UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · que Ele é tudo” (F. Pessoa), por ter me...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

DANIELLE GOMES SANTANA

EVIDÊNCIAS CIENTÍFICAS SOBRE O USO DE PLANTAS MEDICINAIS E

AVALIAÇÃO DO EXTRATO DE CRANBERRY (Vaccinium macrocarpon) NA

PANCREATITE AGUDA EXPERIMENTAL

ARACAJU

2017

1





Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Enilton A. Camargo

ARACAJU-SE

2017

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

S232e

Santana, Danielle Gomes

Evidências científicas sobre o uso de plantas

medicinais e avaliação do extrato de cranberry

(Vaccinium macrocarpon) na pancreatite aguda

experimental / Danielle Gomes Santana ; orientador

Enilton Aparecido Camargo – São Cristóvão, 2017.

145 f. : il.

Tese (doutorado em Ciências da Saúde) –

Universidade Federal de Sergipe, 2017.

1. Pancreatite. 2. Plantas medicinais. 3. Oxicoco. 4.

Stress (Fisiologia). I. Camargo, Enilton Aparecido. II.

Título.

CDU 61:633.88

3





Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde.

Aprovada em: 20/02/2017

_______________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Enilton A. Camargo

_______________________________________________________

1º Examinadora: Profa. Dra. Josimari Melo de Santana

_______________________________________________________ 2º Examinadora: Profa. Dra. Adriana Gibara Giumarães

_______________________________________________________

3º Examinadora: Profa. Dra. Cristiane Banderó Walker

______________________________________________________ 4º Examinadora: Profa. Dra. Margarete Zanardo Gomes

PARECER

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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DEDICATÓRIA

À minha pequena Dora, por todo amor que trouxe

à minha vida e por me permitir “aprender com o

teu pequeno-grande coração”,

Aos meus pais, Seu Raimundo-Radiola (in.

memorian) e Dona Léa, pelos valores, pela

dedicação e pelos sacrifícios que fizeram pela

minha formação,

A Clio, meu grande companheiro de vida, por

quem, acertadamente, “deixei a segurança do meu

mundo”, pelo amor, pela paz e pela luz que

carrega consigo.

A vocês, com amor, dedico.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço inicialmente a Deus, “seja Ele quem for, pois sendo Ele quem for, tenho certeza

que Ele é tudo” (F. Pessoa), por ter me proporcionado uma família amorosa, amigos queridos e

uma vida de paz.

Em um momento tão especial da minha vida, gostaria de agradecer aos meus amados irmãos

Silvinho e Fafá, por uma vida inteira de amizade, carinho, brigas e todas essas coisas incríveis que

só os irmãos fazem na nossa vida. Saibam que a parceria de vocês sempre foi muito importante para

mim. Em adição, agradeço a minha cunhada Du, minhas sobrinhas lindas e espertas Bibi e Cecito,

a Gisele, a irmã emprestada, e Gus. A minhas tias, tios, primos, “parentes e aderentes”, daqui, de

longe ou que já estão do outro lado do véu, muito obrigada pela torcida e pelo carinho de sempre.

À família de Clio, Dona Socorro e Seu Bá, Cammila, Claudimar e Elisa, pelo carinho de

sempre, e em especial à Bia, pela determinação inspiradora.

É impossível chegar aqui e não lembrar de pessoas chave que contribuíram para a

concretização deste momento. Seria ingrato e injusto não retroceder os meus agradecimentos à

“velha mestra” tia Dyonne Carvalho Costa (in memorian), que permitiu que eu, ainda criança,

estudasse de graça em sua escola, quando os meus pais não mais tinham recursos para pagá-la, e

posso dizer, que passei a minha vida buscando honrar esta chance que me foi dada. Carrego comigo

o lema da amada Escola Tiradentes “Só o conhecimento liberta”.

Se hoje estou aqui, é porque me foram dadas várias oportunidades, muitas pessoas e

instituições me ajudaram moral e financeiramente. Agradeço ao Colégio Sagrado Coração de Jesus,

onde cursei o Ensino Médio pelos descontos na tão suada mensalidade, à Universidade Federal de

Sergipe pela inserção no programa de Residência Universitária, onde cresci e conheci pessoas

fantásticas que moram hoje no NRF do meu coração (Heide “Maria”, Rosa, Simone, Day, Karina,

Iandra, Tati), à minha irmã, Fafá, pelo apoio financeiro durante a conclusão dos meus estudos de

graduação em Campina Grande, à UFS e UEPB pelas bolsas de iniciação científica PIBIC-COPES-

UFS e PIBIC-UEPB, sempre tão providenciais e à todos os que me ajudaram ao longo do caminho.

Não é fácil sonhar e lutar por educação de qualidade quando os recursos são escassos, e toda ajuda

e investimento é importante e bem-vinda. Muito obrigada!

Um parágrafo especial é dedicado ao meu orientador Prof. Dr. Enilton A. Camargo, que

me acolheu como sua aluna e aceitou a desafiadora tarefa de orientar uma “aluna-funcionária”,

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sempre tão lhano, perspicaz, inteligente e humilde. Um orientador exemplar, inclusive nos

momentos em que eu não fui uma boa aluna. Neste ato final, deixo de ser sua aluna, mas jamais

deixarei de aprender com você e levo sempre comigo uma frase de G. Rosa que lhe é cara “O que a

vida quer de nós? Coragem”. Meu mais sincero obrigada!

Aos meus colegas de hoje do LAFAPI, Augusto, Betânia, Bruno, Dai, Eduardo, Fabiula,

Janaíne (minha mini-mestranda), Laiza, Luana, Lúcio, Maiara, Marília, Miriam, Rangel, àqueles

de ontem, Igor-Digão-Paiva, Ana Carla, Janaína, Denysson-e-suas-canelas, Fabrício, Vanessa e

outros tantos que por ali passaram. Às professoras Renata Grespan e Sandra Lauton e seus

respectivos alunos, enfim, a todos os que fazem do LAFAPI “uma família muito unida e também

muito ouriçada”, um agradecimento imenso por todas as conversas, experimentos, dosagens,

plaquinhas de silêncio, perguntas e respostas. Cada um, do seu jeito, é especial para mim. Obrigada

amigos! E perdoem a minha chatice durante as medidas de hiperalgesia e as faxinas do laboratório.

Agradeço de maneira especial ao meu “brother” Alan, por tudo, tudo, tudo. Como eu costumo

dizer, uma cabeça em dois corpos, dado o nosso grau de sintonia nos experimentos. Essa conquista

é nossa!

Agradeço a todos os meu ex-crismandos, aos meus afilhados Alana e Gabriel e também aos

meus amados “Tios da crisma”, André, Flavinha, Gustavo, Giovana, Irla, Kayo, Matheus, Matheus

Góes, Marcelo, Michele, Sara e Wilhelm, pela amizade contruída ao longo desses anos, pela torcida,

pelo carinho. Agora, nosso rega-bofe sai!

Algumas pessoas, passam pela nossa vida, e deixam tanto de si, com tamanha generosidade,

que nos marcam para sempre. Entram nessa lista, Mirabeau Ramos, Prof. Lauro Meneses, PS

Marcellini e Aline “Barros”, Izabel e Aline Alves, Joseane (Jó), Nelma, Creme-Ad e família, Venícius

e Jôse, Ana Amélia e Tio Delmo. Vocês são uma inspiração para mim!

Agradeço a amigos muito queridos, Rodrigo, Euda e Let, Guto, Karianny, Félix e Mônica,

meus “irmãos chambinhos”, aos amigos do EJC e aos colegas e ex-professores da UEPB, que me

acolheram de coração em Campina Grande, muito obrigada!

Ao amigo mais que querido Leandro Porfírio (Dose Certa Manipulações), por toda a

amizade, por saber que posso sempre contar com você, pelo extrato de cranberry tão pronta e

gentilmente doado, por tudo, amiguinho. Sou sua fã!

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Aos meus grandes amigos de Aracaju, Alenir, Márcio, Gabriel e Matheus, Andrezza e João,

Aninha, Dona Enir e Seu Alberto e todas as pessoas maravilhosas que conheci por intermédio de

vocês, muito obrigada por tudo! Especialmente a Alenir que já deve ter feito 1435 promessas para

eu “terminar esse doutorado”!

Aos amigos, colegas e treinadores do Clube de Corrida da UFS e ao prof. Rafael, pelo

incentivo e orientação nas corridas que tanto me ajudaram a desopilar a mente nessa reta final.

A todos os meus amigos do Departamento de Farmácia, e do LADEF, personificados nas

pessoas de Alyne, Ellen, Paulina-Hoany-Gui, Juh e Raquel, a todos os ex-alunos do LADEF e a

tantos outros alunos do Curso de Farmácia, sempre tão gentis, dedicados e divertidos. Agradeço

também, de todo coração, a meus colegas de trabalho Mayana, Layane, Iraê, Clara Raíssa,

Jacqueline, Bruno, André e Dona Neide, pelo companheirismo, pelas conversas e pela convivência

fácil e harmoniosa. Agradeço aos professores e chefes de departamento com os quais trabalhei ao

longo desses anos por me apoiarem nesta empreitada.

Ao amigo e Prof. Dr. Fernando Nampo, pela competência, gentileza e cuidado com que me

auxiliou na execução da revisão sistemática, muito obrigada!

Agradeço aos meus colegas de doutorado no PPGCS pela alegre convivência.

Aos colegas do biotério, na pessoa de Maraíza, cujo trabalho é essencial para o sucesso dos

nossos experimentos.

Agradeço de todo coração à toda equipe do Bebê e Cia Berçário e Educação Infantil pelo

amor com que sempre cuidaram de Dora, me dando suporte em todos os momentos. Muito

obrigada por terem feito de “minha filha, sua filha”!

O meu muito obrigada aos professores que fizeram parte da minha banca e avaliaram o este

trabalho com tanta dedicação, desde a qualificação: Profa. Dra. Adriana Carvalho, Profa. Dra.

Adriana Gibara, Profa. Dra. Cristiane Walker, Prof. Dr. Josemar Sena, Profa. Dra. Josimari Melo,

Profa. Dra. Margarete Zanardo, Profa. Dra. Sandra Lauton e Profa. Dra. Thaís Unfer.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, seus funcionários e professores e à

Universidade Federal de Sergipe.

Aos camundongos (meus queridos camungas), pela vida que lhes foi tirada.

E a você, cujo nome eu não citei por falta de espaço, mas não de carinho. É gratificante

chegar até aqui acompanhada de tanta gente incrível!

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“Se cheguei até aqui foi porque me apoiei nos ombros de gigantes” (I. Newton)

9

Segue o teu destino,

Rega as tuas plantas,

Ama as tuas rosas.

O resto é a sombra

De árvores alheias.

10

(Fernando Pessoa)

11

RESUMO Evidências científicas sobre o uso de plantas medicinais e avaliação do extrato de cranberry (Vaccinium macrocarpon) na pancreatite aguda experimental. Danielle Gomes Santana, Aracaju-SE, 2017. A pancreatite aguda (PA) é uma condição inflamatória do pâncreas que pode causar elevada mortalidade nas suas formas graves. Evidências pré-clínicas sugerem que as plantas medicinais (PM) podem ser uma alternativa viável para o tratamento da PA. O extrato padronizado da Vaccinium macrocarpon (EpVm) possui atividade antioxidante e pode ser útil no tratamento desta doença. Os objetivos deste estudo foram realizar uma revisão sistemática sobre o uso de PM em modelos pré-clínicos de PA e investigar as propriedades anti-inflamatória, antioxidante e antinociceptiva do EpVm em modelo de PA em camundongos. Para tanto, foram selecionados estudos pré-clínicos de PA em que PM foram utilizados e os desfechos foram comparados ao grupo controle (tratamento placebo). As buscas eletrônicas foram realizadas utilizando-se das bases MEDLINE, LILACS, BVS, SCIELO, SCOPUS, Web of Science e Embase, além da “gray literature” (Google Scholar) pela inserção de descritores e por “hand search”. Dois revisores independentes identificaram os estudos relevantes, fizeram a extração dos dados e avaliaram o risco de viés dos estudos selecionados, por meio da ferramenta de risco de viés do “Systematic Review Protocol for Animal Intervention Studies” (SYRCLE). Os dados dos estudos elegíveis foram extraídos e sintetizados qualitativamente. Trinta foram selecionados, analisados e a partir dos mesmos, foi possível concluir que o tratamento com PM pode ser efetivo na PA experimental. Para o estudo experimental, foi realizada a avaliação da capacidade antioxidante do EpVm por redução do radical DPPH, do NO e pela inibição da lipoperoxidação. A PA foi induzida em camundongos Swiss machos (30-35 g, n = 6 por grupo) por duas injeções sucessivas de L-arginina (4 g/kg, i.p.) e eutanasiados 72 h após a indução. Os animais foram tratados com EpVm (50, 100 e 200 mg/kg, v.o.), ou dexametasona (5 mg/kg, s.c.) ou morfina (5 mg/kg, i.p.) ou veículo (NaCl, 0,9%) a cada 24 h, iniciando-se 1 h após indução da PA. Após a eutanásia, foram avaliados parâmetros inflamatórios (atividade de mieloperoxidase e concentração de fator de necrose tumoral [TNF]-α, interleucina [IL]-1β e IL-6 nos tecidos pancreático e pulmonar, contagem de leucócitos no sangue e índice de edema no pâncreas), marcadores de estresse oxidativo (formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico [TBARS], conteúdo de grupos sulfidrila não proteicos [NP-SH], conteúdo de radicais carbonil e capacidade total de redução do ferro [FRAP] em pâncreas e pulmão), atividade das enzimas antioxidantes (atividade de catalase [CAT], superóxido dismutase [SOD] e glutationa peroxidase [GSH-Px] no pâncreas e pulmão), parâmetros bioquímicos (amilase, lipase, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, ureia e creatinina no soro) e a hiperalgesia abdominal. A indução da PA pela L-arginina alterou significativamente os parâmetros de inflamação e estresse oxidativo, bem como a hiperalgesia, em relação ao grupo veículo. O tratamento com EpVm inibiu a hiperalgesia abdominal causada pela PA. Todos os parâmetros inflamatórios foram reduzidos quando os animais foram tratados com EpVm. O tratamento com EpVm diminuiu parcialmente as alterações nos parâmetros bioquímicos no soro. A atividade de SOD e CAT no pâncreas e pulmão, que se encontravam reduzidas pela PA, foram restauradas após tratamento com EpVm, mas a atividade de GSH-Px não foi alterada. A formação de TBARS e radical carbonil foi reduzida após tratamento com EpVm e o NP-SH foi aumentado após este tratamento, assim como o FRAP no pâncreas e no pulmão. Em suma, estes resultados indicam que as PM possuem potencial para o tratamento da PA experimental e que o EpVm diminui a inflamação, o estresse oxidativo e a hiperalgesia na PA em camundongos, tornando-o de interesse em abordagens futuras para tratar esta condição. Descritores: pancreatite; plantas medicinais; Vaccinium macrocarpon; inflamação; hiperalgesia; estresse oxidativo; revisão sistemática, animais.

