UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PROGRAMA DE PÓS … · A inflamação é um importante componente...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

JOSÉ MIRABEAU DE OLIVEIRA RAMOS

IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS E ESTUDO FARMACOLÓGICO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS

FOLHAS DA Croton argyrophyllusKunth

ARACAJU 2013

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IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS E ESTUDO FARMACOLÓGICO DO

ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DA Croton argyrophyllusKunth

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Sara Maria Thomazzi

ARACAJU 2013

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IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS E ESTUDO FARMACOLÓGICO DO

ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DA Croton argyrophyllusKunth

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.

Aprovado em 07/03/2013

Orientadora: Profa. Dra. Sara Maria Thomazzi

1º Examinador: Dra. Cristiane Bani Corrêa

2º Examinador: Profa. Dra. Elen Cristina Teizem Landucci

3º Examinador: Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo

4º Examinador: Prof. Dr. Leonardo Rigoldi Bonjardim

PARECER

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5

DEDICATÓRIA

Ao MESTRE JESUS,

Que nos mostrou a necessidade da fé,

A importância da esperança e a realeza do amor. Ingredientes básicos

e essenciais a excelência da vida.

Aos meus pais,

Ursino e Helena, pelo amor e carinho e que tudo fizeram pela minha

formação moral e intelectual do qual tenho imenso orgulho e

admiração.

Aos meus filhos e meu neto

Handel, Raquel e Netinho, esperança e fonte inspiradoras de meus

sonhos.

Aos meus irmãos,

Byron, Ney, Magna, Joésia, sempre amigos e companheiros.

À Ivana,

Pelo seu amor, carinho, compreensão e paciência, dispensada

durante toda essa longa jornada.

À Clio e Dani,

Pelo incentivo e construção diária nessa minha caminhada para

realização do meu sonho, ajudando-me em todos os momentos a

torná-lo um sonho possível. A minha gratidão e meu eterno

obrigado...... Vocês são demais.

Ao Prof. Dr. Ângelo Antoniolli,

6

Que assumiu o aluno desconhecido e acreditando em mim sempre de

forma positiva, dando-me incentivo constante na realização desse

meu doutorado. Minha eterna Gratidão.

À Profa. Dra. Sara Thomazzi,

Pela disponibilidade para comigo em todos os momentos que precisei,

pelo seu amor ao ensino e à pesquisa e pela credibilidade depositada

em mim. O meu muitíssimo obrigadoooo.

7

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Enilton Camargo,

Pela sua amizade, mas, sobretudo comemorando comigo nesse

seu jeito simples e elegante o meu sucesso, em ter

concretizado essa etapa tão importante na minha vida

acadêmica. Obrigadooooo, obrigado mesmo!

Aos amigos e colegas que me ajudaram direta e indiretamente,

estando ao meu lado nos momentos que precisei e que todos

compartilhavam o mesmo ideal de ajudar o próximo; Renata,

Marise, Adailton, Sandra, Débora Pimentel, Alípio, Diego,

Wesley, Carlos Anselmo, Toinho, Maíra,Alaíde, Clóvis Rosa,

Elizangela...Vocês são feras !!!

À UFS, pela oportunidade dada para o desenvolvimento da

ciência e da pesquisa.

Aos colegas do Laboratório, sempre disponíveis em me ajudar.

Aos animais do Laboratório, que contribuíram com suas vidas

em prol da pesquisa.

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AS COISAS BOAS DURAM O TEMPO NECESSÁRIO PARA SE TORNAREM

INESQUECÍVEIS. CHARLES CHAPLIN

9

RESUMO

RAMOS, José Mirabeau de Oliveira. IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS E ESTUDO FARMACOLÓGICO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DA Croton argyrophyllusKunth. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) UFS/SE, Aracaju, 2013. A inflamação é um importante componente de muitas doenças cujo processo central é o recrutamento de células fagocitárias provocando dano tecidual. Os produtos naturais de uso terapêutico são alternativas para o tratamento de diversas patologias; neste sentido, as espécies do gênero Croton (Euphorbiaceae) são amplamente utilizadas na medicina popular. Destaca-se a Croton argyrophyllusKunth, um arbusto abundante na região Nordeste do Brasil, cuja infusão de suas folhas e flores é usada no tratamento de dor de cabeça, gripe e como tranquilizante. Este estudo buscou analisar os constituintes químicos e avaliar as atividades anti-inflamatória, antinociceptiva e antioxidante do óleo essencial (OE) desta planta. O OE da Croton argyrophyllusKunthfoi obtido a partir das folhas frescas e administrado em roedores por via oral (v.o.) nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg de peso, e como veículo foi usado o tween 80 a 0,2% em salina (10 mL/kg, v.o.), administrados 1 h antes do agente flogístico. Observou-se que o OE da Croton argyrophyllusKunthinibiu o edema de pata induzido por carragenina (30 e 100 mg/kg), reduziu o recrutamento de neutrófilos para a cavidade abdominal em todas as doses estudadas e inibiu a produção de metabólitos do óxido nítrico (NO) no lavado peritoneal (100 mg/kg). O OE da Croton argyrophyllusKunth,administrado oralmente, produziu inibição dose-dependente na nocicepção visceral induzida por ácido acético. No teste da placa quente, O OE (100 mg/kg) produziu significativo efeito antinociceptivo. No teste da formalina, o OE inibiu significativamente o tempo de lambida-mordida, tanto na fase inicial (neurogênica; 100 mg/kg) quanto na fase tardia (inflamatória; 30 e 100 mg/kg) do modelo. O pré-tratamento com o OE (30 e 100 mg/kg) levou a uma redução significativa e dose-dependente na nocicepção induzida por capsaicina e glutamato. Também se observou, na dose de 100 mg/kg, que a nocicepção no teste da placa quente foi significativamente atenuada pela injeção intraperitoneal de naloxona (5 mg/kg). Em contraste, a antinocicepção causada pelo OE (100 mg/kg) no teste das contorções abdominais não foi alterada pelo tratamento com L-arginina (i.p., 600 mg/kg). A administração do OE também não foi associada com efeitos inespecíficos como sedação ou relaxamento muscular. Em relação à capacidade antioxidante, observamos que o OE (0,001-100 µg/mL) apresenta capacidade sequestradora do radical óxido nítrico e é capaz de inibir a peroxidação lipídica induzida por FeSO4 e FeSO4 + H2O2. Assim, estes resultados sugerem que o OE de Croton argyrophyllusKunthpossui ação anti-inflamatória, a qual está relacionada, ao menos em parte, com sua atividade antioxidante. Além disso, demonstramos que o OE é capaz de produzir antinocicepção de forma dose-dependente em vários modelos experimentais, através do envolvimento dos sistemas glutamatérgico e opióide, mas não pela via da L-arginina-óxido nítrico.

10

Palavras-chave: inflamação; nocicepção; Croton argyrophyllusKunth; produtos naturais.

11

ABSTRACT

RAMOS, Jose Mirabeau de Oliveira. IDENTIFICATION OF CHEMICAL CONSTITUENTS AND PHARMACOLOGICAL STUDY OF THE ESSENTIAL OIL OF Croton argyrophyllusKunth LEAVES. Thesis (Doctorate in Health Sciences), UFS/SE, Aracaju, 2013. Inflammation is an important component of many diseases whose central process is the recruitment of phagocytic cells causing tissue damage. The therapeutic use of natural products is an alternative for treating various diseases, in this sense, the species of the Croton (Euphorbiaceae) genus are widely used in folk medicine. We highlight the Croton argyrophyllusKunth, a shrub abundant in northeastern Brazil, whose infusion of its leaves and flowers is used in the treatment of headache, flu, and as a tranquilizer. This study investigates the chemical constituents and evaluates the anti-inflammatory, antinociceptive, and antioxidant properties of the essential oil (EO) of this plant. Croton argyrophyllusKunthEO was obtained from fresh leaves and administered in rodents per orally (p.o.) at the doses of 10, 30, and 100 mg/kg, and was used as a vehicle 0.2% tween 80 in saline (10 mL/kg, p.o.), administered 1 h before the phlogistic agent. It was observed that Croton argyrophyllusKunthEO inhibited paw edema induced by carrageenan (30 and 100 mg/kg), reduced neutrophil recruitment into the abdominal cavity at all doses studied, and inhibited the production of nitric oxide metabolites (NO) in the peritoneal wash (100 mg/kg). Croton argyrophyllusKunthEO administered orally, produced dose-dependent inhibition in visceral nociception induced by acetic acid. In the hot plate test, the EO (100 mg/kg) produced significant antinociceptive effect. In the formalin test, the EO significantly inhibited the time-licking bite, both in the initial phase (neurogenic; 100 mg/kg) and late phase (inflammatory; 30 and 100 mg/kg) in the model. Pretreatment with the EO (30 and 100 mg/kg) led to a significant reduction in dose-dependent nociception induced by capsaicin and glutamate. We also observed, at the dose of 100 mg/kg, which nociception in the hot plate test was significantly attenuated by intraperitoneal injection of naloxone (5 mg/kg). In contrast, the antinociception caused by the EO (100 mg/kg) in the writhing abdominal test was not altered by treatment with L-arginine (i.p., 600 mg/kg). Administration of the EO has not been associated with unspecific effects like sedation or muscle relaxation. Regarding antioxidant capacity, we observe that the EO (from 0.001 to 100 µg/mL) presents nitric oxide radical scavenging capacity and is able to inhibit lipid peroxidation induced by FeSO4 and FeSO4 + H2O2. Thus, these results suggest that the EO of Croton argyrophyllusKunthhas anti-inflammatory action, which is related, at least in part, to its antioxidant activity. Furthermore, we showed that the EO is able to produce antinociception in a dose-dependent manner in various experimental models involving the glutamatergic and opioids systems, but not via the L-arginine-nitric oxide. Keywords: inflammation, nociception, Croton argyrophyllus Kunth; natural products.

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Hábito de Croton argyrophyllusKunth................................ 28

Figura 2: Cromatograma do óleo essencial da Croton

argyrophyllusKunthrealizado pela técnica de CG-

MS/FID......................

42

Figura 3: Efeito do OE da Croton argyrophyllusKunthsobre o

edema da pata induzido por carragenina...........................

46

Figura 4: Ensaio da atividade da enzima mieloperoxidase em patas

de ratos...............................................................................

47

Figura 5: Efeito do OE da Croton argyrophyllusKunthsobre a

migração de leucócitos induzida por carragenina para a

cavidade peritoneal em camundongos após 4 h................

48

Figura 6: Efeito do OE da Croton argyrophyllusKunth6 h após a

indução da peritonite na concentração de nitrato e nitrito

(NOx-) no lavado peritoneal.................................................

49

Figura 7: Contorções abdominais induzidas por ácido acético.......... 50

Figura 8: Efeito do OE da Croton argyrophyllusKunthno teste da

formalina.............................................................................

51

Figura 9: Teste da nocicepção induzida por capsaicina.................... 53

Figura 10: Teste da nocicepção induzida por glutamato..................... 54

Figura 11: Participação do sistema L-arginina/óxido nítrico................ 55

Figura 12: Efeito do óleo essencial da Croton argyrophyllusKunthno

teste de campo aberto em camundongos.....................

56

13

LISTA DE TABELAS

Tabela1: Composição do óleo essencial das folhas daCroton

argyrophyllusKunth...........................................................

43

Tabela 2: Atividade antioxidante do OE da Croton

argyrophyllusKunthfrente a diversos

estímulos.......................................

44

Tabela 3: Efeito antinociceptivo do OE da Croton

argyrophyllusKunth no teste da placa quente em

camundongos............

52

Tabela 4: Resumo dos efeitos do OE da Croton argyrophyllusKunth

sobre a inflamação e nocicepção.............................

57

14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT 5-hidroxitriptamina

ANOVA análise de variância

ASC área sob a curva

ATP trifosfato de adenosina

BHT butil-hidroxitolueno

CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal

CG cromatografia gasosa

CGRP peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

COX Ciclo-oxigenase

DNA ácido desoxirribonucléico

EDTA ácidoetilenodiaminotetracético

eNOS óxido nítrico sintase endotelial

EPM erro padrão da média

ERC espécies reativas de cloro

ERN espécies reativas de nitrogênio

ERO espécies reativas de oxigênio

FAD flavina adenosina dinucleotídeo

FID detector de ionização de chama

GPS Global Position System

i.p. intraperitoneal

i.pl. intraplantar

IASP Associação Internacional para Estudo da Dor

iNOS óxido nítrico sintase induzível

L-NOARG L-NG-nitro-arginina

LT Leucotrieno

MDA Malondialdeído

MPO Mieloperoxidase

MS espectrometria de massa

NADPH fosfato de dinucleotídio de nicotinamida e adenina

NK Neurocininas

15

nNOS óxido nítrico sintase neuronal

NO óxido nítrico

OE óleo essencial

OMS Organização Mundial da Saúde

ONOO− Peroxinitrito

PG prostaglandina

PK proteínaquinase

PL Fosfolipase

PPAR-γ receptores ativados pelo proliferados do peroxissomo gama

RRI índice de retenção

s.c. Subcutânea

SBCAL Sociedade Brasileira de Cuidados com Animais de

Laboratório

SP substância P

SUS Sistema Único de Saúde

TBA ácido tiobarbitúrico

TBARS substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TCA ácido tricloroacético

TNF fator de necrose tumoral

TX Tromboxano

UMPO unidades de mieloperoxidase

UV Ultravioleta

v.o. via oral

16

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................... 15

2 REVISÃO DA LITERATURA............................................... 18

2.1 Inflamação........................................................................ 18

2.2 Dor................................................................................... 20

2.3 Radicais Livres................................................................. 22

2.4 Produtos Naturais............................................................ 25

2.5 Gênero Croton................................................................. 25

2.6 Croton argyrophyllus Kunth.............................................. 27

3 OBJETIVOS........................................................................ 29

3.1 Objetivo Geral.................................................................. 29

3.2 Objetivos Específicos....................................................... 29

4 MATERIAL E MÉTODOS................................................... 30

4.1 Coleta e Identificação da Planta...................................... 30

4.2 Extração do óleo essencial.............................................. 30

4.3 Análise Cromatográfica................................................... 31

4.4 Estudo da atividade antioxidante................................. 32

4.4.1 Peroxidação lipídica in vitro........................................ 32

4.4.2 Atividade sequestrantede radical óxido nítrico (NO).. 32

4.5 Animais............................................................................. 33

4.6 Tratamentos..................................................................... 34

4.7 Avaliação da Atividade Anti-inflamatória.......................... 34

4.7.1 Edema de pata em ratos.............................................. 34

4.7.2 Ensaio de mieloperoxidase (MPO) nas patas de ratos 35

4.7.3 Peritonite em camundongos........................................ 36

4.7.4 Determinação de metabólitos do NO (NOx-)............... 36

4.8 Avaliação da Atividade Antinociceptiva....................... 37

4.8.1 Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. 37

4.8.2 Teste da formalina....................................................... 38

4.8.3 Teste da placa quente................................................. 38

4.8.4 Teste da nocicepção induzida por capsaicina............. 39

4.8.5 Teste da nocicepção induzida por glutamato.............. 39

4.8.6 Participação do sistema L-arginina/óxido nítrico......... 39

4.9 Estudo da atividade locomotora................................ 40

17

4.9.1 Teste do campo aberto............................................... 40

4.10 Análise Estatística........................................................ 40

5 RESULTADOS.................................................................... 42

5.1 Extração e Análise cromatográfica do OE da Croton argyrophyllus Kunth.....................................................

