UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS ... · (frutose-bifosfato aldolase,...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

FERNANDA NASCIMENTO RODRIGUES

ESTABELECIMENTO DE CULTIVO IN VITRO E ESTUDO PROTEÔMICO DE

CALOS CAULINARES E FOLIARES DE Artocarpus incisa L.

FORTALEZA – CE

2016




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientador: Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira.

Coorientadora: Profa. Dra. Cristina Paiva da Silveira Carvalho.

FORTALEZA

2016




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientador: Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira.

Coorientadora: Profa. Dra. Cristina Paiva da Silveira Carvalho.

Aprovada em: 23/03/2016.

A Deus.

À minha família e aos meus amigos.

AGRADECIMENTOS

Acima de tudo, agradeço a Deus, por todas as bênçãos concedidas em

minha vida e por me permitir chegar até aqui.

Aos meus pais, Manoel e Rosenir, e à minha irmã Renata, por serem

minha base, meus maiores incentivadores, e os principais responsáveis por tudo o

que sou e que tenho hoje.

Ao meu namorado, Rodrigo, por estar ao meu lado ao longo desses

anos, por todo o apoio e compreensão nos momentos bons e ruins.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Renato Moreira, pelo acolhimento nessa

nova fase, por todos os ensinamentos e conselhos durante esse percurso, tanto na

área científica quanto na vida. Tenho grande admiração, e espero um dia poder

transmitir tudo o que me ensinaste com o mesmo amor e empolgação que

demonstra para os seus alunos.

À minha coorientadora, Profa. Dra. Cristina Paiva, pela dedicação

incondicional aos seus alunos, por ter abraçado junto comigo o desafio do

desenvolvimento desse projeto, pela amizade e apoio demonstrados dentro e fora

do laboratório, sou eternamente grata.

À Profa. Dra. Maria Izabel Gallão, pela ajuda na realização e no

entendimento dos experimentos histológicos, e por gentilmente ter aceitado

participar da banca.

Ao Dr. Eridan Orlando Pereira, pelo aceite em também compor a banca,

sou muito grata.

Aos amigos do Grupo de Pesquisa de Produtos Naturais Aplicados à

Saúde, muito obrigada por toda a ajuda, ensinamentos e paciência na execução dos

experimentos. Àqueles que sempre estiveram dispostos a me ajudar em todas as

etapas do processo, Antonio Neto, Cícero, Fernanda, Felipe, Hyldecia, Kueirislene,

Marina, Melissa, Nydy, Rogênio, Ronielly, Rosueti, Profa Cristina, vocês tornaram

esse caminho mais divertido, e nossa amizade seguirá para além das fronteiras do

laboratório.

Aos amigos do Laboratório de Biotecnologia Vegetal, por toda a

colaboração e apoio nessa caminhada. Gostaria de agradecer, em especial, à Isabel

e à Rachel, por todo o ensinamento quando ingressei no laboratório, por dividirem

comigo as angústias, e pela amizade que sempre nos leva a encarar as situações

difíceis com descontração.

Aos membros do Laboratório de Biologia Celular Vegetal, em especial à

Aryelli, Eudson, Gleicy e João Mateus, por não hesitarem em me ajudar nos

experimentos histológicos, muito obrigada por tudo.

A todos os meus amigos, vocês contribuíram imensamente com esse

trabalho, mesmo nos momentos que não estavam relacionados a ele, pois vocês me

dão forças e me motivam a continuar seguindo os meus sonhos sempre. Agradeço

especialmente ao meu amigo Dalton, por me ajudar no cuidado do material vegetal,

e pela amizade demonstrada desde a graduação.

Às instituições, UFC e Unifor, pela estrutura para a realização desse

trabalho.

Às agências de fomento, CAPES, CNPq, FUNCAP e FINEP, pelo apoio

financeiro.

A todos aqueles que contribuíram, de alguma forma, para a realização

desse trabalho, muito obrigada!

“A persistência é o menor caminho do

êxito”. (Charles Chaplin)

RESUMO

A espécie Artocarpus incisa, pertencente à família Moraceae, é uma planta de porte

arbóreo com várias aplicações na medicina popular. Por ser uma espécie lenhosa,

várias dificuldades são relatadas para sua propagação, como a demora no seu

desenvolvimento e a baixa taxa de germinação. A cultura in vitro de tecidos vegetais,

em particular a cultura de calos, pode servir como uma ferramenta para contornar

essas dificuldades e facilitar a obtenção dos compostos de interesse. O presente

trabalho teve como intuito estabelecer as melhores condições de calogênese, bem

como realizar a análise histológica e o estudo proteômico de calos de A. incisa. Para

a indução dos calos, utilizou-se explantes advindos de folha e de caule, os quais

foram adicionados à formulação nutritiva Woody Plant Medium (WPM), e aplicados

em tratamentos contendo PVP, carvão ativado, e diferentes reguladores de

crescimento (2,4-D, BAP, ANA e CIN). Os resultados mostraram que o cultivo de

explantes foliares e caulinares em meio com carvão ativado 0,1%, suplementado

com 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP foi o melhor tratamento de indução de calos,

com um percentual de produção de 88%. A quantificação de proteínas através do

Protein UV do NanoVue detectou 15,97 µg de proteína/µL de extrato de caule; 20,07

µg de proteína/µL de extrato de folha; 0,75 µg de proteína/µL de extrato de calos

caulinares; e 16,85 µg de proteína/µL de extrato de calos foliares. Os tecidos

originais apresentaram maior concentração de proteínas do que os calos

produzidos, o que pode ser explicado pela diferenciação do tecido. A análise

histológica indicou que as células de calos se mostraram homogêneas e viáveis,

com parede celular fina, e com grande quantidade de polissacarídeos em grânulos.

O estudo proteômico, através de espectrometria de massas, levou à identificação de

peptídeos que apresentam relação com proteínas vegetais já relatadas. Detectou-se

proteínas relacionadas com a defesa (KM+, quitinase, catalase), metabolismo

(frutose-bifosfato aldolase, glutamato-carboxipeptidase) e sinalização celular

(calmodulina) nos calos, independente da origem destes. O trabalho foi pioneiro no

estudo proteômico de calos de A. incisa, e é um passo inicial na compreensão da

bioquímica e fisiologia da espécie em estudo.

Palavras-chave: Artocarpus incisa. Cultura de tecidos. Proteômica.

ABSTRACT

The species Artocarpus incisa, belonging to the Moraceae family, is a tree-sized

plant with multiple applications in folk medicine. As a woody species, several

difficulties are reported to its spread, such as the delay in its development and low

germination rate. In vitro culture of plant tissue, in particular callus culture, can serve

as a tool to overcome these difficulties and to facilitate obtaining the compounds of

interest. This work was meant to provide the best conditions of callus formation as

well as perform histological analysis and proteomic study of A. incisa calluses. For

induction of callus, explants were used arising from leaf and shoot, which have been

added to the nutritional formulation Woody Plant Medium (WPM), and applied in

treatments containing PVP, activated charcoal, and different growth regulators (2,4-

D, BAP, NAA and KIN). The results showed that the cultivation of shoot and leaf

explants in medium with 0.1% activated charcoal, supplemented with 4.5 uM of 2,4-D

and 4.4 uM BAP treatment was the best callus induction with an 88% percentage

production. Quantification of proteins by Protein UV from NanoVue detected 15.97 ug

protein / uL shoot extract; 20.07 ug protein / uL leaf extract; 0.75 ug protein / uL of

shoot callus extract; and 16.85 ug protein / uL of leaf callus extract. The original

tissues showed higher protein concentration than those in produced calluses, which

can be explained by the differentiation of tissue. Histological analysis indicated that

the cells of calluses were homogeneous and viable, with thin cell wall, and large

amount of polysaccharide granules. The proteomic study by mass spectrometry led

to the identification of peptides that have relation to previously reported plant

proteins. We were able to detect proteins related to the defense (KM+, chitinase,

catalase), metabolism (fructose-bisphosphate aldolase, glutamate carboxypeptidase)

and cell signaling (calmodulin) in calluses, regardless of the origin of these. The work

pioneered the proteomic study of A. incisa calluses, and is an initial step in

understanding the biochemistry and physiology of the species under study.

Keywords: Artocarpus incisa. Tissue Culture. Proteomics.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Crescimento dos calos foliares de A. incisa L. em tratamentos

contendo apenas um regulador de crescimento (2,4-D ou BAP), ou ambos no

meio nutritivo..........................................................................................................

Figura 2 - Quantidade de calos formados a partir de explantes foliares de A.

incisa L. após quatro semanas, submetidos a tratamentos contendo somente

um tipo de fitohormônio (2,4-D ou BAP), ou ambos no meio nutritivo...................

Figura 3 – Calos de A. incisa, cultivados em meio WPM + 4,5 µM de 2,4-D e

4,4 µM de BAP.......................................................................................................

Figura 4 - Cortes longitudinais de calos foliares e caulinares de A. incisa após

dois e quatro meses de subcultivo, respectivamente............................................

Figura 5 - SDS-PAGE de amostra de calo caulinar de A. incisa após seis

meses de subcultivo, e frutalina purificada (controle)............................................

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Lista de nutrientes, vitaminas e compostos orgânicos utilizados para

formulação do meio nutritivo Woody Plant Medium (WPM)..................................

Quadro 2 - Tratamentos utilizados para indução de calos a partir de explantes

foliares de A. incisa L.............................................................................................

Quadro 3 - Concentração de Proteínas Totais Solúveis determinada nos

extratos de folha, caule, calos foliares e calos caulinares de A. incisa, através

do NanoVue (GE Healthcare)................................................................................

Quadro 4 - Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-

QUAD-TOF a partir do extrato total de caule de A. incisa.....................................


QUAD-TOF a partir do extrato total de calos caulinares de A. incisa após seis

meses de subcultivo..............................................................................................


QUAD-TOF a partir do extrato total de folhas de A. incisa....................................


QUAD-TOF a partir do extrato total de calos foliares de A. incisa após seis

meses de subcultivo..............................................................................................

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético

ANA Ácido 1-naftalenoacético

AT Azul de Toluidina

BAP 6-benzilaminopurina

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CIN Cinetina

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

FINEP Financiadora de Estudos e Projetos

MS Murashige & Skoog

PAS Periodic Acid Schiff

PVP Polivinilpirrolidona

UFC Universidade Federal do Ceará

WPM Woody Plant Medium

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................

1.1. Artocarpus spp.................................................................................................

1.2. Cultura in vitro de tecidos vegetais..................................................................

1.2.1. Cultura in vitro de Artocarpus..........................................................................

1.3. Proteômica.......................................................................................................

1.4. Lectinas Vegetais............................................................................................

1.4.1. Lectinas de Artocarpus....................................................................................

2. JUSTIFICATIVA.....................................................................................................

3. OBJETIVOS...........................................................................................................

3.1. Objetivo Geral......................................................................................................

3.2. Objetivos Específicos..........................................................................................

4. MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................

4.1. Coleta do Material Vegetal, Desinfestação e Germinação das Sementes de

Artocarpus incisa L.....................................................................................................

4.2. Estabelecimento das condições de cultivo in vitro..........................................

4.3. Determinação de Proteínas Totais Solúveis....................................................

4.4. Análise histológica por microscopia de luz......................................................

4.4.1. Coloração com Azul de Toluidina (AT)............................................................

4.4.2. Coloração pela reação de PAS (Periodic Acid Schiff).....................................

4.5. Digestão tríptica das amostras para aplicação em Espectrometria de

Massas.......................................................................................................................

4.6. Espectrometria de Massas (LC/MS)................................................................

4.7. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS (SDS-PAGE)...

4.8. Atividade Hemaglutinante.................................................................................

4.9. Análise estatística............................................................................................

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................

5.1. Obtenção dos calos.........................................................................................

5.2. Subcultivo dos calos........................................................................................

5.3. Análise histológica dos calos caulinares e foliares..........................................

5.4. Determinação de Proteínas Totais Solúveis.....................................................

5.5. Análise Proteômica.........................................................................................

5.5.1. Caule................................................................................................................

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5.5.2. Calos caulinares..............................................................................................

5.5.3. Folha................................................................................................................