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ABSTRACT Scientific evidence regarding the use of medicinal plants and evaluation of cranberry extract (Vaccinium macrocarpon) in experimental acute pancreatitis. Danielle Gomes Santana, Aracaju-SE, 2016. Acute pancreatitis (AP) is an inflammatory condition of the pancreas, which causes high mortality in the severe forms. Although the incidence of AP is increasing in the last years, there is no specific treatment for this condition. Preclinical evidence suggests that medicinal plants (MP) may be a viable alternative for the treatment of AP. The standardized extract of Vaccinium

macrocarpon (SeVm) possesses antioxidant activity and may be useful in the treatment of this disease. The objetives of this study were to carry out a systematic review regarding the use of MP in preclinical models of AP and to investigate the anti-inflammatory, antioxidant and antinociceptive properties of SeVm in a model of AP in mice. Therefore, pre-clinical studies of AP in which a MP was administered and outcomes were compared to a control group (placebo treatment) were selected. Electronic searches were conducted using MEDLINE via PubMed, SCOPUS, Web of Science and Embase, and gray literature (Google Scholar) and hand search by using specific keywords. Two independent reviewers identified the relevant studies, extracted data and evaluated the risk of bias following the Systematic Review Protocol for Animal Intervention Studies (SYRCLE) risk of bias tool. Data from eligible studies were qualitatively extracted and synthesized. Thirty-one studies were selected, analyzed, and from these studies we concluded that the treatment with MP can be effective to treat experimental AP. For the experimental study, AP was induced in male Swiss mice (30-35 g, n=6 per group) by two successive injections of L-arginine (4 g/kg, i.p.), and euthanized 72 h after induction. Animals were treated with SeVm (50, 100 and 200 mg/kg, p.o.), dexamethasone (5 mg/kg, s.c.), morphine (5 mg/kg, i.p.), or vehicle (NaCl, 0,9%) every 24 h, starting from 1 h after the induction of AP. After euthanasia, inflammatory parameters (myeloperoxidase activity and concentration of tumoral necrosis factor [TNF]-α, interleukin [IL]-1β and IL-6 in pancreas and lung tissues, leucocyte counts in blood and edema index in pancreas), oxidative stress markers (thiobarbituric acid reactive substances [TBARS], non-protein sulfhydryl groups content [NP-SH], carbonyl radicals content and ferric reducing/antioxidant power [FRAP] assay in lung and pancreas), antioxidant enzyme activities (catalase [CAT], superoxide dismutase [SOD] and glutathione peroxidase [GSH-Px] in pancreas and lung), biochemical parameters (concentration of amylase, lipase, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, urea and creatinine in serum) and abdominal hyperalgesia were measured. The induction of AP by L-arginine significantly altered inflammatory parameters and oxidative stress markers, as well as abdominal hyperalgesia induced by AP. Treatment with SeVm inhibited the abdominal hyperalgesia caused by AP. All inflammatory parameters were reduced in animals treated with SeVm. Treatment with SeVm partially decreased the alterations in biochemical parameters in serum. The reduction of SOD and CAT activities in pancreas and lung of animals with AP, were reverted by the treatment with SeVm, but the activity of GSH-Px was not changed. The formation of TBARS and carbonil radicals were reduced after treatment with SeVm and the NP-SH was increased after this treatment, as well as did total antioxidant potential. In summary, these results demonstrate that MP have potential in the treatment of experimental AP and that SeVm decreases inflammation, oxidative stress and hyperalgesia in AP, making it of interest in future approaches to treat this condition. Descriptors: pancreatitis, Vaccinium macrocarpon; inflammation; medicinal plants, hyperalgesia; oxidative stress; systematic review, animals.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Citações de espécies botânicas de plantas medicinais utilizadas no tratamento

experimental da pancreatite aguda. .......................................................................................... 51

Tabela 2. Detalhamento dos estudos incluídos na revisão. ...................................................... 55

Tabela 3. O tratamento com o extrato padronizado da V. macrocarpon (EpVm) reduz a

contagem total e diferencial de leucócitos no sangue periférico de camundongos submetidos a

pancreatite aguda por L-arginina. ............................................................................................. 98

Tabela 4. Ausência de efeito do extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na atividade

locomotora de camundongos no campo aberto ...................................................................... 103

Tabela 5. O tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) reduz parâmetros

bioquímicos séricos em camundongos submetidos a pancreatite aguda induzida por L-arginina.

................................................................................................................................................ 105

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LISTA DE FIGURAS Figura 1. Fisiopatologia da pancreatite aguda.. ........................................................................ 28

Figura 2. Classificação dos compostos fenólicos. .................................................................... 35

Figura 3. Frutos de Vaccinum macrocarpon. ........................................................................... 37

Figura 4. Estrutura básica das antocianinas. ............................................................................. 38

Figura 5. Estrutura básica dos flavonóis. .................................................................................. 38

Figura 6. Estrutura básica dos ácidos hidroxicinâmicos........................................................... 39

Figura 7. Estrutura básica dos ácidos hidrobenzoicos. ............................................................. 39

Figura 8. Fluxograma da pesquisa. ........................................................................................... 50

Figura 9: Sumário dos autores da revisão sobre os itens de risco de viés de cada estudo incluído.

.................................................................................................................................................. 65

Figura 10: Avaliação do risco de viés nos estudos selecionados. Julgamento dos autores da

revisão sobre os itens do risco de viés de cada estudo incluído. .............................................. 66

Figura 11: Linha do tempo referente ao delineamento experimental do tratamento da pancreatite

aguda induzida por L-arginina. ................................................................................................. 84

Figura 12. Atividade antioxidante do extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) frente a

radicais DPPH in vitro. ............................................................................................................. 93

Figura 13. Atividade antioxidante do extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) in vitro

pela eliminação do NO. ............................................................................................................ 94

Figura 14. O extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) diminui a lipoperoxidação in

vitro. .......................................................................................................................................... 95

Figura 15. Efeito do tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na

atividade da mieloperoxidase (MPO) pancreática (A) e pulmonar (B). ................................... 96

Figura 16. Efeito do tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) no

índice de edema pancreático. .................................................................................................... 97

Figura 17. O tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) inibe a produção

de Fator de Necrose Tumoral (TNF)-α no pâncreas e no pulmão ............................................ 99


de Interleucina (IL)-1β no pâncreas e no pulmão. .................................................................. 100


de interleucina (IL)-6 no pâncreas e pulmão.. ........................................................................ 101

Figura 20. Efeito do tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na

hiperalgesia abdominal durante a pancreatite aguda induzida por L-arginina. ...................... 102

15

Figura 21. Efeito do tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na

produção de malondialdeído (MDA) no pâncreas e pulmão de animais com pancreatite aguda.

................................................................................................................................................ 106


geração de grupamentos carbonil no pâncreas e pulmão de animais com pancreatite aguda. 107


geração de radicais sulfidril não protéicos (NP-SH) no pâncreas e pulmão de animais com

pancreatite aguda. ................................................................................................................... 108

Figura 24. Capacidade antioxidante total (FRAP) no pâncreas (A) e pulmão (B) de animais com

pancreatite aguda tratados com veículo ou o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm)

................................................................................................................................................ 109

Figura 25. O tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) reverte as

alterações causadas pela indução da pancreatite aguda sobre a atividade da enzima catalase

(CAT) no pâncreas e pulmão de animais. .............................................................................. 111

Figura 26. Efeito do tratamento extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na atividade

da enzima superóxido dismutase (SOD) no pâncreas e pulmão de animais com pancreatite

aguda. ...................................................................................................................................... 112

Figura 27. Atividade da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px) no pâncreas e pulmão de

animais com pancreatite aguda após tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon

(EpVm) ou veículo. h da indução da pancreatite .................................................................... 113

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATP Trifosfato de adenosina ALT Alanina aminotransferase ANOVA Análise de variância AST Aspartato aminotransferase BHT Butil-hidroxitolueno CAT Catalase CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal DNA Ácido desoxirribonucléico DNPH 2,4-dinitrofenilhidrazina DTNB Ácido dinitrobenzóico EDTA Etilenodiaminotetracético ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EPM Erro padrão da média ERK Cinase reguladora de sinal extracelular EpVm Extrato padronizado da Vaccinium macrocarpon ERCP Colangiopancreatografia endoscópica retrógrada ERN Espécies reativas de nitrogênio ERO Espécies reativas de oxigênio FBS Soro bovino fetal FEIII-TPTZ Complexo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina FRAP Ensaio de redução férrica/poder antioxidante GR Glutationa redutase GSH Glutationa reduzida GSH-Px Glutationa peroxidase GSSH Glutationa oxidada HMG Grupo protéico de alta mobilidade HRP Horseradish peroxidase HSP Proteína do choque séptico i.p. intraperitoneal iNOS Óxido nítrico sintase induzível ICAM Molécula de adesão intercelular IL Interleucina JNK Cinase c-Jun-N-terminal mRNA RNA mensageiro MDA Malondialdeído MAPK Proteína cinase ativada por mitógeno MPO mieloperoxidase NADPH fosfato de dinucleotídio de nicotinamida e adenina NO Óxido nítrico NF-κB Fator nuclear kappa B NP-SH Radicais sulfidril não protéicos OH-1 Heme oxigenase-1 PA Pancreatite aguda PPAR Receptor ativado por proliferador de peroxissoma PBS Tampão salina-fosfato PAF Fator de ativação plaquetária PAR Poly-ADP-ribose PLA2 Fosfolipase A2

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PN produtos naturais PRISMA Preferred Reporting Items for Systematic Review and Meta-Analysis RNA Ácido ribonucleico s.c. subcutâneo SIRCLE Systematic Review Protocol for Animal Intervention Studies sIL-R Receptor solúvel de interleucina SIRS Síndrome da resposta inflamatória sistêmica SOD Superóxido dismutase TBA Ácido tiobarbitúrico TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TCA Ácido tricloroacético TGF-B Fator de transformação do crescimento TLR Receptores do tipo Toll TMB Tetrametilbenzidina TNF Fator de necrose tumoral UMPO Unidades de mieloperoxidase VEGF Fator de crescimento endotelial vascular v.o. via oral

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 20

2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................ 22

2.1 Pancreatite aguda ....................................................................................................... 22

2.1.1 Caracterização .................................................................................................... 22

2.1.2 Epidemiologia ..................................................................................................... 22

2.1.3 Etiologia ............................................................................................................. 23

2.1.4 Fisiopatologia ..................................................................................................... 24

2.1.5 Principais marcadores bioquímicos na pancreatite aguda .................................. 29

2.1.6 Dor na pancreatite aguda .................................................................................... 30

2.1.7 Modelos de pancreatite aguda experimental ...................................................... 31

2.2 Plantas medicinais ...................................................................................................... 34

2.2.1 Compostos bioativos .......................................................................................... 34

2.2.2 Vaccinium macrocarpon Aiton (Ericaceae) ....................................................... 36

2.2.3 Principais classes de compostos presentes nos frutos da Vaccinium macrocarpon 37

3 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 41

3.1 Gerais ......................................................................................................................... 41

3.2 Específicos ................................................................................................................. 41

4 CAPÍTULO 1 ................................................................................................................... 42

4.1 Considerações iniciais ................................................................................................ 43

4.2 Casuística e métodos .................................................................................................. 44

4.2.1 Elaboração da pergunta do estudo ...................................................................... 44

4.2.2 Registro ............................................................................................................... 44

4.2.3 Critérios de elegibilidade .................................................................................... 45

4.2.4 Desfechos ........................................................................................................... 45

4.2.5 Fontes de informação.......................................................................................... 46

4.2.6 Estratégia de pesquisa ......................................................................................... 46

4.2.7 Registros de estudo ............................................................................................. 46

4.2.8 Risco de viés de estudos individuais .................................................................. 48

4.3 Resultados .................................................................................................................. 49

4.3.1 Descrição dos estudos incluídos ......................................................................... 49

4.3.2 Caracterização dos artigos avaliados .................................................................. 49

4.3.3 Avaliação do risco de viés .................................................................................. 63

4.3.4 Plantas medicinais citadas .................................................................................. 66

19

4.4 Discussão ................................................................................................................... 75

5 CAPÍTULO 2 ................................................................................................................... 78

5.1 Considerações iniciais ................................................................................................ 79

5.2 Casuística e métodos .................................................................................................. 80

5.2.1 Reagentes e drogas ............................................................................................. 80

5.2.2 Material vegetal .................................................................................................. 80

5.2.3 Ensaio in vitro de capacidade antioxidante do EpVm ........................................ 80

5.2.4 Animais ............................................................................................................... 82

