

slides were evaluated at 100X magnification. Regarding basement membrane staining, the

following aspects were considered: absence; continuous; or discontinuous. Slides were

evaluated at 100X magnification. In relation to MMP-9 analysis, stroma and epithelium (BL +

SL) were also considered. The number of stromal cells expressing MMP-9 was divided by

total fields (cells/fields: C/F ratio). After that, 3 groups were established: less than 25% of the

labeled cells, 25-50%t labeled and more than 50% of stained cells (Tamamura et al, 2013).

Association of clinical and microscopic data

After data collection, associations between microscopic features and clinical parameters were

established. Clinical data (age, gender, site and tobacco exposure) were examined. Each

variable was compared with molecules expression. The collected data was input on tables.

Statistical Analysis

GraphPad Software (La Jolla, CA, USA) was used for data analysis and graph construction.

Chi-squared test was applied to evaluate clinical analysis. The association between 2 chain

and MMP-9 expression with clinical data was tested by Fischer`s Exact Test. The results were

considered significant when p <0.05.

77

Results

Clinical data

Male was the most affected gender for both groups. Patients older than 60 years were more

prevalent in Group I. In Group II most patients were under 60 years. Lesions affected

different sites however, it was predominantly in alveolar ridge. Regarding habits, most of

patients related smoking. Table 1 summarized clinical data.

Expression of γ2 chain of laminin-332 and MMP-9

In basement membrane, immunostaining of γ2 chain showed differences among groups. In

Group I most of lesions were detected with a continuous membrane (60%) and any lesion had

completely absent of basement membrane staining (Figure 1, C). On the other hand, in Group

II major of cases had a discontinuous membrane (69,2%) or absence (30,8%) (p=0,001).

About epithelial cells expression, both groups showed preference citoplasmatic staining in

BL+ SL (Figure 1, D and E). Laminin-332 expression could be detected in tumor cells,

predominantly in single cells, periphery tumor nests or tumor-stromal interface of invasive

fronts (Figure 1, E). All OSCC cases with invasive fronts had positive reaction for γ2 chain.

When MMP-9 immunoexpression was analyzed, the groups demonstrated differences in

epithelium staining. BL represented 50% of high-risk lesions (Figure 1, G) and, BL+SL was

the main pattern in invasive OSCC, also with 50%. However, there was no significant

difference between groups (p=0,4696). The analysis of stromal cells showed important

feature, with a higher presence of citoplasmatic expression (50% cells/field) in Group II

(Figure 1, H) when compared with Group I (p=0,0086). The findings of both groups are

presented in Table II.

Regarding IFH, it was possible to observe a liner and continuous basement membrane of

laminin-332 (Figure 1, A). Positive expression of MMP-9 was mainly observed in endothelial

cell cytoplasm of microvascular structures and there was no expression of this enzyme in

stromal cells (Figure 1, F). Neither antibody showed staining brownish granules in BL and

SL.

Association between clinical data and expression of γ2 chain and MMP-9

Regarding epithelial compartment, when smokers patients of both groups were compared, the

expression in BL and BL+SL were higher in Group II (Figure 2, A. p<0,0001). All patients in

Group I who presented discontinuous basal membrane had over than 60 years (Figure 2, B.

p<0,0001). Another significant finding was a greater MMP-9 expression in invasive fronts of

smokers when compared with no smokers patients (Figure 2, C. p=0,0225). About MMP-9

78

expression in stroma, male patients of Group II demonstrated more cells with citoplasmatic

staining than male of Group I (Figure 2, D. p=0,0054). The same was observed when only

patients older than 60 years were analyzed, again Group II had a higher number of stromal

cells with MMP-9 expression (Figure 2, E. p=0,0101). Still, the analysis of MMP-9 and 2

expression in epithelium showed that Group II with laminin-332 staining in BL+SL had more

stromal cells with MMP-9 detection (Figure 2, F. p=0,003).

Discussion

The study sought to analyze molecular profile of 2 chain of laminin-332 and MMP-9 in high-

risk oral lesions and invasive OSCC. Still, microscopic features were evaluated in order to

detected possible associations between histological and clinical factors in malignant

transformation.

Our data demonstrated that male was the most affected gender for both groups and a higher

number of patients related smoking. Regarding age, in Group I were more prevalent

individuals over 60 years and in Group II over 50 years. Different areas of oral mucosa were

affected, but alveolar ridge was the most frequent. Shenoi et al (2012), in a retrospective

study of 295 cases of OSCC, showed that 81% of patients were men, with 51-60 years, and

the main habit that led to oral cancer was cigarette consumption. The most prevalent site

mentioned was the mandibular alveolar ridge. Within the context of high-risk lesion,

leukoplakia usually occurs in middle age men (Dost et al, 2013) and prevalence increases

considerably over 70 years. Buccal mucosa, lip vermilion and gums characterize two-thirds of

the sites affected by this disorder (Mortazani et al, 2014; Dost et al, 2013). Our results are in

agreement with these works.

Even with all the scientific development, cancer remains a challenge to be overcome. Several

studies have been carried out to propose new therapies against disease progression, but the

various types of cancers in different tissues and the many mechanisms used by tumor cells

hinder difficult to find the key that can stop disease. However, when trapped in early stage

many tumors have a favorable prognosis. A relevant point to improve cancer diagnostics is

the development of biomarkers that enable the detection of early tissue alterations. One

important step in cancer progression is basement membrane alterations (Kulasekara et al,

2009). This process has been shown to be critical once carcinogenesis depends of different

molecules of this structure, which are preferably used as substrates for invasion and

proliferation (Hirashima et al, 2013).

79

We analyzed γ2 chain expression in tissues of high-risk lesions and invasive OSCC. Our

results demonstrated that Group I had most of lesions detected with a continuous membrane

and any case with completely absent. On the other hand, in Group II major of cases had a

discontinuous or absence membrane. Those findings are in agreement with Imura et al (2012),

that mentioned while disease has not reached advanced stage, basement membrane was

continuous and linear in adenocarcinoma.

In the connective tissue, lesions of Group II showed 2 expression in the periphery of tumor

islands and raised concentration in the tumor-stroma interface, especially in invasive fronts.

Zargaran et al (2011) demonstrated in OSCC well differentiated a heterogeneous laminin

expression. Preferential γ2 chain expression in cells of invasive fronts was associated with

tumor progression, these findings suggest that laminin-332 plays a role in the acquisition of a

migrating profile, a feature that is a requirement for malignancy. There is a relationship

between local loss of laminin in basement membrane and its deposition in stroma, close to the

invading cells, where cancer has an aggressive behavior (Berndt et al, 2001). This aspect was

described in different epithelium cancers, such as in esophagus, colo-rectal area and lung

(Yamamoto et al, 2001; Hlubek et al, 2004; Moon et al, 2015).

Additionally, laminin-332 stimulates tumor cells to form fine protrusions on the sheet-shaped

front edge membranes, which lead to an increase in cell migration and invasion and

underlying tissue (Frank and Carter, 2004). The literature associated proliferation, migration

and invasion activities with a profoundly change in γ2 chain presence. This fact was observed

in a recent study that showed a reduction in migration and invasion when cells are treated

with silencing LAMγ2 (Garg et al, 2014). So, we could consider that γ2 chain expression

contributes to a more aggressive cancer phenotype.

