MÉTODO DE REDUÇÃO DO RADICAL LIVRE DPPH•

Atividade Antioxidante

Antioxidantes

Antioxidantes são comumente compreendidos como substâncias capazes de inibir ou retardar substancialmente a extensão de um processo oxidativo.

Antioxidantes biológicos podem ser enzimáticos (por exemplo, superóxido dismutase, catalase, e glutationa peroxidase) e não-enzimáticos, tais como inibidores de enzimas oxidantes (por exemplo, ciclo-oxigenase) , cofatores de enzimas antioxidantes, sequestrantes de ROS / RNS, e agentes quelantes de metais de transição.

No modo de ação, podemos classificar os antioxidantes como primários (interrompem a reação em cadeia gerando um radical menos ativo ) e secundário (ou preventivos).

Antioxidantes

Antioxidantes primários: interrompem a fase de propagação de processos de formação radicais livres, temos os agentes captadores de radicais (sequestradores de radicais), tais como fenóis, cuja estrutura, em geral, deve possuir duas características importantes: a presença de substituintes volumosos nas duas posições vizinhas ao grupo hidroxilo, e na posição para a presença de um grupo que contribui para a transferência de localização do elétron não emparelhado, como são BHT e o ácido cafeico.

Antioxidantes

Antioxidantes secundários: como os agentes quelantes, sequestradores de cátions metálicos que agem na decomposição do peróxido de hidrogênio a radical hidroxilo; evitando assim a formação desses últimos. Neste grupo temos a penicilamina, o EDTA, e o pró-fármaco dexrazoxano.

Antioxidantes

Os ácidos graxos, presentes nas membranas celulares, são facilmente oxidados tanto por peroxidação enzimática como por autoxidação, devido as reações em cadeia dos radicais livres. Estas reações constam das seguintes etapas:

Antioxidantes

Uma sustância retarda as ações de oxidação quando inibe a formação de radicais livres na etapa de iniciação (etapa I) ou quando interrompe a propagação (etapa II) da cadeia de radicais livres.

Um dos estudos mais importantes sobre a ação dos antioxidantes postula que estes inibem a reação em cadeia atuando como doadores de hidrogênio ou como aceptores de radicais livres, e conclui que o aceptor de radicais livres (antioxidante: AH) reage sobre todo com o radical ROO· e não com os radicais livres R· em uma reação denominada reação de inibição:

Antioxidantes

Sabe-se que os polifenóis têm uma maior atividade antioxidante (anti-radicais) que monofenóis. Para ácidos por exemplo, o ácido cafeico é um composto mais eficaz anti-radicais do que o ácido cumárico, o seu homólogo monofenol (ARP = 9,1 e 0,02 respectivamente).

Ácido cafeicoÁcido cumárico

Antioxidantes

O ácido gálico, um trifenol, é mais eficiente do que o ácido protocatecuico, sua contraparte difenol (ARP = 12,5 e 7,14 respectivamente). A posição destes segundo e terceiro grupos hidroxilo é importante. Esses compostos cujo segundo hidroxilo grupo está na posição orto ou para tem uma maior atividade do que quando ela é meta.

Ácido protocatecuico

Ácido gálico

Antioxidantes

A eficiência do difenol é orto e para, em parte, devido à estabilização do radical aryloxyl por ligação de hidrogênio ou por regeneração de outro difenóis.

Método DPPH

O DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) é um radical livre que pode ser obtido diretamente por dissolução do reagente em meio orgânico.

Quando em solução o radical se comporta de maneira a doar o elétron que possui a mais, possuindo nessa forma (forma reduzida) uma coloração rosada (absorção na faixa de 515 – 517 nm). Após doar o seu elétron (passando assim para a forma oxidada) assume uma coloração amarelada (absorção na faixa 565 - 590 nm).

Método DPPH

Método espectrofotométrico:

Para a avaliação da atividade captadora do radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina),alíquotas das amostras e padrões foram diluídas com etanol para se obter as concentrações de 2,5 a 200 μg/mL.

A 2,5mL de cada amostra foi acrescentado 1,0 mL de solução etanólica do radical livre DPPH 0,243 mM.

Como controle, foi utilizado 1,0 mL de solução etanólica de DPPH 0,243 mM e 2,5 mL de etanol.

Método DPPH

Método espectrofotométrico:

Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, a redução do radical livre DPPH foi mensurada pela leitura da absorbância em 517 nm, contra um branco específico em cada avaliação, formado somente pelas amostras nas suas respectivas diluições.

Substâncias com atividade antioxidante já conhecidas como rutina, quercetina, ácido ascórbico, ou extratos com atividade antioxidante como o de Gingko biloba são utilizados como padrões de comparação.

Quercetina

Método DPPH

Método espectrofotométrico:

Método DPPH

Para avaliar a atividade captadora de radical, foi obtida a porcentagem de inibição, conforme a equação:

(% AA : Porcentagem de atividade antioxidante; Am : Absorbância da amostra; Ab : Absorbância do branco; Acontrol : Absorbância do reativo

DPPH)

A relação (Am - Ab)/Acontrol nos indica o exceso de DPPH que não reagiu com os compostos antioxidantes presentes na amostra (amostra pura ou extrato).

Método DPPH

A determinação da IC50, ou seja, concentração da amostra ou padrão que causa 50% de inibição da concentração inicial de DPPH, é obtida por progressão linear dos pontos plotados graficamente. Para a plotagem dos pontos, são utilizados os valores das médias obtidas de triplicatas realizadas para cada um dos testes.

y = 1,1032x + 5,422850 = 1,1032. IC50 +

5,4228

IC50 = 40,410 µg/mL

Método DPPH

Vários grupos de pesquisa têm utilizado protocolos amplamente variáveis que diferem na concentração de DPPH (22,5-250 µM), tempo de incubação (5 min - 1 h), solvente de reação e pH da mistura reacional.

Elevadas concentrações de DPPH na mistura reacional pode gerar absorbâncias além da precisão das medições espectrofotométricas.

Oxigênio, luz, solvente e o pH da mistura de reação também afetar a absorbância do DPPH.

Método DPPH

Efeito do solvente: a polaridade do solvente, o coeficiente de absortividade , e a dissolução do reagente no solvente bem como o ph do mesmo podem influir na cinética da reação e na absorção por parte dos reagentes.

A ordem de absorbância é mais elevada em solução tamponada metanólica, seguida por soluções metanólica e etanólica. 

Maior absorção em soluções metanólicos implica melhor sensibilidade frente a solução etanólica vis-à-vis de DPPH. 

Método DPPH

Efeito do solvente:

Quercetina em Metanol Quercetina em etanol

Método DPPH

Efeito do solvente:

Quercetina em Metanol:Água (1:1)

Método DPPH

Estudos demonstram que a velocidade de reação do DPPH• com o antioxidante é maior em solventes alcóolicos do que em outros solventes orgânicos.

A proporção de solvente no meio é importante, pois quanto maior a proporção de água, menor é a atividade antioxidante das amostras. A cinética de consumo de DPPH• é dependente do tipo de solvente e da concentração de antioxidante presente na amostra.

Referências

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Referências

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