5.2.5 Procedimento experimental de indução da pancreatite aguda ............................ 83

5.2.6 Delineamento experimental ................................................................................ 83

5.2.7 Determinação de parâmetros inflamatórios ........................................................ 84

5.2.8 Avaliação da hiperalgesia abdominal ................................................................. 86

5.2.9 Estudo da atividade locomotora ......................................................................... 87

5.2.10 Determinação dos parâmetros bioquímicos no soro ........................................... 87

5.2.11 Determinação do status oxidativo ...................................................................... 87

5.2.12 Determinação da atividade de enzimas antioxidantes ........................................ 90

5.2.13 Determinação de proteínas ................................................................................. 91

5.2.14 Análise estatística ............................................................................................... 92

5.3 Resultados .................................................................................................................. 92

5.3.1 Capacidade antioxidante in vitro do EpVm pela eliminação de radicais DPPH 92

5.3.2 Capacidade antioxidante in vitro do EpVm pela eliminação do óxido nítrico (NO) 93

5.3.3 Inibição da peroxidação lipídica in vitro ............................................................ 94

5.3.4 Efeito do EpVm nos parâmetros inflamatórios .................................................. 95

5.3.5 Efeito do EpVm na hiperalgesia mecânica abdominal ..................................... 101

5.3.6 Efeito do EpVm na atividade locomotora ........................................................ 103

5.3.7 Efeito do EpVm nos parâmetros bioquímicos séricos ...................................... 103

5.3.8 Efeito do EpVm no status oxidativo ................................................................. 104

5.3.9 Efeito do EpVm na atividade das enzimas antioxidantes ................................. 110

5.4 Discussão ................................................................................................................. 114

6 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 120

7 Referências ..................................................................................................................... 121

8 ANEXOS ........................................................................................................................ 136

20

1 INTRODUÇÃO

A pancreatite aguda (PA) é uma doença inflamatória do pâncreas caracterizada por

envolver uma sequência complexa de eventos fisiopatológicos que se desenvolvem

rapidamente e podem levar a alterações hemodinâmicas e resposta inflamatória sistêmica

(PASTOR et al., 2006). Existem dois tipos principais de PA: a pancreatite intersticial edematosa

e a pancreatite necrotizante, sendo que, em muitos casos, a pancreatite pode evoluir para a

síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) e atingir diversos órgãos (BANKS et al.,

2013). Existem muitas causas de PA que podem ser facilmente identificadas na maioria dos

pacientes. Entre as causas mais comuns estão a obstrução do ducto pancreático por cálculos

biliares e o alcoolismo (RAMOS et al., 2016).

O seu tratamento é principalmente sintomático e de suporte, com o objetivo de

controlar a dor, atender às necessidades nutricionais, monitorar as complicações e prevenir a

infecção pancreática e a disseminação da inflamação para outros órgãos, principalmente para

os pulmões (AISP, 2015). Vale ressaltar que não há tratamento farmacológico específico

dirigido ao mecanismo fisiopatológico subjacente (PEZZILLI; BELLACOSA; FELICANI,

2009; YOKOE et al., 2015) e que a incidência da PA tem aumentado nos últimos anos a uma

taxa de 2,7% ao ano (ROBERTS et al., 2014), o que torna imprescindível a busca por novas

alternativas de tratamento.

A ausência de terapia específica para o tratamento da PA, seu complexo mecanismo

fisiopatológico e as altas taxas de mortalidade observadas em casos mais graves da doença

tornam essa condição interessante para estudos experimentais baseados na busca de novas

alternativas terapêuticas. Entre as fontes de princípios ativos, os produtos naturais se destacam

pelo importante papel que têm desempenhado ao longo dos anos na busca por novos fármacos

(HARVEY, 2008). Dentre eles, destacam-se as plantas medicinais, que têm servido como fontes

de misturas complexas de metabólitos secundários, como nos extratos, ou compostos

quimicamente isolados oriundos de plantas (LOURENCO; FERREIRA; BRANCO, 2012).

Embora existam muitos trabalhos na literatura relacionando o uso de plantas

medicinais ao tratamento da PA, há escassez de estudos que tenham avaliado as evidências

científicas sobre o uso das plantas medicinais em modelos de PA experimental. Existe apenas

uma revisão narrativa publicada que reporta o uso de produtos naturais com atividade

antioxidante na PA (PARK et al., 2014). No entanto, este trabalho abrange apenas produtos

naturais com ação antioxidante sem abordar os aspectos anti-inflamatórios ou antinociceptivos

destes produtos, e também inclui misturas de tratamentos, como produtos derivados da

21

medicina chinesa, o que pode gerar resultados conflitantes. Estes fatos justificam a primeira

parte do presente estudo, que buscou avaliar a evidência científica obtidas a partir de estudos

relacionados ao uso pré-clínico de plantas medicinais na PA.

Apesar da necessidade de mais evidências científicas sobre estudos envolvendo as

plantas mediciais na PA, nas últimas décadas tem sido enfatizado que o potencial antioxidante

parece ser um possível preditor de efeito benéfico em condições inflamatórias como a

pancreatite, uma vez que o estresse oxidativo desempenha um papel importante na gênese e

desenvolvimento dessa doença (NASCIMENTO et al., 2013; LOURENCO; FERREIRA;

BRANCO, 2012).

Entre as plantas com elevado potencial antioxidante e anti-inflamatório destaca-se a

Vaccinium macrocarpon Aiton (Ericaceae), cujos frutos são popularmente conhecidos como

cranberry e usados como sucos em toda a América do Norte. Devido aos resultados promissores

que vem apresentando em ensaios clínicos e pré-clínicos, o uso dos frutos desta planta se

espalhou por todo o mundo Ocidental, como sinônimo de vida saudável (ANHÊ et al., 2015).

O seu fruto apresenta na composição antocianinas, flavonóides, proantocianidinas, taninos

condensados e ácidos fenólicos, e seu extrato padronizado contém um mínimo de 25% de

antocianinas, o que lhe confere um alto potencial antioxidante. Estudos recentes mostraram que

o extrato padronizado dos frutos de Vaccinium macrocarpon (EpVm) pode atenuar a inflamação

hepática em camundongos obesos (GLISAN et al., 2016), diminuir a inflamação intestinal em

camundongos obesos (ANHÊ et al., 2015) e inibir a adesão de E. coli patogênica em pacientes

com infecção do trato urinário recorrente (SINGH; GAUTAM; KAUR, 2016). Clinicamente, o

EpVm tem sido utilizado no tratamento de doenças do trato urinário e inflamação vascular,

mostrando assim, elevado potencial terapêutico (DURHAM; STAMM; EILAND, 2015;

HISANO et al., 2012).

A iminente necessidade de novas opções terapêuticas no tratamento da PA, bem como

o potencial efeito anti-inflamatório e antioxidante apresentado pelo EpVm sugerem que este

extrato pode se tornar uma alternativa viável na tratamento desta doença, justificando assim a

presente investigação sobre o possível efeito do EpVm na PA experimental em camundongos,

que compõe a segunda parte deste trabalho.

22

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Pancreatite aguda

2.1.1 Caracterização

De acordo com a classificação de Atlanta1 revisada em 2012, a pancreatite aguda (PA)

é definida como um processo inflamatório agudo do pâncreas e que clinicamente deve

apresentar pelo menos duas características iniciais, entre elas: dor epigástrica abdominal

sugestiva de PA, concentrações séricas de amilase e lipase três vezes acima do normal, achados

característicos de PA na tomografia computadorizada ou na ressonância magnética ou em

estudo ecográfico transabdominal (BANKS et al., 2013; THOENI, 2012).

Os dois tipos de pancreatite observados pela classificação de 1992, pancreatite

edematosa e pancreatite hemorrágica necrosante, foram substituídos por conceitos mais

abrangentes e explicativos de pancreatite intersticial edematosa, caracterizada por uma

inflamação aguda no parênquima pancreático e tecidos peripancreáticos sem, contudo,

apresentar necrose; e pancreatite necrotizante que se caracteriza pela inflamação associada à

necrose parenquimal do pâncreas e/ou necrose peripancreática. Ela pode ser ainda do tipo

média, em que não há falência de órgãos ou complicações locais e sistêmicas; do tipo moderada

com falência temporária de órgãos até 48 h ou complicações locais e do tipo sistêmica, com

falência persistente de um ou mais órgãos (BANKS et al., 2013).

2.1.2 Epidemiologia

A pancreatite aguda (PA) é uma das principais causas de admissões hospitalares em

vários países (YADAV; LOWENFELS, 2013; YOKOE et al., 2015). Em todo o mundo, este

índice varia de 5 a 74/100 mil habitantes e se pode observar as mais altas incidências no Japão

e Estados Unidos (LOWENFELS; MAISONNEUVE; SULLIVAN, 2009; NESVADERANI;

ESLICK; COX, 2015; SEKIMOTO et al., 2006; YADAV; LOWENFELS, 2013). No período

de um ano, entre novembro de 2015 e outubro de 2016, no Brasil, a morbidade hospitalar

relacionada à PA foi de 15,2 casos/100 mil habitantes, sendo que 19% destes, evoluíram ao

óbito, segundo dados do Ministério da Saúde (DATASUS, 2016). Vale ressaltar que a

incidência da PA tem aumentado nos últimos anos a uma taxa média de 2,7% ao ano em vários

1 Classificação de gravidade da pancreatite aguda oriuda de reunião internacional de consenso do Acute

Pancreatitis Classification Working Group (APCWG) que ocorre a cada 10 anos em Atlanta-Georgia, EUA.

23

países do mundo (ROBERTS et al., 2014). Em geral, homens e mulheres são igualmente

acometidos por esta doença, com um aumento do risco em indivíduos acima dos 50 anos de

idade (YADAV; LOWENFELS, 2013). Entre os fatores de risco relacionados ao seu

desenvolvimento, estão o etilismo, o tabagismo, a obesidade e o consumo de drogas (YADAV,

LOWENFELS, 2013).

A mortalidade média relacionada varia de 5 a 20%, no entanto, em casos de PA

necrotizante, esta taxa pode chegar a 80%, sendo que em 60% dos casos, o agravamento da PA

está relacionado à falência pulmonar (PEZZILLI; BELLACOSA; FELICANI, 2009). Outros

fatores que aumentam a mortalidade são o tempo de hospitaliação, o tamanho do hospital em

que é feito o atendimento, a presença de comorbidades como diabetes, dislipidemias e

obesidade e a própria etiologia da pancreatite, sendo que a mortalidade é maior quando

relacionada à pancreatite causada por cálculos (ROBERTS et al., 2014).

2.1.3 Etiologia

As principais causas para o desenvolvimento da pancreatite aguda (PA) são os cálculos

biliares (38%) e o alcoolismo (36%). Na maioria dos casos de pancreatite causada por cálculos

(litíase), a passagem de um cálculo biliar pode se alojar no esfíncter de Oddi, no ducto biliar ou

no ducto pancreático, levando à pancreatite por aumento da pressão ductal e perda da

hemostasia local com ativação precoce das enzimas pancreáticas (ZARNESCU et al., 2015). O

mecanismo pelo qual o consumo excessivo de álcool causa pancreatite ainda não está bem

esclarecido, embora seja aceito que metabólitos do álcool possam estar envolvidos na ativação

precoce de tripsina, levando à destruição precoce dos ácinos pancreáticos (FEICK; GERLOFF;

SINGER, 2007; WANG et al., 2009). A terceira causa mais comum de PA é a obstrução do

ducto pancreático por tumores, que corresponde a 14% dos casos, cujos tipos mais comuns de

tumores são carcinoma ductal pancreático, carcinoma ampular, tumor de ilhotas, pseudotumor

sólido de pâncreas, sarcoma, linfoma, colangiocarcinoma ou tumores metastáticos (WALLNER

et al., 2013; WANG et al., 2009)

As demais causas incluem PA pós colangiopancreatografia endoscópica retrógrada

(ERCP) e trauma abdominal que acometem cerca de 5% dos pacientes cada. Pancreatite aguda

induzida por medicamentos, relacionada principalmente, ao uso de azatioprina, sulfonamidas,

sulindaco, tetraciclina, ácido valpróico, didanosina, metildopa, estrogênios, furosemida, 6-

mercaptopurina, pentamidina, corticosteroides e actreotide, que acometem 0,1 a 2% dos casos;

infecções respondem como causa de menos de 1% dos casos de PA, sendo mais comum em

24

crianças e pode estar relacionada principalmente ao vírus de Epistein-Barr, coxsackie vírus,

acovirus e varicela zoster, ou associada a infecções por Mycoplasma pneumoniae, Salmonella

thyposa, Leptospira, Campylobacter e Mycobacterium tuberculosis. Hipercalcemia relacionada

ao hiperparatireoidismo e hipertrigliceridemia (acima de 1000 mg/dL) também estão

relacionadas como etiologias menos comuns da PA, assim como fatores hereditários e

autoimunes (TONSI et al., 2009).

2.1.4 Fisiopatologia

A elucidação dos mecanismos específicos envolvidos na fisiopatologia da pancreatite

aguda (PA) ainda não está completa. A sequência de eventos fisiopatológicos na PA pode ser

dividida em 3 fases: fase de iniciação, quando ocorrem os eventos intra-acinares; fase de

perpetuação, caracterizada pela resposta inflamatória e fase de escalada secundária em que o

processo inflamatório evolui para Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SINGH;

GARG, 2016).

Na fase de iniciação, a ativação prematura das enzimas pancreáticas presentes nos

ácinos é um passo importante e conhecido da patogênese da PA. Vários mecanismos celulares

são partícipes na ativação prematura do tripsinogênio, são eles: alteração na homeostase do

cálcio, colocalização de lisossomos, e alterações no pH e nos zimogênios. É relevante destacar

que a ativação do tripsinogênio é uma causa fundamental para iniciação da PA, no entanto, a

progressão da inflamação, tanto local, quanto sistêmica, ocorre independentemente desta

ativação. O influxo do cálcio citosólico possui um papel chave tanto nos mecanismos

fisiológicos quanto patológicos nas células acinares. As concentrações intracelulares de cálcio

são determinantes na ativação da tripsina, de modo que o influxo excessivo de cálcio para o

interior da célula pode modular a ativação do zimogênio, resultando em maior lesão

pancreática. Um clearance inadequado de cálcio pode aumentar o cálcio intracelular, como se

observa nas lesões pancreáticas causadas por ácidos biliares ou metabólitos do etanol (BOOTH

et al., 2011).