5.5.4. Calos foliares...................................................................................................

5.6. SDS-PAGE e Atividade Hemaglutinante.........................................................

5.7. Considerações Finais.......................................................................................

6. CONCLUSÃO..................................................................................................

REFERÊNCIAS..........................................................................................................

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Artocarpus spp.

O gênero Artocarpus, que integra a família Moraceae, engloba um grupo de

plantas de porte arbóreo, possuindo 50 espécies. É um gênero nativo do sul e

sudeste da Ásia, Nova Guiné e sul do Pacífico. Os representantes principais são as

espécies Artocarpus integrifolia e Artocarpus incisa, popularmente conhecidas como

jaca e fruta-pão, respectivamente. Elas estão localizadas em regiões de clima

tropical úmido e são usualmente encontradas em locais com altitude abaixo de 1000

m. Os frutos possuem pico de produção nos meses de junho e dezembro. Todas as

partes da planta possuem látex de coloração branca. As sementes são grandes,

apresentando de 1 a 2 cm de espessura e são desprovidas de endosperma. A

germinação é do tipo hipógea, e as árvores podem alcançar até 20 metros de altura

e viver cerca de 80 anos (JAGTAP; BAPAT, 2010). No Brasil, as espécies que são

cultivadas se encontram na região amazônica e na costa tropical, do Pará ao Rio de

Janeiro (MADRUGA et al., 2014).

Muitos membros do gênero Artocarpus têm sido usados na medicina popular.

A principal espécie utilizada é a jaca, e cada uma de suas partes apresenta um uso

no tratamento de doenças. As raízes são utilizadas para o tratamento de diarreia e

febre; as folhas estimulam a produção de leite em mulheres e em animais, e também

são úteis no tratamento de sífilis e como vermífugos. O látex, adicionado ao vinagre,

promove a cura de abscessos, picada de cobra e inchaços glandulares, enquanto

que as folhas e a casca do caule são usadas para tratar anemia, asma, dermatite,

diarreia, tosse, atuando como expectorante (BALBACH; BOARIM, 1992). As frutas,

sementes e o tronco apresentam compostos químicos com propriedades

afrodisíacas (FERRAO, 1999).

A maior parte dos efeitos farmacológicos pode ser explicada pelos compostos

fenólicos, incluindo flavonoides, estilbenoides, arilbenzofuronas, presentes em todas

as partes da planta, e das lectinas presentes nas sementes (JAGTAP; BAPAT,

2010).

A espécie Artocarpus incisa L. é uma árvore de raízes profundas e caule

de casca cinzenta e lisa, com 80 a 90 cm de diâmetro, folhas grandes de 30 a 90 cm

de comprimento por 30 a 45 cm de largura, coriáceas, curvadas na base, recortadas

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em 5 a 7 lobos, raramente inteiras, de cor verde escura. Suas flores são desprovidas

de pétalas e muito pequenas (RAGONE, 1997). Seus frutos são diferenciados em

duas variedades de fruta-pão. A variedade apyrena não possui sementes ou se as

possui são atrofiadas (variedade não seminífera) e é conhecida popularmente como

“fruta-pão de massa”. A variedade seminífera, conhecida como “fruta-pão de

caroço”, possui frutos que pesam até 2 kg, com epiderme formando protuberâncias

hexagonais, massa ou polpa em pequena quantidade, envolvendo em média 80

sementes (QUIJANO; ARANGO, 1979; MOREIRA et al., 1998).

Os primeiros estudos com a variedade seminífera de A. incisa L.

culminaram no isolamento de uma lectina (MOREIRA; OLIVEIRA, 1983), que foi

posteriormente denominada frutalina (MOREIRA et al., 1998).

1.2. Cultura in vitro de tecidos vegetais

A cultura in vitro de tecidos vegetais pode ser definida como uma cultura

asséptica de células, tecidos, órgãos, ou plantas inteiras sob condições nutricionais

e ambientais controladas (THORPE, 2007).

O primeiro trabalho relatado que empregou a técnica de cultura de tecidos

data do começo do século XX, quando Gottlieb Haberlandt, em 1902, desenvolveu

experimentos para manter as células do mesofilo em cultura, baseando-se no

postulado que estabelecia a “totipotencialidade das células vegetais”. A partir desse

momento, vários trabalhos têm sido relatados utilizando técnicas de cultura in vitro

de tecidos vegetais, ou micropropagação, sendo úteis em programas de

melhoramento vegetal, conservação da biodiversidade genética e na produção

biofarmacêutica, dentre outras aplicações (GARCÍA-GONZÁLES et al, 2010).

As técnicas de cultura de tecidos vegetais se baseiam em dois processos

de morfogênese, conhecidos como organogênese e embriogênese somática. A

organogênese é a formação de órgãos vegetais a partir de um tecido diferenciado, a

fim de formar uma planta inteira. Isso significa que apenas um órgão aéreo ou raiz é

emitido e a partir daí uma nova planta é regenerada. Além disso, a organogênese

pode ser direta, se o broto for obtido diretamente do tecido vegetal, denominado

explante, ou indireto, se o processo ocorrer com uma formação prévia de calos a

partir do explante inicial (VIJAYA; GIRI, 2003).

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A embriogênese somática é a produção de embriões a partir de células

somáticas para obter uma planta inteira. Diferentemente da organogênese, esse

processo consiste na obtenção de estruturas aéreas e raízes a partir de um embrião

somático. O processo também pode ser direto ou indireto, se o material para a

indução dos embriões for o explante inicial ou calos previamente induzidos

(AMMIRATO, 1983).

A palavra calo é originária do latim callum, que significa rígido, e na

biologia vegetal se refere ao crescimento massivo de células e acumulação de

calose (um polissacarídeo) associada a uma injúria. Atualmente, essa palavra tem

sido usada de forma mais ampla, e massas de células desorganizadas são

coletivamente chamadas de calos (IKEUCHI et al, 2013). Para a indução de calos,

pedaços de cotilédones, hipocótilo, caule, folha ou embrião são usualmente

utilizados. Uma excelente fonte de explante para a indução de calos é o tecido de

plântulas de sementes assepticamente germinadas ou inflorescências maduras

(SMITH, 1992).

Muitas vezes existe a formação de calos que não possuem estruturas

diferenciadas. Estes calos podem apresentar estruturas compactas e/ou friáveis.

Calos friáveis são formados por divisão celular rápida, e compostos por células

indiferenciadas, altamente vacuoladas e frouxamente ligadas, enquanto que calos

compactos são formados por células com pequeno espaço intercelular, não

favorecendo a divisão celular rápida (IKEUCHI et al., 2013).

A indução de calos pode ocorrer usando explantes de qualquer parte da

planta, sob condições assépticas. Com o estímulo de substâncias endógenas de

crescimento adicionadas ao meio, o metabolismo celular é modificado de quiescente

para um metabolismo ativo. É comum o balanceamento de auxinas e citocininas no

processo de diferenciação e acúmulo de metabólitos em tecidos vegetais, e quando

usados conjuntamente, estimulam a divisão celular e controlam a morfogênese

(GASPAR et al., 1996; IKEUCHI et al., 2013).

Uma das dificuldades da cultura de tecidos é o ajuste de um protocolo

com um meio de cultivo que supra as necessidades da planta, tornando-a propícia à

multiplicação em larga escala. Cada espécie vegetal requer um meio de cultura

específico para ter um desenvolvimento considerado normal, por isso, torna-se

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fundamental o estudo da composição em sais minerais, suplementos orgânicos e o

balanceamento e tipo de reguladores vegetais para a indução dos calos, ou a

diferenciação da parte aérea ou raiz das plantas (SANTOS el al, 2005).

O meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) formulado para o cultivo in

vitro de células de Nicotiana tabacum, apresentou-se eficiente para a maioria das

espécies vegetais herbáceas. No entanto, as espécies lenhosas frequentemente não

são responsivas à composição original. No cultivo dessas espécies, modificações

como a redução do teor de macronutrientes, apresentam melhor desempenho. Outra

possibilidade é a substituição do meio MS basal pelo meio WPM (Woody Plant

Medium) (MCCOWN; LLOYD, 1981), de composição mais diluída em compostos

nitrogenados e originalmente formulado para espécies lenhosas (MELO et al., 1999).

De acordo com Pasqual (2001) citado por Soares et al. (2009), o meio WPM possui

25% das concentrações de íons nitrato e amônia quando comparado ao meio MS,

no entanto, apresenta mais potássio e um elevado nível de íons sulfato.

Auxinas, ácido abscísico, citocininas, etileno e giberelinas são conhecidos

como sendo as cinco principais classes de fitohormônios naturais. Auxinas,

citocininas e a interação auxina-citocinina são consideradas como as mais

importantes para a regulação do crescimento e para o desenvolvimento organizado

na cultura de tecidos vegetais, sendo as duas classes de hormônios mais requeridas

(GASPAR et al, 1996). Uma razão intermediária entre as concentrações de auxina e

citocinina promove a indução de calos, enquanto uma alta relação entre

auxina/citocinina ou citocinina/auxina induz a regeneração de raiz ou parte aérea,

respectivamente (SKOOG; MILLER, 1957, apud IKEUCHI, 2013).

O grande objetivo da micropropagação é a produção de plantas

geneticamente idênticas, fisiologicamente uniformes, com desenvolvimento normal e

livre de patógenos, que podem ser aclimatadas por um período de tempo reduzido e

com baixo custo (RATHORE et al, 2004).

1.2.1. Cultura in vitro de Artocarpus

A micropropagação de plantas de porte arbóreo é possível, contudo, com

algumas exceções, os métodos in vitro não são ainda práticos e viáveis

comercialmente para a maioria das espécies arbóreas. A micropropagação de todos

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os tipos de árvores perenes é fortemente afetada pela idade ontogenética (HACKET,

1985). A clonagem in vitro e in vivo de plantas adultas, ou maduras, é afetada

negativamente por características que acompanham a maturação, como a redução

da taxa de crescimento, redução ou perda total da capacidade de enraizamento, e a

ocorrência de um fenômeno indesejável chamado de plagiotropia, o qual consiste no

crescimento horizontal de algumas partes da planta (PIERIK, 1990).

A maturação é o principal problema que impede a utilização da cultura de

tecidos em larga escala entre espécies de plantas arbóreas. Além disso, a

micropropagação de plantas lenhosas que sofrem estresses abióticos no ambiente

natural se torna ainda mais difícil, devido à sazonalidade, e aos fatores ambientais

que influenciam no comportamento e desenvolvimento dos explantes na cultura in

vitro (RATHORE et al, 2004).

O primeiro estudo utilizando a técnica de cultura de tecidos para uma

espécie do gênero Artocarpus foi realizado por Rao et al. (1981), no qual utilizou-se

explantes de A. heterophyllus provenientes de caule, cotilédones e hipocótilos para

regeneração. Contudo, a metodologia utilizada não foi muito eficiente.

Subsequentemente, outros trabalhos conseguiram realizar a propagação in vitro

desta espécie de forma bem-sucedida, utilizando explantes advindos de brotos

(RAHMAN, 1988; RAHMAN; BLAKE 1988a, 1988b), explantes nodais (ROY et al.

1990) e gemas apicais da árvore adulta (AMIN; JAISWAL, 1993).

O uso de outras espécies do genêro Artocarpus para micropropagação é

pouco relatado, com um estudo com A. lakoocha (JOSHEE et al, 2002) e dois com

A. altilis (ROUSE-MILLER; DUNCAN, 2000; MURCH et al, 2008). Todos esses

trabalhos visaram à regeneração através de organogênese direta, com apenas um

relato do uso desse gênero para a produção de calos (MANEECHAI et al, 2012).

Apesar da importância de se ter um protocolo eficiente para

micropropagação das espécies desse gênero, em função dos diversos usos

terapêuticos decorrentes dos metabólitos produzidos por elas, ainda é um desafio se

obter uma metodologia que seja eficiente para o estabelecimento e sobrevivência de

explantes maduros de espécies de Artocarpus, assim como para outras espécies

lenhosas (ROUSE-MILLER; DUNCAN, 2000).