An important finding regarding clinical data and γ2 chain profile was a higher expression in

epithelium of Group II when compared with Group I when only smokers were analyzed

(p<0,0001). Tobacco is a well know risk factor in carcinogenesis, which facilitate the

acquisition of mobility in tumor cells (Gasparoni et al, 2007). Thus, we can consider that

expression of γ2 chain contributes to a more aggressive phenotype of the tumor.

Regarding MMP-9, the results demonstrated difference between groups, with a higher

cytoplasmatic staining (more than 50% cells/field) in patients with invasive OSCC compared

to the lesions high-risk. Tamamura et al, (2013) described few or no expression of MMP-9 in

oral epithelium dysplasia (OED) and in CIS. Moreover, poorly differentiated OSCCs had high

expression of the enzyme. Jordan et al, (2004) found high expression of MMP-1 and -9 in

80

OEDs and invasive OSCC. Still, MMP-9 expression was higher than MMP-1 and was

detected in 100% of carcinomas. Similar findings were reported by De Vicente et al (2005),

which described an association between MMP-9 expression tumor histological grade. In

contrast, Kato et al (2005) have shown that despite being high MMP-9 expression in

invasives CCEs, its activity in tumor, assessed by zymography, was very low leading new

studies of this molecule in CCEs.

MMP-9 synthesis by tumor cells is important to the underlying tissue invasion, and could

represent the disease aggressiveness (Aparna et al, 2015). In our study, a higher MMP-9

expression was present in invasive fronts of smokers when compared with no smokers

patients (p=0,0225). MMPs have the ability to modulate tumor invasion, and its expression is

well recognized in areas such tumor fronts (Tamamura et al, 2013).

In addition to smoking, age and gender are important clinical features in invasive OSCC

development. When patients over the age of 60 years and males from both groups were

compared, the Group II showed more cells with cytoplasmic labeling of MMP-9 than Group I.

The increase in diffuse brownish granules of MMP-9 represented a more aggressive behavior

of disease in males and elderly patients and signaled to a progressive increase of enzyme

synthesis during the malignant transformation process. The positive correlation between the

two molecules (γ2 chain and MMP-9) was demonstrated in epithelial Group II. Cases with

laminin expression in BL+SL had more stromal cells with MMP-9 expression. Patel et al

(2002) found approximately 90% of the basal cells staining for γ2 chain, different from that

observed in normal tissue, where there was no such expression. Furthermore, the authors

found a discontinuous basement membrane in moderately differentiated and undifferentiated

OSCCs.

Basement membrane is the first barrier to neoplastic cells migration, therefore, it loss may be

associated with stromal invasion and metastatic process. MMPs are involved in cleavage

process of basement membrane and ECM remodeling (Aparna et al, 2015; Fullár et al, 2015).

In addition, the increase in MMPs opens a way for cells that are in epithelial-mesenchymal

transition to invade underlying tissues and promote distant metastases. Furthermore, Siegel et

al (2011) related that 50% of invasive OSCC cases have a 5-year survival and worse

prognosis when compared to breast cancer and/or melanoma.

Analysis of γ2 chain expression and MMP-9 in high-risk malignant lesions and invasive

OSCCs is essential to improve the understanding of different stages in carcinogenesis. Still,

81

seek profile associations of molecules expression with clinical data provides insight into how

risk factors could modify tumor microenvironment. Laminin and MMP expression may

represent a useful tool to predict disease behavior and become biomarkers of invasive process

during oral cancer development.

Conclusion

The data suggest possible associations between clinical and microscopic features. The

findings showed that smokers patients with invasive OSCC had higher expression of γ2 chain

in epithelial compartment with discontinuous basement membrane and high MMP-9

expression in invasive fronts. Furthermore, the MMP-9 expression in the stroma was

prevalent in male patients and over 60 years with invasive OSCC. Although there is still

controversy in the literature, it is possible to observe that proteins showed changes in invasive

OED-CIS-OSCCs sequence.

Acknowledgements

This work was supported by grants from Brazilian National Council for Scientific and

Technological Development (CNPq) process number: 479694 2013-3 and the State of

Espírito Santo Research Foundation (FAPES) process number: 67659870 006/2014.

E.M.R Callegari is a recipient of graduate fellowships from FAPES process number:

66882370/2014.

Conflict of Interest

The authors declare no conflict of interest.

Author’s contributions

Eline Manhães Reid Calllegari performed all the methods and wrote the article. Marcos da

Silva Pacheco, Vanessa Morais Freitas and Karla Loureiro Almeida Coburn contributed with

immunohistochemistry analysis. Willian Grassi Bautz helped with graphics construction and

statistical analysis. Liliana Aparecida Pimenta de Barros recruited patients and was

responsible for histopathological diagnosis. Letícia Nogueira da Gama de Souza designed the

study and wrote the article. All authors read and approved the final manuscript.

82

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87

Subtitles

Figure 1: Expression of γ2 chain (A- E) and MMP-9 (F-H) in oral lesions. Negative control

in OSCC moderate differentiated (A). Positive control of γ2 chain along epithelial-stromal

interface in IFH, showing a linear structure (arrow, B). High-risk lesion with continuous

basement membrane (arrow, C). OSCC well differentiated with continuous basement

membrane (arrow) and γ2 chain expression in SL (D). Invasive front with citoplasmatic

staining of γ2 chain in OSCC moderately differentiated (arrow, E). IFH with MMP-9

expression in endothelial cells (arrow, F). High-risk lesion with MMP-9 expression in BL+SL

(G). Enzyme expression in stromal cells surrounding OSCC nests (arrow, H). Scale

bar=20μm.

Figure 2: Graphics of association between clinical data and immunoexpression profile.

Smokers patients of Group II with a higher expression of 2 chain in BL and SL+BL than

smokers of Group I (A, p<0,0001). Patient of Group I with > 60 years had basement

membrane with discontinuous aspect (B, p<0,0001). MMP-9 expression in invasive fronts of

smokers was higher than no smokers (C, p= 0,0225). Higher MMP-9 expression in stroma of

male patients belong Group II (D, p=0,0054). The same was observed with patients older

than 60 years (E, p=0,0101). Group II with 2 chain staining in BL+SL had more stromal

cells with MMP-9 expression (F, p=0,003).

90

Table I- Clinical data.

Group I (n=10) Group II (n=26)

Gender

Male 70% (n=7) 88,4% (n=23)

Female 30% (n=3) 12,6% (n=3)

Site

Alveolar ridge 70% (n=7) 34,6% (n=9)

Mouth floor 0% (n=0) 30,8% (n=8)

Tongue 20% (n=2) 19,2% (n=5)

Other sites 10% (n=1) 15,3% (n=4)

Age

≤ 60 20% (n=2) 57,7% (n=15)

> 60 80% (n=8) 42,3% (n=11)

Habit

Smoking 50% (n=5) 76,9% (n=20)

Non- Smoking 50% (n=5) 23,1% (n=6)

91

Table II- Expression profile of γ2 chain of laminin-332 and MMP- 9.