42

5.2 Avaliação da atividade antioxidante............................. 44

5.3 Edema de pata............................................................. 44

5.4 Ensaio da atividade da mieloperoxidase nas patas de ratos.............................................................................

47

5.5 Peritonite e contagens total e diferencial de leucócitos do lavado peritoneal....................................

48

5.6 Concentração de NOx- no lavado peritoneal............... 49

5.7 Contorções Abdominais............................................... 49

5.8 Teste da Formalina...................................................... 50

5.9 Teste da placa quente................................................. 51

5.10 Teste da nocicepção induzida por capsaicina............. 52

5.11 Teste da nocicepção induzida por glutamato.............. 53

5.12 Participação do sistema L-arginina/óxido nítrico......... 54

5.13 Teste do campo aberto............................................... 55

5.14 Sumário dos resultados obtidos com os tratamentos 56

6. DISCUSSÃO....................................................................... 58

7. CONCLUSÃO.................................................................. 65

8. REFERÊNCIAS................................................................ 66

ANEXOS 78

18

1 INTRODUÇÃO

Durante séculos a humanidade lutou contra as enfermidades buscando

não apenas a sobrevivência, como também uma melhor qualidade de vida. A

utilização de plantas medicinais em diversas civilizações, com o uso de chás,

sucos, banhos, unguentos e demais preparados, propiciou ao longo dos anos a

cura das mais diversas doenças (VIEGA JR; BOLZANI; BARREIRO, 2006).

De acordo com Veiga-Júnior, Pinto e Maciel (2005), o ressurgimento do

interesse internacional em pesquisas sobre as plantas medicinais deve-se em

grande parte à República Popular da China. Isso porque foi este um dos

primeiros países que introduziu uma análise sistemática de plantas utilizadas

como remédios tradicionais. Os estudos com base na medicina tradicional

chinesa propiciaram a descoberta de novas drogas de origem vegetal com

diversas propriedades, entre asquais as anti-hipertensivas, anti-

hipoglicemiantes e antifúngicas (FAN et al., 2012). A utilização de plantas

medicinais pela população mundial tem sido significativa nos últimos tempos.

Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) demonstram que cerca de

80% da população dos países em desenvolvimento fizeram uso de algum tipo

de planta para aliviar ou curar determinadas enfermidades (OMS, 2011).

O Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo,

contando com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre

350.000 e 550.000 (GIULIETTI et al., 2005). Destes, apenas 8% das espécies

vegetais da flora foram estudadas em busca de compostos bioativos e 1.100

espécies vegetais foram avaliadas em suas propriedades medicinais, com 590

plantas registradas para comercialização no Ministério da Saúde (CARVALHO

et al., 2008).

O nordeste brasileiro, bem como o estado de Sergipe, onde domina o

clima marcado por secas periódicas e precipitação que varia entre 300-800

mm/ano, écaracterizado pela diversidade de formas vegetais. Nesta região,

existe um predomínio de caatingas, associadas a carrascos e mata de altitude

(matas de brejo), além de áreas de cerrado e de campo rupestre, mata

atlântica e vegetação costeira, entre outras. Este cenário ocupa 18% do

19

território nacional (1.561.177,8 km2), onde vivem 54 milhões de habitantes, dos

quais, cerca de 30% habitam a área rural (BRASIL, 2010).

O crescente uso das plantas medicinais tem estimulado a pesquisa na

busca de substâncias com atividade biológica, no sentido de dar uma base

científica a este conhecimento popular, além de buscar novas estruturas

químicas de interesse à indústria farmacêutica, já que muitos fitoterápicos são

produzidos com fundamento no uso popular das plantas, sem nenhuma

comprovação pré-clínica e clínica, ficando, portanto, difícil de competir a nível

nacional e também internacional (YUNES et al., 2001).

As plantas medicinais que têm sua eficácia terapêutica e toxicológica ou

segurança de uso avaliadas, dentre outros aspectos, estão cientificamente

aprovadas para serem utilizadas pela população nas suas necessidades

básicas de saúde, além de possuírem outras vantagens como facilidade de

acesso, baixo custo e compatibilidade cultural com as tradições populares

(GAZZANEO; LUCENA; ALBUQUERQUE, 2005).

O gênero Croton faz parte da família Euphorbiaceae que abrange cerca

de 300 gêneros e aproximadamente 8.000 espécies. A Croton ssp, destaca-se

por seu expressivo número de espécies, aproximadamente 800 (COSTA et al.,

2008). Nos últimos anos várias espécies vegetais desse gênero foram

estudadas para comprovação do seu uso terapêutico na medicina popular,

inclusive quanto as suas atividades anti-inflamatória e antinociceptiva

(MOLLICK et al., 2011; CAVALCANTI et al., 2012; MONTOPOLI et al., 2012;

ZHAO et al., 2012; ALMEIDA et al., 2013).

A espécie Croton argyrophyllus Kunth, conhecida como “marmeleiro

prateado ou sacatinga”, tem sido estudada nos últimos anos no intuito de

conhecer mais a respeito de suas ações farmacoterapêuticas e da validação do

seu uso na medicina popular (MORAIS et al., 2006; GOBBO-NETO; LOPES,

2007; COSTA et al., 2008; VEIGA-JÚNIOR; PINTO; MACIEL, 2008). Na

maioria destes estudos a ação antibacteriana e antifúngica foram investigadas,

sendo verificado a ausência do conhecimento a respeito das ações anti-

inflamatória e antinociceptiva da CrotonargyrophyllusKunth.Deste modo, torna-

se necessária constatar a existência destas atividades terapêuticas do Croton.

20

O desenvolvimento de atividades de pesquisa envolvendo o estudo dos

produtos naturais, principalmente tomando-se como base o conhecimento

popular, deve ser de interesse prioritário para o desenvolvimento regional

(AGRA et al., 2007). Neste sentido, este trabalho se desenvolveu a partir do

estudo do óleo essencial de uma planta da caatinga amplamente usada pela

população local, principalmente para tratar condições inflamatórias e dolorosas.

Os testes para avaliar as atividades anti-inflamatória e antinociceptiva

representam uma das formas mais utilizadas na avaliação de novos

medicamentos e tratamentos quanto a sua agressividade e capacidade de

adaptação aos tecidos (CONSOLARO, 2009).Diante do exposto, este trabalho

teve como objetivo realizar análise dos constituintes químicos e estudar as

atividades anti-inflamatória, antinociceptiva e antioxidante do óleo essencial do

Croton argyrophyllusKunth.

21

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Inflamação

O processo inflamatório é uma reação complexa em resposta a vários

agentes nocivos, que consiste de respostas vasculares, migração e ativação de

leucócitos e respostas sistêmicas. Neste processo ocorrem alterações no

calibre vascular com consequente aumento do fluxo sanguíneo, alterações

estruturais na microcirculação levando ao extravasamento de plasma,

proteínas e leucócitos, sendo que a migração leucocitária com acúmulo no foco

da lesão e ativação destes leucócitos para eliminar o agente agressor

caracteriza o processo inflamatório agudo (MARCHE, 1959).

As reações inflamatórias podem ser desencadeadas por vários

estímulos, como infecções, trauma, agentes físicos e químicos, necrose,

corpos estranhos e reações imunológicas a micro-organismos patogênicos,

dentre outros (KUMAR et al., 2005). Estas reações ocorrem com vistas a

debelar o agente agressor; no entanto, a exacerbação da resposta inflamatória

pode levar ao agravamento dos sinais inflamatórios, calor, rubor, edema e dor

e até a perda da função da estrutura lesada (KLEBANOFF, 2005).

Os mediadores inflamatórios são substâncias naturais do organismo,

com estruturas químicas e atividades farmacológicas e fisiológicas variadas;

estes podem se derivar do plasma, dos leucócitos ou de neurônios, com a

função de ligar-se a receptores específicos na célula alvo, estimulando a

liberação de novos mediadores e suas ações podem ser passíveis de inibição

por antagonistas específicos (RUFINO; SILVA JR, 2006).

Quando os agentes infecciosos entram num tecido lesionado,

macrófagos ou neutrófilos presentes no local começam a fagocitá-los. Os

macrófagos ativados durante este processo liberam citocinas, tais como o fator

de necrose tumoral (TNF)-α, a interleucina (Iδ)-1, a IL-6, a IL-8 e a IL-12. Os

macrófagos também produzem outros mediadores tais como as

prostaglandinas (PGs), os leucotrienos (LTs), o fator de ativação das plaquetas

(PAF) e o óxido nítrico (NO), este último responsável, juntamente com a

22

histamina, pelo aumento da permeabilidade vascular, propiciando o

espaçamento entre as células endoteliais (STEIN et al., 2009).

As PGs são metabólitos do ácido araquidônico, um importante

componente dos fosfolipídeos de membrana, e no sítio inflamatório, as PGs

liberadas de células endoteliais e inflamatórias sensibilizam os nervos

(hiperalgesia), aumentam o fluxo sanguíneo, potencializam a formação do

edema, levando ao extravasamento de líquidos, e no sistema nervoso central

levam ao aparecimento da febre (PHILLIPSON; KUBES, 2011). As PGs são

sintetizadas e liberadas por muitos tipos de células e formadas pela ação da

enzima ciclo-oxigenase (COX) pela adição de duas moléculas de oxigênio

(GIERSE et al., 2008). Esta enzima possui duas isoformas, a COX-1 e a COX-2

(HONG et al., 2002; KIM et al., 2004).

A COX induzível (COX-2) é aumentada em resposta a vários estímulos,

incluindo os inflamatórios em diferentes tipos de tecidos, largamente expressa

em macrófagos e mastócitos quando estimulados por citocinas pró-

inflamatórias ou por lipopolissacarídeo, enquanto que a COX constitutiva (COX-

1) atua na manutenção da função celular e está presente em todo tipo de célula

(ANDRADE et al., 2007). Uma variante da enzima COX-1, a COX-3, foi descrita

no córtex cerebral e no coração (CHANDRASEKHARAN et al., 2002).

Outra importante enzima que contribui para geração de mediadores

inflamatórios é a 5-lipoxigenase, que catalisa a formação dos LTs a partir do

ácido araquidônico. Os LTs são sintetizados por leucócitos residentes ou

recrutados durante processos inflamatórios. Estas moléculas agem via

receptores de superfície de membrana acoplados a proteína G,

desencadeando eventos sinalizadores intracelulares que levam ao acúmulo de

leucócitos, aumento da capacidade fagocítica e microbicida pelos fagócitos e

geração de outros mediadores pró-inflamatórios (PETERS-GOLDEN et al.,

2005).

O PAF, um derivado lipídico da ação das fosfolipases (PLA2), atua via

receptores específicos de superfície celular, localizados em numerosas células

e tecidos, incluindo plaquetas, leucócitos e células endoteliais

(SCHOLMERICH, 1996). O PAF está envolvido em muitos eventos

inflamatórios, incluindo ativação de plaquetas, de neutrófilos e macrófagos,

23

aumento da permeabilidade vascular e contração do músculo liso (FORMELA;

GALLOWAY; KINGSNORTH, 1995).

Outro mediador de destaque é a histamina, uma amina básica

relacionada com processos inflamatórios e alérgicos, que causa vasodilatação

e aumento da permeabilidade vascular (ANDRADE et al., 2007).

Neuropeptídios, como a substância P (SP) e a neurocinina A (NKA), que são

liberados a partir de terminações nervosas sensoriais, têm sido observados em

estudos estimulando a liberação de histamina pelos mastócitos, a qual causa

aumento da permeabilidade vascular, aumentoda síntese de citocinas como o

TNF-α e Iδs (GUO et al., 1997), e estimula as terminações nervosas sensoriais,

fazendo com que seja liberada mais substância P (SP). A neurocinina B (NKB)

produz antinocicepção mediada por receptores opióides na medula espinhal e

está correlacionada com a dor neuropática (CAHILL; CODERRE, 2002).

Os mediadores envolvidos na dor são PG, NKA, peptídeo relacionado ao

gene da calcitonina (CGRP), entre outros (ROCHA et al., 2008). As cininas

(calidina e bradicinina) são importantes mediadores vasoativos derivados da

ação de enzimas denominadas calicreínas (tecidual ou plasmática) sobre

cininogênios de alto ou baixo peso molecular. Esses mediadores são, por sua

vez, degradados pela ação de enzimas chamadas cininases I e II e estão

envolvidos em vários processos inflamatórios, causando principalmente

aumento da permeabilidade vascular e formação de edema. A bradicinina tem

maior importância em processos inflamatórios, agindo preferencialmente via

ativação de receptores acoplados à proteína G, denominados receptores B2

quando ativados agudamente e, em condições crônicas, via receptores B1

(LIEBMANN et al., 1990; MEINI et al., 2009).

Sendo a dor o principal sintoma da inflamação que faz com que o

indivíduo doente procure ajuda médica, estando ou não associada a processos

inflamatórios, a busca de novos agentes para seu tratamento, com menos

reações adversas, é sempre necessária (ROCHA et al., 2008).

2.2 Dor

Segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP, 2002),

esta é definida como uma experiência sensorial e emocional desagradável

24

associada a um dano tecidual potencial e/ou real. Não obstante, é um processo

cognitivo dependente da memória e de aspectos culturais e psíquicos.