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Os principais problemas que se encontram com o cultivo in vitro de

espécies lenhosas são a contaminação, escurecimento, necrose do tecido, resposta

inconsistente dos explantes e baixa eficiência de propagação. Dessa forma, os

protocolos de micropropagação são geralmente específicos para as espécies, ou até

mesmo para cada cultivar específica (MURCH et al, 2008).

Contornados esses problemas, a micropropagação de plantas arbóreas

permite a produção, em grande quantidade, de espécies importantes do ponto de

vista econômico e ecológico, facilitando a sua conservação e distribuição pelo

mundo (MURCH et al, 2008).

1.3. Proteômica

A proteômica é uma poderosa ferramenta que envolve a identificação e

caracterização de proteínas (WANG et al, 2010). Além de realizar a identificação

sistemática das proteínas celulares, a proteômica também é útil para elucidar

detalhes moleculares que ocorrem durante processos complexos, como as etapas

envolvidas no desenvolvimento vegetal (YIN et al, 2007; YIN; LAN; ZHU, 2008).

Mudanças no perfil proteico decorrentes de alterações ambientais, do

desenvolvimento da planta, abundância de proteínas, modificações pós-traducionais

e interações entre proteínas podem ser investigadas (VALLEDOR; JORRÍN, 2011).

As técnicas de proteômica têm sido utilizadas para investigar os sistemas

de cultura de tecidos de muitas espécies, incluindo Citrus sinensis (PAN et al. 2009),

Cyclamen persicum (BIAN et al. 2010), Manihot esculenta (LI et al. 2010), Vanilla

planifolia (TAN et al, 2013) e Glycine max (MIERNYK; JETT; JOHNSTON, 2016).

A metodologia mais comum de análise proteômica é a combinação da

eletroforese bidimensional para separar e visualizar proteínas e a espectrometria de

massas para identificação proteica. As proteínas desempenham um papel duplo nos

processos genéticos, servindo tanto como um produto gênico, como carreador

funcional, e o RNAm é o intermediário desse processo. Todavia, devido aos

mecanismos de modificações pós-traducionais, à meia-vida de proteínas específicas

ou do RNAm, e à localização intracelular e associação molecular das proteínas

resultantes da expressão gênica, a relação entre o RNAm e os níveis de expressão

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proteica ainda não está claro. Muitos estudos têm sido feitos para correlacionar os

níveis de expressão proteica e o RNAm das mesmas amostras (YIN et al, 2007).

Estudos proteômicos de calos vegetais têm sido realizados para elucidar

os eventos bioquímicos e moleculares decorrentes da interação auxina/citocinina na

desdiferenciação dos tecidos in vitro (YIN; LAN; ZHU, 2008), avaliar a resistência a

baixas temperaturas (LEI et al, 2013), e determinar a relação entre a maturação e a

competência da embriogênese somática no crescimento vegetal (HERINGER et al,

2015).

Portanto, a proteômica de calos tem se mostrado uma excelente

abordagem para estudos de bioquímica e fisiologia vegetal, e análises mais

aprofundadas são necessárias para se elucidar o papel das proteínas na iniciação e

diferenciação dos calos, bem como as suas funções no vegetal.

1.4. Lectinas vegetais

As lectinas são uma classe de proteínas que se ligam de maneira

reversível e com alta especificidade a mono e oligossacarídeos, diferindo das

enzimas por não apresentarem atividade catalítica, e de anticorpos por não

necessitarem de estimulação antigênica (SHARON; LIS, 1989; GABIUS et al., 2002).

Peumans e Van Damme (1995) apresentaram uma definição que

considerava que o único pré-requisito para uma proteína ser classificada como

lectina é que esta apresentasse, pelo menos, um domínio não catalítico capaz de

ligar-se reversível e especificamente a carboidratos. Além dessa definição, Peumans

e Van Damme propuseram uma classificação para as lectinas vegetais, levando-se

em consideração sua estrutura proteica. Elas foram divididas em merolectinas,

hololectinas e quimerolectinas.

As merolectinas são proteínas que apresentam exclusivamente um único

sítio ligante a carboidratos. As hololectinas são proteínas que também apresentam

apenas um domínio de ligação a carboidratos, porém contém dois ou mais sítios de

ligação (os quais podem ser iguais ou homólogos) para essas moléculas, estando

aptas a aglutinar células e/ou precipitar glicoconjugados. As quimerolectinas são

proteínas que possuem, além do domínio ligante a carboidratos, outro domínio com

22

atividade catalítica ou atividade biológica que age independentemente do domínio

ligante de açúcar (PEUMANS; VAN DAMME,1995).

Pouco tempo depois, Van Damme et al. (1998) propuseram uma

modificação nesta classificação, que foi ampliada com a inclusão de uma nova

classe, as superlectinas. As superlectinas são um grupo especial de

quimerolectinas, sendo proteínas de fusão, as quais são estruturalmente diferentes e

reconhecem carboidratos distintos.

Quatro anos depois, foi sugerido por Monteiro-Moreira (2002) mais uma

classe de lectinas, denominadas multilectinas, definidas como proteínas constituídas

exclusivamente de domínios ligantes a carboidratos, que são idênticos ou

homólogos, mas que reconhecem açúcares estruturalmente não relacionados. Ou

seja, são lectinas de especificidade múltipla.

Na natureza, as lectinas estão distribuídas em uma grande variedade de

organismos, como procariotos, algas, fungos, corais, plantas, invertebrados e

vertebrados (AKKOUH et al., 2015). Nas plantas, as lectinas são

predominantemente abundantes nas sementes (CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002).

Nas sementes de leguminosas, por exemplo, as lectinas chegam a constituir 10% do

total das proteínas (ETZLER, 1986).

A localização das lectinas nas células vegetais pode ser em corpos

proteicos (ou vacúolos de estocagem), que são pequenos vacúolos que sofreram

diferenciação para serem capazes de estocar proteínas durante a maturação da

semente e hidrolisá-las durante períodos de crescimento (CHRISPEELS, 1984).

Contudo, já foram identificadas lectinas que estão presentes no citoplasma, núcleo

(VAN DAMME et al, 2004) além de também ocorrerem no espaço intercelular

(ETZLER et al., 1986).

Apesar de diversas lectinas de plantas terem sido estudadas em grandes

detalhes, o papel fisiológico destas proteínas ainda é pouco conhecido (VAN

DAMME et al., 2004). Algumas evidências têm sustentado a ideia de que, quando as

plantas são estimuladas por fatores bióticos e abióticos específicos, elas respondem

por meio da expressão de lectinas nucleares ou citoplasmáticas. A localização e a

regulação da expressão destas lectinas indicam que as mesmas estão envolvidas

23

em interações proteína-carboidrato endógenas específicas (VAN DAMME et al.,

2004).

1.4.1. Lectinas de Artocarpus

Moreira e Ainouz (1977) isolaram a primeira lectina do gênero Artocarpus,

proveniente de sementes de A. integrifolia L. (jaqueira). Ela ficou posteriormente

conhecida como Jacalina, sendo a lectina mais estudada deste gênero e de toda a

família botânica.

Estudos subsequentes encontraram uma segunda lectina nas sementes

de A. integrifolia, a qual foi denominada inicialmente de Artocarpina, porém esse

termo já era utilizado para designar a lectina de A. lakoocha (CHOWDHURY;

AHMED; CHATTERJEE, 1991). Inicialmente, foi proposto que essa lectina era

específica a D-manose e D-glucose, mas não a D-galactose, e foi denominada KM+

(SANTOS-DE-OLIVEIRA et al, 1994). Contudo, investigações posteriores revelaram

que essa é uma lectina poliespecífica, que reage com vários tipos de

monossacarídeos (BARRE et al., 2004). Estudos relatam algumas atividades

biológicas relacionadas à KM+, como a ativação e migração de neutrófilos pela

ligação ao receptor CXCR2 (PEREIRA-DA-SILVA et al, 2006; TOLEDO et al, 2009),

e a degranulação de mastócitos pela ligação à imunoglobulina E (IgE) (MORENO et

al, 2003). Devido à sua atividade poliespecífica, a KM+ é considerada um

interessante agente imunomodulador (CECÍLIO et al, 2016).

A lectina encontrada em sementes de Artocarpus incisa L. (frutalina) foi

isolada e caracterizada por MOREIRA et al. (1998), por cromatografia de afinidade

em coluna de galactomanana de Adenanthera pavonina. A frutalina é uma

glicoproteína α-D-galactose ligante, que possui 2,1% de carboidratos em sua

estrutura e apresenta elevados teores de aminoácidos ácidos, hidroxilados e

hidrofóbicos, e baixo teor de aminoácidos sulfurados. Além da frutalina, foram

encontradas proteínas do tipo manose ligante (frutapina) e quitina ligante

(frutaquina) em A. incisa L., presentes em diferentes quantidades na semente.

Algumas das suas propriedades biológicas foram bem estabelecidas (MONTEIRO-

MOREIRA, 2002).

24

A estrutura primária da frutalina é composta pela cadeia alfa com 133

resíduos de aminoácidos e pela cadeia beta com 20 resíduos. A estrutura

secundária desta lectina é formada predominantemente por folhas beta

antiparalelas. A frutalina é uma proteína oligomérica, encontrando-se como

tetrâmero apenas em pH alcalino, com massa molecular aparente de 60 kDa

(MOREIRA et al., 1998; CAMPANA et al., 2002).

A frutalina apresenta duas bandas proteicas com massas moleculares

aparentes de 12 e 15 kDa quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida

sob condições desnaturantes (PAGE-SDS), na presença e ausência de β-

mercaptoetanol, evidenciando assim que esta lectina não apresenta pontes

dissulfeto (MOREIRA et al., 1998).

A partir do alinhamento das sequências de aminoácidos da frutalina com

outras lectinas isoladas de moráceas, observou-se que a frutalina apresenta em

torno de 40% de identidade com a KM+, lectina manose-ligante de Artocarpus

integrifolia, 76% com a lectina de Maclura pomifera e 98% com a Jacalina

(MONTEIRO-MOREIRA, 2002).

A determinação da estrutura tridimensional da frutalina, obtida através de

cristalografia de raio-X por Monteiro-Moreira (2015) mostra a grande similaridade

dessa lectina com a jacalina, lectina galactose ligante de Artocarpus integrifolia.

Esse fato corrobora com a hipótese de Monteiro-Moreira (2002) que, como a

estrutura primária das duas lectinas são bastante similares, esperava-se que a

estrutura tridimensional de ambas também estivesse bem próximas.

Devido à sua especificidade anomérica por α-D-galactose, diversas

atividades biológicas da frutalina foram descritas. Pesquisas mostraram o uso da

frutalina no estudo de lesões benignas e malignas de tireoide humana (MILHOME,

2003), na indução da migração de neutrófilos na cavidade pleural de ratos, na

indução da quimiotaxia e reorganização do citoesqueleto de actina em neutrófilos

humanos (BRANDO-LIMA et al, 2005), e na ativação mitogênica de linfócitos

humanos (BRANDO-LIMA et al, 2006). Além disso, estudos demonstraram efeito

citotóxico irreversível da frutalina em células HeLa advindas de câncer cervical

(OLIVEIRA et al, 2011), e efeito gastroprotetor (ABDON et al, 2014).

25

Com esses estudos, a frutalina mostrou ser uma ótima ferramenta para

investigações relacionadas ao câncer, apresentando potencial como biomarcador e

como um produto terapêutico, e possui a vantagem de advir de fonte vegetal.

26

2. JUSTIFICATIVA

O presente trabalho mostra o estabelecimento das condições de cultivo in

vitro para a formação de calos de Artocarpus incisa, oriundos de explantes foliares e

caulinares, e a análise histológica desses tecidos de calos.

O interesse em se estabelecer as condições de cultivo in vitro dessa

espécie partiu da concepção de que a cultura de tecidos, por sua própria natureza

clonal, pode fornecer material geneticamente homogêneo, essencial para a

obtenção de metabólitos de importância econômica. Além disso, a cultura de calos

pode assegurar a produção de substâncias ativas em um curto período de tempo e

sem a influência de fatores externos (POUREBAD et al, 2015).