*P value represents difference of basement membrane aspect between groups

**P value represents difference of MMP-9 expression stroma/field between groups

Group I (n=10) Group II (n=26) P

γ2 chain in basement membrane

0,0001*

Continuous 60% (n=6) 0

Discontinuous 40% (n=4) 69,2% (n=18)

Absence 0 30,8% (n=8)

2 expression in epithelium cells

0,4904

Basal 10% (n=1) 30,8% (n= 8)

Suprabasal 0 3,8% (n=1)

Basal+Suprabasal 90% (n=9) 65,4% (n=17)

MMP-9 expression in epithelium

cells

0,4696 Basal 50% (n=5) 27% (n=7)

Suprabasal 30% (n=3) 23% (n=6)

Basal+Suprabasal 20% (n=2) 50% (n=13)

MMP-9 expression stroma/field

< 25% cells/field 40% (n=4) 11,5% (n=3)

25-50% cells/field 50% (n=5) 15,4% (n=4) 0,0086**

> 50% cells/field 10% (n=1) 73,1% (n=19)

92

10 APÊNDICE 2

10.1 Artigo 2

Associação entre aspectos clinicopatológicos e expressão da cadeia γ2

da laminina 332 em estruturas vasculares de Carcinomas de Células

Escamosas Orais

Association of clinicopathologic features with γ2 chain of laminin 332

expression in vascular structures of Oral Squamous Cell Carcinomas

Estudo realizado na Universidade Federal do Espírito Santo, Departamento de

Morfologia, Vitória, Espírito Santo, Brasil

Lorena De Angeli Graduada em Odontologia. Universidade Federal do Espírito

Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil.

Letícia Côgo Marques Graduada em Odontologia. Universidade Federal do Espírito

Santo,Vitória, Espírito Santo, Brasil.

Eline Manhães Reid Callegari Programa de Pós Graduação em Clínica

Odontológica. Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil.

Marcos da Silva Pacheco Departamento de Morfologia. Universidade Federal do

Espírito Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil.

Karla Loureiro de Almeida Coburn Departamento de Morfologia. Universidade

Federal do Espírito Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil.

Willian Grassi Bautz Programa de Pós Graduação em Fisiopatologia Experimental.

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo. Departamento de

Morfologia. Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil.

93

Liliana Aparecida Pimenta de Barros Departamento de Clínica Odontológica.

Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil.

Letícia Nogueira da Gama de Souza Departamento de Morfologia, Programa de

Pós Graduação em Clínica Odontológica. Universidade Federal do Espírito Santo,

Vitória, Espírito Santo, Brasil.

Correspondência para: Letícia Nogueira da Gama de Souza. Endereço: Av.

Marechal Campos, 1468 - Maruípe. Vitória, ES. Brasil. CEP: 29.040-090. Tel: 55-27-

33357362. E-mail: [email protected]

Financiamento: Fundação de Amparo à Pesquisa do Espírito Santo (FAPES).

Processo nº: 64772845/2013 e CNPq Universal Processo nº: 479694 2013-3.


94

RESUMO

Introdução: carcinoma de células escamosas orais (CCE) representa

importante lesão do complexo maxilofacial, estando associada a altos índices

de morbidade e mortalidade. Além da gradação histopatológica, análise

específica de componentes da membrana basal vascular poderá auxiliar na

detecção de processos invasivos locais, importante evento na progressão da

doença. Objetivo: analisar a expressão da cadeia γ2 da laminina 332 em

membrana basal de vasos presentes em CCE e associar aspectos clínicos com

os microscópicos. Métodos: 16 casos de CCE, 8 Bem Diferenciado e 8

Moderadamente Diferenciado, foram processados com imuno-histoquímica para

cadeia γ2. Foi avaliada presença ou não da molécula em vasos, e aspecto de

sua membrana basal. Dados clínicos foram coletados dos prontuários e

associados aos achados microscópicos. Resultados: 87,5% e 100% dos CCE

Bem e Moderadamente Diferenciados tiveram expressão da cadeia γ2

respectivamente. Imunomarcação foi associada aos pacientes homens,

fumantes e com até 60 anos. Conclusões: nossos dados sugerem que a

expressão da cadeia γ2 em estruturas vasculares está presente em lesões de

CCE e pode estar associada ao comportamento mais agressivo da doença.

Ainda, alguns fatores de risco foram associados de forma positiva aos achados

microscópicos.

Palavras-chave: carcinoma de células escamosas orais; laminina 332; cadeia

γ2.

95

ABSTRACT

Introduction: oral squamous cell carcinomas (OSCC) represent important

lesions of the maxillofacial complex and generally are associated with high rates

of morbidity and mortality. In addition to histopathological grading, specific

analysis of the vascular basement membrane components could improve

detection of local invasion, an important event in disease progression.

Objective: analyze the expression of γ2 chain of laminin 332 in basement

membrane of OSCC vascular structures and establish association between

clinical and microscopic aspects. Methods: 16 cases of OSCC, 8 Well

Differentiated and 8 Moderately Differentiated, were staining for γ2 chain by

immunohistochemistry. It was analyzed presence or absence of the molecule in

vessels and feature of its basement membrane. Clinical data were collected

from medical records and associated with microscopic findings. Results: 87,5%

and 100% of Well Differentiated and Moderately Differentiated OSCC showed

γ2 chain expression respectively. Molecule expression was associated with

male patients, smokers and until 60 years. Conclusion: our data suggest that

γ2 chain expression in vascular structures is detected in OSCC lesions and

could be associated with a more aggressive disease behavior. Even, some

clinical features were positively associated to microscopic findings.

Keywords: oral squamous cell carcinomas; laminin 332; γ2 chain. 5

96

INTRODUÇÃO

O câncer de boca é uma denominação que inclui os cânceres de lábio e da cavidade

oral (mucosa jugal, gengivas, palato duro, língua e assoalho da boca)1. Dentre as

neoplasias malignas que acometem a cavidade da boca e se originam do epitélio de

revestimento, o carcinoma de células escamosas (CCE) é considerado o mais

comum², representando 90 a 95% do número total, geralmente associado a

elevados índices de morbidade e mortalidade,3. Vários fatores de risco participam do

desenvolvimento do CCE de boca, com papel de destaque para consumo excessivo

de álcool e uso de tabaco (incluindo a forma não fumável) envolvidos em

aproximadamente 90% das manifestações de câncer oral no mundo4,5. Por ser uma

neoplasia maligna, apresenta capacidade de invadir e destruir estruturas adjacentes

e migrar para locais distantes6. Além dos aspectos clínicos do paciente e da lesão, a

análise histológica desempenha papel importante no diagnóstico e também na

elucidação de características que poderão comprometer o prognóstico. Atualmente,

outros aspectos da doença passaram a ser considerados principalmente quando as

lesões são diagnosticadas em estágios mais avançados. Dentro desse contexto

figura a invasão linfovascular, que representa a presença de ninhos de células

tumorais no interior do espaço vascular7,8. O processo invasivo dos CCEs orais está

associado a prognósticos piores, bem como às elevadas taxas de recorrência,

comportamento agressivo, metástases e baixa sobrevida9. Embora a detecção

desses processos seja importante, muitas vezes podem passar despercebidos.