Nos estágios iniciais da PA também é possível observar a inativação precoce do

zimogênio, em especial, daqueles grânulos localizados mais próximos dos lisossomos, o que

pode estar relacionado a alterações no pH, que intensificam a secreção dos grânulos de

zimogênio após o aumento da acidez do meio (BEHRENDORFF et al., 2010). A ativação dos

lisossomos se relaciona com a autofagia, um processo biológico que envolve uma complexa

resposta fisiológica com a participação de lisossomos os quais eliminam agregados de

25

proteínas, organelas ou micro-organismos (GRASSO et al., 2011). No contexto da PA, essa

autofagia é descrita como uma resposta protetora com a função de degradar grânulos de

zimogênio potencialmente deletérios, ativados nos estágios iniciais da PA, no entanto, este

processo autofágico pode se mostrar lesiva ao liberar o tripsinogênio do lisossomo, que será

convertido em tripsina, com acumulação intra-acinar de tripsina (GRASSO et al., 2011;

MARENINOVA et al., 2009).

Um importante aspecto da PA é a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO’s) e

de nitrogênio (ERN’s). O estresse oxidativo - que ocorre sob condições de excesso de agentes

oxidantes e/ou deficiência do sistema protetor, gerando um desequilíbrio entre o consumo de

glutationa reduzida (GSH) e a produção de glutationa oxidada (GSSG) (RAU et al., 2000) -

observado durante a PA é importante tanto para os eventos locais iniciais à PA, quanto em

relação à SIRS. Já foi reportado que as enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT)

possuem um papel importante na gênese da PA (SANFEY; BULKLEY; CAMERON, 1984).

Um dos principais efeitos das ERO’s é a lipoperoxidação, que leva a alterações na estrutura das

membranas celulares com consequente perda da seletividade nas trocas iônicas e liberação de

conteúdo celular com formação de metabólitos tóxicos como as substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico (TBARS) que tem como principal representante o malondialdeído (MDA) (TIAN

et al., 2013).

Também são observadas na PA as lesões a proteínas, tanto pelas degradações

proteolíticas que convertem aminoácidos em derivados de carbonil, quanto pela oxidação de

grupamentos sulfidril (-SH) presentes nos aminoácidos, o que pode comprometer o

funcionamento das proteínas. O estresse oxidativo é primariamente gerado do complexo

enzimático fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NADPH) oxidase e de

disfunções mitocondriais que ocorrem durante a PA. Uma vez produzidas, estas ERO’s

desencadeam e exacerbam o processo inflamatório, atacando diretamente a matriz lipídica das

membranas biológicas e estimulando o metabolismo do ácido araquidônico, que aumenta a

produção de mediadores da inflamação (RAU et al., 2000).

O estresse oxidativo tem um papel duplo na lesão pancreática. A produção de ERO’s

leva à apoptose das células acinares, o que é vantajoso para as células, uma vez que a apoptose

não induz o processo inflamatório. Por sua vez, a inibição da geração das ERO’s é acompanhada

pela redução do trifosfato de adenosina (ATP), o que leva à necrose, um processo mais lesivo

à célula pois desencadeia a resposta inflamatória (RAU et al., 2000). Por outro lado, o estresse

oxidativo nos neutrófilos durante a inflamação inicial, pode ser responsável pela propagação da

inflamação local em sistêmica (BOOTH et al., 2011). O desequilíbrio redox na célula está

26

relacionado tanto a lesões celulares e teciduais como à sinalização de genes pró-inflamatórios

via fator nuclear (NF)-κB, responsável pela ativação de citocinas pró-inflamatórias como o fator

de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β e IL-6 (SAH; DAWRA; SALUJA, 2013).

Nesta fase, há formação do edema pancreático cuja extensão total é correlacionável com

a gravidade da doença e a sua formação durante o processo inflamatório ocorre devido a

distúrbios na microcirculação que incluem a presença de óxido nítrico (NO), ERO’s,

bradicinina, prostaciclina (PG)-I2 e endotelina (AKINOSOGLOU; GOGOS, 2014).

A segunda fase da fisiopatologia da pancreatite se caracteriza pelo desenvolvimento de

um processo inflamatório local e sistêmico relacionado ao intrincado balanço entre a lesão

tecidual local e a produção sistêmica de mediadores pró e anti-inflamatórios (DIOS et al., 2011).

A resposta celular inicial, que consiste em infiltração tecidual de neutrófilos e monócitos,

parece exacerbar a lesão pancreática, sendo responsável, em parte, pela falência precoce de

órgãos vista em alguns casos de PA (SHRIVASTAVA; BHATIA, 2010). O recrutamento de

neutrófilos para o sítio da inflamação pode ser quantificado pela atividade de mieloperoxidase

(MPO), uma hemoproteína estocada nos grânulos azurófilos dos neutrófilos que catalisa a

conversão de cloreto e peróxido de hidrogênio em hipoclorito, o qual é secretado pelos

neutrófilos durante o processo inflamatório (KLEBANOFF, 2005). Os neutrófilos estão entre

as primeiras células do sistema imunológico a responder a uma lesão tecidual, a infiltração

pancreática de neutrófilos pode ocorrer 1 h após a indução da pancreatite em modelos

experimentais e a infiltração neutrofílica no pulmão 3 h após (SZATMARY; GUKOVSKY;

ANGELES, 2016). Este recrutamento de células inflamatórias da medula óssea para a

circulação é favorecido por mediadores inflamatórios, incluindo quimiocinas e citocinas como

o TNF-α (DIOS et al., 2011).

Uma das características marcantes no curso da PA é a liberação de citocinas pró-

inflamatórias, causada, principalmente, pela lesão nas células acinares (SZATMARY;

GUKOVSKY; ANGELES, 2016). A necrose desses ácinos libera padrões moleculares

associados a lesões, tais como histonas e ATP, o qual inicia uma resposta aguda inflamatória

que partilha semelhanças com os eventos moleculares observados na sepse (AKINOSOGLOU;

GOGOS, 2014). O significado clínico do agravamento dos quadros de PA reforça a necessidade

da dosagem de citocinas que nos permitem prever, por exemplo, se a inflamação pancreática

está autolimitada ou se autoperpetua resultando em lesões significativas e necrose acinar

(HIROTA et al., 2000). As principais citocinas envolvidas no processo inflamatório pancreático

são o TNF-α, a IL-6 e a IL-1β. Estas citocinas são responsáveis por mediar os efeitos sistêmicos

da pancreatite como febre, hipotensão e choque (POORAN et al., 2003).

27

O TNF-α tem se mostrado um importante iniciador das lesões locais e sistêmicas

observadas durante a PA. O aumento global das concentrações de TNF-α no tecido e no soro

se correlacionam diretamente com a gravidade da PA em curso (MAEDA et al., 2003). A IL-

1β é outra potente citocina que também é oriunda dos macrófagos, assim como o TNF-α

(HIROTA et al., 2000). A IL-6 é uma citocina chave envolvida na gênese inflamatória da PA

(IGOILLO-ESTEVE et al., 2011). Modelos in vivo de PA experimental mostram o aumento

das concentrações de IL-6 em correlação com a gravidade do modelo utilizado. Esta citocina é

primariamente derivada de fagócitos mononucleares e sua concentração está particularmente

elevada na pancreatite moderada, sendo responsável pelo clearence tardio do infiltrado de

neutrófilos em associação à necrose pancreática e assim um mediador chave na resposta de fase

aguda (DIOS et al., 2011; POORAN et al., 2003; SZATMARY; GUKOVSKY; ANGELES,

2016).

No terceiro estágio de decurso da PA há o desenvolvimento da SIRS, de distúrbios

circulatórios e de coagulação, com presença de translocação bacteriana podendo evoluir para

um choque séptico (SINGH; GARG, 2016). Durante a SIRS ocorrem reações imunes e

inflamatórias, devido à ativação dos leucócitos na circulação sistêmica, alterações na

microcirculação pulmonar que levam à migração de leucócitos ao interstício pulmonar,

aumento da permeabilidade vascular e edema pleural (BHATIA et al., 2000; SHRIVASTAVA;

BHATIA, 2010). A lesão pulmonar associada à pancreatite é multifatorial e pode estar

relacionada com o grau de agressão celular, a presença de enzimas ativadas, a destruição do

surfactante pulmonar, a participação de citocinas e de mediadores inflamatórios e a perfusão

pulmonar deficiente (ZHOU et al., 2010). Em adição, a ciclo-oxigenase (COX)-2 possui um

papel central na gênese da pancreatite associada à lesão pulmonar, principalmente na infiltração

neutrofílica e no edema pulmonar nos estágios iniciais, de modo que a inibição da COX-2

diminui tanto a gravidade da pancreatite quanto a lesão pulmonar a ela associada, por um efeito

multifatorial, que pode envolver alterações na expressão de óxido nítrico sintase induzida

(iNOS) e na função neutrofílica (ETHRIDGE et al., 2002). Outros órgãos também podem ser

afetados, como os rins, o coração, o sistema vascular, o fígado e o duodeno, cujas alterações na

permeabilidade da barreira intestinal podem levar à translocação de bactérias para a circulação

sistêmica e endotoxemia, podendo evoluir para a sepse (KOUSSOULAS et al., 2006). Em

adição, os distúrbios circulatórios presentes nesta fase incluem adesão leucocitária, agregação

plaquetária, hemoconcentração, vasoconstricção, aumento da permeabilidade vascular e edema,

diminuição da contratilidade do miocárdio devido a formação de mediadores inflamatórios,

incluindo o NO (DIOS et al., 2011). Na Erro! Fonte de referência não encontrada.1 pode-se

28

observar um resumo gráfico da fisiopatologia da PA no qual são abordados os três principais

estágios, de iniciação, lesão acinar e inflamação secundária.

Figura 1. Fisiopatologia da pancreatite aguda. IL (Interleucina), TNF (Fator de Necrose Tumoral), PAF (Fator de Ativação Plaquetária), MCP (Proteína Quimiotática de Monócitos), ICAM (Molécula de Adesão Intercelular), TGF (Fator de Crescimento Tumoral), NF-kB (Fator Nuclear kappa B), ERO (Espécies Reatvas de Oxigênio). Fonte: do próprio autor.

29

2.1.5 Principais marcadores bioquímicos na pancreatite aguda

Na prática clínica, alguns biomarcadores são essenciais ao diagnóstico da pancreatite

aguda (PA), já que, em conjunto, fornecem de maneira rápida e barata, informações

relacionadas ao diagnóstico e ao agravamento desta doença. Uma avaliação laboratorial inicial

deve incluir determinação das concentrações de amilase e lipase, contagem total e diferencial

de leucócitos, determinação das concentrações séricas de ureia e creatinina, aspartato

aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), proteína C-reativa (PC-R) e cálcio

(ZARNESCU et al., 2015).

Amilase e lipase, enzimas digestivas secretadas pelas células acinares, são os

marcadores laboratoriais mais comuns no diagnóstico da PA. A lipase plasmática é mais

sensível e específica do que a amilase, pois que esta pode estar elevada em processos como

insuficiência renal e em concentrações normais na pancreatite crônica alcoólica, além disso,

estas enzimas possuem cinéticas de liberação diferentes, ao passo que a amilase é o primeiro

destes biomarcadores a se alterar em casos de PA e o aumento sérico de lipase é mais lento,

porém, mais duradouro (AISP, 2015; NOZAWA et al., 2013; YOKOE et al., 2015). A lesão

dos ácinos pancreáticos leva à liberação de amilase que flui para o sistema linfático intra-

pancreático, podendo atingir preferencialmente o pulmão e a corrente sanguínea (MEHER et

al., 2015; NESVADERANI; ESLICK; COX, 2015).

Em resposta ao processo inflamatório local, neutrófilos e macrófagos, principalmente,

secretam mediadores inflamatórios, como por exemplo, as citocinas que vão desencadear uma

resposta aguda hepática, levando ao aumento sérico de proteínas plasmáticas, como a PC-R

(MEHER et al., 2015). No entanto, em murinos, a PC-R não é uma proteína de fase aguda,

possuindo, inclusive, uma estrutura diferente daquela em humanos (PADILLA et al., 2003;

RASSOULI et al., 1992). Embora existam evidências científicas de suas alterações em algumas

doenças, como a arteriosclerose, não é possível ainda, relacioná-la fortemente às condições

inflamatórias em animais de experimentação como ocorre em humanos (TORZEWSKI;

WAQAR; FAN, 2014).

Alterações na ALT, mas não na AST são sugestivas de PA de origem biliar, podendo,

inclusive, servir como um preditor clínico inicial da etiologia da PA (ZARNESCU et al., 2015).

Durante a evolução da PA, o aumento concentrações séricas de ureia e creatinina podem ocorrer

devido insuficiência pré-renal (hipovolemia), além disso, ambas são consideradas marcadores

da gravidade da PA, pois o aumento da creatinina sérica está relacionado à presença de necrose

30

pancreática e o aumento da ureia relaciona-se ao agravamento do quadro de PA (MUDDANA

et al., 2009; WU et al., 2011).

2.1.6 Dor na pancreatite aguda

Um dos principais sintomas clínicos da pancreatite aguda (PA) é a dor, sendo

caracterizada pelo paciente como um forte desconforto epigástrico com sensação de

“queimação” na região superior do abdômen, podendo irradiar para as demais regiões

abdominais, podendo estar acompanhada de alodinia – sensibilidade da pele ao toque (VAN

ESCH et al., 2006). Na prática clínica, o controle da dor na PA é feito com opióides, embora

em alguns pacientes a sensação dolorosa possa permanecer por mais de 24 h após iniciado o

tratamento. Além disso, os efeitos adversos do tratamento com opióides como, náusea, vômito

e diminuição da motilidade do trato gastrintestinal podem agravar o desconforto sentido pelos

pacientes durante o curso da PA (VAN ESCH et al., 2006; YOKOE et al., 2015).