A cultura de calos apresenta as seguintes vantagens: ela pode ser

conduzida em ambientes controlados, reduzindo a influência de fatores ambientais;

o tempo necessário para o amadurecimento dos tecidos de calos é mínimo; a

purificação de certos metabólitos a partir de calos é mais simples, uma vez que

esses não possuem quantidades elevadas de pigmentos; a produção de calos é

mais facilmente ajustada para suprimir a demanda de substâncias químicas do

mercado, inclusive compostos de valor medicinal (GARCÍA-GONZÁLES et al, 2010).

Além disso, os calos de diversas espécies vêm sendo utilizados para

estudos histológicos, com o objetivo de caracterizar o processo e as vias de

regeneração de plantas in vitro (ALVES; XAVIER; OTONI, 2004; DIBAX et al., 2010).

Entre as principais proteínas de importância farmacológica presentes em

sementes de Artocapus incisa L., pode-se listar as lectinas α-D-galactose-ligante

(frutalina), manose ligante (frutapina) e quitina ligante (frutaquina), presentes em

diferentes quantidades na semente (MONTEIRO-MOREIRA, 2002). Algumas destas

lectinas de A. incisa (com exceção da frutalina) estão presentes na semente em

concentrações extremamente baixas. A obtenção das mesmas em quantidades

apreciáveis, seja por cultura em forma de calos, seja em suspensões celulares, é

essencial para um estudo mais detalhado de seus efeitos.

Pesquisas já foram desenvolvidas avaliando a síntese de lectinas em

calos vegetais, onde foi demonstrada a presença de lectinas que também são

27

encontradas em sementes (GUPTA; SRIVASTAVA, 1998; SILVA et al, 2003; SILVA

et al 2005).

Além disso, realizou-se o primeiro estudo protêomico de calos de A.

incisa, comparando-se as proteínas detectadas nos calos com as dos explantes

originais. Os resultados poderão contribuir no entendimento da fisiologia dos calos e

na compreensão dos mecanismos moleculares que levam à formação de calos nas

diferentes partes da planta.

28

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Esse trabalho teve como objetivo estabelecer as condições de cultivo in

vitro para induzir a proliferação de calos em explantes caulinares e foliares de

Artocarpus incisa L., e analisar as proteínas expressas através da Espectrometria de

Massas.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Definir um protocolo eficiente de multiplicação in vitro de calos de A.

incisa L., oriundos de explantes de folha e caule;

Quantificar as proteínas totais nos calos e nos explantes de origem;

Realizar a análise histológica dos tecidos de calos caulinares e foliares

através de microscopia de luz;

Verificar as proteínas expressas pelos calos caulinares e foliares e pelos

explantes originais através de espectrometria de massas;

Comparar o perfil de expressão proteica dos calos com os tecidos de

origem.

29

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Coleta do Material Vegetal, Desinfestação e Germinação das

Sementes de Artocarpus incisa L.

Frutos e sementes de Artocarpus incisa L. foram coletados na região

serrana do município de Maranguape, Ceará, no período de novembro de 2014 e

fevereiro de 2015.

Os frutos de A. incisa coletados foram desinfestados de acordo com

Joshee et al (2002). Inicialmente foram lavados em água corrente por 1 hora, em

seguida mergulhados em detergente comercial diluído e enxaguados três vezes com

água destilada autoclavada. Na sequência, os frutos foram imersos em solução

alcoólica na concentração 70% e deixados secar ao ar livre para posterior remoção

das sementes.

As sementes de A. incisa foram lavadas em água corrente para retirada

dos resíduos do fruto. Em seguida, foram submersas em solução alcoólica na

concentração 70% por 1 minuto. Posteriormente, foram imersas em solução de

hipoclorito de sódio com 1% de cloro ativo por 15 minutos. Por fim, as sementes

foram lavadas três vezes em água destilada estéril. Todo o procedimento de

desinfestação das sementes foi realizado em câmara de fluxo laminar.

Após a etapa de desinfestação das sementes, foi feita a semeadura em

copos plásticos contendo areia e vermiculita autoclavadas, na proporção de 1:1. Os

recipientes com as sementes foram mantidos em câmara de germinação tipo B.O.D.

com fotoperíodo de 16 horas e temperatura 25 ± 2 ºC.

Após dois meses, as plantas foram transferidas para vasos, que também

continham areia e vermiculita, e foram mantidas na casa de vegetação do

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do

Ceará.

Para a desinfestação dos explantes, folhas de A. incisa foram lavadas em

detergente diluído por 5 minutos, e em seguida foram imersas por 20 minutos em

uma solução de hipoclorito de sódio (1% de cloro ativo), sendo então submetidas a

três lavagens em água destilada estéril. O mesmo procedimento foi adotado com os

30

explantes caulinares, sendo que o tempo de exposição à solução de hipoclorito de

sódio foi de 30 minutos.

4.2. Estabelecimento das condições de cultivo in vitro

As plantas de A. incisa mantidas em casa de vegetação foram usadas

como fonte de explantes para produção dos calos. Os fragmentos de folhas e de

caule foram cultivados em tubos de ensaio e/ou placas de Petri contendo o meio de

cultura WPM (Woody Plant Medium), uma formulação nutritiva mais adequada para

plantas lenhosas, acrescido de 2% de sacarose e 0,8% de ágar (Quadro 1). O pH foi

ajustado para 5,6 (MCCOWN; LLOYD, 1981).

Quadro 1 - Lista de nutrientes, vitaminas e compostos orgânicos utilizados para formulação do meio

nutritivo Woody Plant Medium (WPM).

COMPONENTES CONCENTRAÇÃO (mg/L)

MACRONUTRIENTES

NH4NO3 400

Ca(NO3)2 . 4H2O 556

K2SO4 990

MgSO4 . 7H2O 370

KH2SO4 170

CaCl2 . 2H2O 96

MICRONUTRIENTES

H3BO3 6,2

MnSO4 . H2O 22,3

ZnSO4 . 7H2O 8,6

Na2MoO4 . 2H2O 0,25

CuSO4 . 5H2O 0,25

FeSO4 . 7H2O 27,8

Na2 . EDTA 37,3

VITAMINAS E COMPOSTOS ORGÂNICOS

Tiamina HCl 1,6

Ácido nicotínico 0,5

Mio-inositol 100 Fonte: McCown; Lloyd, 1981

31

Para determinar as melhores condições de crescimento dos calos, testes

preliminares foram executados. Em todos os testes, utilizou-se a formulação nutritiva

WPM, da forma descrita anteriormente. Para o primeiro teste, os explantes foliares

foram inoculados em meio de cultura que foi suplementado com 36 µM da citocinina

sintética cinetina (CIN), de acordo com metodologia de Amin e Jaiswal (1993).

Para o segundo teste, utilizou-se explantes foliares distribuídos em dois

tratamentos. O primeiro foi suplementado com a auxina sintética ácido 1-

naftalenoacético (ANA) na concentração 3 µM, e com a citocinina cinetina na

concentração 4,6 µM, seguindo-se metodologia de Suri e Ramawat (1995). O

segundo tratamento foi suplementado com os mesmos reguladores de crescimento

anteriores, e foi acrescido de polivinilpirrolidona (PVP) na concentração 100 mM. O

PVP tem sido bastante empregado por sua ação antioxidante. Os compostos

fenólicos são adsorvidos pelo PVP por meio de ligações de hidrogênio, o que

previne a oxidação e polimerização (PASQUAL et al. 1997).

Para o terceiro teste, com o intuito de reduzir a oxidação dos explantes

foliares e caulinares, fez-se um pré-tratamento suplementando o meio nutritivo com

0,05% de carvão ativado, que tem a função de adsorver os compostos fenólicos

liberados pela planta (VAN WINKLE; JOHNSON; PULLMAN, 2003). Após quatro

semanas, os explantes oriundos do pré-tratamento foram transferidos para novos

tubos de ensaio contendo a formulação WPM, acrescida de 3 µM de ANA e 4,6 µM

de CIN.

Após os testes preliminares, realizou-se um experimento apenas com

explantes foliares, baseado na metodologia empregada por Maneechai et al (2012).

Inicialmente, fez-se um pré-tratamento suplementando o meio nutritivo com 0,1% de

carvão ativado.

Após quatro semanas, os explantes oriundos do pré-tratamento foram

separados em cinco tratamentos distintos. O primeiro continha a auxina sintética

ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) na concentração de 4,5 µM, o segundo

continha a citocinina sintética 6-benzilaminopurina (BAP) na concentração de 4,4

µM, o terceiro possuía 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP, o quarto apresentava 4,5

µM de 2,4-D e 8,8 µM de BAP, e o quinto não apresentava reguladores de

crescimento, atuando como grupo controle. O experimento foi conduzido em

delineamento inteiramente casualizado, havendo seis repetições para cada

32

tratamento, sendo considerada como unidade experimental uma placa de Petri com

cinco explantes.

Todos os meios de cultura passaram por prévia esterilização, utilizando

autoclavagem a 121 ºC por 15 minutos. O inóculo dos explantes foi realizado em

câmara de fluxo laminar. Os explantes foram cultivados na sala de cultura do

Laboratório de Biotecnologia Vegetal da UFC, com fotoperíodo de 16h e temperatura

25 ± 2 ºC. Após 4 semanas, fez-se uma avaliação quanto à ocorrência de formação

dos calos, calculando-se o percentual de indução de acordo com a seguinte fórmula:

%indução de calos =número de explantes que formaram calos

número total de explantes inoculados 𝑥 100

Após o estabelecimento das condições de cultivo in vitro, fez-se a

produção em grande quantidade dos calos oriundos dos explantes de folha e caule

de A. incisa, utilizando-se a melhor metodologia e seguindo todos os passos

mencionados anteriormente. Os subcultivos foram feitos a cada quatro semanas,

durante seis meses, até se obter uma grande quantidade de calos para análises

posteriores.

4.3. Determinação de Proteínas Totais Solúveis

Após a obtenção dos calos a partir de explantes foliares e caulinares de

A. incisa, estes foram macerados, separadamente, com o uso de almofariz e pistilo e

com adição de nitrogênio líquido. A farinha obtida foi dissolvida em solução salina

(NaCl 0,15 M) na proporção 1:3. Amostras de tecido de folha e caule também

passaram pelo mesmo procedimento. Todas as amostras foram centrifugadas a

3000 x g por cinco minutos. Em seguida, fez-se a determinação do teor de proteínas

totais solúveis com base no método “Protein UV”, no NanoVue Plus

Spectrophotometer (GE Healthcare). Esse método realiza a quantificação das

proteínas através da leitura de absorbância nos comprimentos de onda 280 nm e

260 nm, e fornece uma média dos valores obtidos. Essa técnica permite reduzir o

erro na leitura de absorbância a 280 nm que possa ser ocasionado pela presença de

ácidos nucleicos (GE Healthcare). Todas as análises foram realizadas em duplicata.

33

4.4. Análise histológica por microscopia de luz

A fim de se obter informações sobre as características histológicas dos

calos caulinares e foliares de A. incisa, foi realizada uma série de técnicas para o

estudo celular, que vão desde a fixação do material biológico até a montagem das

lâminas para serem visualizadas em microscópio de luz. Este procedimento foi

realizado no Laboratório de Biologia Celular Vegetal do Departamento de Biologia da

UFC. Utilizou-se amostras de calos foliares e caulinares cultivados por dois e quatro

meses, respectivamente, em sala de cultura do laboratório de Biotecnologia Vegetal.

As amostras foram colocadas em contato com aproximadamente 1 mL do

fixador Karnovsky (1965), sem glutaraldeído, em microtubos, e armazenadas a 4 ºC

por pelo menos 48 h. Em seguida, foram lavadas três vezes em tampão fosfato pH

7,2 por 10 minutos, e depois lavadas rapidamente por três vezes em água destilada.