Lâminas coradas com técnicas de rotina (Hematoxilina e Eosina-HE) representam

desafio na detecção de invasões iniciais e locais, pois os tecidos podem se

apresentar desorganizados e/ou remodelados. Assim, a utilização de biomarcadores

configura ferramenta de grande valor, pois permite a detecção de proteínas

97

específicas em diferentes estruturas do tecido. A membrana basal (MB) é uma

importante estrutura, existente ao redor dos vasos representando uma

especialização da matriz extracelular (MEC). Diversas funções já foram descritas

para essa estrutura, tais como: suporte, ancoragem celular e compartimentalização

de tecidos, determinação da polaridade celular, do metabolismo, organização de

proteínas na membrana plasmática, promoção da sobrevivência e proliferação

celulares, e via para a migração10,11. A MB é formada por uma rede tridimensional de

macromoléculas incluindo, colágenos, laminina, entactina (nidogênio) e

proteoglicano de heparan sulfato. Dessas diversas moléculas, as lamininas formam

um grupo amplo de glicoproteínas compostas pelas cadeias α, ß e γ, sendo

essenciais na MB12. Dezessete isoformas de lamininas com diferentes combinações

dessas cadeias já foram descritas13. Apesar da laminina 332 ser mais conhecida

como um componente epitelial da membrana basal na interface epitélio-conjuntivo,

também foi descrita na membrana basal dos vasos sanguíneos14. Em gliomas

humanos, a expressão da cadeia γ2 está associada com a angiogênese tumoral15.

Dentro desse contexto, a investigação da relação da laminina 332 com a integridade

a membrana basal de vasos e a evolução dos tumores é importante, pois lesões

mais agressivas possuem alta capacidade de produzir enzimas que degradam a

membrana basal, favorecendo a invasão tumoral16,17. Já se sabe que a invasão de um

tumor maligno primário e seu crescimento em um sítio distante ocorre a partir da

degradação da membrana basal, permitindo assim a migração celular através do

tecido conjuntivo, e consequente disseminação por via vascular6. Para o CCE oral, a

invasão em vasos foi definida pela presença de grupos isógenos de queratinócitos

no interior do espaço vascular, aderidos ao endotélio8. Portanto, análise específica

integridade da membrana basal de vasos em lesões de CCEs poderá auxiliar na

98

detecção de processos invasivos locais. Ademais, a associação dos dados clínicos

com os microscópicos é fundamental para traçar o perfil dos pacientes e permitir

análise mais detalhada do prognóstico. Todos esses dados em conjunto ampliarão o

conhecimento sobre a tumorigênese do CCE, lesão responsável por altos índices de

mortalidade e morbidade.

METODOLOGIA

Material

Foram selecionados 23 casos de CCEs do Serviço de Anatomia Patológica do Curso

de Odontologia/UFES entre os anos de 2004-2011. As amostras foram obtidas a

partir de biópsias de lesões suspeitas de CCEs em diferentes locais da boca de

pacientes que procuraram atendimento no Programa de Prevenção e Diagnóstico de

Câncer e Lesões de Boca, desenvolvido pelas disciplinas de Estomatologia e

Cirurgia Buco-Maxilo-Facial II. O material obtido foi fixado em formaldeído 10% e

incluído em parafina. Para as análises microscópicas foram preparadas lâminas

histológicas submetidas às técnicas HE para diagnóstico histopatológico e, imuno-

histoquímica para análise da cadeia γ2 da laminina 332. Durante a seleção da

amostra foram adotados os seguintes critérios de inclusão: Termo de consentimento

livre e esclarecido assinado pelo paciente ou responsável; prontuário do paciente

devidamente preenchido contendo gênero, idade e fator de risco (tabaco); dados da

lesão: localização e diagnóstico histopatológico e material suficiente para análise

microscópica. Assim, 7 amostras foram excluídas por não apresentarem amostra

suficiente, o que resultou em 16 casos para o estudo. Desses, 8 casos incluíam CCE

Bem Diferenciado e 8 CCE Moderadamente Diferenciado. O trabalho foi aprovado

pelo comitê de ética sob o número 45995815.9.0000.5060.

99

Imuno-histoquímica

Para a análise microscópica e imuno-histoquímica foram realizados cortes seriados

com 3µ de espessura e processados com técnica de imuno-histoquímica para

cadeia γ2 utilizando-se o anticorpo Laminin γ2 (B-2, gerado em camundongo, Santa

Cruz). Inicialmente as lâminas sofreram desparafinização em xilol e reidratação em

série decrescente de etanol (100%, 90% e 80% por 5 minutos). Foi realizada

remoção de pigmento formólico com hidróxido de amônio à 10% em etanol 95%,

durante 10 minutos. Em seguida passou-se para recuperação antigênica com

solução tampão de citrato pH 6,4 a 95ºC. Após isso, foi realizado bloqueio da

peroxidase endógena e bloqueio de anticorpos inespecíficos. A incubação do

anticorpo primário ocorreu durante 16 horas a 4º C (1:100). Passou-se para

incubação do anticorpo secundário e terciário pelo Sistema Reveal (Springer,

Biogen), conforme instruções do fabricante. A revelação foi com cromógeno

Diaminobenzidina (DAB) e contra- coloração com hematoxilina de Mayer. As

amostras foram montadas com Permount. Entre as etapas foram feitas passagens

em solução tampão de PBS. Como controle negativo da imunomarcação, foi

realizado o mesmo processamento, porém com substituição do anticorpo primário

por PBS.

Análise Qualitativa e Semiquantitativa

O avaliador passou por etapas de calibração e testes cegos para garantir que a

análise fosse realizada de forma homogênea e imparcial. Durante análise

microscópica dos vasos foi utilizada a objetiva de 100x e para cada lâmina foram

capturadas 10 imagens de campos aleatórios que serviram como área

representativa do corte. Para evitar que um mesmo vaso fosse avaliado mais de

100

uma vez ou alguma estrutura deixasse de ser avaliada, cada imagem foi dividida em

6 campos com o auxílio de grade. As análises foram feitas da seguinte maneira:

Análise I- A) presença ou não de expressão da cadeia γ2 na membrana basal dos

vasos. B) se presente, a membrana basal foi classificada como contínua ou

descontínua.

Análise II- percentual de vasos com descontinuidade: grupo 1 com presença de até

80% de vasos com descontinuidade e grupo 2 com mais de 80% de vasos com

descontinuidade.

Análise III- número total de vasos marcados; grupo 1 com presença de até 3 vasos

com imunomarcação, grupo 2 com presença de até 10 vasos e grupo 3 com

presença de mais que 10 vasos.

Análise IV- porcentagem de vasos/lâmina. Nessa marcação foi definida fração de

número de vasos com expressão da cadeia γ2 em relação ao número total de vasos

encontrados; grupo 1 com até 70% de 10 vasos imunomarcados, e grupo 2 com

mais de 70%. Todos os dados foram computados utilizando o programa Microsoft

Office Excel 2007.

Cruzamento dos Dados Clínicos e Microscópicos

Foram estabelecidas associações da integridade da membrana basal dos vasos com

os seguintes aspectos clínicos: gênero, hábito de fumar e idade. Nessa etapa, foram

definidos dois grupos: grupo 1 casos que apresentaram até 60% dos vasos com

descontinuidade e, grupo 2 casos que apresentaram mais de 60% dos vasos.

Análise estatística As análises estatísticas foram realizadas com o software

GraphPad. Foi aplicado o teste exato de Fisher sendo considerados significativos os

dados com p<0,05.

101

RESULTADOS

Dados clínicos

Nas lesões bem diferenciadas, o local de maior acometimento foi o assoalho bucal

(50%) seguido de rebordo alveolar (25%). Em CCE Moderadamente Diferenciado, o

sítio de maior ocorrência foi a língua e associações entre língua e gengiva (50%).