O pâncreas é inervado pelo nervo vago contendo neurônios colinérgicos que que

regulam a sua secreção exócrina, bem como por neurônios simpáticos e que modulam ambas

as funções pancreáticas (endócrina e exócrina) (CHANDRA; LIDDLE, 2011). O bloqueio da

inervação simpática, mas não do nervo vago, é efetivo no tratamento da dor pancreática, visto

que as fibras aferentes viscerais acompanham os nervos simpáticos para transmitir a informação

até o pâncreas (CEYHAN et al., 2008). Uma das teorias relacionadas à gênese da dor na PA se

refere a fatores mecânicos como o aumento da pressão intra-ductal, e à liberação local de

mediadores inflamatórios como a bradicinina e as prostaglandinas (MATEU et al., 2014).

A segunda hipótese da gênese da dor na pancreatite baseia-se no mecanismo

inflamatório neurogênico. Neste caso, os neurônios sensoriais primários que inervam o

pâncreas podem liberar, mediante estímulos adequados, neuropeptídios capazes de agir no

tecido alvo, induzindo um processo inflamatório neurogênico, caracterizado, principalmente

por vasodilatação arteriolar e extravasamento plasmático (BARRETO; SACCONE, 2012).

Assim, a ativação das fibras primárias, que provocam reflexos na medula espinal com

consequente aumento na excitabilidade dos neurônios que partem dessa estrutura, contribui

para a amplificação dos sinais de dor provenientes da periferia (WINSTON et al., 2005). Apesar

das controvérsias, está estabelecido que a via comum final de qualquer processo patológico que

provoca dor de origem pancreática é a inervação desse órgão, que na maioria compreende fibras

C não-mielinizadas (VERA-PORTOCARRERO; LU; WESTLUND, 2003), bem como a

31

formação de outros mediadores que reconhecidamente sensibilizam ou disparam as terminações

sensoriais, como a bradicinina e as prostaglandinas (CONWELL et al., 2001).

Vários autores concordam que o conhecimento nesta área é incompleto, de modo que

a caracterização de mediadores e receptores/canais iônicos na terminação nervosa sensorial é

necessária a fim de facilitar o desenvolvimento de novos tratamentos farmacológicos

(BARRETO; SACCONE, 2012; MICHALSKI et al., 2007), bem como a descoberta de novas

drogas que modulem os mecanismos dolorosos no curso da PA (MICHALSKI et al., 2007;

SANTANA et al., 2012a).

2.1.7 Modelos de pancreatite aguda experimental

Diversos modelos experimentais in vivo de indução da pancreatite aguda (PA) foram

desenvolvidos ao longo do tempo, com a finalidade de examinar mecanismos fisiopatológicos,

genéticos e moleculares a ela relacionados, testar intervenções terapêuticas e estudar a

influência da inflamação pancreática no desenvolvimento do câncer de pâncreas (LERCH;

GORELICK, 2013). Cada modelo possui características próprias relacionadas à gravidade da

PA, duração, reversibilidade e evolução, sendo que cabe ao pesquisador a escolha de qual

modelo será mais adequado às condições laboratoriais existentes e aos objetivos de cada

pesquisa (GRANGER; REMICK, 2005). Embora muitas espécies dentre as quais coelhos,

gatos, cachorros, porcos, preás e até peixes tenham sido usadas em modelos de PA

experimental, a maioria das investigações fazem uso de roedores (ratos e camundongos) devido

a menores dificuldades de padronização da técnica e manutenção dos animais durante a

pesquisa (LERCH; GORELICK, 2013).

Destacam-se algumas diferenças entre a anatomia do pâncreas de humanos e de

roedores, sendo que o entendimento destas diferenças é importante durante os processos de

indução e coleta de tecidos para análise em distintos modelos (SU; CUTHBERTSON;

CHRISTOPHI, 2006). As principais diferenças entre o pâncreas dos roedores e dos humanos é

que em humanos, os ductos biliar e pancreático são estruturas separadas que formam um

pequeno canal comum na ampola duodenal, enquanto que em roedores, trata-se de um único

canal comum (ducto biliopancreático) que coleta tanto bile quanto sucos pancreáticos (HYUN;

LEE, 2014). Outra diferença reside no fato de que os roedores não possuem vesícula biliar e

que seu pâncreas é composto de diversos segmentos no omento peritoneal, enquanto que em

humanos o pâncreas é um órgão sólido e bem delimitado (DOLENŠEK; RUPNIK; STOŽER,

2015). Apesar das diferenças, estes órgãos possuem similaridades como a drenagem dos suco

32

pancreático para o duodeno, as características entre as células acinares, ductais e endócrinas de

ambos os órgãos e a finalidade de ambos que possuem funções endócrina e exócrina (HYUN;

LEE, 2014).

Para fins de estudo, os modelos de indução da PA experimental podem ser divididos em

invasivos e não invasivos, sendo que na primeira classe de modelos tem-se a indução da PA

por obstrução do ducto biliopancreático, por injeção retrógrada intra-ductal, por fechamento da

alça duodenal, pela combinação de hiperestimulação secretória com injeção intra-ductal de

ácidos biliares, por alterações vasculares, isquemia e reperfusão. Como representantes dos

modelos não invasivos, tem-se a indução da PA por análogos da colecistocinina, por álcool, por

imunomoduladores, por dieta, por L-arginina e por knockout de genes (SU; CUTHBERTSON;

CHRISTOPHI, 2006). Segue abaixo um breve relato acerca dos modelos mais comumente

empregados:

a) indução da PA por obstrução do ducto biliopancreático – o modelo de indução da

pancreatite por obstrução do ducto biliopancreático é capaz de mimetizar os estágios

iniciais da pancreatite por litíase em humanos, que é a principal causa clínica da pancreatite

aguda (SAMUEL et al., 2005). Neste modelo, o acúmulo de enzimas digestivas no pâncreas

ocorre devido à obstrução mecânica ductal, favorecendo a lesão das células acinares por

estas enzimas, ao invés de sua secreção na forma inativada pelo ducto pancreático

(MEYERHOLZ et al., 2008). Este modelo apresenta características de pancreatite

hemorrágica, estando associado à lesão pulmonar, com presença de infiltração neutrofílica

e perda da arquitetura tissular, além do aumento do número de macrófagos teciduais no

pâncreas, acompanhado por edema, ativação de quinases envolvidas em vias de sinalização

intracelular, elevação da MPO tecidual, além de fibrose pancreática e aumento do número

de células apoptóticas (MEYERHOLZ et al., 2008). Observa-se também o aumento da

atividade de amilase, tripsina e lipase séricos, bem como a queda das concentrações de

glutationa no pâncreas (URUÑUELA et al., 2002). Pode ser realizado em ratos e

camundongos, no entanto, por se tratar de um método de indução cirúrgico, exige

cuidadoso treinamento do experimentador, a fim de evitar erros durante a indução cirúrgica

(SAMUEL et al., 2005, 2010);

b) indução da PA por injeção retrógrada intra-ductal – diversas substâncias podem ser

injetadas no ducto biliopancreático de ratos para a indução da PA experimental. A injeção

retrógrada intra-ductal de sais biliares é um modelo útil quando se deseja estudar os

33

estágios iniciais da PA necrotizante em um período de tempo relativamente curto de quatro

a 12 h (GRANGER; REMICK, 2005). Imediatamente após a infusão de sal biliar, em geral,

o tauracolato de sódio, pode-se observar uma necrose hemorrágica no parênquima

pancreático, estendendo-se a partir do ducto biliopancreático e seis horas depois observa-

se a presença de ascite e de necrose pancreática acentuada (HYUN; LEE, 2014). Este

método é executado em ratos e possui como desvantagem a necessidade de treinamento

cuidadoso por parte do experimentador, a fim de não haver contaminação do meio durante

a laparotomia, exposição do pâncreas e injeção intra-ductal (SU; CUTHBERTSON;

CHRISTOPHI, 2006). Enzimas como a tripsina e a fosfolipase A2 secretória (PLA2)

também podem ser injetadas via intra-ductal para a indução da PA experimental (BOHE et

al., 1984; CAMARGO et al 2005).

c) indução da PA por ceruleína - esta substância é um análogo da enzima pancreática

colecistocinina e é amplamente conhecida por induzir uma pancreatite experimental

histologicamente semelhante aos estágios iniciais da pancreatite aguda em humanos e pode

ser utilizada tanto em ratos quanto em camundongos (CHAN; LEUNG, 2007). É mais

comumente utilizada pela via intraperitoneal, geralmente em quatro a sete injeções com

intervalos de uma hora entre elas, sendo que uma hora após a primeira injeção de ceruleína

pode ser observado um edema pancreático, que aumenta gradualmente até as 12 h após o

início da indução da PA, no entanto, este modelo leva ao desenvolvimento de uma PA de

gravidade leve a moderada, inviabilizando o seu uso para estudar as formas mais graves da

doença (HYUN; LEE, 2014). Embora a indução da PA por ceruleína seja de fácil execução,

os custos do agente indutor são elevados, o que pode limitar o seu uso (SU;

CUTHBERTSON; CHRISTOPHI, 2006);

d) indução da PA por L-arginina - a administração intraperitoneal de dose excessiva de L-

arginina (2,5-5,0 g/kg de peso) pode induzir uma pancreatite com características

bioquímicas e histológicas de uma pancreatite necrosante em ratos e camundongos

(DAWRA et al., 2007; TANI et al., 1990). Em camundongos, após 24 h da injeção de L-

arginina, observa-se a alteração de parâmetros inflamatórios que se intensificam com o

passar do tempo, é um modelo reprodutível, não invasivo e produz necrose acinar por um

mecanismo que ainda não está completamente elucidado, embora, seu efeito sobre o

pâncreas deva-se, em parte, a um mecanismo de inibição proteica, aumento da síntese de

NO e peroxidação lipídica (CZAKO et al., 1998; HEGYI et al., 2009). A pancreatite

34

induzida por L-arginina é caracterizada por aumento na amilase sérica, do edema

pancreático, das concentrações circulantes de IL-6, da atividade de MPO pancreática,

ativação de tripsina, lesão pulmonar e alterações histológicas no pâncreas e pulmão (KUI

et al., 2015).

A escolha do modelo ideal de indução experimental da PA deve levar em conta a

habilidade de reproduzi-lo, a possibilidade de execução de parâmetros que possibilitem a

resposta aos objetivos iniciais, a adequação da gravidade da pancreatite observada em cada

modelo aos objetivos do estudo e a padronização cuidadosa das técnicas de indução a fim de

evitar erros na indução do modelo (SU; CUTHBERTSON; CHRISTOPHI, 2006).

2.2 Plantas medicinais

2.2.1 Compostos bioativos

O estudo de plantas medicinais tem importância fundamental na descoberta de novos

tratamentos para as mais diversas condições clínicas (CALIXTO, 2000). Dentre as fontes de

princípios ativos medicamentosos, os produtos naturais se destacam pelo importante papel que

vêm desempenhando ao longo dos anos na descoberta de novos medicamentos, com relevância

para aqueles com comprovado potencial antioxidante (HARVEY, 2008). O uso de fitocêuticos,

extratos ou misturas de extratos padronizados de plantas medicinais é uma realidade na clínica

para tratar diversas condições (REVATHI; GAUTAMI; SREE, 2015).

Evolutivamente, as plantas desenvolveram mecanismos de produção de compostos que,

embora não vitais, são essenciais para a sobrevivência da espécie, atuando na defesa contra

herbívoros ou na manutenção da homeostase em ambientes agressivos, estes compostos

orgânicos, oriundos do metabolismo secundário do CO2 advindo da fotossíntese, podem ocorrer

a partir de quatro vias biossintéticas, a saber: via do ácido chiquímico que dá origem aos

metabólitos nitrogenados e aos compostos fenólicos, via do acetato malonato que orgina os

compostos fenólicos, e as vias do ácido mevalônico e do metileritritol fosfato cujos produtos

finais são os terpenos (KLIEBENSTEIN; OSBOURN, 2012). Assim, os metabólitos

secundários são divididos em três grandes grupos: compostos nitrogenados, terpenos e

compostos fenólicos.

Os compostos fenólicos contém uma grande quantidade de substâncias caracterizadas

pela existência de pelo menos um anel aromático no qual ao menos um hidrogênio foi

substituído por um grupo hidroxila, podendo estar nas formas livre (aglicona) ou ligado a a

35

açúcares (glicosídeos), proteínas, terpenos, ou outros, e podem ser sintetizados pela via do ácido

chiquímico, pela via do acetato malonato ou por ambas, como no caso dos flavonóides, que

possuem biossíntese mista (BENNETT; WALLSGROVE, 1994). São conhecidos por diversas

propriedades, incluindo antioxidante, anti-inflamatória, antitumoral, antibacteriana, entre

outras (HAJIEVA, 2017; HIDALGO; ALMAJANO, 2017). Dentre os compostos fenólicos

mais comuns tem-se ácidos fenólicos, fenilpropanóides, flavonóides, quinonas, cumarinas,

taninos, antocianinas e ligninas (LOURENCO; FERREIRA; BRANCO, 2012), como pode ser

observado na Figura 2.

Figura 2. Classificação dos compostos fenólicos. Fonte: adaptado de Luthria e col., 2006.