A dor sentida no momento da lesão é um evento fisiológico de proteção

que permite ao organismo localizar precisamente o local lesionado a fim de

cessar o estímulo doloroso, evitando ou reduzindo o dano tecidual (STEIN et

al., 2009). É produzida pela estimulação dos nociceptores mecânicos que

transmitem rapidamente os potenciais de ação através das fibras A . Se o

estímulo não causa dano e é de curta duração, a dor desaparece quando o

estímulo cessa (CHAPMAN, 2005).

No entanto, ao persistir o estímulo ou tendo havido lesão, a segunda

fase da dor é fisiopatologicamente responsável pela sensação dolorosa que

ocorre secundariamente a uma lesão e tem por finalidade proteger o local de

futuros traumas, ocorrendo após estímulo dos nociceptores e é transmitida por

fibras tipo C (CHAPMAN, 2005). Este sistema é primariamente envolvido com

respostas inflamatórias após estímulo sensitivo. Esta sensibilização causa

hiperalgesia ou alodínia em humanos, fenômenos que envolvem a percepção

da dor, e é mais bem descrita como hipernocicepção em modelos animais

(VERRI-JUNIOR et al., 2006; CUNHA et al., 2008).

As fibras nervosas responsáveis pela nocicepção são caracterizadas

como fibras aferentes primárias de pequeno diâmetro, denominadas fibras C e

A . As fibras C não são mielinizadas, possuem baixa velocidade de condução

(<1 m/s) e respondem a estímulos nocivos de origem térmica, mecânica ou

química. As fibras A são mielinizadas, apresentam velocidade de condução de

5-30 m/s e respondem a estímulos térmicos e mecânicos (JULIUS; BASBAUM,

2001).

Os mediadores inflamatórios envolvidos com a dor incluem a bradicinina,

PGE2, prostaciclina (PGI2), leucotrienos (LTB4), ácido (8R,15S)-di-hidroxi-icosa-

(5E-9,11,13Z) tetraenóico (8R,15S-diHETE), 5-hidroxitriptamina (5-HT),

adenosina, histamina, IL-1, IL-8, fator de crescimento do nervo (NGF), TNF-α,

mediadores derivados de fibras sensoriais, como a SP (LEVINE; REICHLING,

1999), K+, H+, ATP, NO, adenosina, neurotrofinas, neuropeptídios (NKA,

CGRP) e mediadores simpáticos, os quais podem agir de modo sinérgico

(KIDD; URBAN, 2001).

25

A bradicinina pode ativar direta ou indiretamente os nociceptores,

acarretando dor e/ou ainda sensibilização periférica, a qual envolve a liberação

de outros mediadores como as aminas biogênicas, neuropeptídios e a geração

de ácido araquidônico e prostanóides (DRAY; PERKINS, 1993). Os demais

mediadores, em sua maioria, agem através da ativação de receptores

acoplados à proteína G, fosforilando canais iônicos, via ativação das proteínas

quinases A (PKA) e C (PKC). Podem atuar ativando diretamente o nociceptor

(histamina e SP), induzindo dor espontânea, ou sensibilizando os nociceptores,

induzindo hiperalgesia (citocinas, 5-HT e PGE2) (RIEDEL; NEECK, 2001).

Um dos parâmetros possíveis de ser avaliado em animais de

experimentação é a hipernocicepção, que é a resposta exagerada a um

estímulo doloroso, causada pela ativação e sensibilização de nociceptores

periféricos que ocorre devido à ação de mediadores químicos produzidos pela

lesão ou inflamação tecidual (HOGAN, 2002). A hipernocicepção pode ser

primária, quando sentida no local da lesão e pode envolver aumento da

sensibilidade ao calor e a estímulos mecânicos, ou secundária, quando ocorrer

nas regiões circunvizinhas, envolvendo sensibilização central e sendo

caracterizada por um aumento da resposta a estímulos mecânicos (TREEDE;

MARGERL, 2000; SERPELL, 2006). A nocicepção visceral é um importante

aspecto da dor em humanos e, em geral, modelos de dor visceral em roedores

envolvem injeção intraperitoneal de algum agente irritante que deve induzir

contorções abdominais (HOGAN, 2002).

A inflamação e a dor, presentes em vários processos patológicos,

estão relacionados à liberação de radicais livres e espécies reativas

(SALVEMINI; DOYLE; CUZZOCREA, 2006). Portanto, substâncias com

atividade antioxidante também podem ser considerados no tratamento desses

males.

2.3 Radicais livres

Um radical livre équalquer espécie quecontém um ou mais elétrons

desemparelhados, ou seja, elétrons que individualmente estejam ocupando um

orbital atômico oumolecular. Estes radicais livres, que possuem o elétron

desemparelhado centrado nos átomos de oxigênio, nitrogênio ou cloro são

26

denominados, respectivamente, espécies reativas de oxigênio (ERO), de

nitrogênio (ERN) ou de cloro (ERC) (HALLIWELL; WHITEMAN, 2004).

O termo ERO inclui tanto os radicais de oxigênio como o ânion radical

superóxido (O2−) e o hidroxil (OH), quanto espécies não-radicalares que são

agentes oxidantes e/ou são facilmente convertidos em radicais como o

peróxido de hidrogênio (H2O2) e o oxigênio singlete (O21∆g). As ERN

compreendem os radicais livres de nitrogênio como o óxido nítrico (NO, ou

simplesmente NO, como será chamado de agora em diante) e as espécies

não-radicalares como o peroxinitrito (ONOO−). Do mesmo modo, fazem parte

das ERC o cloro radicalar (Cl) e o ácido hipocloroso (HOCl) (HALLIWELL;

WHITEMAN, 2004).

Em condições normais, estas espécies são geradas nas células

aeróbicas como subprodutos de uma série de reações metabólicas e são

rapidamente removidas por sistemas antioxidantes existentes na própria célula

(URUÑUELA et al., 2002). Quando a geração destas espécies reativas é

superior à capacidade dos sistemas antioxidantes endógenos, desenvolve-se o

estresse oxidativo (HALLIWELL; WHITEMAN, 2004), que provoca distúrbios na

homeostase celular, uma vez que as ERO/ERN/ERC podem causar alterações

bioquímicas e funcionais em diferentes níveis celulares, como lipoperoxidação,

oxidação de proteínas ou danos ao ácido desoxirribonucléico (DNA), entre

outros efeitos tóxicos (MONFARED et al., 2009). Indiretamente, estes radicais

agem na cascata do ácido araquidônico aumentando a produção de

tromboxano (TX) e de LTB4(RAU et al., 2000). Além disso, alguns dos produtos

resultantes da lipoperoxidação podem atuar como cofatores ou ativadores de

outros mecanismos patológicos (TSUKAHARA et al., 1999), ou ainda podem

atuar na via de sinalização dos receptores ativados pelo proliferador do

peroxissomo gama (PPAR- ), interferindo na regulação de macrófagos e

exacerbando o processo inflamatório (GUTIERREZ et al., 2008).

O malondialdeído (MDA) é o principal aldeído liberado pelas membranas

das células, resultante dos ataques das ERO a estas membranas, o que leva a

lipoperoxidação, um processo que primariamente acomete os ácidos graxos

poli-insaturados das biomembranas e se caracteriza por uma degradação auto

catalítica mediada por radicais livres (URUÑUELA et al., 2002). Em condições

27

normais, as ERO são geradas por processos celulares aeróbicos e removidas

por diferentes sistemas antioxidantes endógenos, mas em algumas situações,

como no quadro inflamatório agudo, estas defesas são insuficientes frente a

uma produção exacerbada de ERO, desenvolvendo o estresse oxidativo(RAU

et al., 2000). A geração destes radicais não é um evento iniciador da

inflamação, no entanto, o aumento das espécies reativas de oxigênio pode ser

considerado um importante mediador da lesão tecidual (SEVILLANO et al.,

2003).

Vários mediadores que se formam a partir do sistema oxidante estão

envolvidos no processo inflamatório, inclusive o óxido nítrico. O NO é um

importante mensageiro de vários sistemas no organismo participando, por

exemplo, na regulação do tônus vascular, na defesa imunológica do hospedeiro

promovendo a diminuição da migração de leucócitos para o local da

inflamação, na neurotransmissão e em inúmeras funções endócrinas. Algumas

disfunções vasculares estão associadas à produção prejudicada de NO.

Entretanto, conforme sua concentração e o tecido em questão, o NO (tanto

diretamente como por meio de espécies derivadas) pode atuar como agente

citotóxico, com importante papel no processo inflamatório (BARRETO;

CORREA; MUSCARÁ, 2005; SHUKLA et al., 2009).

O NO, um radical livre altamente reativo, tem efeitos biológicos

complexos e por vezes paradoxais, atuando ora como um mediador anti-

inflamatório, protegendo o endotélio pela inibição da agregação plaquetária e

da adesão de leucócitos, ora como um agente citotóxico via geração de

peroxinitrito (ANDICAN et al., 2005). Sua função biológica é influenciada pela

isoforma de óxido nítrico sintase (NOS) envolvida na sua síntese, pela

localização da sua produção e pela quantidade de NO produzido. Seu papel na

inflamação é controverso, apresentando efeito protetor, decorrente

principalmente da sua ação vasodilatadora na microcirculação (AKTAN,

2004),enquanto que em outros estudos, apresenta um papel deletério,

decorrente principalmente do estresse oxidativo, que contribui para a

citoxicidade de macrófagos e neutrófilos na resposta inflamatória (ANDICAN et

al., 2005; MEHTA, 2005).

28

Uma vez produzidas, as ERO são capazes de desencadear diversos

processos inflamatórios e seu papel tem sidoamplamente estudadoemdiversos

modelos animais(RAU et al., 2000; URUÑUELA et al., 2002; TURKYILMAZ et

al., 2008). Acredita-se que a liberação local de ERO e a infiltração de células

inflamatórias no tecido, principalmente neutrófilos, têm um papel fundamental

na evolução dos quadros inflamatórios e das complicações a eles associados

(CUZZOCREA et al., 2004). Elas podem atacar diretamente a matriz lipídica de

membranas biológicas e estimular o metabolismo do ácido araquidônico com o

aumento da produção de PG, TX e LT, reforçando assim o acúmulo e a

aderência de neutrófilos e plaquetas para a parede capilar(YU et al., 2002).

Assim, as ERO podem comprometer a microcirculação e perturbar a

integridade microvascular, resultando em diminuição da perfusão e aumento da

permeabilidade capilar e transudação de fluido (DABROWSKI et al., 1999).

2.4 Produtos naturais

A utilização de plantas pela necessidade de sobrevivência propiciou ao

longo da existência da humanidade a descoberta de possíveis aplicações

terapêuticas (RIOS; RECIO, 2005). Assim, em todas as civilizações, as mais

diversas enfermidades vêm sendo tradicionalmente cuidadas com chás, sucos,

tinturas, banhos, cataplasma e unguentos preparados, tendo as plantas como

base (YUNES et al., 2001).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS, 2011), nos

países em desenvolvimento, 70-80% da população depende de plantas

medicinais, exclusivamente ou como complementar para os cuidados básicos

com a saúde. No Brasil, a inserção da fitoterapia no âmbito do Sistema Único

de Saúde (SUS) foi estimulada a partir da aprovação da Política Nacional de

Plantas Medicinais e Fitoterápicos (BRASIL, 2006a) e da Política Nacional de

Práticas Integrativas e Complementares no SUS (BRASIL, 2006b), que buscam

valorizar o conhecimento construído pelas populações locais a respeito dos

seus recursos naturais e do seu uso na saúde e nas doenças, bem como

inserir o uso das plantas medicinais e dos fitoterápicos na atenção básica no

sistema público.

29

2.5 GêneroCroton

O gênero Crotonfaz parte da família Euphorbiaceaeque abrange cerca

de 300 gêneros e aproximadamente 8.000 espécies. A Croton spp. destaca-se

por seu expressivo número de espécies, aproximadamente 800 espécies

(COSTA et al., 2008). Nos últimos anos várias espécies vegetais desse gênero

foram estudadas para comprovação de seu uso terapêutico na medicina

(MOLLICK et al., 2011; CAVALCANTI et al., 2012; MONTOPOLI et al., 2012;

ZHAO et al., 2012; ALMEIDA et al., 2013).

No Brasil, há alta diversidade de espécies de Crotonna região Nordeste,

principalmente na vegetação da caatinga. Esse bioma cobre quase um milhão

de km2 desta região e sua vegetação xerófita característica é afetada por

períodos irregulares de seca, altas temperaturas e elevada radiação ultravioleta

(MORAIS et al., 2006). Cruz et al. (2007) enfatizam que a caatinga apresenta-

se com extrema diversidade de plantas medicinais e que mais estudos

fitoquímicos e farmacológicos são necessários para comprovação do uso

terapêutico popular desses vegetais.

A maioria das espécies do gênero Crotonapresenta aroma, propriedade

adquirida para combate a possíveis agentes biológicos agressores, com

enfoque aos terpenos produzidos como o α-pineno, o limoneno e o mirceno

(VIEGAS-JUNIOR, 2003). Este gênero tem importância na medicina popular da

região para tratamento de enfermidades como micoses, distúrbios

gastrintestinais, distúrbios estomacais, processos inflamatórios, diabetes, dor e

afecções do trato respiratório. Dentre os constituintes químicos presentes

nesse gênero destacam-se os terpenóides, flavonóides, alcalóides, esteróides,

taninos e saponinas (ALBUQUERQUE et al., 2007; COSTA et al., 2008;

MORAIS et al., 2006; RADULOVIC et al., 2006b; ROCHA et al., 2008; SANTOS

et al., 2008; SANTOS et al., 2009).

Veiga-Júnior, Pinto e Maciel (2008) ao pesquisarem a o extrato das

folhas de Crotoncajucara constataram ação no combate ao diabetes mellitus,

como a trans-deidrocrotonina (RODRIGUES et al., 2012) e efeito emagrecedor,

no entanto, alertam que diversas pessoas foram hospitalizadas nas cidades do

Rio de Janeiro (RJ) e em Belém (PA) devido ao uso indiscriminado, por longos

períodos, do chá dessa planta, por apresentarem toxicidade hepática. Gobbo-

30

Neto e Lopes (2007) alertam para a estocagem e procedência dos extratos das

plantas principalmente para uso em chás em virtude da sua composição

química, pois, o metabolismo secundário pode variar consideravelmente

dependendo de vários fatores. Nesse sentido, a ANVISAdispõe sobre o registro

de medicamentos fitoterápicos e exige a apresentação de uma série de

relatórios que atestem, para o preparo fitoterápico ao qual buscam registro, a

segurança e a eficácia dos produtos metabólitos a serem comercializados

(BRASIL, 2006a).