Foi observado maior prevalência em homens (87,5% e 75%) e fumantes (100% e

75%) para CCE Bem e Moderadamente Diferenciados respectivamente. A média de

idade foi de 58,68 anos (Tabela 1).

Microscopia de Luz

A análise microscópica dos vasos marcados para cadeia γ2 mostrou variações. Foi

possível identificar vasos que não apresentavam a marcação (Figura 1, A e F), e

vasos que apresentavam marcação. Nos vasos imunomarcados, 11 casos

evidenciaram membrana basal contínua (Figura 1, D e G).

Associação de Dados

Dos 16 casos avaliados, 15 (93,75%) apresentaram expressão da cadeia γ2 em

vasos. O único caso em que não foi observada marcação ocorreu em CCE Bem

Diferenciado. Em análise comparativa, dos 8 casos de CCE Bem Diferenciado,

87,5% eram homens e desses, 85,5% tiveram expressão. A única mulher

encontrada também apresentou expressão. Todos os casos estavam associados ao

hábito de fumar. Em relação à idade, 75% tinham menos ou até 60 anos (Figura 2,

gráficos A, B e C). Os 8 casos de CCE Moderadamente Diferenciado e com

expressão, 75% eram homens e também fumantes. 50% tinham menos ou até 60

anos e 50% idade superior a 60 anos (Figura 2, gráficos D, E e F).

102

Para os 15 casos que apresentaram marcação nos vasos, 40% pertenceram ao

grupo 1, 40% ao grupo 2 e 20% ao grupo 3 (Figura 2, gráfico G).(Qual análise? Não

ficou MT claro)

Em relação à fração de vasos encontrados com expressão da cadeia γ2, 66,66%

pertenceram ao grupo 2 (Figura 2, gráfico H).

Quanto à integridade da membrana basal dos vasos, dos 15 casos com marcação,

93,33% tiveram aspecto de descontinuidade (Figura 2, gráfico I). As análises

quantitativas resultaram em 42,85% dos casos com até 80% dos vasos com

membrana basal descontínua (Figura 2, gráfico J). Para os 7 casos de CCE Bem

Diferenciados com expressão da cadeia γ2, 85,71% apresentaram vasos com perda

de continuidade. Desses, 66,66% tiveram até 60% de vasos com esse aspecto

(Figura 3, gráfico A).

Já para os 8 casos de CCE Moderadamente Diferenciados com expressão da

cadeia, 100% tiveram 12 vasos com descontinuidade. Ainda, 7 casos foram

classificados no grupo com mais de 60% de vasos com esse achado microscópico

(Figura 3, gráfico B). Em relação às associações entre gênero, hábito de fumar e

idade com integridade da membrana basal em CCE Bem Diferenciado, foi possível

observar que dos 6 casos que tiveram perda de continuidade, 5 foram encontrados

em homens, sendo 60% classificados no grupo 1. A única mulher do grupo

apresentou mais de 60% dos vasos com perda de integridade (Figura 3, gráfico C).

Todos os 6 casos relataram hábito de fumar e desses, 67% pertenceram ao grupo 1

(Figura 3, gráfico D). Em relação à idade, 3 pacientes que tinham menos do que 60

anos foram classificados no grupo 1 (Figura 3, E). Porém, foram significativas as

associações com gênero e idade. Já em vasos de CCE Moderadamente

103

Diferenciado, os achados foram: dos 8 casos, 6 casos acometeram homens, sendo

84% classificados no grupo com mais de 60% de perda de integridade (Figura 3,

gráfico F). Ainda, 6 apresentaram o hábito de fumar e 84% também pertenceu ao

grupo 2 (Figura 3, gráfico G). Por fim, dos 4 casos com idade < 60 anos, todos foram

classificados no grupo 2 (Figura 3, gráfico H). Nessas análises, todos os achados

foram significativos.

DISCUSSÃO

O estudo buscou determinar associações entre o perfil clínico de pacientes

acometidos pelo CCE e a expressão da cadeia γ2 da laminina 332 em estruturas

vasculares. Com aumento do conhecimento sobre aspectos genéticos e proteicos, a

busca por novos biomarcadores passou a ser uma estratégia terapêutica relevante

para melhor compreensão do comportamento do câncer e como opção para futuras

terapias18. Carcinomas são tumores de origem epitelial caracterizados pela invasão

de células malignas no tecido conjuntivo subjacente e posterior migração para

formar metástases em locais distantes. Para que o processo ocorra, são necessárias

alterações e interações entre as células e componentes da MEC, como as

lamininas19, glicoproteína mais abundante na membrana basal sendo componente

estrutural e biologicamente ativo11. Quanto aos achados clínicos, a maioria dos casos

de CCEs foram diagnosticados em homens, com hábito de fumar e na faixa etária

entre a 4ª e 6ª década de vida. Esses dados estão em concordância com estudos

sobre o câncer de boca, que revelaram acometimento maior em pacientes

tabagistas. A literatura destaca que tanto o tabaco quanto o álcool são fatores que

aumentam o risco para o desenvolvimento do CCE20,21. Em relação ao sítio, o

assoalho bucal foi o mais acometido, semelhante ao estudo de Ribeiro et al. (2009)

104

22. Esse achado difere da maioria dos relatos da literatura, que apresentam a língua

como local mais frequente23,24. Ainda sobre o sítio, observamos variação entre os dois

tipos de CCE. Para os casos Bem Diferenciados, o local mais frequente foi o

assoalho bucal, já para as lesões moderadamente diferenciadas, o mais comum foi

a associação de dois sítios. Nas lesões de CCE Bem Diferenciado com expressão

da laminina 332, 85,5% eram homens, 100% da amostra apresentou hábito de fumar

e 75% com idade até 60 anos. Já para os casos de CCE Moderadamente

Diferenciado e com expressão da laminina, a amostra compreendeu 75% de

homens fumantes e 50% com idade até 60 anos. A média de idade dos casos foi de

58,68 anos. Estudo feito por Yukiko et al. 25 (1999) em CCE localizados na língua

demonstrou que 63% eram indivíduos do gênero masculino com média de idade de

58,9 anos. Já Souza et al. 26 (2007) avaliaram 30 casos de CCEs orais e encontraram

74,2% das lesões em homens e média de idade de 60 anos. Em relação ao perfil da

membrana basal nas estruturas vasculares, 87,5% dos casos de CCE Bem

Diferenciado apresentaram imunoexpressão, e nesses, houve perda de continuidade

em 85,7%. Já nos casos de CCE Moderadamente Diferenciado, 100% da amostra

apresentou a marcação e perda de continuidade.

Dentro desse contexto, estudos tem demonstrado a preferência de expressão da

cadeia γ2 da laminina 332 em lesões com comportamento invasor27,28. Ressalta-se

ainda que, CCE Moderadamente Diferenciado apresenta comportamento biológico

mais agressivo e invasivo quando comparado ao CCE Bem Diferenciado4. Como já

descrito na literatura, a interação de células endoteliais e adesão a componentes da

MEC são fatores considerados críticos para a manutenção da integridade vascular.