Diversas plantas medicinais tem sido estudadas como alternativa ou adjuvante ao

tratamento da PA, isto se deve, em parte, à atividade antioxidante apresentada por estes

produtos, já que o estresse oxidativo desempenha um papel importante na gênese e no

desenvolvimento da PA, o qual tem sido amplamente investigado em diversos modelos animais

(RAU et al., 2000; URUÑUELA et al., 2002; TURKYILMAZ et al., 2008). Algumas destas

plantas já tem uso popular e clínico associados ao tratamento de uma determinada condição,

como o extrato do Ginkgo biloba utilizado como neuroprotetor e que permitiu o isolamento do

composto ginkgolibe B, que por sua vez apresentou atividade anti-inflamatoria em modelo de

PA induzida por injeção intraductal de tauracolato (JI et al., 2011; NASH; SHAH, 2015), ou o

Compostos fenólicos

Polifenóis

Taninos

Hidrolisáveis

Ácido gálico

Não-hidrolisáveis

Catequinas e epicatequinas

Flavonóides

Flavonas, chalconas, flavanóis,

flavanonas, isoflavonas, flavonóis e

antocianidinas

Ácidos fenólicos

Ácido hidroxicinâmico

Ácido hidroxibenzóico

Outros

Cumarinas, stilbenos e

ligninas

36

pó das raízes de Curcuma longa, que possui atividade hepatoprotetora e digestiva e foi eficaz

no tratamento experimental da PA induzida por ceruleína (MENON; SUDHEER, 2007; SEO

et al., 2011).

2.2.2 Vaccinium macrocarpon Aiton (Ericaceae)

Entre os fitocêuticos com importante atividade anti-inflamatória, mas sem estudos

relacionados à PA, destaca-se a Vaccinium macrocarpon Ainton, conhecida popularmente

como cranberry, cujos frutos são popularmente usados sob a forma de sucos em toda a América

do Norte, e, devido aos resultados promissores que vem apresentando, o seu consumo foi

difundido por todo o ocidente como sinônimo de vida saudável (ANHÊ, et al., 2015).

A Vaccinium macrocarpon é um arbusto perene da família Ericaceae e do gênero

Vaccinium, de folhas pequenas e flores de cor rosa escura. Seu fruto é uma baga inicialmente

de cor branca, mas que se torna vermelho-escuro (Figura 3) quando completamente maduro,

sendo comestível, de sabor adocicado e levemente ácido (DINH et al., 2014). O suco de seus

frutos é amplamente consumido, possuindo as antocianidinas como classe majoritária, o que

lhe confere uma elevada atividade antioxidante (BÁRTÍKOVÁ et al., 2014). Seus frutos são

comumente utilizados para tratar condições inflamatórias relacionadas ao trato urinário

(BÁRTÍKOVÁ et al., 2014; HAMILTON et al., 2014), mas já existe evidência científica

sugerindo seu uso em diversas condições clínicas, conforme observado seu efeito inibitório

sobre IL-6, IL-8 e prostaglandinas no tratamento da inflamação (BODET; CHANDAD;

GRENIER, 2007), como adjuvante no tratamento da obesidade (ANHÊ et al., 2015),

hepatoprotetor (GLISAN et al., 2016), cardioprotetor (NOVOTNY et al., 2015), entre outros.

É interessante destacar o uso de extratos padronizados ao invés dos seus componentes

isolados. Sabe-se que os metabólitos secundários presentes nos espécimes vegetais agem de

maneira sinérgica entre si, ao apresentarem suas atividades biológicas (SPINELLA, 2002). Um

trabalho que avaliou a atividade anti-proliferativa de um extrato padronizado de Vaccinium

macrocarpon versus seus constituintes fitoquímicos demonstrou que o extrato desta planta

possuía atividade biológica superior aos seus constituintes usados de maneira isolada,

demonstrando a importância do sinergismo entre seus constituintes, em especial as

antocianidinas, proantocianidinas e flavonóis (SEERAM et al., 2004). No processo de sinergia

farmacodinâmica, diversas substâncias atuam em alvos diferentes de receptores envolvidos na

doença para aumentar o efeito terapêutico global, de modo que a sinergia entre diferentes

37

constituintes de extratos pode ser fundamental para uma série de atividades farmacológicas

(RASOANAIVO et al., 2011; SPINELLA, 2002).

Figura 3. Frutos de Vaccinum macrocarpon. Fonte: Cranberry Institute, disponível em: http://www.cranberryinstitute.org/ 2.2.3 Principais classes de compostos presentes nos frutos da Vaccinium macrocarpon

Diversas classes de compostos bioativos já foram identificadas em frutos de Vaccinium

macrocarpon, podendo-se observar uma predominância de compostos fenólicos, como

antocianinas, antocianidinas, flavanols, ácidos hidroxicinâmicos e hidroxibenzóicos e flavan-

3-óis (SKROVANKOVA et al., 2015). Uma análise metabolômica realizada em cinco

diferentes cultivares de V. macrocarpon, detectou entre 4477 e 6330 compostos diferentes

presentes em cada cultivar, sendo que os compostos presentes majoritariamente foram

conservados em todos os cultivares (WANG; ZUO, 2011). Foram listados abaixo, as principais

classes de compostos presentes no extrato dos frutos da Vaccinium macrocarpon:

a) antocianinas (Figura 4) são pigmentos vegetais insolúveis em água, neste caso, as

responsáveis pela coloração dos frutos da Vaccinium macrocarpon. Quimicamente, são

compostos fenólicos pertencentes ao grupo dos flavonoides, caracterizados pela presença

do núcleo básico (cátio 2-fenilbenzopirílio) que consiste de dois anéis aromáticos unidos

por uma unidade de três carbonos e condensados por um oxigênio, são sempre encontradas

na forma de glicosídeos facilmente hidrolisados por aquecimento em meio ácido,

resultando em açúcares e agliconas, denominadas antocianidinas (SEERAM et al., 2004).

As antocianinas mais comumente presentes nestes frutos estão associadas a moléculas de

açúcar, são a 3-O-galactosídeo e a 3-O-arabinosídeo da cianidina e peonidina, sendo que

um total de 13 antocianinas, a maioria 3-O-monoglicosídeo já foram detectadas

38

(BLUMBERG et al., 2013). Por estarem presentes em grande quantidade nos frutos da V.

macrocarpon, são frequentemente utilizadas como marcadores dos extratos vegetais

obtidos a partir dos frutos desta planta (BÁRTÍKOVÁ et al., 2014);

Figura 4. Estrutura básica das antocianinas. O “R” presente na estrutura indica um ponto de variação na estrutura básica que define cada composto. Peonina: R1=OCH3, R2=H; cianina: R1=OH, R2=H; malvinina: R1=R2=OCH3; delfinina: R1=R2=OH; petunina: R1=OCH3, R2=OH, pelargonina: R1=R2=H. Fonte: Blumberg et al., 2013. b) flavonóis (Figura 5) são uma classe de flavonoides com a estrutura básica de uma 3-

hidroxiflavona, que possui grande diversidade entre suas moléculas devido à grande

variedade de grupamentos fenólicos e consistem, principalmente, de glicosídeos de

quercetina, miricetina e em menor quantidade, kampferol, sendo que a quercetina 3-

galactosídeo é a forma predominante na Vaccinium macrocarpon, embora outros 11

glicosídeos estejam presentes em baixas concentrações (BLUMBERG et al., 2013);

Figura 5. Estrutura básica dos flavonóis. O “R” presente na estrutura indica um ponto de variação na estrutura básica que define cada composto. Quercetina: R1=R3=OH, R2=H; miricetina: R1=R2=R3=OH; kampferol: R1=R2=H, R3=OH; quercetina 3-O-galactosídeo: R1=OH, R2=H, R3=O-galactose. Fonte: Blumberg et al., 2013.

39

c) ácidos hidroxicinâmicos (Figura 6) são derivados do ácido cinâmico com um radical

hidroxila no carbono 4, os principais representantes desta classe presentes nos frutos de V.

macrocarpon são os ácidos p-cumarínico, sinápico, ferúlico e cafeico (BLUMBERG et al.,

2013);

Figura 6. Estrutura básica dos ácidos hidroxicinâmicos. O “R” presente na estrutura indica um ponto de variação na estrutura básica que define cada composto. Ácido p-cumarínico: R1=R2=H; ácido cafeico: R1=OH, R2=H; ácido ferúlico: R1=OCH3, R2=H; ácido sinápico: R1=R2= OCH3. Fonte: Blumberg et al., 2013.

d) ácidos hidroxibenzoicos (

e) Figura 7) são os ácidos fenólicos mais simples encontrados na natureza, com destaque para

a isomeria entre o ácido p-benzoico e o ácido acetilsalicílico, o ácido p-benzoico está

presente em altas concentrações nos frutos da Vaccinium macrocarpon, em contraste com

os ácidos p-hidroxibenzoico, o-hidroxibenzoico e 2,4-dihidroxibenzóico, que são

encontrados em quantidades muito baixas (BLUMBERG et al., 2013).

Figura 7. Estrutura básica dos ácidos hidrobenzoicos. O “R” presente na estrutura indica um ponto de variação na estrutura básica que define cada composto. Ácido benzoico: R1=R2=H; ácido p-hidroxibenzoico: R1=H, R2=OH; ácido p-hidroxibenzoico: R1=OH, R2=H; ácido 2,4-dihidroxibenzoico: R1=R2= OH. Fonte: Blumberg et al., 2013.

Outras classes de compostos presentes em menor concentração nos frutos da Vaccinium

macrocarpon incluem terpenos, esteroides, flavan-3-ols, proantocianidinas e chalconas

(WANG; ZUO, 2011).

40

Assim, a necessidade de um tratamento para o mecanismo fisiopatológico subjacente ao

desenvolvimento da pancreatite aguda associada às inúmeras possibilidades de descobertas de

novas formas de tratamento advindas do uso de plantas medicinais motivaram a realização deste

trabalho que contém uma revisão sistemática da literatura acerca do uso de plantas medicinais

na pancreatite aguda experimental e um estudo experimental que utiliza o extrato padronizado

dos frutos da Vaccinium macrocarpon no tratamento da pancreatite aguda experimental

induzida pro L-arginina em camundongos.

41

3 OBJETIVOS

3.1 Gerais

• Avaliar a evidência científica envolvendo plantas medicinais utilizadas em estudos pré-

clínicos em modelos de pancreatite aguda;

• Investigar os efeitos do extrato padronizado de V. macrocarpon na pancreatite aguda

experimental.

3.2 Específicos

• Fazer um levantamento e analisar a evidência científica disponível acerca de plantas

medicinais utilizadas em estudos pré-clínicos em modelos de pancreatite aguda;

• Avaliar o risco de viés de estudos pré-clínicos utilizando plantas medicinais em modelos

de pancreatite aguda;

• Realizar avaliação da capacidade antioxidante do extrato padronizado de V.

macrocarpon frente a sistemas in vitro.

• Investigar a ação anti-inflamatória do extrato padronizado de V. macrocarpon na lesão

pancreática e pulmonar da pancreatite aguda experimental;

• Comparar as concentrações de marcadores bioquímicos séricos em animais com

pancreatite aguda experimental tratados ou não com o extrato padronizado de V.

macrocarpon;

• Avaliar a atividade antioxidante do extrato padronizado de V. macrocarpon na lesão

pancreática e pulmonar da pancreatite aguda experimental;

• Realizar estudo da atividade locomotora dos animais após tratamento com o extrato

padronizado de V. macrocarpon;

• Avaliar a atividade antinociceptiva do extrato padronizado de V. macrocarpon na

pancreatite aguda experimental.

4 CAPÍTULO 1

EVIDENCIAS CIENTÍFICAS ACERCA DO USO DE PLANTAS MEDICINAIS NO ESTUDO DA PANCREATITE AGUDA EXPERIMENTAL: UMA REVISÃO

SISTEMÁTICA

43

4.1 Considerações iniciais

Historicamente, os produtos naturais fornecem moléculas biologicamente ativas para

tratar várias condições clínicas, sendo portanto, frequentemente utilizados em modelos de

avaliação pré-clínica para inferir sobre o potencial terapêutico de plantas medicinais e seus

metabólitos secundários (HARVEY, 2008). Embora estudos pré-clínicos com animais de

laboratório forneçam evidências científicas em condições laboratoriais ideais, alguns desses

trabalhos podem ser limitados pela falta de padronização do modelo estudado ou viés

relacionado ao desenho do estudo (HOOIJMANS; RITSKES-HOITINGA, 2013). Esse

problema torna-se ainda mais evidente no estudo pré-clínico da pancreatite aguda (PA) devido

a uma variedade de modelos de indução que reproduzem seus vários estágios, desde a PA leve

até pancreatite necrotizante (SU; CUTHBERTSON; CHRISTOPHI, 2006). Assim, revisões

sistemáticas como esta podem ser de grande valor para conceber medidas em modelos animais

cujos resultados pré-clínicos ainda não são suficientemente robustos para justificar a avaliação

de plantas medicinais em ensaios clínicos e para determinar quais operações têm resultados

suficientemente consistentes para serem utilizadas em ensaios clínicos. Isso contribui para a

transição do conhecimento científico básico da área básica para o campo clínico.

Outro aspecto importante a ser considerado é a ausência de tratamento específico para

a pancreatite aguda, cujo tratamento é prioritariamente de suporte e requer estratégias capazes

de conter a inflamação e a dor, especialmente em seus estágios iniciais quando a taxa de

sobrevivência dos pacientes é maior (YOKOE et al., 2015). É necessário, então, sistematizar o

conhecimento produzido em relação aos estudos pré-clínicos com animais, especialmente no

que se refere aos novos tratamentos com produtos naturais ou seus derivados. Isso se deve ao

amplo leque de possibilidades terapêuticas que esses produtos representam, além do fato de que

evitam a alocação de recursos futuros no estudo de produtos que se mostraram ineficazes ou

repetitivos, protegendo os animais de uma potencial experimentação indevida futura.

Considerando-se a busca por informações acerca de estudos pré-clínicos na pancreatite, há uma

carência de estudos direcionados à elaboração de um consenso sobre o uso das plantas

medicinais na pancreatite aguda.