Ao pesquisar a atividade antioxidante de Croton zenhtnerie eCroton

nepetaefolium, Morais et al. (2006) constataram queentre os constituintes

químicos presentes nos óleos essenciais dessas espécies os

maispredominantes foram o ρ-anisaldeído, -anetol e o formiato de anisila para

aprimeira, e na segunda espécie as substâncias em maior concentração foram

ο-copaeno e o metil-eugenol; importante salientar que o-pineno e o óxido

decariofileno foram encontrados nas duas espécies e o biciclogermacreno na

Crotonnepetaefolium. Essas plantas mostram-se como uma fonte eficiente de

compostos antioxidantes através dos seus metabólitos secundários,

combatendo os radicais livres e protegendo o organismo contra os danos

induzidos pelo estresse oxidativo celular (SHUKLA et al., 2009).

Nos estudos de Radulovicet al. (2006) foi apresentado que a maioria

das espécies de Crotoncontem -cariofileno e α/ -pineno.Estudos

desenvolvidos por Rocha et al. (2008) avaliaram a ação anti-inflamatória e o

efeito antinociceptivo de Crotonpullei. Essa planta vem sendo utilizada pela

população amazonense no combate a dores e processos inflamatórios. Os

resultados desta pesquisa corroboraram com o uso popular desta planta, ou

seja, foram demonstradas ações antinociceptiva e anti-inflamatória. Esses

mesmos autores através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria

de massa identificaram as substâncias químicas que compunham o óleo

essencial das folhas de Croton nepetaefoliuse Croton zenhtneri, para a

primeira, os constituintes presentes em maior concentração foram metil-

eugenol, biciclogermacreno e -cariofileno , e o estragole para a segunda

espécie.

31

2.6Croton argyrophyllus Kunth

A espécie Croton argyrophyllusKunth (Figura 1), conhecida

popularmente como “sacatinga” ou “marmeleiro prateado”, uma planta da

caatinga, vegetando em lugares pedregosos, apresenta-se morfologicamente

como um arbusto de ramos delgados, cilíndricos e cenerescentes, sendo uma

espécie nativa do nordeste. Suas folhas e cascas têm sido estudadas no intuito

de se conhecer suas ações, farmacoterapêuticas e toxicológicas, e de validar

seu uso na medicina popular, sendo observada a ausência do conhecimento a

respeito das ações anti-inflamatórias e antinociceptivas da Croton

argyrophyllusKunth.

Nos estudos desenvolvidos por Cruz (2002) na região de Canindé do

São Francisco-SE, verificou-se que diversas pessoas da comunidade fazem

uso dessa planta no combate a problemas do trato respiratório. Algumas

pesquisas foram desenvolvidas com essa espécie com a finalidade de

confrontar os resultados com o uso popular. Morais et al. (2006), empregando

técnicas para verificar a atividade antioxidante, identificou na entrecasca

daCroton argyrophyllus Kunth a presença de α-pineno , E-cariofileno e 1,8

cineol . Deste modo, procurando viabilizar a veracidade do seu uso, tornam-se

necessárias constatar a existência destas atividades. Em consequência disso,

esta pesquisa avaliou as atividades anti-inflamatória, antinociceptiva e

antioxidante do óleo essencial da Croton argyrophyllus Kunth.

32

Figura 1: Hábito de Croton argyrophyllusKunth. Fonte: Acervo pessoal. 2010.

33

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar os constituintes presentes e investigar as ações farmacológicas do

óleo essencial das folhas da Croton argyrophyllusKunth.

3.2 Objetivos Específicos

Analisar os constituintes do OE da Croton argyrophyllusKunth.

Avaliar a atividade anti-edematogênica do OE da Croton argyrophyllusKunth

em modelo in vivo.

Avaliar a capacidade do OE em inibir:

- O infiltrado de leucócitos em modelos in vivo;

- A produção de metabólitos do NO.

Avaliar a atividade antinociceptiva do OE da Croton argyrophyllusKunthem

modelos de nocicepção induzidos por agentes químicos e térmicos, in vivo.

Avaliar in vivo o envolvimento:

- Do sistema L-arginina/óxido nítrico na atividade antinociceptiva do OE

da Croton argyrophyllusKunth;

- Do sistema opióide na atividade antinociceptiva do OE da Croton

argyrophyllusKunth;

- Da via glutamatérgica na atividade antinociceptiva OE da Croton

argyrophyllusKunth.

- Da via neurogênica na atividade antinociceptiva OE da Croton

argyrophyllusKunth.

Avaliar a atividade antioxidante do OE da Croton argyrophyllusKunth frente

a diferentes agentes oxidantes in vitro.

Avaliar o efeito do OE da Croton argyrophyllusKunth sobre a atividade

locomotora em modelo in vivo.

34

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Coleta e Identificação da Planta

A Croton argyrophyllus Kunth utilizada nesta pesquisa foi coletada no

Povoado Curituba, Município de Canindé do São Francisco - SE, em 10 de

outubro de 2010 (na estação primavera), com auxílio de mateiros da região e a

utilização do Global Positioning System (GPS) para o georreferenciamento. Os

pontos estabelecidos pelo aparelho foram: 09°γ9’γ9.8”S, γ7°55’17.8”O com

altitude de 98 m. Um espécime foi identificado pela botânica Profa. Dra. Ana

Paula Prata do Departamento de Biologia da UFS, e depositado no Herbário da

Universidade Federal de Sergipe (Av. Marechal Rondon S/N, São Cristóvão –

SE, 49.100-000, Brasil) sob o nº ASE 20.584.

4.2 Extração do óleo essencial

A extração óleo essencial da Croton argyrophyllus foi realizada no

laboratório de Fitotecnia do departamento de Agronomia da Universidade

Federal de Sergipe sob a coordenação do Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank.

O óleo essencial das folhas frescas (7.300 g) foi extraído por

hidrodestilação através de aparelho do tipo Clevenger. As folhas frescas foram

transferidas para balão de destilação que seguiu por um processo de

aquecimento com o auxílio de mantas térmicas atingindo a temperatura de

70°C, possibilitando dessa forma, a origem de vapores e a extração dos

constituintes voláteis das folhas. O óleo e o hidrolato foram condensados no

Clevenger. O primeiro foi coletado e armazenado em recipientes de vidro

opaco em freezer a –20ºC, e o segundo, ou seja, o hidrolato foi descartado. Ao

final, deste processo, obteve-se o rendimento calculado segundo a

Farmacopéia Brasileira com o uso de picnômetro calibrado. Todas as doses do

OE administradas foram calculadas levando-se em conta a densidade do óleo

essencial da C. argyrophyllus.

35

4.3 Análise Cromatográfica

As análises foram realizadas utilizando um CG-MS/CG-DIC (GC-2010

Plus; GCMS-QP2010 Ultra, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão) equipado

com um amostrador automático AOC-20i (Shimadzu). As separações foram

realizadas usando uma coluna capilar de sílica fundida Rtx®-5MS Restek

(polissiloxano 5%-difenil-95%-dimetil) de 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno

(d.i.), 0,25 µm de espessura de filme, em um fluxo constante de hélio

(99,999%) com taxa de 1,2 mL/min. Foi utilizado um volume de injeção de 0,5

µL (5 mg/mL), com uma razão de split de 1:10. A programação de temperatura

do forno utilizada foi a partir de 50°C (isoterma durante 1,5 min), com um

aumento de 4° C/min, à 200°C, em seguida, a 10°C/min até 250°C, terminando

com uma isoterma de 5 min a 250°C.

Os dados de CG-EM e CG-DIC foram simultaneamente adquiridos

empregando um sistema de separação de detector; a razão de separação de

escoamento foi de 4:1 (EM: FID). Um tubo restritor de 0,62 m x 0,15 milímetros

d.i. (coluna capilar) foi usado para ligar o divisor para o detector do EM; um

tubo restritor de 0,74 m x 0,22 mm d.i. foi usado para ligar o divisor para o

detector do DIC. A temperatura do injetor foi de 250°C e a temperatura da fonte

de íons foi de 250°C. Os íons foram gerados à 70 eV; uma velocidade de

varredura de 0,3 fragmentos/s detectados no intervalo de 40-350 Da. A

temperatura do DIC foi ajustada para 250ºC, e os suprimentos de gás para o

DIC foram hidrogênio, ar e hélio em taxas de fluxo de 30, 300 e 30 mL/min,

respectivamente. A quantificação de cada constituinte foi estimada por

normalização área do pico gerado no DIC (%). As concentrações dos

compostos foram calculadas a partir das áreas dos picos de CG e foram

dispostos por ordem de eluição do CG.

A identificação dos constituintes foi realizada com base na comparação

dos índices de retenção da literatura (ADAMS, 2007). Para o índice de

retenção foi utilizando a equação de Van denDool e Kratz (1963) em relação a

uma série homóloga de n-alcanos (nC9-nC18). Também foram utilizadas três

bibliotecas do equipamento WILEY8, NIST107 e NIST21 que permite a

36

comparação dos dados dos espectros com aqueles constantes das bibliotecas

utilizando um índice de similaridade de 80%.

44 Estudo da atividade antioxidante

4.4.1 Peroxidação lipídica in vitro

Para determinar o conteúdo de substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico (TBARS), como indicativo de lipoperoxidação, conforme

previamente descrito por Gelainet al. (2004), sistemas in vitro de produção de

radicais com FeSO4 (0,145 mM) ou FeSO4 (0,145 mM) + H2O2 (0,4 M) foram

utilizados, e a capacidade do extrato de prevenir ou aumentar o dano oxidativo

causado por esses sistemas em uma preparação de lipossomos (gema de ovo

a 0,1% p/v, 50 mM tampão fosfato, pH 7,4, sonicado por 10 s em potência 4) foi

quantificada. Após incubação por 1 hora a 37°C com o OE da C. argyrophyllus

nas concentrações de 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 e 100 µg/mL, as amostras (0,3

mL) tiveram as proteínas precipitadas pela adição de ácido tricloroacético

(TCA, 0,6 mL) a 20%, e foram centrifugadas (10.000xg por 10 min, 4°C). Os

sobrenadantes (0,5 mL) foram incubados com ácido tiobarbitúrico (TBA,

solução 0,67%, 0,5 mL) em banho a 100°C por 30 min. Após resfriamento em

banho de gelo, as amostras foram lidas em espectrofotômetro (532 nm), a

concentração de TBARS calculada usando o coeficiente de absorção 1,56 ×

105/M x cm e os resultados, em triplicata, expressos em percentual de

malondialdeído (MDA), o qual se condensa com o TBA produzindo cromógenos

com absortividade molar no espectro visível. O sistema contendo FeSO4 (0,145

mM) ou FeSO4 (0,145 mM) + H2O2 (0,4 M), gema de ovo a 0,1% e tampão

fosfato foi considerado como indutor de 100% de dano lipoperoxidativo

(ESTERBAUER; CHEESEMAN, 1990). Como controle padrão foi utilizada a

vitaminaC (Sigma ChemCo, EUA; 0,001 - 100 µg/mL), em triplicata. Para

normalizar os resultados encontrados, todos os valores obtidos foram

subtraídos do valor do branco (gema de ovo a 0,1% em tampão fosfato).

4.4.2 Atividade scavenger de radical óxido nítrico (NO)

37

A atividade do OE da C. argyrophyllus como scavenger de radical NO foi

medida em um sistemain vitro de produção de NO por nitroprussiato de sódio

em tampão fosfato 20 mM (pH 7,4). Uma vez gerado do sistema, o NO reage

com oxigênio para produzir nitrito, os quais são quantificados

espectrofotometricamentepela reação de Griess, utilizando kit de reagente de

Griess. Após incubação do sistema de produção de NO com o composto

estudado (OE nas concentrações de 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 e 100 µg/mL, 0,05

mL) por 60 min a 37°C, o reagente de Griess foi adicionado e incubado por

mais 15 min, sendo a absorbância em 540 nm determinada em

espectrofotômetro(XU et al., 2008). A vitamina C (0,001 - 100 µg/mL) foi

utilizada como controle positivo.

4.5 Animais

Os animais, ratosWistar (180-220 g) e camundongos Swiss(20-30 g),

machos, adultos, foram obtidos do Biotério Central da Universidade Federal de

Sergipe (São Cristóvão, Brasil) e transportados para o biotério local do

Departamento de Fisiologia antes do uso, onde permaneceram por pelo menos

02 dias até o manuseio. Os animais foram aleatoriamente divididos em grupos

e mantidos em caixas plásticas (5 ratos ou 8 camundongos por caixa) em sala

com temperatura controlada (21 ± 2°C), com água e ração ad libitum, sob ciclo

claro/escuro de 12:12 h, e troca da serragem a cada 2 dias. Todos os

procedimentos experimentais foram conduzidos durante o período das 7 às 17

h, e de acordo com as normas de procedimentos sobre cuidados com animais

para uso em pesquisa do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da

Universidade Federal de Sergipe e da Sociedade Brasileira de Cuidados com

Animais de Laboratório (SBCAL).Para o desenvolvimento deste projeto, o

mesmo foi submetido ao CEPA da Universidade Federal de Sergipe e

aprovado sob o protocolo n.º 06/2011.

Os animais submetidos à administração oral do óleo essencial e dos

controles foram aclimatados no laboratório durante 24 h e colocados em jejum

12 h antes do experimento. Todos os esforços foram realizados para minimizar

38

o número de animais usados e o sofrimento destes, sendo administrado

anestésico sempre que necessário.

Posteriormente, após o manuseio dos animais nos procedimentos in

vivo, estes foram anestesiados com uma dose de 50 mg/kg (i.p.) de tiopental

sódico (Thiopentax – Cristália/SP) e eutanasiados por deslocamento cervical,

acondicionados em sacos plásticos brancos e guardados em freezer reservado

para esta finalidade, até o descarte definitivo conforme a rotina do

Departamento de Fisiologia, pelo serviço de coleta seletiva de lixo biológico da

UFS.

4.6Tratamentos

Os animais foram pré-tratados com o OE da C. argyrophyllus em

diferentes doses (10, 30 e 100 mg/kg) ou com o veículo (Tween 80 a 0,2% em

solução salina NaCl 0,9%, 10 mL/kg, controle negativo) por via oral (v.o.) 1 h

antes da administração dos compostos indutores da inflamação ou nocicepção.