Após a fixação, o material foi submetido a uma desidratação em série etanólica

crescente (50, 60, 70, 80, 90 e 100%) por 1 h em cada concentração, sendo 30 min

a vácuo e, logo após, colocado em contato com a solução de pré-infiltração e

deixado a vácuo por 1 h, para depois ser armazenado a 4 ºC por 24 h. Após esse

período, as amostras foram transferidas para a solução de infiltração contendo

resina líquida, na qual permaneceu por mais 24 h a 4 ºC. Para inclusão na resina, as

amostras foram depositadas de forma a se obter cortes transversais e longitudinais

em suportes de plástico contendo a solução de infiltração e a resina endurecedora

(Historesin Embbeding Kit - Jung) na proporção 15:1. Os suportes foram deixados

em repouso por 24 h e os blocos de resina contendo o material de A. incisa foram

submetidos a cortes de 6 µm em micrótomo CUT 5062 Slee Mainz. Os cortes foram

distendidos em banho-maria a 40 °C e transferidos para lâminas, para então

passarem pelo processo de coloração diferencial (o detalhamento de cada método

de coloração citoquímica está exposto nas seções seguintes). Para a montagem das

lâminas, duas a três gotas de verniz foram dispostas sobre os cortes e cobertos com

lamínula. Após a secagem, as lâminas foram visualizadas em microscópio de luz

OLYMPUS BX 41 acoplado a uma câmera digital (UC30) e a um computador

contendo o software “CELLB”, por onde se fez o registro fotográfico.

34

4.4.1. Coloração com Azul de Toluidina (AT)

Para detecção de radicais aniônicos (CARVALHO; RECCO-PIMENTEL,

2013), as lâminas foram colocadas em contato com o corante Azul de Toluidina

0,025% pH 6,8 por 15 minutos, em seguida lavadas rapidamente com água

destilada, deixadas em repouso para secar e depois montadas.

4.4.2. Coloração pela reação de PAS (Periodic Acid Schiff)

Este teste visa detectar polissacarídeos neutros (CARVALHO; RECCO-

PIMENTEL, 2013). O material contido nas lâminas foi oxidado em ácido periódico

0,5% por 9 minutos, em seguida lavado em água destilada e secado levemente.

Logo após, o material foi colocado em contato com o reagente de Schiff por 12

minutos no escuro e lavado três vezes por 3 minutos em água sulfurosa (HCl 8,3%,

metabissulfito 10%, em água destilada). Após este procedimento, as lâminas foram

deixadas em repouso para secar e em seguida montadas.

4.5. Digestão tríptica das amostras para aplicação em

Espectrometria de Massas

Os extratos de caule, folha, calos caulinares e calos foliares de A. incisa

foram inicialmente centrifugados a 3000 x g por cinco minutos. O sobrenadante foi

transferido para novos tubos de microcentrífuga e armazenado. Em seguida, 50 µL

de cada amostra, na concentração de 1 µg/µL, foram transferidos para tubos de

microcentrífuga. Adicionou-se 10 µL de bicarbonato de amônio 50 mM.

Posteriormente, as amostras foram aquecidas a 80 ºC por 15 minutos. Em seguida,

os tubos foram centrifugados a 3000 x g por cinco minutos. Adicionou-se 2,5 µL de

ditiotreitol (DTT) 100 mM, e as amostras foram agitadas em vortex. Em seguida, os

tubos foram aquecidos a 60 ºC por 30 minutos. Após o aquecimento, as amostras

foram deixadas resfriando a temperatura ambiente, e foram centrifugadas a 3000 x g

por cinco minutos. Posteriormente, adicionou-se 2,5 µL de iodoacetamida (IAA) 300

mM e agitou-se em vortex. As amostras foram mantidas na ausência de luz, em

temperatura ambiente, por 30 minutos. Em seguida, adicionou-se 10 µL da solução

de tripsina (Promega) em bicarbonato de amônio 50 mM, e agitou-se em vortex. As

amostras foram deixadas em estufa a 37 ºC, durante 24 horas, para que a digestão

35

tríptica ocorresse. Os sobrenadantes obtidos foram transferidos para frascos

apropriados (Total Recovery vials, Waters).

4.6. Espectrometria de Massas (LC/MS)

Os peptídeos obtidos após a aplicação dos extratos digeridos de folha,

caule, calos foliares e calos caulinares de A. incisa foram analisados em

espectrômetro de massas SYNAPT HDMS (Waters, Manchester, Reino Unido). A

análise foi realizada por ESI-Q-TOF acoplado a um sistema de cromatografia nano

ACQUITY UPLC, utilizando separação por fase reversa em uma coluna do tipo BEH

C18 com dimesões de 100 mm x 75 μm e tamanho da partícula de 1,7 μm, com um

gradiente de 0 a 85% de acetonitrila, contendo ácido fórmico 0,1%, a um fluxo de

400 nL/ minuto. A coluna foi alimentada com 50 ng de amostra, contendo os

peptídeos. Para todas as medições, o espectrômetro de massas foi operado no

modo 'V', com uma potência de resolução de, pelo menos, 10.000 m/z. Todas as

análises foram realizadas utilizando ionização por electrospray no modo ESI (+)

através da fonte NanoLockSpray. Os espectros de massas obtidos foram

processados usando o software ProteinLynx Global Server v. 2.4 (Waters) e os

arquivos PKL gerados foram consultados no bando de dados NCBI (National Center

for Biotechnology Information) usando a pesquisa do software MASCOT v.2.5.1

(Matrix Science – www.matrixscience.com).

4.7. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS

(SDS-PAGE)

Amostras de calos caulinares de A. incisa e de frutalina purificada foram

utilizadas para a execução da eletroforese. A metodologia utilizada foi adaptada de

Laemmli (1970), para o uso de gel 15%. Para a preparação do gel de separação

com concentração 15%, utilizou-se 1,135 mL de água ultrapura, 3 mL de acrilamida

29%/ bisacrilamida 1%, 1,265 mL de Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8, 50 µL de SDS 10%, 125

µL de PSA 1% e 6 µL de TEMED. Após a sua preparação, o gel foi adicionado entre

as placas do aparato. Depois de polimerizado, adicionou-se o gel de aplicação com

concentração 3%, o qual foi preparado utilizando-se 1,538 mL de água ultrapura,

375 µL de acrilamida 29%/ bisacrilamida 1%, 282 µL de Tris-HCl 1,0 M, pH 6,8, 23

µL de SDS 10%, 125 µL de PSA 1% e 6 µL de TEMED. Em alíquotas de 20 µg de

proteínas das amostras de calos caulinares de A. incisa e de frutalina, adicionou-se

36

15 µL de tampão de amostra (Tris-HCl 0,25 M, Glicerol 10%, SDS 2,5% e azul de

bromofenol 0,001%). As amostras foram fervidas por cinco minutos. Após a

polimerização completa do gel, a cuba de eletroforese foi preenchida com tampão de

corrida (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS 0,1%), e as amostras foram aplicadas

nos poços. A corrida durou aproximadamente quatro horas, com configuração de

200 V e 30 mA. Com o término da corrida, o gel foi mantido em agitação, por 30 min,

em solução corante de proteínas (0,25 g de Coomassie Brilliant Blue R250 em 45

mL de metanol: 45 mL de água: 10 mL ácido acético). Em seguida, o corante foi

retirado e o gel passou por sucessivas lavagens com água destilada e aquecimento

em micro-ondas por 1 minuto por vez, até que fosse possível visualizar as bandas

de forma nítida.

4.8. Atividade Hemaglutinante

Para os ensaios de atividade hemaglutinante foram empregadas amostras

de sangue de coelho coletadas no setor do Núcleo de Biologia Experimental –

NUBEX (Unifor). O sangue foi coletado através da veia marginal da orelha. Em

seguida, as amostras de sangue foram transferidas para um tubo contendo

anticoagulante heparina, na concentração de 1μL/mL de sangue coletado, e lavado

com NaCl 0,15 M por cinco vezes (3.000 x g, 4 ºC, 5 min.). O sobrenadante foi

descartado e o precipitado foi utilizado para preparação de uma suspensão de

hemácias 2%.

Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados por diluições

seriadas em placas segundo o método de Moreira e Perrone (1977). Utilizou-se duas

placas, a primeira para o ensaio com calos de origem caulinar, e a segunda para

calos de origem foliar. Em cada poço foram adicionados 100 μL de solução de NaCl

0,15 M, e 100 μL do extrato de calos apenas no primeiro poço. Após a diluição

seriada, adicionou-se o mesmo volume de suspensão de hemácias 2%. O controle

negativo consistia de volumes iguais de NaCl 0,15 M e solução de hemácias 2%.

Após 30 minutos de incubação a 37 ºC e repouso por mais 30 minutos à temperatura

ambiente, a atividade hemaglutinante foi observada visualmente.

37

4.9. Análise estatística

Os dados obtidos com o experimento de indução de calos caulinares e

foliares de A. incisa foram examinados utilizando-se a análise de variância (ANOVA).

O teste de múltiplas comparações de Tukey foi utilizado para identificar as médias

que diferiram no teste de ANOVA. Valores de p<0,05 foram considerados

estatisticamente diferentes. O programa utilizado foi o GraphPadPrism 6.

38

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Obtenção dos calos

Para o primeiro teste preliminar realizado, no qual utilizou-se explantes

foliares de A. incisa inoculados em tubos contendo a formulação WPM,

suplementada com 36 µM de CIN, seguiu-se a metodologia relatada por Amin e

Jaiswal (1993). Nesse artigo, que teve por objeto de estudo a espécie A.

heterophyllus, foi relatado que o aumento da concentração de citocininas favorecia a

produção de calos, com maior produção na concentração de 36 µM de cinetina. No

presente trabalho utilizou-se 15 tubos de ensaio para a avaliação, e não houve

formação de calos em nenhum deles, além da ocorrência de oxidação dos

explantes.

A oxidação dos explantes no cultivo in vitro é um problema conhecido de

várias plantas lenhosas, sendo relatado em espécies como Cocos nucifera

(coqueiro) (SIQUEIRA; INOUE, 1991), Hancornia speciosa (mangabeira) (LÉDO et

al, 2007) e Dalbergia nigra (jacarandá-da-bahia) (SARTOR et al, 2013). Isso ocorre

como resultado da alta concentração de compostos fenólicos nas espécies

lenhosas, que acabam oxidando e degradando o material vegetal (KERBAUY,

2004). Para amenizar esse processo, pode-se fazer uso de substâncias adsorventes

ou antioxidantes, como PVP, carvão ativado, ácido ascórbico e ácido cítrico

(SIQUEIRA; INOUE, 1991).

No segundo teste, utilizou-se explantes foliares e 15 tubos de ensaio

contendo a formulação WPM suplementada com 3 µM de ANA e 4,6 µM de CIN, e

outros 15 tubos de ensaio contendo a mesma formulação anterior, e acrescido de

100 mM de PVP. O estudo baseou-se na metodologia de Suri e Ramawat (1995),

que obtiveram crescimento de calos com essa formulação para uma espécie

laticífera. O PVP foi adicionado para atuar como um agente adsorvente de

compostos fenólicos. Os resultados mostraram, todavia, que o PVP não só não

conseguiu reduzir a oxidação, como interferiu no crescimento dos calos, pois apenas

20% dos explantes que estavam na formulação que continha o PVP apresentaram

calogênese após quatro semanas. Em contrapartida, 73% dos explantes que se

encontravam em meio nutritivo sem PVP apresentaram formação de calos, apesar

dos explantes se mostrarem oxidados.

39

Os calos formados foram subcultivados em novos tubos com meios

nutritivos contendo a mesma formulação WPM suplementada com 3 µM de ANA e

4,6 µM de CIN, porém após quatro semanas todo o material estava oxidado e

contaminado.

O uso do PVP como agente adsorvente mostrou-se eficaz em trabalhos

com Rubus sp. (amoreira-preta) (AUGUSTO; BIASI, 2002) e Musa spp. (bananeira)

(OLIVEIRA et al, 2011). Contudo, em estudo com coqueiro, o uso de 400 mM de

PVP não conseguiu reduzir o grau de oxidação (SIQUEIRA; INOUE, 1991). O

resultado obtido por Sartor et al (2013), para o jacarandá-da-bahia, também mostrou

que a concentração de 400 mM de PVP não foi capaz de impedir a oxidação, e os

explantes ainda mostraram grau de oxidação maior do que aqueles sem nenhum

tratamento. Logo, os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os dois

citados anteriormente, especialmente pelo fato das espécies estudadas serem

lenhosas, as quais apresentam grande liberação de compostos fenólicos da cultura

in vitro.

No terceiro teste, realizou-se um pré-tratamento contendo a formulação

WPM acrescida de 0,05% de carvão ativado, como uma forma de reduzir a oxidação

dos explantes. Foram empregados 50 explantes foliares e 50 caulinares.