Dado o exposto, este capítulo se destina a resumir e analisar a evidência científica

disponível acerca do uso de plantas medicinais utilizadas em estudos pré-clínicos em modelos

de pancreatite aguda e a avaliar o risco de viés de estudos pré-clínicos utilizando plantas

medicinais em modelos de pancreatite aguda.

44

4.2 Casuística e métodos

4.2.1 Elaboração da pergunta do estudo

Esta revisão foi conduzida de acordo com o instrumento Preferred Reporting Items for

Systematic Review and Meta-Analysis (PRISMA). Para a elaboração da pergunta deste estudo

foram seguidos quatro passos, a saber: (1) identificação da intervenção adotada (tratamento

com plantas medicinais); (2) identificação da doença de interesse (pancreatite aguda (PA)); (3)

definição da espécie animal estudada (ratos e camundongos); (4) definição dos desfechos de

interesse (amilase sérica, atividade de mieloperoxidase (MPO) pancreática e análise histológica

do pâncreas. Para tanto, partiu-se do fato que a pancreatite aguda (PA) é uma doença para qual

não existe tratamento específico às suas causas subjacentes, sendo apenas de suporte (YOKOE

et al., 2015), aliado ao fato de que as plantas medicinais, historicamente, são fontes de

moléculas biologicamente ativas para o tratamento de diversas condições clínicas (HARVEY,

2008), esta revisão sistemática pretendeu compilar trabalhos de pesquisa pré-clínica em PA

tratada com plantas medicinais, partindo das seguintes questões: (i) o tratamento com plantas

medicinais é efetivo no controle da PA experimental? (ii) quais as plantas mais utilizadas no

tratamento da PA experimental? (iii) quais os modelos experimentais são mais frequentemente

utilizados para essa investigação?

4.2.2 Registro

O protocolo desta revisão foi desenvolvido seguindo-se a lista de verificação

Preferred Reporting Items for Systematic Review and Meta-Analysis Protocols (PRISMA-P)

(SHAMSEER et al., 2015), e registrado no website do Systematic Review Protocol for Animal

Intervention Studies (SYRCLE):

(https://www.radboudumc.nl/Research/Organisationofresearch/Departments/cdl/SYRCLE),

sob o seguinte domínio (ANEXO A):

(https://www.radboudumc.nl/Research/Organisationofresearch/Departments/cdl/SYRCLE/Do

cuments/Protocol_GomesSantana%202015.pdf)

45

4.2.3 Critérios de elegibilidade

1.1.1.1 Tipos do estudo

Foram elegíveis para inclusão no estudo trabalhos pré-clínicos in vivo controlados

(aleatórios, quasi-aleatórios e não aleatórios) que compararam a eficácia de plantas medicinais

ao placebo em modelos experimentais de PA.

1.1.1.2 Modelos animais

Foram selecionados estudos realizados com ratos e/ou camundongos de ambos os

sexos, independentemente da técnica de indução da PA.

1.1.1.3 Intervenção

O tratamento deveria ser a utilização de planta medicinal. No entanto, os estudos que

utilizaram as misturas, associações ou combinações de tratamentos no mesmo grupo de animais

foram excluídos. Nos estudos em que existiam grupos com misturas de tratamentos e grupos

com tratamentos simples (apenas um tipo de produto natural), foram considerados apenas os

desfechos observados nos grupos de tratamento simples.

O tratamento com produtos naturais pode ter sido realizado antes ou depois da indução

da PA em uma ou várias administrações. Para a síntese qualitativa, todas as vias de tratamento

foram consideradas.

1.1.1.4 Idioma e ano de publicação

Não houve restrições quanto à data ou idioma de publicação.

4.2.4 Desfechos

O desfecho primário foi a concentração de sérica de amilase e os desfechos secundários

foram a atividade de mieloperoxidase pancreática e a análise histológica pancreática. Os artigos

que não apresentaram um destes desfechos foram excluídos da análise de risco de viés, embora

tenham sido incluídos na síntese qualitativa da revisão sistemática.

46

4.2.5 Fontes de informação

Foram desenvolvidas estratégias de pesquisa para obter o maior número possível de

artigos relevantes no contexto do tratamento da pancreatite aguda com produtos naturais. Os

estudos foram identificados através de uma pesquisa nas bases de dados eletrônicas Medical

Literature Analysis and Retrieval System Online (MEDLINE), Sci Verse Scopus, Web of

Science, Excerpta Medica dataBASE (EMBASE), Literatura Latino-Americana e do Caribe em

Ciências da Saúde (LILACS) e Google Scholar (literatura “cinza”). A lista de referência dos

estudos incluídos também foi selecionada para a busca de outras referências de interesse (hand

search).

4.2.6 Estratégia de pesquisa

Foi realizada uma busca computadorizada em seis bases de dados eletrônicas além da

busca manual realizada pela revisão das referências dos estudos incluídos no estudo (hand

search). A pesquisa eletrônica foi concluída em dezembro de 2016 nas bases: (MEDLINE, Sci

Verse Scopus, Web of Science, EMBASE e LILACS) e literatura “cinza” (Google Scholar). A

estratégia completa de pesquisa que foi realizada no endereço virtual da National Library of

Medicine of the United States (PubMed) e adaptada para os demais bancos de dados está

disponível no Quadro 1.

4.2.7 Registros de estudo

Gestão dos dados

Os resultados da pesquisa estão carregados no software de gerenciamento

bibliográfico on-line EndNoteTM e os arquivos duplicados foram removidos, utilizando-se de

algoritmos apropriados presentes no software. Todas as estratégias de busca e os resultados da

pesquisa foram cuidadosamente documentados a fim de explicar a condução do processo.

Processo de seleção dos estudos

Todos os títulos, resumos e textos completos foram analisados de forma independente

por dois investigadores (DGS e ASO) para determinar a elegibilidade do estudo para inclusão

na revisão.

47

Após a exclusão de duplicatas, os estudos foram selecionados por título e resumo,

sendo observado o tipo de estudo, o tipo de animais e o tipo de intervenção. Em seguida, foi

avaliado o texto completo dos estudos remanescentes. Nenhum dos autores esteve encoberto

para os títulos de revistas, autores ou instituições de estudo.

Quadro 1: Estratégia de busca no PubMed. Condição: pancreatite (ex. pancreatitis/OR pancreatitis.ti,ab. OR

pancreatitis.ti,ab. OR ANP.ti,ab. OR

(pancreas.ti,ab. AND inflammation.ti,ab.)

OR (pancreatic.ti,ab. AND

inflammation.ti,ab.)

Intervenção: plantas medicinais ethnobotan* OR Ethnopharmacolog* OR

ethno botan* OR caatinga OR inner bark

OR traditional Chinese medicine OR

Chinese medicine OR Chinese medicine

OR natural products OR natural product

OR plant OR plants OR phytother*

Animais Filtro para estudos com animais.

1.1.1.5 Processo de coleta de dados

Dois revisores independentes (DGS e ASO) extraíram os dados dos estudos incluídos,

utilizando um formulário padronizado (ANEXO ).

1.1.1.6 Dados coletados

Os dados extraídos dos artigos foram: autor, título, ano de publicação, idioma e grupos

experimentais, número de animais por grupo, espécie animal, idade, peso, sexo, técnica de

indução da pancreatite, tipo de tratamento, via, dose e duração do tratamento. Todos os

desfechos dos experimentos realizados nos artigos foram observados para a realização da

síntese qualitativa.

48

4.2.8 Risco de viés de estudos individuais

Dois investigadores (DGS e ASO) avaliaram independentemente a validade do

construto interno dos estudos incluídos. A validade interna foi realizada usando a ferramenta

Risk of Bias Tool for Animal Intervention Studies (SYRCLE’s Rob tool/ANEXO C)

(HOOIJMANS et al., 2014). As questões relacionadas aos critérios apresentados foram

identificadas e registados em cada domínio em formulário padronizado (ANEXO D) e a estes,

foi atribuída uma classificação de "alto risco" (resposta à questão “não”) ou "baixo risco"

(resposta à questão “sim”). Naqueles em que houve falta de informações, o domínio foi rotulado

como “incerto” (resposta à questão “não informa”). Foram adotadas as seguintes questões

relacionadas aos critérios de qualidade:

1) Aleatorização (viés de seleção) − A sequência de alocação dos animais foi

randomizada?

2) Características basais (viés de seleção) − Sexo, idade e peso dos animais estavam

unificados?

3) Alocação dos animais (viés de seleção) − A alocação dos animais foi

adequadamente encoberta?

4) Habitação aleatória (viés de desempenho) – Os animais foram colocados em

caixas com condições idênticas?

5) Encobrimento (viés de desempenho) – Os investigadores/cuidadores foram

encobertos sobre a intervenção que cada animal recebeu?

6) Avaliação de desfecho aleatória (viés de detecção) – Os animais foram

selecionados aleatoriamente para a eutanásia?

7) Encobrimento (viés de detecção) – O avaliador dos resultados estava encoberto?

8) Desfechos com dados incompletos (viés de atrito) – Todos os animais foram

incluídos na análise?

9) Relatório seletivo de desfechos (viés de relato) – Os resultados foram livremente

reportados?

10) Outras fontes de viés (viés de relato) – A metodologia de preparação dos extratos

das plantas está claramente descrita?

49

4.3 Resultados

4.3.1 Descrição dos estudos incluídos

Um total de 227 artigos foi obtido durante o processo de busca: 107 da MEDLINE, 26

da Sci Verse Scopus, 34 da Web of Science, 57 da EMBASE e três da LILACS. Posteriormente,

foram analisados pelo título os 100 primeiros artigos oriundos da pesquisa no Google Scholar

e destes, 12 trabalhos foram incorporados, além da adição de três trabalhos identificados em

pesquisas das bibliografias dos artigos selecionados (hand search), totalizando, 242 referências.

Após a remoção de duplicatas, 177 trabalhos permaneceram e foram avaliados de acordo com

o título e resumo. Durante a avaliação inicial, 119 artigos foram excluídos pelos principais

motivos: estudo de condição clínica diferente da pancreatite aguda (PA), utilização de espécie

animal distinta, realização do tratamento com misturas de plantas e condução do experimento

em humanos. Desta forma, restaram 58 artigos cujos textos completos foram analisados,

gerando 30 artigos que foram incluídos na síntese qualitativa, sendo que nesta etapa, 12 artigos

foram excluídos por apresentarem associações de plantas como tratamento da PA, 10 artigos

por estudarem o tratamento com plantas medicinais em complicações secundárias à pancreatite

aguda, cinco artigos por utilizarem compostos isolados oriundos de plantas no tratamento da

PA e um artigo por ter induzido pancreatite crônica.

4.3.2 Caracterização dos artigos avaliados

Nos 30 artigos selecionados, foram detectadas 22 espécies diferentes de plantas testadas

em modelo pancreatite aguda (PA) experimental, pertencentes a um total de 17 famílias

botânicas. A espécie mais estudada foi: Nardostachys jatamansi, presente em três artigos,

seguida de Camelia sinensis, Curcuma longa, Emblica officinalis, Rheum officinnale, Rheum

palmatum e Salvia miltiorrhiza, estudadas em dois artigos cada, e Acantopanax senticosus,

Artemisia asiatica, Caesalpinia pyramidalis, Cichorium intybus, Echium amoenun, Gardenia

jasminoides, Ginkgo biloba, Hypericum perforatum, Lithospermum erytrorhizon, Opuntia

humifusa, Panax ginseng, Patrinia scabiosifolia, Punica granatum, Tripterygium wilfordii e

Urtica dioica que foram estudadas como tratamento experimental da PA em um artigo cada

(Tabela 1).

50

Tabela 1

Figura 8. Fluxograma da pesquisa.

MEDLINE (n=107)

Sci Verse Scopus (n=26)

EMBASE (n=57)

Web of Science (n=34) LILACS (n=3)

227 referências identificadas nas buscas das bases de dados

Google Scholar (n=12)

Hand search (n=3)

242 referências no total

177 referências após a retirada de duplicatas

119 artigos excluídos pelo título e resumo

58 textos completos examinados segundo critérios de elegibilidade 28 textos completos

excluídos: - misturas de tratamentos: 12 artigos; - efeitos secundários da PA: 10 artigos; - compostos isolados: 5 artigos - pancreatite crônica: 1 artigo 30 estudos incluídos

51

Tabela 1. Citações de espécies botânicas de plantas medicinais utilizadas no tratamento da pancreatite aguda experimental.

Espécie botânica Família Número de

citações

Porcentagem das espécies encontradas

Referência

Nardostachys jatamansi

(D.Don) DC. Caprifoliaceae 3 10% Bae et al., 2010;

Bae et al., 2012a;

Bae et al., 2012b

Camellia sinensis (L.) Kuntze Theaceae 2 6,7% Babu et al., 2009;

Das et al., 2006

Curcuma longa L. Zingiberaceae 2 6,7% Seo et al., 2011;

Yu et al., 2011

Emblica officinalis Gaertn. Phyllanthaceae 2 6,7% Aruna et al., 2014; Sidhu et al., 2011

Rheum officinnale Baill. Polygonaceae 2 6,7% Chen et al., 1999;

Feng et al., 2012

Rheum palmatum L. Polygonaceae 2 6,7% Yao et al., 2015;

Zhao et al., 2004

Salvia miltiorrhiza Bunge Lamiaceae 2 6,7% Ou et al., 2012;

Zhang et al., 2009a

Acantopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms

Araliaceae 1 3,3% Wang et al., 2015

Artemisia asiatica (Pamp.) Nakai ex Kitam.