Como controle positivo, grupos de animais foram tratados com ácido

acetilsalicílico (Sigma ChemCo., EUA; AAS; 300 mg/kg, v.o., 60 min antes da

administração do agente flogístico), dexametasona

(ResearchBiochemicalsInternational, EUA; 2 mg/kg, subcutânea (s.c.), 60 min

antes da administração do agente flogístico), morfina (Cristália, SP; 3 mg/kg,

i.p., 30 min antes da administração do agente flogístico ou da inserção dos

animais na placa quente) ou diazepam (Cristália, SP; 1,5 mg/kg, i.p., 30 min

antes da inserção no campo aberto), dependendo do teste. Em adição, grupos

separados de animais foram inicialmente tratados com naloxona

(ResearchBiochemicalsInternational, EUA; 5 mg/kg, i.p., 60 min antes da

inserção na placa quente) e, posteriormente, com o OE (100 mg/kg, v.o., 30

min antes da administração do agente flogístico, inserção da placa quente ou

no campo aberto) ou morfina (3 mg/kg, i.p., 30 min antes da administração do

agente flogístico ou inserção na placa quente). Para avaliar o envolvimento do

sistema L-arginina/óxido nítrico, grupos de animais foram tratados com L-

arginina (600 mg/kg, i.p), 15 minutos antes da administração de OE (100

mg/kg, v.o.) ou L-NOARG (75 mg/kg, i.p.).

39

4.7 Avaliação da Atividade Anti-inflamatória

4.7.1 Edema de pata em ratos

Um método utilizado para avaliar a atividade anti-inflamatória foi o

modelo de edema de pata induzido pela carragenina a 1% (Sigma ChemCo.,

EUA), administrada no volume de 100 μδ/animal na região subplantar (s.pl.) da

pata traseira direita do rato, segundo o método descrito por Winter, Risley e

Nuss (1962) modificado. Os animais (ratos Wistar, 180-220 g, n=6/grupo) foram

pré-tratados (60 min antes da injeção de carragenina) com o OE da C.

argyrophyllus (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.), dexametasona (2 mg/kg, s.c., grupo

controle positivo) ou veículo (tween 80 a 0,2%, v.o.). Na região s.pl. das patas

contralaterais dos ratos que receberam o pré-tratamento com veículo foram

injetados 100 μδ de salina a 0,9%/animal. O volume da pata foi medido com o

auxílio de um hidropletismômetro (modelo 7150, Ugo Basile, Itália),

observando-se o deslocamento da coluna de líquido, imediatamente antes da

injeção s.pl. do agente edematogênico carragenina, sendo esta denominada

medida basal. Medidas do volume da pata foram novamente realizadas em

intervalos regulares de 1, 2, 3 e 4 h após a injeção da carragenina (HARRIS;

SPENCER, 1962). Os resultados estão expressos como média ± E.P.M. da

variação do volume (mL) da pata encontrada entre os grupos controle e

tratados. Também foram calculados os valores de área sob a curva (ASC),

utilizando a regra trapezoidal, em todos os grupos. A porcentagem de inibição

no edema foi calculada com base na ASC.

4.7.2 Ensaio de mieloperoxidase (MPO) nas patas de ratos

O recrutamento de neutrófilos foi indiretamente medido pela atividade da

MPO, que se baseia na velocidade de oxidação do substrato о-dianisidina na

presença de H2O2, evidenciada pela mudança de absorbância medida a 460

nm para tanto, os animais provenientes do edema de pata foram eutanasiados

após a 4ª hora e o tecido muscular da região s.pl. das patas estimuladas com

carragenina e das contra-patas onde foi injetada apenas salina (0,9%, 100

40

μδ/pata) foi coletado, pesado, cortado em pedaços pequenos e mantido em

tubos teste na presença de tampão fosfato [50 mM, pH 6,0 contendo 0,5% de

brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB, Sigma Chem. Co, EUA)].

Cada amostra foi homogeneizada em homogeneizador de tecidos Ultra

Turrax e alíquotas do homogenato foram aquecidas durante 2 h a 60°C para

inativação da catalase endógena (OHTA; KONGO; KISHIKAWA, 2003) e,

posteriormente, centrifugadas a 12.000xg por 5 min a 4°C. Os sobrenadantes

obtidos foram submetidos à análise da atividade da MPO, conforme descrito a

seguir. Em placa de 96 poços, os sobrenadantes foram adicionados a solução

de di-hidrocloreto de o-dianisidina (Sigma Chem. Co, EUA; 0,167 mg/mL,

preparada em tampão fosfato de potássio 50 mM contendo 0,005% de H2O2).

As alterações nos valores de absorbância a 460 nm foram registradas

em leitor de microplaca (LabsystemMultiskan®, Helsinki, Finlândia) e os

resultados foram expressos como unidades de MPO (UMPO)/mg de tecido,

considerando-se 1 UεPO como a quantidade de enzima que degrada 1 μmol

de H2O2 por min, gerando variação de absorbância de 0,0113 unidades de

absorbância, conforme previamente descrito (BRADLEY et al., 1982;

CAMARGO et al., 2008).

4.7.3 Peritonite em camundongos

Camundongos Swiss (20–30 g, n = 6/grupo) foram pré-tratados com o

OE da C. argyrophyllus (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.), dexametasona (2 mg/kg,

s.c.) ou veículo (tween 80 a 0,2%, v.o.), e após 1 h foi injetada uma solução de

carragenina i.p. (1%, 0,25 mL, diluída em salina), de acordo com a técnica

modificada de Mendes et al. (2010). Após 4 h da injeção da carragenina, os

animais foram anestesiados com tiopental sódico (50 mg/kg, i.p.) e

eutanasiados por deslocamento cervical. Para a coleta dos fluidos peritoneais

foi utilizada solução salina contendo 1mM de ácido etilenodiaminotetracético

(EDTA, 3 mL, i.p.). A contagem dos leucócitos totais foi realizada em câmara

de Neubauer e a contagem diferencial em esfregaço sob lâmina obtido por

citocentrifugação a 600 rpm/10 min em citocentrífuga de bancada (Sorocito

2400, FANEN®, São Paulo-SP), analisadas sob microscópio ótico (CX41,

41

Olympus Optical do Brasil®, São Paulo-SP) baseado no critério morfológico

normal. Os resultados foram expressos como número de leucócitos/mL e a

porcentagem de inibição de leucócitos foi calculada pela fórmula: % inibição=

(1 – T/C) x 100, onde T representa a contagem de leucócitos dos grupos

tratados e C representa a contagem de leucócitos do grupo controle.

4.7.4 Determinação de Metabólitos do NO (NOx-)

A técnica se baseia na detecção de nitrato e nitrito, metabólitos do NO,

após a redução do nitrato a nitrito, que foi determinado pela reação de Griess,

segundo método modificado de Grisham et al.(1996). Os camundongos

(n=6/grupo) foram pré-tratados com o OE da C. argyrophyllus (100 mg/kg, p.o.),

dexametasona (2 mg/kg, s.c.) ou veículo (tween a 0,2%, p.o.) 1 h antes da

administração de carragenina. Amostras de lavado peritoneal, recolhidas 6 h

após a indução do experimento de peritonite realizado previamente, foram

centrifugadas em microtubos de 10 kDa (Microcon, Ultracel YM-10, Millipore,

USA) a 8000xg durante 120 min. Em seguida, 100 µL do sobrenadante foram

incubados durante 30 min a 37ºC em estufa na presença de Aspergillus nitrato

redutase, flavinaadenosídeodinucleotídeo (FAD) e fosfato de dinucleotídio de

nicotinamida e adenina (NADPH), preparadas em tampão Tris-HCl pH 7,6.

Decorrido este tempo, foram acrescentados lactato desidrogenase e ácido

pirúvico com incubação adicional de 30 min a 37ºC. Ao final do período de

incubação, 100 µL do reagente de Griess (iguais volumes de 0,2% (v/v) de

naftilenoetilenodiamina e 2% (v/v) de sulfanilamida em 5% (v/v) de ácido

fosfórico) foram adicionados, e após 10 min em temperatura ambiente, foi

determinada a absorbância a 540 nm em leitor de microplaca. A curva-padrão

de NaNO3 nas concentrações 0,2-200,0 µmol/L foi realizada e os resultados

foram expressos como µmol de NOx- por litro de lavado.

4.8 Avaliação da atividade antinociceptiva

4.8.1 Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético

42

As contorções abdominais consistem de uma contração no músculo

abdominal junto a um alongamento dos membros traseiros (TORNOS et al.,

1999), induzidas pela injeção i.p. de ácido acético (solução a 0,6%, 0,1 mL/10

g) em camundongos (KOSTER; ANDERSON; DEBBER, 1959).

Os animais (camundongos Swiss, 20-30 g, n=6/grupo) foram pré-

tratados com OE da C. argyrophyllus (10, 30 ou 100 mg/kg), AAS (300 mg/kg,

usado como controle positivo) ou veículo (tween 80 a 0,2%, usado como

controle negativo) oralmente, 60 min antes da aplicação do estímulo doloroso.

Para a observação das contorções abdominais, os animais foram dispostos em

grupos de 3 em caixas plásticas e a avaliação foi feita por um único

observador. As contorções foram contadas durante um período de 20 min,

começando 5 min após a administração do ácido acético.

4.8.2 Teste da formalina

O teste da formalina foi realizado de acordo com o método descrito por

Dubuisson e Dennis (1977), e posteriormente modificado por Hunskaar e Hole

(1987). Os camundongos (Swiss, 20-30 g, n=6/grupo) foram tratados com o OE

da C. argyrophyllus (10, 30 ou 100 mg/kg, v.o., 60 min antes), morfina (3

mg/kg; i.p., 30 min antes) e AAS (300 mg/kg, v.o., 60 min antes) antes da

injeção s.pl. da solução de formalina a β% (β0 μδ/pata traseira direita). O grupo

controle negativo recebeu tween 80 (0,2% em salina 0,9%, 0,1 mL/10 g, v.o.,

60 min antes). O tempo que o animal gastou lambendo ou mordendo sua pata

foi medido durante a primeira (0-5 min) e a segunda (15-30 min) fases do teste.

4.8.3 Teste da placa quente

Os animais (camundongos Swiss, 20-30 g, n=6/grupo) foram pré-

tratados com o OE da C. argyrophyllus (10, 30 e 100 mg/kg, v.o., 30 min

antes), morfina (3 mg/kg, i.p., 30 min antes), veículo (tween 80 a 0,2%, v.o., 30

min antes), naloxona (5 mg/kg, i.p., 60 min antes) + morfina (3 mg/kg, i.p., 30

min antes), ou naloxona (5 mg/kg, i.p., 60 min antes) + OE da C. argyrophyllus

(100 mg/kg, v.o., 30 min antes) e, posteriormente, colocados individualmente

sobre uma placa metálica (Insight, Brasil) aquecida a 55 ± 0,5ºC. Os

43

camundongos que se mantiveram na placa, em um ensaio 24 h antes do teste,

por mais de 10 s sem apresentar reação ao estímulo, foram excluídos do teste

(JACOB; TREMBLAY; COIOMEEL, 1974; JACOB; RAMABADRAN, 1978).

O tempo decorrido até o aparecimento de reações ao estímulo térmico

(latência, em s), tais como lamber, sapatear ou sacudir (flinch) a pata traseira,

foi registrado como índice de nocicepção (WOOLFE; MACDONALD, 1944) nos

tempos 30, 60, 90, 120 e 150 min após o tratamento. Um corte no período de

30 s foi imposto para evitar danos às patas, sendo, portanto, o tempo de

latência máximo.

4.8.4 Teste da nocicepção induzida por capsaicina

A injeção subcutânea de capsaicina, uma neurotoxina extraída de

pimenta do gênero Capsicum, é capaz de promover dor de origem neurogênica

através da ativação seletiva das fibras aferentes primárias do tipo C, induzindo

a liberação espinhal de glutamato e substância P, com o envolvimento de NO

(SAKURADA et al., 2003). Grupos de animais (n=8) foram tratados com veículo

(tween80 a 0,2%, v.o., 60 min antes), OE da C. argyrophyllus em diferentes

doses (10, 30 e 100 mg/kg, v.o., 60 min antes) ou morfina (3 mg/kg, i.p., 30 min

antes) e posteriormente receberam injeção de β0 μδ de uma solução de

capsaicina (1,6 μg/pata). Em seguida, os animais foram colocados em caixas

espelhadas, e observados durante os 5 min subsequentes. O tempo que os

animais despenderam lambendo ou mordendo a pata injetada foi registrado

com o auxílio de um cronômetro, e considerado como indicativo de nocicepção

(SAKURADA et al., 1992; SANTOS; CALIXTO, 1997).

4.8.5 Teste da nocicepção induzida por glutamato

Com o objetivo de obter evidências mais diretas a respeito da interação

da C. argyrophyllus com o sistema glutamatérgico, foi avaliado seu efeito frente

à injeção i.pl. de glutamato. Camundongos (n=8/grupo)foram pré-tratados com

veículo (tween80 a 0,2%, v.o., 60 min antes), OE da C. argyrophyllus nas

doses de 10, 30 e 100 mg/kg (v.o., 60 min antes), ou morfina 3 mg/kg (i.p., 30

44

min antes), após o tempo foram submetidos à injeção de β0 μδ de uma solução

de glutamato (β0 μmol/pata) na pata posterior direita. Em seguida, os animais

foram observados por um período de 15 min em caixas espelhadas, iniciados

imediatamente após a injeção de glutamato, como descrito anteriormente

(BEIRITH et al., 2002). O tempo despendido pelos animais para lamber ou

morder a pata injetada foi considerado como indicativo de nocicepção.

4.8.6 Participação do sistema L-arginina/óxido nítrico

Para avaliar se parte da atividade antinociceptiva apresentada pelo OE

da C. argyrophyllus envolve a inibição da via L-arginina/óxido nítrico, 24

camundongos foram pré-tratados com L-arginina (substrato para a enzima

óxido nítrico sintase; NOS; 600 mg/kg, i.p.) e, após 15 min, com OE da C.

argyrophyllus (100 mg/kg, v.o.; n=8), L-NOARG (inibidor da enzima NOS, 75

mg/kg, i.p.; n=8) ou veículo (tween80 a 0,2%, v.o., n=8) (VAZ et al., 1996;

BEIRITH et al., 1998). Decorridos 60 min do último tratamento, os animais

foram submetidos ao teste das contorções abdominais – administração de

ácido acético a 0,6% (i.p.) e quantificação das contorções abdominais durante

20 min depois de decorridos 5 min da administração do agente nociceptivo, de

acordo com Koster, Anderson e Beer (1959) e Broadbearet al. (1994). Os 3

grupos controles foram tratados somente com OE da C. argyrophyllus (100

mg/kg, v.o.; n=8), L-NOARG (75 mg/kg, i.p.; n=8) ou veículo (tween80 a 0,2%;

v.o., n=8), 60 min antes da indução da nocicepção.