Algumas atividades, como proliferação e migração fazem parte da angiogênese,

processo essencial para diferentes condições, sejam elas fisiológicas, como a

105

cicatrização de feridas, ou patológicas, como o crescimento tumoral29. A modificação

do sistema vascular nos tecidos afetados pelo câncer está fortemente envolvida na

progressão dessa doença. O aumento da angiogênese pode resultar em

metástases21. A invasão metastática de tumores ocorre em várias etapas e para isso

necessita que suas células destaquem-se do tumor primário, invadam e migrem nos

tecidos adjacentes, infiltrando e sobrevivendo na circulação. Para invadir os vasos,

as células tumorais precisam inicialmente aderir à laminina presente na membrana

basal15 para em seguida secretar as próprias enzimas proteolíticas ou até mesmo

induzir as células hospedeiras a elaborar proteases que clivam componentes das

membranas basais epiteliais e vasculares6. Para os casos de CCE Bem

Diferenciados com expressão da cadeia γ2, 6 apresentaram vasos com perda de

continuidade. Desses, 66,66% tiveram até 60% de vasos com esse aspecto. Já nas

lesões de CCE Moderadamente Diferenciados com expressão da cadeia, todos

tiveram vasos com perda de continuidade. Esses achados novamente reforçam que

quanto mais agressiva a lesão, mais modificado estará o microambiente tumoral.

Quando realizadas as associações entre aspecto da membrana basal vascular e

dados clínicos, observamos que em CCE Bem Diferenciado com membrana basal

descontínua, a maioria foi diagnosticada em homens e 60% deles tiveram grande

parte dos vasos com alterações. Já em CCE Moderadamente Diferenciado, 84% dos

homens acometidos apresentaram alterações nos vasos. Ainda, foi diagnosticada

maior porcentagem de descontinuidade na membrana basal em pacientes fumantes.

Por fim, todos os casos de pacientes com idade menor do que 60 anos,

apresentaram a maioria dos vasos com aspecto de descontinuidade. Vários

parâmetros clínicopatológicos vêm sendo analisados e implicados no prognóstico,

recorrência e sobrevivência de pacientes com lesões de CCE. Trabalho realizado

106

por Grimm30 (2012) avaliou de forma retrospectiva 429 pacientes diagnosticados com

CCE. Suas análises demonstraram que tumores com tamanho aumentado,

comprometimento de linfonodos, invasão microvascular e envolvimento linfático

tiveram mau prognóstico. Ainda, quando realizada análise multivariada, a invasão

microvascular foi detectada como um dos fatores prognósticos independentes no

estabelecimento da sobrevida dos pacientes. Esses achados demonstram que

modificações no microambiente tumoral devem ser avaliados e considerados para

melhor definição do prognóstico e sobrevida de pacientes acometidos pelo CCE.

Importante também é a associação dos dados clínicos com os aspectos

microscópicos, uma vez que vários fatores participam do desenvolvimento e

progressão do câncer.

CONCLUSÃO

Os resultados sugerem que a expressão da cadeia γ2 da laminina 332 em estruturas

vasculares sofre perda de sua integridade durante a progressão da doença e parece

estar associada ao comportamento mais agressivo do CCE. Ainda, fatores clínicos,

como idade e hábito de fumar, apresentaram associação com as variações

estruturais da membrana basal vascular.

107

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111

Tabela 1.Dados clínicos dos CCEs.

Bem Diferenciado

N (%)

Moderadamente Diferenciado

N (%)

Gênero

Masculino 7 (87,5%) 6 (75%)

Feminino 1 (12,5%) 2 (25%)

Tabagismo

Sim 8 (100%) 6 (75%)

Não 0 2 (25%)

Idade

< 60 anos 6 (75%) 4 (50%)

> 60 anos 2 (25%) 4 (50%)

Localização lesão

Assoalho bucal 4 (50%) 2 (25%)

Língua, Gengiva e Língua 1 (12,5%) 4 (50%)

Rebordo alveolar 2 (25%) 1 (12,5%)

Palato (Duro e Mole) 1 (12,5%) 1 (12,5%)

112

Figura 1. Expressão cadeia γ2 da laminina 332 em vasos de CCEs. (A) Presença de vasos

da microcirculação (seta) em CCE Bem Diferenciado processado pela técnica de HE o que

não permitiu detecção da membrana basal vascular. (B) Controle negativo em vaso (*) de

CCE Bem Diferenciado. (C) Vaso sem imunoexpressão em CCE Bem Diferenciado (*). (D)

Vaso de CCE Bem Diferenciado com imunomarcação e membrana basal contínua (*). (E)

CCE Bem Diferenciado e expressão da cadeia e aspecto de descontinuidade. (F) Vaso com

ausência de marcação em CCE Moderadamente Diferenciado (seta) e (G) vaso com

presença de marcação e membrana basal contínua (seta). (H) CCE Moderadamente

Diferenciado com vaso apresentando perda de continuidade (*). Imuno-histoquímica. Barra

de escala = 20 μm.

114

Figura 2. Gráficos da associação entre aspectos clínicos e expressão da cadeia γ2 em

CCEs. A-C análises em lesões de CCE Bem Diferenciado, sendo associação com gênero

(A, p<0,0001), hábito de fumar (B, p=1,0) e idade (C, p<0,0001). D-F análises em lesões de

CCE Moderadamente Diferenciado, sendo associação com gênero (D, p=1), hábito de

furmar (E, p=1) e idade (D, p=1). Análise do número de lesões com vasos marcados (G) e

porcentagem de vasos marcados encontrados (H). Análise do aspecto da membrana basal

nos casos com expressão da cadeia γ2 (I) porcentagem de vasos descontinuidade da

membrana basal (J). Teste exato de Fischer.

115

Figura 3. Gráficos da análise da membrana basal. Porcentagem de vasos que

apresentaram maior ou menor perda de continuidade da membrana basal em CCE Bem

Diferenciado (A) e CCE Moderadamente Diferenciado (B). Associação entre aspectos

clínicopatológicos com a descontinuidade da membrana basal, sendo C-E em CCE Bem

Diferenciado com gênero (C, p<0,0001), hábito de fumar (D, p=1) e idade (E, p<0,0001). As

mesmas análises para CCE Moderadamente Diferenciado com gênero (F, p<0,0001), hábito

de fumar (G, p<0,0001) e idade (H, p<0,0001). Teste Exato de Fisher.

116

ANEXO I

NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA ORAL DISEASE

5. MANUSCRIPT FORMAT AND STRUCTURE

5.1. Page Charge

Articles exceeding 6 published pages, including title page, abstract, references,

table/figure legends and tables and figures, are subject to a charge of GBP70 per

additional page. As a guide, one published page amounts approximately to 850

words, or two to four small tables/figures. Additional supplementary material

(including text and figures), which does not fit within the page limits, can be published

online only as supporting information.

5.2. Format

Language: Authors should write their manuscripts in British English using an easily

readable style. Authors whose native language is not English should have a native

English speaker read and correct their manuscript. Spelling and phraseology should

conform to standard British usage and should be consistent throughout the paper. A

list of independent suppliers of editing services can be found at

http://authorservices.wiley.com/bauthor/english_language.asp. All services are paid

for and arranged by the author, and use of one of these services does not guarantee

acceptance or preference for publication.

Presentation: Authors should pay special attention to the presentation of their

findings so that they may be communicated clearly. The background and hypotheses

underlying the study as well as its main conclusions should be clearly explained.

Titles and abstracts especially should be written in language that will be readily

intelligible to any scientist.

Technical jargon: should be avoided as much as possible and clearly explained

where its use is unavoidable.

http://authorservices.wiley.com/bauthor/english_language.asp

117

Abbreviations: Oral Diseases adheres to the conventions outlined in Units, Symbols

and Abbreviations: A Guide for Medical and Scientific Editors and Authors. Non-

standard abbreviations must be used three or more times and written out completely

in the text when first used.