Após quatro semanas, 20% dos explantes foliares e 86% dos explantes

caulinares contaminaram. O material restante apresentou um reduzido grau de

oxidação na região central do explante. Os explantes foliares e caulinares que se

mostraram viáveis foram subcultivados em formulação WPM contendo 3 µM de ANA

e 4,6 µM de CIN.

Após quatro semanas de cultivo, apenas cinco explantes caulinares

apresentaram formação de calos, e todo o restante do material encontrava-se

bastante oxidado.

Nesse ponto, percebe-se que os reguladores de crescimento utilizados

foram capazes de induzir a formação de calos, porém o protocolo ainda não foi

eficiente. A discordância nos resultados ao se comparar com Suri e Ramawat (1995)

pode ser decorrente da grande diferença das espécies em estudo, pois o artigo faz

uso de Calotropis procera, uma planta herbácea, e que não apresentou problemas

40

quanto à oxidação, apesar de ser uma espécie laticífera. O carvão ativado

apresentou pouca eficiência, provavelmente em função da baixa concentração

utilizada, não sendo capaz de adsorver todos os compostos fenólicos presentes no

meio. Pasqual (1990) relata o uso do carvão ativado com sucesso para o

crescimento de embriões de diferentes culturas em uma faixa de 0,2% a 3%. Chapla

et al (2009) descrevem que o crescimento in vitro de Miltonia flavescens Lindl. foi

favorecido com a adição de carvão ativado em concentrações entre 0,1% e 0,2%.

Portanto, um novo teste foi realizado com o uso do carvão ativado em concentração

maior, para confirmar seu efeito no controle da oxidação dos explantes.

A realização dos testes preliminares teve como intuito avaliar as

respostas dos explantes de folha quando submetidos a diferentes tratamentos com

substâncias adsorventes e fitohormônios. Percebeu-se que o uso do carvão ativado

não interferiu na formação de calos, e os hormônios utilizados ainda não forneciam

uma metodologia eficiente. Fez-se uso apenas de explantes foliares nos testes

preliminares devido ao fácil acesso de obtenção desse material. Portanto, após a

realização desses testes, definiu-se um experimento que utilizou carvão ativado

como pré-tratamento, e dois reguladores de crescimento que se mostraram

eficientes para a indução de calos de uma espécie do gênero Artocarpus, de acordo

com Maneechai et al (2012).

Nesse experimento, utilizou-se 40 placas de Petri, com cinco explantes

por placa, contendo a formulação WPM acrescida de 0,1% de carvão ativado. Após

quatro semanas, os explantes foliares mostraram redução no grau de oxidação,

ocorrendo apenas nas bordas, comprovando a eficácia dessa metodologia.

O trabalho desenvolvido com mangabeira (LÉDO et al, 2007) relatou

melhoria no crescimento de plântulas in vitro com a adição de 0,2% de carvão

ativado. Van Winkle et al (2003) também descrevem o benefício da utilização de

carvão ativado no meio de cultivo de conífera. Contudo, como o carvão ativado

também pode adsorver compostos do meio nutritivo, como micronutrientes e

reguladores de crescimento (VAN WINKLE; JOHNSON; PULMANN, 2003), não é

interessante adicioná-lo à formulação para crescimento dos calos, ou pode-se

aumentar a concentração desses compostos, caso seja necessário inclui-lo na

formulação de crescimento.

41

Após quatro semanas com o pré-tratamento, 25% das placas

contaminaram, e o restante do material foi distribuído em cinco tratamentos distintos,

com um tratamento para cada seis placas, os quais estão relatados no Quadro 2:

Quadro 2: Tratamentos utilizados para indução de calos a partir de explantes foliares de A. incisa L.

Tratamento Formulação com

fitohormônios

Quantidade de

explantes

foliares/placa

Quantidade total

de explantes

foliares

A WPM + 4,5 µM de

2,4-D

5 30

B WPM + 4,4 µM de

BAP

5 30

C WPM + 4,5 µM de

2,4-D e 4,4 µM de

BAP

5 30

D WPM + 4,5 µM de

2,4-D e 8,8 µM de

BAP

5 30

E WPM 5 30

A escolha dos reguladores seguiu o protocolo de Maneechai et al (2012).

Após quatro semanas, analisou-se a formação de calos (Figura 1).

Figura 1 – Crescimento dos calos foliares de A. incisa L. em tratamentos contendo apenas um

regulador de crescimento (2,4-D ou BAP), ou ambos no meio nutritivo.

A B C

42

Fonte: Elaborado pela autora.

Legenda: A – WPM + 4,5 µM de 2,4-D; B – WPM + 4,4 µM de BAP; C – WPM + 4,5 µM de 2,4-D + 4,4 µM de BAP; D – WPM + 4,5 µM de 2,4-D + 8,8 µM de BAP; E – WPM (controle). Cada tratamento foi realizado em sextuplicata. Os resultados foram obtidos após quatro semanas de cultivo. As setas indicam os calos formados.

Os tratamentos A e B, que continham apenas um tipo de regulador de

crescimento, não apresentaram formação de calos, bem como o grupo controle (E).

Os tratamentos que continham os dois reguladores de crescimento apresentaram

bom desenvolvimento dos calos, com formação em 73% dos explantes do grupo C e

70% dos explantes do grupo D. A análise estatística mostrou que não houve

diferença significativa nos valores de crescimento de calos entre os grupos C e D

(Figura 2). Osman et al (2016) realizaram experimentos utilizando diferentes

concentrações de 2,4-D e CIN para a formação de calos a partir de endosperma da

espécie lenhosa Barringtonia racemosa L. Eles obtiveram o melhor percentual de

indução de calos (56,7%) utilizando 4,5 µM de 2,4-D e 7 µM de CIN. Isso mostra o

efeito sinergístico dos dois hormônios para o crescimento de calos. Atribui-se ao 2,4-

D a capacidade de estimular a divisão celular e suprimir a organogênese, sendo

capaz de induzir calos mesmo na ausência de citocininas (STABA, 1980). Contudo,

a adição de citocinina é fundamental para se obter calos com características

morfológicas desejáveis, como friabilidade e maior tamanho. A combinação

hormonal entre 2,4-D, benziladenina (BA) e ácido naftalenacético (ANA) mostrou-se

eficaz na indução de calos a partir de folhas de Berberis aristata DC., com uma

produção de 97,5% (BRIJWAL; PANDEY; TAMTA, 2015). Maneechai et al. (2012)

foram os primeiros a relatar a produção de calos de uma espécie de Artocarpus, e

conseguiram obtê-los com o uso de fitohormônios nas concentrações de 4,5 µM de

2,4-D e 4,4 µM de BAP. O presente trabalho corrobora com esses dados, mostrando

a necessidade de se utilizar um balanço correto entre auxinas e citocininas para

promover o desenvolvimento de calos em espécies lenhosas. Como não houve

D E

43

diferença significativa, neste trabalho, em relação ao aumento da concentração de

BAP, escolheu-se utilizar as menores concentrações (4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de

BAP) para realizar a produção dos calos foliares e caulinares em grande quantidade.

Figura 2: Quantidade de calos formados a partir de explantes foliares de A. incisa L. após quatro semanas, submetidos a tratamentos contendo somente um tipo de fitohormônio (2,4-D ou BAP), ou ambos no meio nutritivo.

Fonte: Elaborado pela autora.

*Os dados foram avaliados por análise de variância (ANOVA), aplicando o teste de Tukey, com 0,05% de probabilidade para confirmar a significância do resultado. Letras minúsculas iguais não diferem significativamente.

5.2. Subcultivo dos calos

Inicialmente, inoculou-se explantes foliares em 25 tubos de ensaio

contendo formulação WPM, acrescida de 0,1% de carvão ativado, e explantes

caulinares em outros 25 tubos, contendo a mesma formulação. Após quatro

semanas, os explantes foram transferidos para novos tubos contendo formulação

WPM, acrescida de 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP. Decorridas quatro semanas,

observou-se um percentual de formação de calos de 88%, tanto para os explantes

foliares quanto para os caulinares, mostrando a eficiência do protocolo.

A cada quatro semanas, os calos foram subcultivados em novos meios

nutritivos com mesma formulação, durante seis meses, até que não houvesse a

presença do tecido original. Os calos de origem caulinar foram maiores (2-3 cm) do

44

que aqueles de origem foliar (1-2 cm) (Figura 6). Os calos caulinares também se

mostraram mais friáveis do que os foliares. Ambos apresentaram coloração

esbranquiçada.

Lee e Lee (2013) relataram que a formulação nutritiva e reguladores de

crescimento que utilizaram para produzir calos de Viscum album (visco coreano),

oriundos de explantes de caule e folha, só foram capazes de formar calos nos

explantes caulinares, e com uma taxa de 4,89%.

Warcol et al (2015) descrevem que a melhor formulação para a obtenção

de calos de Cordyline australis, a partir de gemas axilares, produziu calos a uma

taxa de 70,5%. Portanto, o protocolo utilizado nesse trabalho pode ser considerado

excelente para a espécie em estudo.

Figura 3 – Calos de A. incisa, cultivados em meio WPM + 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP.

Fonte: Elaborado pela autora. Legenda: A – calo caulinar após quatro meses de subcultivo; B – calo foliar após dois meses de subcultivo. Barras = 5 mm.

5.3. Análise histológica dos calos caulinares e foliares

Os cortes histológicos dos calos caulinares e foliares de A. incisa,

analisados por microscopia de luz, são mostrados na Figura 4. O corante Azul de

Toluidina (AT) se liga a radicais aniônicos presentes, por exemplo, na pectina e

lignina encontradas na parede celular vegetal. Também pode interagir com os ácidos

nucleicos presentes no núcleo celular (SILVA et al, 1997). Tanto os calos caulinares

quanto os foliares apresentam pectina e lignina na sua composição, o que é

característico de célula vegetal, e que foi evidenciado pela coloração AT a pH 6,8.

Observou-se que ocorreu reação metacromática entre o corante e o material, e em

algumas regiões da parede celular a coloração se mostra mais azulada, enquanto

em outras ela se encontra em tom arroxeado. Essa diferença ocorre devido à

45

disponibilidade de pectina na organização do material para reagir com o corante.

Resultados semelhantes foram obtidos por Feitosa et al (2013), após a coloração de

amostras de calos de Jatropha curcas L., e por Barbosa et al (2005) ao estudar

calos de genótipos de Coffea.

O teste do PAS é capaz de detectar polissacarídeos neutros, os quais se

encontram em maior quantidade na parede celular e nos grânulos de amido

(CORTELAZZO, 1992). Ambos os calos avaliados apresentaram regiões com

grande concentração de polissacarídeos neutros, os quais provavelmente são

depósitos de amido, o que pode ser decorrente do intenso metabolismo desse

tecido. A parede celular também mostrou forte coloração após a realização do teste

do PAS, por conta da presença de celulose e hemicelulose, os quais são os

principais carboidratos que a constituem (GALLÃO et al, 2007).

Figura 4: Cortes longitudinais de calos foliares e caulinares de A. incisa após dois e quatro meses de subcultivo, respectivamente.

Fonte: Elaborado pela autora. Legenda: (A) Corte de calo caulinar corado com Azul de Toluidina pH 6,8, mostrando reação metacromática nas paredes e núcleos celulares. (B) Corte de calo foliar corado com Azul de Toluidina pH 6,8. (C) Corte de calo caulinar corado pelo teste do PAS. (D) Corte de calo foliar corado pelo teste do PAS. As regiões arroxeadas em (A) e (B), indicadas pelas setas pretas, representam os núcleos celulares. Os grânulos em (C) e (D), indicados pelas setas vermelhas, revelam a presença de

polissacarídeos neutros (amido).

46

A análise microscópica revelou que os calos caulinares e foliares não

apresentam distinção aparente. As duas colorações, no entanto, foram úteis para

demonstrar que os calos estudados se encontravam morfológica e histologicamente

com características de calos friáveis, apresentando parede celular fina, células

homogêneas, sem sinais de ruptura, com espaços vacuolares e com presença de

grânulos de polissacarídeos neutros. Essas características são relatadas por Gallão

et al (2010), Saeed e Shahzad (2015) e Ma et al (2015). Logo, pode-se afirmar que

os calos produzidos se encontram viáveis para a realização dos estudos posteriores.