4.9 Estudo da Atividade Locomotora

4.9.1Teste do campo aberto

A atividade locomotora dos animais foi investigada no campo aberto

(Insight®, Ribeirão Preto-SP) de 60 cm de diâmetro. Os camundongos foram

divididos em três grupos experimentais contendo 6 animais cada e tratados

com veículo ou OE da C. argyrophyllus (100 mg/kg; v.o.) 1 h antes e diazepam

(Compaz - Cristália®, Itapira-SP; 1,5 mg/kg; i.p.) 30 min antes de serem

colocados individualmente ao campo aberto, e após 1 minuto de ambientação,

45

foi registrada durante 4 min a frequência de locomoção dos animais, que

consistiu do ato do animal penetrar com as quatro patas em uma das divisões

da arena do campo aberto, e foi expressa como número de campos cruzados,

segundo descrição de Capaz et al. (1981).

4.10 Análise Estatística

Os resultados dos experimentos foram expressos com média ± erro

padrão da média (E.P.M.) e analisados estatisticamente utilizando-se a análise

de variância (ANOVA), e o pós-teste de Bonferroni ou Newman-Keuls, através

do programa GraphPadPrism (versão 5.0). Valores de P<0,05 foram

considerados estatisticamente significativos.

46

5 RESULTADOS

5.1 Extração e Análise Cromatográfica do OE da Croton argyrophyllusKunth

O rendimento foi de 0,76% de óleo essencial por 100 g de folhas, com

densidade de 0,93 g/mL. A tabela 1 mostra os quarenta e dois compostos do

OE da Croton argyrophyllusKunth que foram identificados por CG-MS/FID

(Figura 2), além dos índices de retenção, e percentagem de composto na

composição do óleo, listados em ordem de eluição. Observou-se que os

principais componentes do óleo foram os terpenos biciclogermacreno,

espatuleno, (E)-cariofileno, β-elemeno, β-felandreno, mirceno e óxido de

cariofileno (tabela 1).

Figura 2: Cromatograma do óleo essencial da Croton argyrophyllusKunth realizado pela técnica de CG-MS/FID.

47

Tabela 1. Composição do óleo essencial das folhas de Croton

argyrophyllusKunth.

RRI Compostos GC-MS (%) GC-FID (%) 928 α-tujeno 0,80 1,24 932 α-pineno 1,79 2,83 975 Sabineno 1,06 1,56 979 -pineno 1,39 2,17 992 Mirceno 3,42 4,81 1006 α-felandreno 0,28 0,33 1008 -3-careno 1,88 2,57 1026 p-cimeno 0,24 0,27 1032 -felandreno 4,62 5,75 1034 1,8-cineol 1,86 2,52 1049 E- -ocimeno 0,59 0,73 1061 -terpineno 0,29 0,39 1069 Hidrato de cis-sabineno 0,35 0,36 1091 Terpinoleno 0,75 0,95 1101 Linalol 0,88 0,90 1181 Terpinen-4-ol 0,74 0,75 1195 α-terpineol 0,69 0,53 1344 -elemeno 2,33 2,85 1355 α-terpinil acetato 0,37 0,35 1394 -bourboneno 0,34 0,42 1399 -elemeno 5,83 6,19 1430 (E)-cariofileno 6,78 6,79 1441 -elemeno 1,04 1,19 1452 6,9-guaiadieno 0,55 0,58 1464 α-humuleno 1,47 0,93 1472 Allo-aromadendreno 0,46 0,47 1491 Germacreno-D 0,68 0,68 1509 Biciclogermacreno 15,27 14,60 1525 Cubebol 0,38 0,32 1532 -cadineno 0,33 0,34 1554 α-calacoreno 0,36 0,20 1559 Elemol 1,99 1,37 1588 Germacrene-D-4-ol 0,28 0,18 1592 Espatulenol 10,10 8,27 1598 Cariofileno óxido 4,36 3,68 1618 Ledol 1,85 1,41 1627 Eremoligenol 2,23 1,85 1651 Allo-aromadendreno epóxido 1,79 1,46 1665 α-eudesmol 1,58 1,18 1672 cis-calamenen-10-ol 0,73 0,67 1681 trans-calamenen-10-ol 0,99 0,83 1684 14-hidroxi-9-epi-(E)-cariofileno 0,61 0,55 Total identificado 84,33 86,02 RRI: Índice de Retenção Relativo, % Percentagem do composto.

48

5.2 Avaliação da atividade antioxidante

O radical óxido nítrico gerado a partir do nitroprussiato de sódio foi

inibido pelo OE da Croton argyrophyllus Kunth em todas as concentrações

estudadas (P < 0,001, Tabela 2). O óleo essencial em estudo também preveniu

a lipoperoxidação induzida pelo FeSO4e pelo FeSO4associado a H2O2, em

todas as concentrações estudadas (P < 0,001, Tabela 2).

Tabela 2. Atividade antioxidante do OE da Croton argyrophyllusKunth frente a diversos estímulos.

Valores mostrados como média ±E.P.M. (triplicata). * P < 0,001 versus o resultado do respectivo sistema (ANOVA e pós-teste de Newman-Keuls).

5.3 Edema de Pata

Inibição (%)

Amostra (μg/mL) Atividade scavenger do

radical NO

TBARS (FeSO4)

TBARS (FeSO4 +

H2O2) OE 0,001 57,22 ± 2,65* 51,97 ± 0,66* 75,22 ± 2,61*

OE 0,01 56,35 ± 2,34* 53,51 ± 0,38* 77,65 ± 0,96*

OE 0,1 56,26 ± 3,14* 59,65 ± 0,76* 75,10 ± 1,99*

OE 1,0 51,39 ± 3,26* 60,96 ± 0,38* 78,93 ± 2,33*

OE10,0 52,09 ± 0,66* 69,96 ± 1,66* 80,72 ± 0,22*

OE100,0 52,35 ± 0,99* 70,61 ± 0,76* 83,27 ± 0,22*

Vitamina C 0,001 78,53 ± 1,20* 49,25 ± 1,26* 70,27 ± 0,92*

Vitamina C 0,01 80,82 ± 1,02* 53,92 ± 3,91* 76,11 ± 1,40*

Vitamina C 0,1 81,93 ± 0,21* 54,26 ± 5,21* 78,41 ± 0,31*

Vitamina C 1,0 82,27 ± 0,12* 60,27 ± 2,52* 78,94 ± 0,31*

Vitamina C 10,0 83,38 ± 0,55* 73,62 ± 5,36* 77,70 ± 0,53*

Vitamina C 100,0 85,87 ± 0,55* 79,30 ± 1,76* 78,05 ± 0,31*

49

Conforme demonstrado na Figura 3A, o tratamento com o OE da C.

argyrophyllus Kunth na dose de 100 mg/kg reduziu significativamente (P<0,05)

a formação do edema de pata induzido pela carragenina comparando-se com o

grupo que foi submetido somente ao pré-tratamento com veículo; efeito este

observado a partir da 3ª hora após indução. Em adição, as doses de 10, 30 e

100 mg/kg reduziram (P<0,05) a formação do edema na 3ª h. Como esperado,

a dexametasona (2 mg/kg) inibiu (P<0,05) a resposta edematogênica evocada

pela carragenina a partir da 2ª hora.

Com base nos valores da ASC0-4h, foi observado que a injeção s.pl. de

carragenina, em animais pré-tratados com veículo, aumentou (P < 0,001) a

formação do edema quando a comparação foi realizada com os animais que

receberam a injeção s.pl. de salina a 0,9% na contra-pata (Figura 3B). O pré-

tratamento dos animais comas doses de 30 e 100 mg/kg do OE da Croton

argyrophyllusKunth causou uma inibição (P < 0,05) de 32,8% e 35,1%,

respectivamente, em comparação com o grupo que recebeu pré-tratamento

com o veículo (3,9 ± 0,3 mL x h) (Figura 3B). A administração de

dexametasona (2 mg/kg) inibiu a formação do edema em 53,7% (P<0,001).

50

A

0 1 2 3 4 0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

Dexa 2 mg/kg

Veículo

10 mg/kg

30 mg/kg

100 mg/kg*

*

*

*****

***

h

* Salina

###

###

###

###

Ede

ma

(mL)

B

Figura 3:Efeito do óleo essencial no edema de pata induzido por carragenina em ratos. Os animais foram pré-tratados com veículo (tween 80 a 0,2%), dexametasona (2 mg/kg) ou OE da Croton argyrophyllusKunth(10, 30 e 100 mg/kg) 1 h antes da injeção de carragenina (1%, 100 µL, s.pl.). A pata contra lateral de cada animal recebeu a injeção de salina (100 µL, s.pl.). Painel A: As medidas foram realizadas nos tempos de 0, 1, 2, 3 e 4 h após a injeção subplantar do agente flogístico na pata traseira direita. Painel B: Efeito do OE da Croton argyrophyllusKunth sobre o edema da pata induzido por carragenina durante 4 h (ASC0-4h). Cada valor representa a média ± E.P.M. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas, *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001 vs. veículo; ###P < 0,001 vs. salina. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=6 animais/grupo).

0

1

2

3

4

5

*

***

Veículo Dexametasona

C. argyrophyllus (mg/kg)

*

Salina

###

Carragenina - + + + + +10 30 100

AS

C (

mL

x h

)

51

5.4 Ensaio da atividade da mieloperoxidase nas patas de ratos

Foi observado que a injeção s.pl. de carragenina em animais pré-

tratados com veículo aumentou (P < 0,001) a atividade da mieloperoxidase

quando a comparação foi realizada com o grupo de animais que recebeu a

injeção s.pl. de salina e o pré-tratamento com veículo (8,57 ± 0,94 e 0,00 ± 0,00

UMPO/mg de tecido, respectivamente). O pré-tratamento com o OE da Croton

argyrophyllusKunth foi capaz de diminuir a atividade da mieloperoxidase de

forma significativa (P < 0,001) nas três doses investigadas (2,96 ± 0,87, 0,70 ±

0,14 e 0,46 ± 0,05 UMPO/mg de tecido para 10, 30 e 100 mg/kg,

respectivamente) em comparação ao grupo de animais pré-tratados com o

veículo (Figura 4). O tecido da pata dos animais que receberam dexametasona

(2 mg/kg) no pré-tratamento mostrou uma baixa atividade da enzima (0,38 ±

0,06 UMPO/mg de tecido), logo, uma baixa migração de neutrófilos para a pata

(P < 0,001) quando comparado ao grupo de animais pré-tratados com o veículo

(Figura 4).

Figura 4: Ensaio da atividade da enzima mieloperoxidase em patas de ratos. Grupos de ratos foram pré-tratados com veículo (tween 80 a 0,2%), dexametasona (2 mg/kg) ou OE da Croton argyrophyllusKunth(10, 30 e 100 mg/kg), 1 h antes da injeção de carragenina (1%, 100 µL, s.pl.). Após 4 h, o tecido da pata foi coletado, preparado o homogenato e analisado em leitor de placas a 460 nm. Cada valor representa a média ± E.P.M. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas, *P < 0,001, em relação ao grupo veículo; ###P

0

20

40

60

80

100

120

###

**

* *

VeículoSalina


10 30 100 Dexametasona

UM

PO

/mg

tec

ido

52

< 0,001 vs. salina. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=6 animais/grupo).

5.5 Peritonite e contagens total e diferencial de leucócitos do lavado peritoneal

A injeção de carragenina (1%, 250 µL, i.p.) nos animais previamente

tratados com veículo induziu migração de leucócitos para a cavidade

peritoneal. As doses de 10, 30 e 100 mg/kg do OE da Croton

argyrophyllusKunth inibiram 47,9%, 42,8% e 56,3%, respectivamente (P <

0,001) esta resposta (Figura 5). O anti-inflamatório esteroidal dexametasona (2

mg/kg, controle padrão) reduziu a migração em 42,8% (P < 0,001) (Figura 5).

As doses de 10, 30 e 100 mg/kg do OE da Croton argyrophyllusKunth

provocaram diminuição significativa (P < 0,001) na contagem diferencial de

polimorfonucleares do lavado peritoneal (58,6%, 62,5% e 70,5%,

respectivamente; Figura 5), com predominância de neutrófilos, apresentando o

mesmo perfil da dexametasona (2 mg/kg, inibição de 58,6%, P < 0,001),

quando comparado ao grupo de animais pré-tratados com veículo (Figura 5).

Figura 5: Efeito do OE da Croton argyrophyllusKunthsobre a migração de leucócitos induzida pela carragenina para a cavidade peritoneal em camundongos após 4 h. Grupos de camundongos foram pré-tratados com veículo (tween 80 a 0,2%), dexametasona (2 mg/kg) ou OE da Croton argyrophyllusKunth (10, 30 e 100 mg/kg), 1 h antes da injeção de carragenina (1%, 0,25 mL/cavidade). A contagem de células foi realizada 4 h após a injeção de carragenina. Contagens total e diferencial de leucócitos. Cada valor representa a média ± E.P.M. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas,

0

5

10

15

Veículo Dexametasona


10 30 100

***

***

***

***

***

***

***

***

Leucócitos totais

Polimorfonucleares

Mononucleares

Leu

cóci

tos

x 10

6 /mL

53

***P < 0,001, em relação ao respectivo grupo veículo. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=6 animais/grupo). 5.6 Concentração de NOx

- no lavado peritoneal

O lavado coletado na peritonite foi utilizado para a determinação de

metabólitos do NO (NOx-), onde se observou que o pré-tratamento com o OE

da Croton argyrophyllus Kunth (Figura 6) na dose de 100 mg/kg reduziu

significativamente (3,99 ± 0,48 µM, P< 0,01) a concentração de NOx- no lavado

peritoneal em comparação com os animais tratados apenas com o veículo

(7,86 ± 0,94 µM). O tratamento com dexametasona também foi hábil em reduzir

a concentração de NOx- (3,09 ± 0,73 µM,P< 0.01).