5.3. Structure: All papers submitted to Oral Diseases should include:

Title Page

Structured Abstract (reviews need not include a structured abstract)

Main text

References

(Figures)

(Figure Legends)

(Tables)

Title Page: should be part of the manuscript uploaded for review and include:

A title of no more than 100 characters including spaces

A running title of no more than 50 characters

3-6 keywords

Complete names and institutions for each author

Corresponding author's name, address, email address and fax number

Date of submission (and revision/resubmission)

Abstract: is limited to 200 words in length and should contain no abbreviations. The

abstract should be included in the manuscript document uploaded for review as well

as separately where specified in the submission process. The abstract should convey

the essential purpose and message of the paper in an abbreviated form set out

under:

Objective(s),

Subject(s) (or Materials) and Methods,

Results,

Conclusions(s).

118

The Main Text of Original Research Articles should be organised as follows

Introduction: should be focused, outlining the historical or logical origins of the study

and not summarize the results; exhaustive literature reviews are inappropriate. It

should close with the explicit statement of the specific aims of the investigation.

Materials and Methods must contain sufficient detail such that, in combination with

the references cited, all clinical trials and experiments reported can be fully

reproduced. As a condition of publication, authors are required to make materials and

methods used freely available to academic researchers for their own use. This

includes antibodies and the constructs used to make transgenic animals, although

not the animals themselves. Other supporting data sets must be made available on

the publication date from the authors directly.

(i) Clinical trials: As noted above, these should be reported using the CONSORT

guidelines available at www.consort-statement.org. A CONSORT checklist should

also be included in the submission material. Clinical trials can be registered in any of

the following free, public clinical trials registries: www.clinicaltrials.gov,

http://clinicaltrials.ifpma.org/clinicaltrials/, http://isrctn.org/.As stated in an editorial

published in Oral Diseases (12:217-218), 2006), all manuscripts reporting results

from a clinical trial must indicate that the trial was fully registered at a readily

accessible website. The clinical trial registration number and name of the trial register

will be published with the paper.

(ii)Experimental subjects: As noted above, experimentation involving human

subjects will only be published if such research has been conducted in full

accordance with ethical principles, including the World Medical Association

Declaration of Helsinki (version 2002) and the additional requirements, if any, of the

country where the research has been carried out. Manuscripts must be accompanied

by a statement that the experiments were undertaken with the understanding and

written consent of each subject and according to the above mentioned principles. A

statement regarding the fact that the study has been independently reviewed and

approved by an ethical board should also be included.Editors reserve the right to

reject papers if there are doubts as to whether appropriate procedures have been

http://www.consort-statement.org/

http://www.consort-statement.org/mod_product/uploads/CONSORT%202001%20checklist.doc

http://www.clinicaltrials.gov/

http://clinicaltrials.ifpma.org/clinicaltrials/

http://isrctn.org/

http://www.wma.net/en/20activities/10ethics/10helsinki/index.html

119

used. When experimental animals are used the methods section must clearly

indicate that adequate measures were taken to minimize pain or discomfort.

Experiments should be carried out in accordance with the Guidelines laid down by

the National Institute of Health (NIH) in the USA regarding the care and use of

animals for experimental procedures or with the European Communities Council

Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and in accordance with local laws and

regulations.

(iii) Suppliers: Suppliers of materials should be named and their location (town,

state/county, country) included.

Results: should present the observations with minimal reference to earlier literature

or to possible interpretations.

Discussion: may usually start with a brief summary of the major findings, but

repetition of parts of the abstract or of the results sections should be avoided. The

section should end with a brief conclusion and a comment on the potential clinical

relevance of the findings. Statements and interpretation of the data should be

appropriately supported by original references.

Acknowledgements: Should be used to provide information on sources of funding

for the research, any potential conflict of interest and to acknowledge contributors to

the study that do not qualify as authors. All sources of institutional, private and

corporate financial support for the work within the manuscript must be fully

acknowledged, and any potential grant holders should be listed. Acknowledgements

should be brief and should not include thanks to anonymous referees and editors.

Where people are acknowledged, a covering letter demonstrating their consent must

be provided.

5.4. References

The journal policy is to encourage references to original papers, not to literature

reviews. References in the text should quote the last name(s) of the author(s) and

the year of publication (Brown and Smith, 2005). Three or more authors should

always be referred to as, for example, Jones et al., 2005.

120

We recommend the use of a tool such as Reference Manager for reference

management and formatting. Reference Manager reference styles can be searched

for here: www.refman.com/support/rmstyles.asp

A list of the references must be given at the end of the paper and should follow the

recommendations in Units, Symbols and Abbreviations: A Guide for Medical and

Scientific Editors and Authors, (1975), p.36. London: The Royal Society of Medicine.

a) The arrangement of the references should be alphabetical by first author's

surname.

b) The order of the items in each reference should be:

(i) for journal references:

last name(s) of all the author(s) and their initials, year, title of paper, title of journal,

volume number, first and last page numbers.

(ii) for book references:

Name(s) of author(s), year, chapter title, title of book, edition, volume, town of

publication, publisher, page number(s).

c) Authors' names should be arranged thus:

Smith AB and Jones DE

d) The year of publication should be surrounded by parentheses: (2005).

e) The title of the paper should be included without quotation marks.

f) The journal title should be abbreviated, should be italicised, and followed by the

volume number in bold type and page numbers separated by a dash.

Examples:

http://www.refman.com/

http://www.refman.com/support/rmstyles.asp

121

Gupta PC, Murti PR, Bhonsle RB, Mehta FS, Pindborg JJ (1995). Effect of cessation

of tobacco use on the incidence of oral mucosal lesions in a 10-year study of 12212

users. Oral Diseases 1: 54-58.

Baum BJ, Voutetakis A, Wang J (2004). Salivary glands: novel target sites for gene

therapeutics. Trends Mol Med. 10: 585-590.

Shear M and Speight PM (2007). Cysts of the Oral and Maxillofacial Regions. Wiley-

Blackwell: Oxford.

Scully C (2004). The oral cavity and lips. In: Burns DA, Breathnach SM, Cox N,

Griffiths C, eds., Rooks Textbook of Dermatology. 7th Edition. Blackwell Science:

Oxford, pp.66.1.-66.121.

5.5. Tables, Figures and Figure Legends

Figures: All figures and artwork must be provided in electronic format. Please save

vector graphics (e.g. line artwork) in Encapsulated Postscript Format (EPS) and

bitmap files (e.g. half-tones) or clinical or in vitro pictures in Tagged Image Format

(TIFF).

Detailed information on our digital illustration standards can be found at

http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp.

Check your electronic artwork before submitting it:

http://authorservices.wiley.com/bauthor/eachecklist.asp.

Unnecessary figures and parts (panels) of figures should be avoided: data presented

in small tables or histograms, for instance, can generally be stated briefly in the text

instead. Figures should not contain more than one panel unless the parts are

logically connected.

Figures divided into parts should be labelled with a lower-case, boldface, roman

letter, a, b, and so on, in the same type size as used elsewhere in the figure.