5.4. Determinação de Proteínas Totais Solúveis

Os extratos totais de folha, caule, calos foliares e calos caulinares de A.

incisa foram analisados no equipamento NanoVue para quantificar as proteínas

totais de cada amostra. A opção “Protein UV” realiza a leitura em dois espectros de

absorbâncias, 260 nm e 280 nm, e fornece uma média dos resultados na

concentração de µg/µL (GE Healthcare Application Note, 2008). As análises foram

realizadas em duplicata. Os valores que se obteve estão descritos no quadro 3:

Quadro 3: Concentração de Proteínas Totais Solúveis determinada nos extratos de folha, caule, calos foliares e calos caulinares de A. incisa, através do NanoVue (GE Healthcare).

Material Vegetal Concentração de Proteínas Totais

Solúveis (µg/µL)

Extrato de folha 20,07

Extrato de calos foliares 16,85

Extrato de caule 15,97

Extrato de calos caulinares 0,75

*Cada análise foi realizada em duplicata.

Bala et al (2010) relatam que a quantidade de proteínas totais dos calos

de Pisum sativum (ervilha), oriundos de explante de semente, foi de 4,42 µg/µL,

enquanto o tecido original possuía 9,49 µg/µL. Já Gupta e Srivastava (1998)

descrevem que, para Zizyphus mauritiana, os calos obtidos de folhas cotiledonares

apresentavam 9,58 µg/µL de proteínas totais, enquanto a semente apresentava

19,16 µg/µL. Silva et al (2003) relatam uma baixa concentração no conteúdo de

proteínas totais dos calos de Abrus pulchellus, com valor de 0,44 µg/µL. Logo, a

quantidade de proteínas totais de um tecido vegetal e dos calos oriundos varia muito

47

de espécie para espécie. Contudo, o tecido original costuma apresentar valores

maiores de proteína, que pode ser decorrente da diferenciação do tecido. Neste

trabalho, a quantidade de proteínas detectadas nos calos foliares foi bastante

superior ao encontrado em calos caulinares. Essa discrepância pode ser devida a

própria diferença entre os tecidos de calos. Esse fato condiz com o que é descrito

por Santos et al (2008), que acompanharam os teores de proteínas totais de calos

formados a partir de segmentos foliares e nodais de Coffea canephora 'Apoatã'

durante 84 dias. Durante todo o experimento, os calos foliares mostraram maior

quantidade de proteínas em relação aos nodais. Portanto, diferenças significativas

na quantidade de proteínas detectadas entre calos oriundos de diferentes explantes

podem ocorrer numa mesma espécie.

5.5. Análise Proteômica

A partir da análise das amostras de caule, folha, calos foliares e calos

caulinares de A. incisa, e identificação por espectrometria de massas, pôde-se

observar que a lista de picos obtidas representa fragmentos iônicos das amostras

digeridas, e, ao ser associada ao banco de dados de proteínas do NCBI, mostrou

identidade com peptídeos de algumas proteínas vegetais já relatadas.

A análise qualitativa dos peptídeos das amostras de calos em outras

plantas é sustentada pelo padrão proteico diferenciado que este tecido apresenta

em relação ao explante original (YIN; LAN; ZHU, 2008). Apesar da baixa

similaridade entre os peptídeos das amostras estudadas em relação às proteínas

relatadas no banco de dados, pode-se sugerir que há a presença de proteínas

vegetais diversas nos calos produzidos in vitro, e que estas proteínas podem estar

totalmente ou parcialmente processadas.

5.5.1. Caule

Nos peptídeos identificados na amostra de caule de A. incisa L. (Quadro

4), foi observada a presença de uma proteína relacionada à defesa vegetal, a

quinase serina/treonina com receptor S-like e lectina tipo G. De acordo com Sun et

al (2013), o gene que codifica para essa proteína (GsSRK), em Glycine soja,

apresentou maiores níveis de expressão quando exposta a estresses salino, de

seca, e indução com ácido abscísico (ABA). Além disso, eles demostraram que a

48

superexpressão desse gene em Arabidopsis thaliana promoveu a germinação da

semente, o enraizamento primário e o crescimento foliar durante os estágios iniciais

do estresse salino. Portanto, essa proteína, em A. incisa L., deve apresentar o

mesmo papel de tolerância ao estresse salino e de seca.

Duas proteínas relacionadas ao crescimento também foram detectadas

nos extratos de caule. Uma delas é a helicase DEAD/DEAH box. Diferentes

proteínas DEAD-box podem ser encontradas nos eucariotos, e elas apresentam

funções importantes no metabolismo do RNA, incluindo transcrição, splicing,

biogênese ribossomal, tradução, dentre outras (LINDER, 2006).

A segunda proteína é a queuine tRNA-ribosiltransferase, também

conhecida como tRNA-guanina transglicosilase, é uma enzima que atua na

incorporação da base queuine no tRNA. Queuine é uma base hipermodificada que

ocorre na posição instável dos anticódons dos tRNAs de aspartato, asparagina,

histidina e tirosina. Alguns estudos sugerem que a queuine apresenta importantes

efeitos na fisiologia de eucariotos, independente do papel do tRNA. Alguns destes

efeitos estão relacionados com a distribuição da isoenzima lactato desidrogenase,

padrões de fosforilação proteica e na modulação da proliferação celular (REUYL,

2003; TODOROV; GARCIA, 2006).

49

Quadro 4: Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-QUAD-TOF a partir do extrato total de caule de A. incisa.

Massa Molecular Calculada

pI Calculado

Score ID Sequência de Peptídeos

Descrição e Origem das Proteínas Identificadas

1 870 6.18 62 gi|460366084 KDGVLSPR Proteína quinase serina/treonina com receptor S-like e lectina tipo G (Solanum lycopersicum)

2 1954 5.67 56 gi|255085454 NKWHIIVEGVDIPPPIK

DEAD/DEAH box helicase (Micromonas sp. RCC299)

3 1955 5.44 56 gi|303282327 DKWHIIVEGVDIPPPIK

DEAD/DEAH box helicase (Micromonas pusilla CCMP1545)

4 1228 5.76 45 gi|743802237 NFDDKYTPTK Queuine tRNA-ribosiltransferase-like isoforma X1 (Populus euphratica)

5 1074 5.87 18 gi|168003513 ADSQISSPDR Proteína deduzida (Physcomitrella patens)

6 1097 9.14 18 gi|242046094 ALKALSPDQR Proteína hipotética SORBIDRAFT_02g037480 (Sorghum bicolor)

*Estas proteínas foram caracterizadas pela massa molecular e pI calculados, sequências dos peptídeos incomuns, o número de entrada no NCBI, e a

origem.

50

5.5.2. Calos caulinares

Dentre as proteínas relacionadas aos peptídeos detectados nos calos

caulinares de A. incisa (Quadro 5), a catalase foi identificada. Essa proteína

apresenta um papel importante no mecanismo de defesa vegetal, pois atua na

redução do dano oxidativo causado por estresses bióticos e abióticos (CHELIKANI;

FITA; LOEWEN, 2004).

A quitinase também está relacionada com o mecanismo de defesa

vegetal, pois é capaz de hidrolisar as ligações glicosídicas da quitina. Esse

carboidrato faz parte da composição estrutural de vários patógenos de plantas, em

especial os fungos (VAN LOON; REP; PIETERSE, 2006).

Outra proteína identificada que está relacionada com a defesa vegetal é a

glucan endo-1,3-β–glucosidase, também conhecida como β-1,3-glucanase. Essa

enzima está envolvida na hidrólise de β-D-glucanas, e esse carboidrato é

encontrado na parede celular fúngica (BARBOSA et al, 2004). Portanto, essa enzima

atua de forma a evitar a infecção por fungos.

A frutose-bifostato aldolase é uma enzima encontrada na glicólise,

enquanto a glutamato carboxipeptidase e a aspartato-semialdeído desidrogenase

estão relacionadas ao metabolismo das proteínas. Tan et al (2013) relatam que

enzimas do metabolismo energético são encontradas em abundância em tecidos de

calos em função da intensa atividade metabólica, devido ao seu rápido crescimento

e divisão celular.

51

Quadro 5: Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-QUAD-TOF a partir do extrato total de calos caulinares de A. incisa após seis

meses de subcultivo.


pI Calculado

Score ID Sequência de Peptídeos Descrição e Origem das Proteínas Identificadas

1 2250 7.40 123 gi|115679 GFFEVTHDVSHLTCADFLREGNFDLVGNNMPVFFIR

Catalase isoenzima 1 (Zea mays)

2 2250 6.87 109 gi|5759096 GFFEVTHDVSHLTCADFLREGNFDIVGNNFPVFFIRDEEVDYFPSR

Catalase CAT 1 (Manihot esculenta)

3 1345 6.49 104 gi|2213867 GILAADESTGTIGKVAPEVIAEYTVR

Frutose-bifosfato aldolase (Mesembryanthemum crystallinum)

4 1331 6.56 85 gi|719974028

GILAADESTGTIGKVAPEVVAEYTVRANSEATLGSYK

Frutose-bifosfato aldolase isoenzima citoplasmática-like (Nelumbo nucifera)

5 1128 5.85 84 gi|733408561

SADLIDALGVR Glutamato carboxipeptidase (Microbacterium mangrovi)

6 2226 5.33 82 gi|63253782

EAIGSFSVIYDLNGEPFSGPK Lectina KM+ (Artocarpus integer)

7 1459 6.77 80 gi|1168410 LSSINVENVESNR Frutose-bifosfato aldolase isoenzima citoplasmática 2 (Pisum sativum)

8 1567 4.26 76 gi|62825470

NTDSEEEIKEAFR Calmodulina parcial (Obelia dichotoma)

9 1469 6.12 74 gi|763760850

SVELLQGDGGPGTIK Proteína hipotética B456_005G063600 (Gossypium raimondii)

10 1168 4.97 72 gi|497334562

QDLPALALDGR Aspartato-semialdeído desidrogenase (Actinomyces sp. ICM47)

11 1209 6.23 69 gi|114408 VVDALGVPIDGR Subunidade alfa da ATP sintase mitocondrial (Oenothera biennis)

12 2002 8.05 66 gi|227774 LPGYGVITNIINGGLECGR Quitinase básica (Arabidopsis thaliana)

13 1983 6.75 61 gi|16215 EGNFDLVGNNFPVFFIR Catalase (Arabidopsis thaliana)

14 1306 5.20 59 gi|729375836

AGMEMALIDAAAK L-Ala-D/L- amino ácido epimerase isoforma X1 (Tarenaya hassleriana)

15 1155 5.13 57 gi|288557884

IIEGDGGPGTIK Proteína relacionada à patogênese 10.6 (Vitis vinifera)

52

16 1440 5.51 57 gi|674903250

REIMVDGEEHAR BnaA01g19050D (Brassica napus)

17 1259 8.99 52 gi|640925577

TNMYLSLQFK Proteína dedos de zinco C6 (Colletotrichum sublineola)

18 1328 9.27 49 gi|703076038

DISLDYALFRTYNNNLVQHVKHWGLFLPNK

Glucan endo-1,3-beta-glucosidase, isoforma básica (Morus notabilis)

19 1025 7.07 47 gi|930750741

MGMGGLPMGK Proteína quinase alfa 3-like isoforma X2 (Haplochromis burtoni)

20 2139 4.55 45 gi|913330960

LRAEETQPEVAQEDSNPAR Proteína não-caracterizada LOC106140052 (Amyelois transitella)


origem.

53

É válido ressaltar a presença de peptídeos relacionados à lectina KM+

(ROSA et al, 1999), uma lectina manose-ligante das sementes de Artocarpus

integrifolia. A presença de uma lectina manose-ligante indica uma possível

associação a um mecanismo de defesa, pois é relatado que o efeito inseticida de

lectinas pode ser primariamente determinado pela ligação a estruturas glicosiladas

no intestino dos insetos, causando inibição da absorção de nutrientes e/ou

destruição das células intestinais (VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004). Essa

característica é válida no tecido estudado, já que o calo, na sua ocorrência natural,

acontece em situações de injúria. Yin et al (2008) detectaram uma lectina ligante a

manose em calos de arroz, e sugerem que esta proteína apresenta também um

papel chave na diferenciação dos calos.