Figura 6: Efeito do OE da Croton argyrophyllusKunth 6 h após a indução da peritonite na concentração de nitrato e nitrito (NOx

-) no lavado peritoneal. Os camundongos foram pré-tratados com veículo (Tween 80 a 0,2% em salina) ou OE (100 mg/kg) 1 h antes da indução da peritonite. A concentração de NOx

- no lavado peritoneal, 6 h após a indução da peritonite, é mostrada com média ± EPM Os asteriscos denotam diferenças estatísticas, **P < 0,01, em relação ao grupo veículo. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=6 animais/grupo). 5.7Contorções Abdominais

As doses de 10, 30 e 100 mg/kg do OE da Croton argyrophyllusKunth

reduziram de forma dose-dependente (P < 0,05) em 30,8%, 51,2% e 72,7%,

respectivamente, as contorções induzidas pelo ácido acético em camundongos

(Figura 7). O AAS na dose de 300 mg/kg também inibiu as contorções

0

2

4

6

8

10

****

Veículo C. argyrophyllus 100 mg/kg

Dexa

NO

x- (

mo

l/L

)

54

abdominais induzidas pelo ácido acético de forma significativa (P < 0,001) em

81,2% (Figura 7).

Figura 7: Contorções abdominais induzidas por ácido acético.Grupos de camundongos foram pré-tratadoscom veículo (tween 80 a 0,2%), AAS (300 mg/kg) ou OE da Croton argyrophyllusKunth (10, 30 e 100 mg/kg), 1 h antes da injeção de ácido acético 0,6% (0,1 mL/10 g de peso). O número das contorções abdominais foi observado por um período de 20 min, iniciando 5 min após a administração do ácido acético. Cada valor representa a média ± E.P.M. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas, *P < 0,05 e ***P < 0,001 em relação ao grupo veículo. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=6 animais/grupo).

5.8 Teste da Formalina

A injeção intraplantar de solução de formalina produz um

comportamento nociceptivo tanto na primeira quanto na segunda fase (72,5 ±

2,8 e 103,0 ± 2,2 s, respectivamente; Figura 8). O OE da Croton argyrophyllus

Kunth inibiu (P < 0,001) o comportamento nociceptivo na 1ª. fase(neurogênica)

com a dose de 100 mg/kg (31,7%; P<0,001), e inibiu a 2ª. fase (inflamatória) do

teste de formalina com as doses de 30 e 100 mg/kg (51,0% e 94,6%; P <

0,001), em comparação ao grupo de animais pré-tratados com o veículo

(Figura 8). Conforme esperada ação farmacológica, a morfina (3 mg/kg) inibiu

ambas as fases do teste (P < 0,001) e o AAS (300 mg/kg) inibiu apenas a

segunda fase (P < 0,001) (Figura 8).

0

10

20

30

40

Veículo 10 30 100

Croton argyrophyllus (mg/kg)

AAS 300 mg/kg

*

***

*** ***

Nú

mer

o d

e co

nto

rçõ

es a

bd

om

inai

s

55

0

30

60

90

120

3010Veículo

C. argyrophyllus OE (mg/kg)

100 AAS

*

Morfina

Primeira fase

Segunda fase

*

*

*

**

La

mb

end

o/m

ord

end

o t

emp

o (

s)

Figura 8: Efeito do OE da Croton argyrophyllus Kunthno teste da formalina. Grupos de camundongos foram pré-tratados com o veículo (tween 80 a 0,2%), AAS (300 mg/kg), morfina (3 mg/kg) ou OE da Croton argyrophyllusKunth(10, γ0 e 100 mg/kg). Posteriormente, foi administrado formalina a β% (β0 μδ, s.pl.) na pata posterior direita. O tempo que o animal passou lambendo e/ou mordendo sua pata foi cronometrado em dois períodos: durante a primeira fase (0-5 min após a injeção de formalina), e durante a segunda fase (15-30 min após a injeção de formalina). Cada valor representa a média ± E.P.M. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas, *P < 0,001 em relação ao respectivo grupo veículo. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=6 animais/grupo). 5.9 Teste da Placa Quente

A dose de 100 mg/kg do OE da Croton argyrophyllusKunth aumentou

(P < 0,05) o tempo de latência, em s, dos camundongos na placa quente nos

tempos 30, 60, 90, 120 e 150 min após o primeiro estímulo térmico quando

comparada com o grupo que recebeu a administração do veículo (tween 80 a

0,2%), conforme mostrado na tabela 3. O grupo que recebeu morfina (3 mg/kg),

um analgésico opióide, apresentou elevado tempo de latência (P < 0,05). Para

avaliação do envolvimento dos receptores opióides na ação antinociceptiva do

OE da Croton argyrophyllus, foi administrada naloxona (5 mg/kg).O pré-

tratamento dos animais com naloxona foi capaz de reverter o efeito

56

antinociceptivo induzido pelo OE (100 mg/kg), bem como àquele induzido pela

morfina (3 mg/kg) (Tabela 3).

Tabela 3: Efeito antinociceptivo do OE da Croton argyrophyllusKunth no teste da placa quente em camundongos.

Tempo de reação após estímulo (s)

Tratamento Dose

(mg/kg)

30 min 60 min 90 min 120 min 150 min

Veículo -- 7,0±0,9 10,3±0,7 9,7±1,1 9,5±1,3 10,8±1,4

OE 10 8,0±0,5 8,2±1,3 8,8±1,1 8,0.±1,1 10,0±1,1

30 72±0,7 10,0±0,7 9,5±1,2 8,8±1,4 10,3±1,6

100 12,9±0,5a 14,8±1,4a 16,0±0,9a 14,3±0,7a 17,2±1,3a

Morfina 3 30,0±0,0a 30,0±0,0a 29,2±0,8a 28,2±0,9a 30,0±0,0a

Naloxona + Morfina 5 + 3 7,6±0,9b 9,6±0,8b 9,2±0,9b 11,2±1,0b 9,8±1,0b

Naloxona + OE 5 + 100 9,7±0,6c 9,5±1,1c 9,8±0,6c 9,5±1,5c 9,7±1,7c

P< 0,05 vs. aveículo, bmorfina, e cOE (100 mg/kg) (n=6/grupo).

5.10 Teste da nocicepção induzida por capsaicina

A capsaicina, após ser administrada estimula a liberação de glutamato e

de neuropeptídios de neurônios periféricos e centrais. Pode-se observar na

figura 9 que a administração do óleo essencial da Croton argyrophyllusKunth,

nas doses de 30 e 100 mg/kg, reduziu (41,7% e 57,9%, respectivamente, P <

0,001) o tempo de lambida/mordida após injeção intraplantar de capsaicina

(Figura 9). Conforme esperada ação farmacológica, a morfina (3 mg/kg)

diminuiu o tempo de lambida/mordida observado nos animais (59,2%, P <

0,001; Figura 9).

57

Figura 9: Teste da nocicepção induzida por capsaicina.Grupos de camundongos foram pré-tratados com veículo (tween 80 a 0,2%, 60 min antes), morfina (3 mg/kg, 30 min antes) ou OE da Croton argyrophyllusKunth (10, 30 e 100 mg/kg, 60 min antes), O tempo que o animal passou lambendo e/ou mordendo sua pata foi cronometrado nos primeiros 5 min após a injeção da capsaicina(1,6 µg/pata). Cada valor representa a média ± E.P.M. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas, ***P < 0,001 em relação ao grupo veículo. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=8 animais/grupo).

5.11 Teste da nocicepção induzida por glutamato

A figura 11 mostra que os animais tratados com as doses de 30 e 100

mg/kg do óleo da Croton argyrophyllus Kunthapresentaram uma redução no

tempo de lambida/mordida induzida por glutamato de maneira dose-

dependente (38,9% e 51,1%, respectivamente, P<0,001, Figura 10). A morfina

(3 mg/kg) também inibiu (76,1%, P<0,001) a nocicepção induzida por glutamato

(Figura 10).

0

20

40

60

Veículo MorfinaOE C. argyrophyllus (mg/kg)

10 30 100

*** ******

Tem

po d

e la

mbi

da/m

ordi

da (

s)

58

Figura 10: Teste da nocicepção induzida por glutamato.Grupos de camundongos foram pré-tratados com veículo (tween 80 a 0,2%, 60 min antes), Morfina (3 mg/kg, 30 min antes) ou OE da Croton argyrophyllusKunth (10, 30 e 100 mg/kg, 60 min antes).O tempo que o animal passou lambendo e/ou mordendo sua pata foi cronometrado nos primeiros 15 min após a injeção do glutamato (20 µmol/pata). Cada valor representa a média ± E.P.M. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas, ***P < 0,001 em relação ao grupo veículo. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=8 animais/grupo).

5.12 Participação do sistema L-arginina/óxido nítrico

O pré-tratamento sistêmico dos camundongos com o precursor de NO, L-

arginina (600 mg/kg, i.p.), administrado 15 min antes, reverteu

significativamente a antinocicepção causada pelo L-NOARG (75 mg/kg, i.p., um

inibidor da NO sintase), mas não a antinocicepção induzida pelo OE (100

mg/kg), no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético (Figura

11).

10 30 100

0

20

40

60

Veículo Morfina


***

***

***

Tem

po

de

lam

bid

a/m

ord

ida

(s)

59

Figura 11: Participação do sistema L-arginina/óxido nítrico. Grupos de camundongos foram pré-tratados com L-arginina (600 mg/kg, i.p.) 15 min antes do tratamento com o OE da Croton argyrophyllusKunth (100 mg/kg, v.o.), L-NOARG (75 mg/kg, i.p.) ou veículo. O número das contorções abdominais foi observado, 1 h após os tratamentos, por um período de 20 min, iniciando 5 min após a administração do ácido acético. Cada valor representa a média ± E.P.M. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas,*P<0,05, **P<0,01 e ***P < 0,001 em relação ao grupo veículo; ##P<0,01 em relação ao L-NOARG. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=8 animais/grupo).

5.13 Teste do campo aberto

O OE na dose de 100 mg/kg não afetou a atividade locomotora dos

camundongos submetidos ao teste do campo aberto, quando comparado com

os animais que receberam veículo. Como esperado, a injeção de diazepam

(1,5 mg/kg) reduziu o número de vezes que o animal cruzou o campo após o

tratamento (P < 0,001, Figura 12).

0

10

20

30

***

***

VeículoL-Arginina (600 mg/kg)

L-NOARG (75 mg/kg)C. argyrophyllus (100 mg/kg)

+ -

- + -

+ -

- +

- - -

--

- - -

+

+ -

-

+

+

##

+

Nº

con

torç

ões

ab

do

min

ais

60

Figura 12: Efeito do óleo essencial da Croton argyrophyllusKunth no teste de campo aberto em camundongos. Os animais foram tratados com veículo (Tween 80 a 0,2% em salina, 1 h antes), OE da Croton argyrophyllus (100 mg/kg, 1 h antes) ou diazepam (1,5 mg/kg, 30 min antes). Foi avaliado o número de cruzamentos em 4 min, após 1 min de ambientação. Os asteriscos denotam diferenças estatísticas, ***P < 0,001 em relação ao grupo veículo. ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni (n=6 animais/grupo).

5.14 Sumário dos resultados obtidos com os tratamentos

A tabela 4 mostra o resumo dos dados obtidos com os tratamentos com

o OE de Croton argyrophyllusKunth na investigação das atividades anti-

inflamatória e antinociceptiva.

0

20

40

60

80

***

Veículo C. argyrophyllus 100 mg/kg

Diazepam

Fre

qu

ênci

a d

e lo

com

oçã

o

61

Tabela 4: Resumo dos efeitos do OE da Croton argyrophyllusKunth sobre a inflamação, nocicepção e antioxidante.

Parâmetro avaliado Croton argyrophyllus (mg/kg)

10 30 100

Edema de pata A ↓ ↓

Atividade de MPO na pata ↓ ↓ ↓

Contagem total de leucócitos - Peritonite ↓ ↓ ↓

Contagem diferencial (PMN) - Peritonite ↓ ↓ ↓

Contagem diferencial (MN) - Peritonite A A A

Determinação de metabólitos do NOx- ↓

Contorções abdominais (ácido acético) ↓ ↓ ↓

Formalina 1ª fase A A ↓

Formalina 2ª fase A ↓ ↓

Placa quente (tempo de latência) A A ↑

Capsaicina A ↓ ↓

Glutamato A ↓ ↓

Sistema L-arginina/NO (L-NOARG) A

Campo aberto A

Parâmetro avaliado Croton argyrophyllus (mg/kg)

0-100 (μg/mL)

Peroxidação lipídica ↓

Atividade scavenger NO ↓

A = Ausência de alteração na resposta. ↓ Diminuição da resposta. ↑ Aumento da resposta.

62

6 DISCUSSÃO

O uso popular da Croton argyrophyllusKunth para o tratamento de

diversas condições inflamatórias (ALBUQUERQUE et al., 2007), associado a

efeitos prévios em animais de experimentação (CRUZ, 2002), direcionou o

desenvolvimento do presente estudo que envolveu diversos modelos

experimentais para avaliar o efeito protetor sobre os parâmetros inflamatórios,

nociceptivos e radicalares induzidos por diferentes agentes. Em adição,

também é considerado de grande interesse o conhecimento acerca dos

componentes do óleo essencial extraído desta planta. A presença de terpenos

nos óleos essenciais (ADAMS, 2007) foi fator decisivo para o desenvolvimento

de um método cromatográfico que fosse capaz de permitir a elucidação dos

componentes deste óleo.

O presente estudo descreve pela primeira vez a análise cromatográfica

do OE da C. argyrophyllusKunth onde se observa a presença de quarenta e

dois compostos com destaque para o biciclogermacreno, espatuleno, (E)-

cariofileno, β-elemeno, β-felandreno, mirceno e óxido de cariofileno, além de

diversos outros terpenos com reconhecidas atividades anti-inflamatória,

antinociceptiva e antioxidante, pelo uso da técnica de cromatografia gasosa

associada ao espectrômetro de massa com detector de ionização de chama,

que se apresenta como o método mais completo disponível para este tipo de

análise (ADAM, 2007). Assim, o conhecimento dos componentes no óleo

essencial da C. argyrophyllusKunth tem sua importância por auxiliar na

validação do uso popular desta planta e na elucidação dos seus mecanismos

de ação como anti-inflamatório, antinociceptivo e antioxidante.

Os modelos comumente utilizados como ferramenta farmacológica para

avaliar o processo inflamatório são úteis na validação do uso de substâncias

utilizadas pela população no seu dia-a-dia.