Lettering in figures should be in lower-case type, with the first letter capitalized. Units

should have a single space between the number and unit, and follow SI

http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp

http://authorservices.wiley.com/bauthor/eachecklist.asp

122

nomenclature common to a particular field. Unusual units and abbreviations should

be spelled out in full or defined in the legend. Scale bars should be used rather than

magnification factors, with the length of the bar defined in the legend rather than on

the bar itself. In general visual cues (on the figures themselves) are preferred to

verbal explanations in the legend (e.g. broken line, open red triangles etc).

123

ANEXO II

NORMAS REVISTA BRASIELEIRA DE PESQUISA EM SAÚDE

APRESENTAÇÃO DO MANUSCRITO

Os manuscritos deverão ser digitados em Word for Windows e enviados exclusiva-

mente pelo Sistema On-line de Submissão de Manuscritos

(http://periodicos.ufes.br/RBPS/index), acompanhados dos documentos digitaliza-

dos: Declaração de Conflito de Interesse, Carta de Aprovação do Comitê de Decla-

ração de Responsabilidade e Transferência de Direitos Autorais.

As páginas do manuscrito devem estar numeradas e configuradas para papel A4,

com margens superior, inferior, esquerda e direita de 3cm, fonte Arial tamanho 12 e

espaço duplo, com alinhamento do texto justificado. O número de páginas está limi-

tado a 25 e deve obedecer à configuração acima, incluindo Página de Rosto, Resu-

mo, Abstract, Introdução, Métodos, Resultados, Discussão, Conclusão, Referências,

além de ilustrações (figuras, tabelas, quadros, gráficos, fotos etc.).

Página de rosto

Deverá ser enviada uma página de rosto contendo somente os seguintes itens: título

do manuscrito em português e inglês e nome completo dos autores, informação so-

bre a afiliação dos autores (principal instituição de origem, cidade, estado e país),

nome e endereço completo para correspondência, local em que o estudo foi realiza-

do. Indicação do responsável pela troca de correspondência, fornecendo endereço

completo (CEP, telefone e E-mail) para contato.

Devem ser incluídas na folha de rosto as fontes de financiamento para realização da

pesquisa, tais como: bolsas de estudos e auxílios financeiros.

Resumo e Abstract

124

Os resumos devem possibilitar ao leitor avaliar o interesse do manuscrito e compor

uma série coerente de frases, e não a simples enumeração de títulos, fornecendo,

portanto, uma visão clara e concisa do conteúdo do manuscrito, suas conclusões

significativas e a contribuição para a saúde coletiva. Deve conter, no máximo, 250

palavras e ser apresentado em português e inglês, incluindo palavras de estrutura

(Introdução, Objetivo, Métodos, Resultados, Conclusão) e palavras-chave.

Palavras-chave e Keywords

São palavras ou expressões que identificam o conteúdo do manuscrito, fornecidas

pelo próprio autor. Deverão ser seguidos os cabeçalhos de assuntos

dos Descritores em Ciências da Saúde (DeCS), em português e inglês, indicados

pela Biblioteca Virtual em Saúde (http://regional.bvsalud.org/php/index.php).

Estrutura do texto

A estrutura do texto deverá estar de acordo com a natureza do manuscrito: Editorial,

Artigos Originais, Revisões Sistemáticas, Relato de Casos.

ILUSTRAÇÕES

As ilustrações e tabelas do manuscrito submetido à apreciação estão limitadas ao

número máximo de cinco. No entanto, no caso de aceite do manuscrito, serão solici-

tados aos autores os arquivos originais em que as ilustrações e tabelas foram cons-

truídas a fim de permitir a formatação gráfica.

De acordo com a ABNT, NBR 14724, de 17 de março de 2011, “Qualquer que seja o

tipo de ilustração [ou tabela], sua identificação aparece na parte superior, precedida

da palavra designativa (desenho, esquema, fluxograma, fotografia, gráfico, mapa,

organograma, planta, quadro, retrato, figura, imagem, entre outros), seguida de seu

número de ordem de ocorrência no texto, em algarismos arábicos, travessão e do

125

respectivo título”. Os desenhos enviados poderão ser melhorados ou redesenhados

pela produção da Revista, a critério do Corpo Editorial. Imagens fotográficas deverão

ser apresentadas na forma de slides e em duplicata. Na falta destes, as fotografias

em papel devem ser acompanhadas dos negativos que lhe deram origem. Imagens

digitais poderão ser aceitas desde que sua captação primária tenha ocorrido, pelo

menos, em tamanho (10cm x 15cm) e com resolução adequada (300 dpi). Muitas

máquinas fotográficas digitais, comerciais ou semiprofissionais, não alcançam os pa-

râmetros citados, portanto não se prestam a produzir imagens com qualidade profis-

sional para reprodução. Desenhos e esquemas deverão ser limitados ao mínimo,

feitos, preferencialmente, em Corel Draw, devendo ser fornecidos em formato digital

junto com o arquivo do manuscrito e apresentados em folhas separadas. Se houver

figuras extraídas de outros trabalhos previamente publicados, os autores devem

providenciar permissão, por escrito, para a reprodução. Essa autorização deve a-

companhar o manuscrito submetido à apreciação para publicação. Todas as ilustra-

ções e tabelas, sem exceção, devem ser citadas no corpo do texto e ser apresenta-

das em páginas separadas.

Agradecimentos

É opcional aos autores. Devem ser breves, diretos e dirigidos apenas a pessoas ou

instituições que contribuíram substancialmente para a elaboração do manuscrito.

Deverão estar dispostos no manuscrito antes das referências.

REFERÊNCIAS

As referências estão limitadas a um número máximo de 30 (exceto para revisões sis-

temáticas) e devem ser apresentadas na ordem em que aparecem no texto, nume-

radas e normatizadas de acordo com o Estilo Vancouver. Os exemplos devem estar

conforme os Requisitos Uniformes para Manuscritos Apresentados a Periódicos Bi-

omédicos (http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html). A exatidão das

referências é de responsabilidade dos autores. Referências a documentos não inde-

126

xados na literatura científica mundial, em geral de divulgação circunscrita a uma ins-

tituição ou a um evento (teses, relatórios de pesquisa, comunicações em eventos,

dentre outros) e informações extraídas de documentos eletrônicos, não mantidas

permanentemente em sites, se relevantes, devem figurar no rodapé das páginas do

texto onde foram citadas.

Citação das referências no texto

Seguir o sistema numérico de citação, no qual somente os números índices das re-

ferências, na forma sobrescrita, são indicados no texto. Não devem ser citados os

nomes dos autores e o ano de publicação. Somente é permitida a citação de nome

de autores (seguido de número índice e ano de publicação do manuscrito) se estri-

tamente necessário. Exemplos de citação de referências no texto:

● Números aleatórios

“O processamento é negligenciado pela maioria dos profissionais,chegando alguns

autores a afirmar que cerca de 90% das falhas em radiografias acontecem na câma-

ra escura” 2,8,10.

● Números aleatórios e sequenciais

“Desde que observações clínicas comprovaram que lesões de mancha branca são

reversíveis, a remineralização passou a ser um importante mecanismo na prevenção

e redução clínica das cáries em esmalte”1-4.

● Citação de nome de autor

“Cassatly et al.2 reportam um caso de osteomielite em uma paciente submetida à a-

picectomia com laser de Nd:YAG, que levou à necrose de parte da maxila, pela difu-

são do calor gerado ao tecido ósseo adjacente ao ápice radicular.”

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE...

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