Monteiro-Moreira (2002) relata a presença de uma lectina manose-ligante

nas sementes de A. incisa, a qual foi denominada frutapina, e que é expressa em

pequenas quantidades. Contudo, a sequência dessa proteína e sua estrutura

tridimensional ainda não foram elucidadas. Todavia, sabendo-se que a jacalina,

proteína galactose ligante de A. integrifolia, apresenta grande similaridade estrutural

com a frutalina, proteína galactose-ligante de A. incisa (MONTEIRO-MOREIRA et al,

2015), pode-se sugerir que a KM+ detectada nas amostras de calos seja, na

verdade, a frutapina, e que ambas também apresentam grande similaridade

estrutural.

Outra proteína relevante é a calmodulina, que está envolvida no processo

de sinalização celular mediada por íons cálcio. A calmodulina está envolvida em

diversos processos celulares, dentre eles pode-se citar a imunidade inata (MA et al.,

2008), respostas induzidas por hormônios (LUAN et al., 2002), patogênese e

cicatrização (YAMANAKA et al., 2001), e resposta hipersensitiva (BLUME et al.,

2000). Considerando-se que, para a formação de calos na cultura in vitro, é

necessário que haja a estimulação com o uso de fitohormônios, como auxinas e

citocininas, pode-se sugerir que a calmodulina tenha um papel envolvido na

sinalização desses hormônios ao tecido vegetal, induzindo a desdiferenciação e

favorecendo o crescimento dos calos.

Proteínas dedos de zinco estão entre as proteínas mais abundantes do

genoma de eucariotos. Apresentam diversas funções, como reconhecimento de

54

DNA, empacotamento de RNA, ativação transcricional, regulação da apoptose,

enovelamento e montagem de proteínas, e ligação a lipídeos (LAITY; LEE;

WRIGHT, 2001). Considerando-se essas funções, essa proteína pode estar

envolvida no crescimento e manutenção dos calos, pois desempenha papéis

essenciais na regulação do metabolismo.

5.5.3. Folha

Dentre as proteínas relacionadas aos peptídeos identificados na amostra

de folha de A. incisa (Quadro 6), a proteína glutamato carboxipeptidase é conhecida

por atuar no metabolismo das proteínas, e também foi detectada nos calos

caulinares.

A proteína taumatina-like está incluída no grupo das proteínas

relacionadas à patogênese (PR-proteínas) e, nas plantas, ela atua na defesa do

hospedeiro, especialmente contra fungos patogênicos. Seu mecanismo antifúngico

está relacionado a uma variedade de atividades enzimáticas, dentre ela está incluída

a glucanase, que atua na parede celular de fungos (LIU; STURROCK;

EKRAMODDOULLAH, 2010).

A zeamatina também está incluída no grupo das proteínas taumatina-like,

apresentando, portanto, atividade antifúngica (BATALIA et al, 1996).

A proteína S-isoprenilcisteína metiltransferase está envolvida na

modificação pós-traducional de proteínas que apresentam a terminação CaaX (C é

uma cisteína, A é um aminoácido alifático, e X é um dos demais aminoácidos). Essa

modificação ocorre, por exemplo, em proteínas da família Ras, as quais estão

relacionadas com o crescimento celular, diferenciação e sobrevivência (HRYCYNA

et al, 1991).

De modo geral, nos peptídeos detectados na amostra de folha de A.

incisa, poucas proteínas foram identificadas. O baixo número de proteínas

identificadas pode ser associado à dificuldade de extração e identificação proteica

no tecido, da mesma forma como ocorreu no caule.

55

Quadro 6: Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-QUAD-TOF a partir do extrato total de folhas de A. incisa.


pI Calculado



1 1128 5.85 90 gi|733408561 SADLIDALGVR Glutamato carboxipeptidase (Microbacterium mangrovi)

2 1479 4.90 75 gi|17978815 CPQAYSYAYDDK

Proteína taumatina-like (Daucus carota)

3 1287 5.06 69 gi|255538966 FSCLTGDCGSGK

Precursor zeamatina (Ricinus communis)

4 1260 9.28 53 gi|750321973 APMSKIDSCPR Proteína S-isoprenilcisteína metiltransferase (Sphingobium lactosutens)


origem.

56

5.5.4. Calos foliares

Nos peptídeos identificados na amostra de calos de folha de A. incisa

(Quadro 7), foi observada a presença de proteínas como a KM+, frutose-bifosfato

aldolase e calmodulina, as quais também foram encontradas nos tecidos de calos

caulinares. A presença desses peptídeos reforça seus papéis descritos

anteriormente nos tecidos de calos, independentemente de sua origem.

A proteína quinase serina/treonina com receptor S-like e lectina tipo G foi

detectada também nos extratos de caule, e ela provavelmente deve manter a sua

função de tolerância a estresses abióticos nos tecidos de calos.

A proteína homóloga de resistência à infecção tardia R1A-3 confere

resistência a patógenos que transportam o gene de avirulência Avr-1. Proteínas

dessa classe protegem a planta contra patógenos que contêm uma proteína de

avirulência específica, através da interação indireta com esta proteína. Isso

desencadeia um sistema de defesa, incluindo a resposta de hipersensibilidade, a

qual restringe o crescimento do organismo infectante (KUANG et al, 2005).

Proteínas osmotina-like fazem parte da família das PR-proteínas. Seu

mecanismo de ação relacionado à defesa vegetal ainda não está completamente

elucidado, contudo estudos mostraram que elas conferem resistência a estresses

abióticos, especialmente tolerância à seca e à salinidade (WEBER et al, 2014).

57

Quadro 7: Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-QUAD-TOF a partir do extrato total de calos foliares de A. incisa após seis

meses de subcultivo.


pI Calculado



1 2226 5.33 122 gi|63253782 EAIGSFSVIYDLNGEPFSGPK

Lectina KM+ (Artocarpus integer)

2 1345 6.49 65 gi|2213867 GILAADESTGTIGKVAPEVIAEYTVR

Frutose-bifosfato aldolase (Mesembryanthemum crystallinum)

3 1128 9.19 58 gi|145347856 SLDALDAIGVR Proteína deduzida (Ostreococcus lucimarinus CCE9901)

4 870 6.18 56 gi|460366084 KDGVLSPR Proteína quinase serina/treonina com receptor S-like e lectina tipo G (Solanum lycopersicum)

5 1128 6.33 55 gi|971573908 SADILADRLR Proteína homóloga de resistência à infecção tardia (Solanum tuberosum)

6 1625 8.52 51 gi|848856255 MDIATTFFPSNNPR

Proteína não-caracterizada LOC105975214 (Erythranthe guttata)

7 1808 4.18 49 gi|16223 VFDKDQNGFISAAELR

Calmodulina (Arabidopsis thaliana)

8 1791 7.55 48 gi|34538350 NECPYTVWAAASPGGGR

Proteína osmotina-like II (Gossypium hirsutum)


origem.

58

5.6. SDS-PAGE e Atividade Hemaglutinante

A abordagem proteômica permitiu a detecção de diversas proteínas,

contudo, pode-se ressaltar a possível presença da lectina frutapina, similiar à KM+,

como foi relatado para os tecidos de calos, e a qual não foi detectada nos tecidos

originais. Com o intuito de aprofundar os estudos na identificação dessa lectina,

realizou-se ensaios preliminares de eletroforese e atividade hemaglutinante. A

eletroferese da amostra de calo de origem caulinar permitiu a visualização de uma

banda proteica que se encontra em posição intermediária entre as bandas

características da frutalina, estando mais próxima da banda de 15 kDa (Figura 5).

Barre et al. (2004), ao caracterizar a lectina KM+, demonstraram que a eletroforese

dessa proteína também apresenta uma única banda, e que esta também se

encontra em posição intermediária às bandas da jacalina, que estão nas posições de

15 e 18 kDa. Além disso, a atividade hemaglutinante demonstrou que as amostras

de calos caulinares e calos foliares apresentaram aglutinação até a diluição 1/16. Os

resultados obtidos pela análise proteômica, eletroforese e atividade hemaglutinante

fornecem indícios de que há a presença de uma lectina similar à KM+ nos calos, e a

qual já foi detectada nas sementes de A. incisa por Monteiro-Moreira (2002), sendo

denominada frutapina.

Figura 5: SDS-PAGE de amostra de calo caulinar de A. incisa após seis meses de subcultivo, e frutalina purificada (controle). Comparação com a eletroforese realizada por Barre et al. (2004) com a lectina KM+ purificada de A. integrifolia, utilizando jacalina como controle.

Fonte: Elaborado pela autora. Fonte: Barre et al., 2004.

Legenda: O retângulo preto indica a banda proteica da possível lectina (frutapina) encontrada no tecido de calo.

59

5.7. Considerações finais

De modo geral, a detecção de proteínas nas amostras dos tecidos

originais foi maior do que nos tecidos de calos. Esse fato pode ter sido ocasionado

pela diferença do material ou pela metodologia de extração utilizada, a qual foi

maceração em nitrogênio líquido e centrifugação. A maceração pode ser um método

ineficaz de extração proteica, e por isso a digestão tríptica não foi capaz de fornecer

peptídeos que fossem similares aos depositados no banco de dados. A extração foi

a mesma utilizada nos tecidos de calos, mas para o tecido original pode-se sugerir a

integração do método de maceração e centrifugação com outras metodologias que

tornem a extração mais eficiente. Contudo a análise proteômica mostrou-se

relevante na caracterização dos calos e dos tecidos, pois mostrou a eficiência da

extração em cada tecido, identificou peptídeos relacionados a proteínas únicas de

cada tipo de amostra, e principalmente, identificou proteínas comuns entre eles. A

abordagem também possibilitou visualizar possíveis papéis fisiológicos das

proteínas dos calos, as quais apresentaram papéis principalmente relacionados à

defesa. Esse fato pode ter relação com a função dos calos na natureza, o qual é

produzido em situações de injúria.

O estudo proteômico, aliado à análise eletroforética e à atividade

hemaglutinante, mostraram fortes indício da presença da lectina frutapina nos

tecidos de calos, reforçando a importância da presença de uma lectina manose-

ligante no desenvolvimento desse tecido.

O estudo desenvolvido pode ser complementado com outras

perspectivas, como a visualização deste painel proteico por eletroforese

bidimensional, além de sugerir a otimização de métodos de extração, investigação

de outros tecidos, investigação de DNA e RNA de moléculas de interesse no tecido,

ensaios de atividade biológica, dentre outros.

60

6. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos neste trabalho mostram a eficiência na metodologia

de produção de calos caulinares e foliares de A. incisa, apesar das dificuldades

apresentadas para espécies lenhosas, pois conseguiu-se um percentual de

produção de 88%. A quantificação de proteínas totais mostrou que os explantes de

caule e folha apresentam maior quantidade de proteínas quando comparados com

os calos, e esse fato pode estar relacionado com o grau de diferenciação do tecido.

A análise histológica não revelou diferenças entre os calos caulinares e foliares,

contudo, foi útil para mostrar que as células apresentavam características de calos

friáveis e em pleno crescimento. A abordagem proteômica permitiu identificar

peptídeos que apresentam similaridade com proteínas vegetais descritas, e

identificou maior número de proteínas nos calos do que nos tecidos originais. Pode-

se destacar a presença de uma lectina semelhante à KM+ em ambas as amostras

de calos, o que pode ser um indício da presença de frutapina nos calos. Essa

suspeita foi reforçada com os ensaios preliminares de eletroforese e atividade

hemaglutinante, o que leva a crer que essa lectina apresenta um importante papel

fisiológico no desenvolvimento desse tecido. Além disso, a proteômica permitiu a

detecção de diversas proteínas relacionadas à defesa vegetal, e esse fato pode ter

relação com o papel dos calos na natureza, pois são tecidos encontrados em

situações de injúria. Portanto, o presente trabalho serviu como um passo inicial para

o entendimento da bioquímica e fisiologia dos calos de A. incisa L., e fornece uma

base para estudos mais aprofundados desse tecido e das proteínas que o

constituem.

61

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