O edema de pata induzido pela carragenina é um modelo clássico de

screening de compostos anti-inflamatórios, para investigar a fisiopatologia da

inflamação aguda local e avaliar o efeito antiedematogênico de diversas

substâncias (CICALA et al., 2007), entre elas, produtos naturais, exibindo um

63

alto grau de reprodutibilidade. Em ratos, a resposta inflamatória induzida pela

carragenina é caracterizada por uma resposta bifásica acompanhada de

marcante formação de edema, resultante de uma rápida produção de vários

mediadores inflamatórios, tais como histamina, 5-HT e bradicinina (primeira

fase), que é sustentada pela liberação de PG e NO (segunda fase), com pico

na terceira hora, produzidos pelas isoformas induzíveis da COX (COX-2) e

óxido nítrico sintase (iNOS), respectivamente (SEIBERT et al., 1994; BUCCI et

al., 2005).

O resultado apresentado neste trabalho mostra que a injeção intraplantar

de carragenina na pata de ratos ocasionou a formação tempo-dependente de

um edema em 4 h e que o OE da C. argyrophyllusKunthreduziu

significativamente a formação do edema nas doses de 10, 30 e 100mg/kg, na

terceira hora, e na dose de 100 mg/kg na quarta hora. Sugere-se então que

osmediadores da inflamação envolvidos neste mecanismo são as PG e o NO

pordiminuir a formação do edema entre a 3ª e 4ª h. O biciclogermacreno e o

espatuleno já possuem sua atividade anti-inflamatória descrita (AMORIM et al.,

2009; CHAVAN et al., 2010), o que pode explicar, em parte, os efeitos

observados.

Após a lesão tecidual, ocorrem migração e ativação dos leucócitos

polimorfonucleares(PMN), principalmente de neutrófilos possuidores de

grânulos azurofílicos que contêm aenzima MPO, a qual é capaz de modular a

resposta inflamatória devido às substânciasoxidantes resultantes da reação

com o peróxido de hidrogênio e cloreto existentes no meio(KLEBANOFF,

2005). Em todas as doses estudadas, o OE da C. argyrophyllus foi hábil em

inibir a migração celular para o foco inflamatório induzido pela injeção de

carragenina na pata dos animais.

A inflamação induzida pela carragenina envolve migração celular,

exsudação deplasma e produção de mediadores, como NO, PGE2, IL-1 , Iδ-6 e

TNF-α (δORAε et al., β007). Pode-se sugerir que todas as doses estudadas

(10, 30 e 100 mg/kg) do OE, assim como o anti-inflamatório dexametasona na

dose estabelecida de 2mg/kg, reduziram a formação de alguns desses

mediadores no modelo de peritonite induzida por carragenina, inibindo assim a

inflamação no peritônio dos camundongos. Os estudosrealizados por

64

Albuquerque et al. (2007) mostraram que as COX, o NO e as

citocinas,principalmente o TNF-α, estão envolvidos no processo inflamatório

provocado porcarragenina no peritônio. A peritonite é uma condição

inflamatória frequente com alta taxa demorbimortalidade e de etiologia

infecciosa bastante ampla incluindo bactérias, fungos eparasitas

(KOLACZKOWSKA; ARNOLD; OPDENNAKER, 2008).

O recrutamento ocorre quando a célula se adere ao endotélio

inflamadoligando-se às integrinas e liberando substâncias quimiotáticas. A

infiltração dos PMN éregulada pelas moléculas de adesão, citocinas e

componentes da matriz extracelular do vaso edo tecido adjacente (KASUGA et

al., 2010). A redução no número de PMN na cavidade peritoneal daqueles

animais que receberam a injeção de carragenina e as doses de 10, 30 e 100

mg/kgdo OE da C. argyrophyllusKunth corrobora o resultado de diminuição da

atividade da MPOmensurada no modelo de edema de pata.

Uma espécie química altamente reativa que tem importante papel nos

processos inflamatórios é o NO, que foi quantificado indiretamente através das

concentrações de seus metabólitos nitrato e nitrito no filtrado do lavado

peritoneal coletado 4 h após a indução da peritonite por carragenina. A

peritonite levou a um aumento dos níveis de NOx- no exsudato inflamatório

presente no peritônio, sendo que o pré-tratamento com a dose de 100 mg/kg

do OE da C. argyrophyllus impediu a elevação dos níveis deste metabólito. O

aumento dos níveis de NOx- no foco inflamatório está associado com a

gravidade do processo, sendo que este aumento deve-se principalmente, à

indução da produção de NO via iNOS(AKTAN, 2004). A atividade anti-

inflamatória observada para o OE C. argyrophyllus observada nos modelos

acima citados indica um potencial deste óleo essencial como fonte de

substâncias para o tratamento de diversas condições inflamatórias.

O efeito antinociceptivo do OE da C. argyrophyllus foi avaliado

utilizando-se diversos modelos de nocicepção, entre os quais se destacam os

modelos das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, teste da

placa quente e teste da formalina. O teste das contorções abdominais

induzidas pelo ácidoacético investiga atividade periférica, enquanto o teste da

formalina investiga atividades central eperiférica (QUEIROZ et al., 2010). Este

65

último modelo é constituído de duas fases: a primeirafase, transitória, é

causada pelo efeito direto da formalina nas fibras C sensoriais, e a

segundafase, prolongada, está associada com o desenvolvimento da resposta

inflamatória e com aliberação de mediadores nociceptivos (HUNSKAAR;

HOLE, 1987). A injeção s.pl. de formalina foi descrita por Omoteet al.

(2001)como indutora de produção e liberação de NO que é sugerido como

sendo o componenteessencial da resposta pró-inflamatória/nociceptiva por

estimular a produção e liberação de citocinas, EROs e prostanóides.

Foi reportado por Du et al. (2007) que a SP e a bradicinina participam na

resposta daprimeira fase, e a histamina, a 5-HT, a PG e a bradicinina na

resposta da segunda fase no testeda formalina, onde drogas de ação central,

como os narcóticos, inibem ambas as fasesigualmente, enquanto que drogas

anti-inflamatórias inibem apenas a segunda fase, ações estas que foram

reproduzidas neste estudo com os controlespadrões utilizados.

Nestas condições de estudo, o OE da C. argyrophyllus apresentou

atividade antinociceptiva periférica nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg no teste

das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, o qual, apesar de

possuir baixa especificidade, possui boa sensibilidade, funcionando como um

modelo de screening para avaliar a atividade antinociceptiva de diversas

substâncias (ARCHANA et al., 2005). O teste das contorções abdominais, além

de ser um modelo de dor visceral, mostra-se útil para avaliar a ação

antinociceptiva, pois já foi reportado que a atividade nociceptiva do ácido

acético se deve ao fato de que o mesmo leva à liberação de citocinas como o

TNF-α, IL-1 e IL-8 pela modulação de macrófagos e mastócitos teciduais

residentes no peritônio (DU et al., 2007).

Já no teste da nocicepção induzida por formalina, o OE da C.

argyrophyllus inibiu o tempo de mordida/lambida nas primeira e segunda fases

do experimento, a fase neurogênica na dose de 100 mg/kg, e a fase

inflamatória nas doses de 30 e 100 mg/kg, dado este que, de certo modo,

confirma a ação anti-inflamatória da C. argyrophyllus pois a segunda fase do

teste da formalina é caracterizada pela liberação de histamina, bradicinina, 5-

HT e PG no sítio onde foi injetada a formalina.

66

A fim de avaliar a ação central do OE da C. argyrophyllusfoi utilizado o

teste da placaquente, considerado sensível a fármacos que atuam modulando

a resposta dolorosa em nívelespinhal e supra espinhal (SILVA et al., 2006). Os

resultados sugeremque o óleo da planta em estudo promove efeito analgésico

central, como evidenciado pelo tempo de respostaprolongado dos

camundongos quando sujeitos ao estímulo nociceptivo (calor). Foi

observadoque apenas a dose de 100 mg/kg foi capaz de aumentar o tempo de

latência dosanimais na placa quente. Este resultado corrobora o efeito

antinociceptivo observado com este óleo na 1ª. fase do teste de formalina. Para

demonstrar o envolvimento do sistema opióide na atividade central do OE da C.

argyrophyllus, observou-se em um grupo de animais que recebeu a dose de

100 mg/kg do OE e em outro que recebeu naloxona(5 mg/kg), antagonista de

receptores opióides, a reversão da ação antinociceptiva da mesmadose da

planta administrada isoladamente até os níveis daqueles que receberam

apenas oveículo.

A fim de se avaliar por quais possíveis vias o OE da C. argyrophyllus

estaria produzindo um efeito antinociceptivo foram realizados os testes da

nocicepção induzida por capsaicina e por glutamato e a avaliação da

participação do sistema L-arginina-óxido nítrico.

A nocicepção plantar induzida por capsaicina foi primeiramente

demonstrada por Sakuradaet al. (1992), que observaram a vigorosa

nocicepção causada pela administração intraplantar de capsaicina em

camundongos, sendo esta caracterizada por lambidas e mordidas. Este efeito é

relacionado com a nocicepção de origem neurogênica, pois a capsaicina, uma

neurotoxina extraída da pimenta vermelha do gênero Capsicum, estimula o

receptor TRPV1 localizado nas fibras C e quando aplicada em contato com a

pele causa irritação caracterizada por reação dolorosa e subsequente

dessensibilização para a nocicepção quimicamente induzida (MELO et al.,

2006). A administração prévia do OE da C. argyrophyllus, nas doses de 30 e

100 mg/kg, apresentou um menor tempo de lambida/mordida da pata após a

injeção intraplantar de capsaicina, sugerindo um envolvimento deste óleo

essencial na inibição dos receptores TRPV1.

67

O glutamato é um importante aminoácido excitatório bastante difundido

no sistema nervoso central onde participa de grande número de fenômenos

fisiológicos e patológicos (CODERRE, 1993). A resposta nociceptiva causada

pelo glutamato envolve sítios de ação periférico, espinhal e supraespinhal com

os receptores glutamatérgicos (NEUGEBAUER, 2001). É capaz de estimular os

receptores metabotrópicos acoplados à proteína G e estão envolvidos na

transmissão aferente primária da nocicepção, sendo liberado no local de

injeção, no caso deste trabalho, na pata e posteriormente na medula, causando

o estímulo (FERREIRA; SANTOS; CALIXTO, 1999; BEIRITH; SANTOS;

CALIXTO, 2002), além de não provocar o aparecimento de edema no local da

aplicação (FIORENTINO; CAIRNS; HU, 1999). A administração das doses de

30 e 100 mg/kg do OE da C. argyrophyllus fez com que o tempo de

lambida/mordida da pata que recebeu injeção de glutamato diminuísse,

mostrando que o mecanismo de inibição da transmissão do glutamato está

presente no teste com o óleo essencial.

O envolvimento da via L-arginina/NO foi analisado com o pré-tratamento

dos animais com o precursor de óxido nítrico, L-arginina, o qual não se mostrou

significativamente diferente do grupo controle (veículo), mas capaz de reverter

a atividade antinociceptiva exibida pelo inibidor de NO sintase, L-NOARG.

Conforme resultado esperado (KHALID et al., 2011) observamos reversão

quando a L-arginina foi administrada conjuntamente com L-NOARG; resultado

este comparado com aquele cujos animais receberam somente L-arginina.

Porém, o mesmo não aconteceu quando se administrou L-arginina com o OE, o

que nos mostra que o sistema L-arginina/NO não está envolvido no mecanismo

antinociceptivo do OE de C. argyrophyllus.

Estudos mostram que os inibidores da NO sintase reduzem a

nocicepção causada pelo ácido acético (LARSON et al., 2000; MEOTTI et al.,

2006) e nossos achados são coerentes com estudos prévios de Chien et al.

(2008) e Perimal et al. (2011) que reportam terpenos, como geraniol e mentol

agindo como potentes inibidores de NO.

Estudos sugerem que a depressão do SNC e o efeito relaxante muscular

nãoespecíficopodem reduzir a resposta de coordenação motora a qual pode

invalidar osresultados do teste de nocicepção (LE BARS, 2001). Para tanto, foi

68

realizado o teste do campo aberto a fim de se verificar a presença ou não de

alterações na frequência de locomoção dos animais expostos ao tratamento

com o OE da C. argyrophyllus, verificando-se que a dose de 100 mg/kg, a

maior dose administrada, não foi capaz de alterar a frequência de locomoção

dos animais no campo aberto, diferente dos animais tratados com diazepam.

Deste modo, a atividade antinociceptiva do OE da C. argyrophyllus pode ser

destacada, pois houve a redução, em vários modelos de nocicepção da

hiperalgesia nos animais, evidenciada pela ausência de comportamentos pré-

determinados.

A avaliação do potencial antioxidante dá base e norteia as atividades

anti-inflamatória e antinociceptiva dos produtos naturais. O óxido nítrico

configura-se como um importante modulador em vários tipos de processo

inflamatório (SHUKLA et al., 2009), além de exercer papel fisiológico como

vasodilatador (MOLLACE et al., 2005; SALVEMINI; DOYLE; CUZZOCREA,

2006). No presente estudo, o OE da C. argyrophyllus, investigado

anteriormente como inibidor da produção de NO, mostrou atividade scavenger

em todas as concentrações analisadas (0,001 a 100 μg/mδ), o que pode

representar um importante papel norteador na inibição da inflamação.

A peroxidação lipídica é uma cascata de eventos bioquímicos resultando

na ação de radicais livres nos lipídeos insaturados da membrana celular,

produzido principalmente por radicais alquil, peroxil e alcoxil. Este processo

pode conduzir à destruição da estrutura da membrana, falha do mecanismo de

troca de metabólitos e, em casos extremos, morte celular (SRINIVASAN et al.,

2007). Isto consiste na incorporação de oxigênio molecular ao ácido graxo poli-

insaturado para produzir um lipídio hidroperoxidado como produto primário

inicial (PORTER; CALDWELL; MILLS, 1995). O OE foi capaz de prevenir a

peroxidação lipídica provocada tanto pelo FeSO4 quanto pelo FeSO4 incubado

com H2O2 em todas as concentrações analisadas.

69

7 CONCLUSÃO

O óleo essencial extraído das folhas da Croton argyrophyllus apresentou

diversos monoterpenos de importância biológica em sua composição, além de

atividades anti-inflamatória, antinociceptiva e antioxidante, atuando nas vias

opióide, glutamatérgica e da capsaicina, sem, contudo, apresentar atividade na

via da L-arginina/óxido-nítrico. Sendo assim necessários novos estudos e

outras abordagens para que seus compostos ou associações destes produtos

possam contribuir na clínica.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PROGRAMA DE PÓS … · A inflamação é um importante componente...

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