Compositae 1 3,3% Hahm et al., 1998

Caesalpinia pyramidalis Tul. Leguminosae 1 3,3% Santana et al., 2012

Cichorium intybus L. Compositae 1 3,3% Minaiyan et al., 2012

Echium amoenun Fisch. & C.A.Mey

Boraginaceae 1 3,3% Abed et al., 2012

Gardenia jasminoides J.Ellis Rubiaceae 1 3,3% Jung et al., 2008

Ginkgo biloba L. Ginkgoaceae 1 3,3% Zeybek et al., 2003

Hypericum perforatum L. Hypericaceae 1 3,3% Genovese et al., 2006

Lithospermum erytrorhizon

Siebold & Zucc. Boraginaceae 1 3,3% Choi et al., 2015

Opuntia humifusa (Raf.) Raf. Cactaceae 1 3,3% Choi et al., 2014

Panax ginseng C.A.Mey Araliaceae 1 3,3% Joo et al., 2015

Patrinia scabiosifolia Link Caprifoliaceae 1 3,3% Seo et al., 2006

Punica granatum L. Lythraceae 1 3,3% Minaiyan et al., 2014

Tripterygium wilfordii Hook. f. Celastraceae 1 3,3% Wang et al., 2013

Urtica dioica L. Urticaceae 1 3,3% Yilmaz et al., 2014

52

Durante o processo de revisão, todas as nomenclaturas botânicas das plantas foram

submetidas à verificação na base de dados The Plantlist (http://www.theplantlist.org/), a fim de

confirmar a nomenclatura botânica correta da planta descrita no artigo. Como em alguns casos

os autores do artigo haviam se referido à planta por sinonímias ou por nomenclaturas

incompletas, decidiu-se por acrescentar à síntese qualitativa a nomenclatura botânica aceitável

para estes espécimes segundo a base de dados consultada, sempre que necessário.

Curiosamente, 4 artigos se referiam ao uso do “ruibarbo” em 2 deles como Rheum

palmatum L. e em 2 deles como Rheum officinale Bail, plantas que, embora pertençam ao

mesmo gênero e família, são de espécies distintas, no entanto, a Organização Mundial da Saúde

e a Farmacopéia Brasileira consideram ambos como um único produto natural, o ruibarbo

(WHO, 1999; ANVISA, 2010). Assim, por se tratarem de espécies distintas, optou-se por

analisar os artigos que utilizam o ruibarbo separadamente para Rheum palmatum L. e Rheum

officinale Bail.

Na Tabela 2, pode-se observar a compilação dos principais dados obtidos nos trabalhos

analisados, contendo a espécie de cada planta, os tipos de preparações vegetais utilizadas, os

modelos de PA experimental desenvolvidos, bem como, o tipo e o sexo dos animais e suas

quantidades por grupo, a dose, a via e o momento da administração dos tratamentos, o momento

da eutanásia em cada protocolo experimental, os controles utilizados, os desfechos utilizados

e os resultados para cada desfecho de cada estudo experimental.

Em relação ao tipo de preparação vegetal utilizada, observa-se uma predominância do

extrato aquoso, escolhido em 20 (60%) preparações, seguido do extrato hidroetanólico utilizado

sete vezes (23,3%), do extrato metanólico e do pó seco, ambos utilizados duas vezes (6,6%) e

do óleo, presente em um artigo (3,3%), sendo que em sete preparações (23,3%), foram usados

extratos padronizados. Para a elaboração dos extratos e preparações vegetais, as principais

partes da planta utilizadas foram raízes e rizomas, que constituíram matéria prima para 13

extratos (43,3%), seguida de folhas, usadas em oito preparações (26,7%) e frutos, usados em 3

preparações (10%); entrecasca, partes aéreas, sementes e toda a planta foram citadas duas vezes

(6,6%) nos trabalhos revisados e hastes em um (3,3%) destes.

Dentre os trabalhos selecionados para a revisão, o principal modelo de indução da PA

utilizado foi o modelo da ceruleína, perfazendo 15 artigos (48,3%). Esta substância é um

análogo da enzima pancreática colecistocinina e é amplamente conhecida por induzir uma

pancreatite experimental histologicamente semelhante aos estágios iniciais da PA em humanos

(CHAN; LEUNG, 2007). Nestes modelos, a ceruleína foi administrada na forma de (4-7)

injeções intraperitoneais a cada uma hora, em doses de 50 µg/kg em 13 estudos. Apenas dois

53

estudos (6,4%) utilizaram a via intravenosa para administração da ceruleína na dose de 40

µg/kg, 2 aplicações com intervalo de 1 hora. Outros dois trabalhos (6,4%) fizeram uso do

modelo de indução da PA por dieta contendo etanol-ceruleína.

O segundo modelo mais utilizado é o de indução da PA por tauracolato de sódio,

presente em sete (22,5%) artigos, no qual é realizada uma injeção retrógrada intraductal de sais

biliares, dando origem a uma pancreatite com características necro-hemorrágicas que se

acentuam com o aumento da concentração de tauracolato de sódio utilizada na indução

(GRANGER; REMICK, 2005). De maneira semelhante, pode-se substituir o tauracolato de

sódio por outro sal biliar como o deoxicolato de sódio, conforme se observa em um (3,2%) dos

artigos sintetizados.

Em dois dos artigos (6,4%) a PA foi induzida por dieta deficiente em colina-metionina

e suplementada com 5% de DL-etionina, que leva à formação de uma AP hemorrágica

provocada pela deficiência de colina, substância essencial à formação das membranas celulares

(SU; CUTHBERTSON; CHRISTOPHI, 2006). Os demais modelos de indução da pancreatite

aguda foram citados apenas uma vez (3,2%) e podem ser divididos em modelos não invasivos

como a indução por excesso de L-arginina, colecistocinina octapeptídeo e dietilditiocarbamato,

e invasivo como a obstrução do ducto biliopancreático.

Foi observado que 16 artigos (53,2%) utilizaram ratos machos e um (3,3%) utilizou

ratos de ambos os sexos, sete artigos (26,6%) utilizaram camundongos fêmea e seis (20%)

fizeram uso de camundongos machos. Além disso, o número de animais por grupo variou de 4-

20 animais. Com predominância de camundongos da linhagem C57Bl/6 (48,2%) e de ratos da

linhagem Sprague-Dawley (64,5%).

As vias de administração mais usadas foram: oral em 14 protocolos (46,6%) e

intraperitoneal em 12 protocolos (40%), também foram citadas as vias intravenosa em três

protocolos (10%) e intragástrica em dois (6,7%). O tratamento profilático da PA experimental

foi utilizado em 17 delineamentos (47,2%) e o terapêutico em 16 (44,4%), sendo que em três

casos (8,3%) o tratamento foi administrado juntamente com a droga indutora da PA. Nos

delineamentos experimentais dos artigos aqui revisados, o momento da eutanásia variou de uma

hora até 28 dias após a indução da PA, com destaque para os tempos de 6 h (12 casos, 26,08%),

12 h (9 casos, 19,5%) e 24 h (8 casos, 17,4%) após a indução da PA.

Em 25 artigos (83,3%) foi utilizado apenas o controle negativo (Solução salina ou

solução salina + DMSO), não tendo sido utilizada nenhum tipo de controle positivo. Nos cinco

artigos (16,7%) que utilizaram controles positivos, não houve consenso quanto à droga

54

utilizada, a saber: vitamina C, dexametasona, ulnistatina, superóxido dismutase, gabexato

mesilato.

Conforme consta na metodologia, os desfechos de interesse são a atividade de amilase

sérica, a atividade de mieloperoxidase tecidual e a análise histológica do pâncreas. Vinte e cinco

estudos (83,3%) investigaram o efeito de seus respectivos tratamentos na atividade da amilase

sérica. A atividade da MPO foi quantificada em 13 (43,3%) dos 30 artigos sintetizados. No

total, 24 estudos (80%) realizaram análise histológica do pâncreas para avaliar a atividade das

plantas medicinais testadas durante a pancreatite. Entre os artigos analisados, foi observado que

em três casos (10%) o desfecho amilase não foi alterado após o tratamento com plantas

medicinais da pancreatite aguda experimental e o mesmo ocorreu em 8,7% dos artigos

analisados em relação ao desfecho análise histológica.

55

Tabela 2. Detalhamento dos estudos incluídos na revisão. Espécie / Referência

Tipo de preparação

Modelo de pancreatite

Animal Dose e via de adm. do tratamento

Momento da adm. do tratamento

Momento da eutanásia

Controles Desfecho Resultado*

Nardostachys

jatamansi (D. Don) DC. (Bae et al., 2010)

Extrato aquoso das folhas

Ceruleína, i.p., 50 µg/kg, 6 x,

Camundongos C57BL/6 fêmeas, n=6/grupo

10 ou 20 mg/kg, v. o.

1, 3 e 5 h após (i)PA

5 dias antes da (i)PA, 1x/dia

6 h após o fim da (i)PA

Solução salina Amilase (U/L)

MPO (U/mg proteína)

Análise Histológica

10 ou 20 mg/kg (↓p<0,05) (p-t)

10 ou 20 mg/kg (↓p<0,05) (p-t)

10 ou 20 mg/kg (↓p<0,05) (p-t)

Nardostachys

jatamansi (D. Don) DC. (Bae et al., 2012a)

Extrato aquoso das raízes

Dieta deficiente em colina-metionina + 0,5% de DL-etionina por 3 dias


5 ou 10 mg/mL, v.o. na água de beber

Durante a dieta de indução, 1x/dia por 3 dias

4 dias após o fim da (i)PA



5 ou 10 mg/kg (↓p<0,05)

5 ou 10 mg/kg (↓p<0,05)

Nardostachys

jatamansi (D. Don) DC. (Bae et al., 2012b)

Fração do extrato aquoso das raízes



1, 5 ou 10 mg/kg, i.p.

1 h antes da (i)PA





1, 5 ou 10 µg/kg (↓p<0,05)

1, 5 ou 10 µg/kg (↓p<0,05)

1, 5 ou 10 µg/kg (↓p<0,05)

(Continua)

56

Tabela 2 (Continuação) Espécie Tipo de

preparação Modelo de pancreatite




Controles Desfecho

Resultado*

Camellia

sinensis (L.) Kuntze (Babu et al., 2009)



Camundongos CD machos, n=20/grupo

25 mg/kg, i.p. 1, 3 e 6 h após a (i)PA

24 h após a (i)PA



(↓p<0,01)

(↓p<0,01)

Camellia

sinensis (L.) Kuntze (Das et al., 2006)


Etanol 30% por 5 semanas + ceruleína 20 µg/kg 3x semana/3 semanas

Ratos Wistar

machos, n=6/grupo

1 ml/100 g de solução 2,5%, v.o.

Diariamente, associado à indução

24 h após a (i)PA



(↓p<0,01)

(↓p<0,01)

Curcuma

longa L. (Seo et al., 2011)

Extrato aquoso da raiz e rizomas


Camundongo C57BL/6, fêmeas n=6/grupo

50, 100, 500 e 1000 mg/kg, v.o.

1 x/dia, por 7 dias antes da (i)PA

6 h após a (i)PA




Todas as doses (↓p<0,05)



Curcuma

longa L. (Yu et al., 2011)

Extrato aquoso da raiz e rizomas


Camundongo Kun Ming, machos n=10/grupo

50 mg/kg, via i.p.

1 x/dia, por 6 dias, antes da (i)PA

10 h após a (i)PA

DMSO 10% em solução salina

Amilase (U/L)


Não alterou

(↓p<0,05)

(Continua)

57

Tabela 2 (Continuação)

Espécie/ Referência

Tipo de preparação






Emblica

officinalis

Gaertn. (Aruna et al., 2014)

Extrato metanólico dos frutos

Etanol 30% por 5 semanas + ceruleína 20 µg/kg 3x semana/3 semanas

Ratos Wistar

machos, n=6/ grupo

200 mg/kg, v.o.

1 x por dia, por 15 dias, durante a (i)PA


Solução salina MPO (U/mg proteína)

(↓p<0,05)

Emblica

officinalis

Gaertn. (Sidhu et al., 2011)

Extrato aquoso padronizado dos frutos

L-arginina, i.p., 2 g/kg, 2x

Ratos Wistar de ambos os sexos, n=6/grupo

100 mg/kg, v.o.

2 h após o término da (i)PA

24 h, 3, 7, 14 e 28 dias após a (i)PA

Vitamina C 900 mg/kg

Solução salina

Amilase (U/100 ml)


(↓p<0,05) em 24 h e 3 dias

(↓p<0,05) em todos os tempos

Rheum

officinnale Bail (Chen et al., 1999)

Extrato aquoso dos rizomas e raízes

Deoxicolato de sódio, intra-ductal, 2%

Ratos Wistar machos n=6/grupo

0,3 mg/animal, v.o.

A cada 8 h após a (i)PA até 48 h


Solução salina Análise Histológica

Não alterou

Rheum

officinnale Bail (Feng et al., 2012)


Tauracolato de sódio, intra-ductal, 5%,

Ratos Sprague-

Dawley machos n=8/grupo

150 mg/kg, v.o.

Após a (i)PA 1, 3, 6 e 12 h após a (i)PA


Não alterou

Rheum

palmatum L. (Yao et al., 2015)


Tauracolato de sódio, intra-ductal, 5%

Ratos Sprague-

Dawley machos, n=7/grupo

500 mg/kg, i.g. Imediatamente após a (i)PA e a cada 8 h por 24 h

24 h após a (i)PA



(↓p<0,05)

(↓p<0,05)

(Continua)

58


Espécie Tipo de preparação






Rheum palmatum

L. (Zhao et al., 2004)


Ceruleína, i.p. 40 µg/kg, 2 x,

Ratos Sprague-


75 ou 150 mg/kg, v.o.

2 e 15 h antes da (i)PA

5 h após o início da (i)PA



150 mg/kg (↓p<0,05)

150 mg/kg (↓p<0,01)

Salvia

miltiorrhiza

Bunge (Ou et al., 2012)

Extrato aquoso padronizado da raiz

Tauracolato de sódio, intra-ductal, 3,5%,

Ratos Sprague-


4 mL/kg (1 mL = 1,5 g de extrato), i.v.

15 min após a (i)PA

3, 6 e 12 h após a (i)PA

Solução salina

Dexametasona 0,5 mg/100 g

Amilase (U/L)


12 h (↓p<0,05)

3 h, 6 h e 12 h (↓p<0,01)

Salvia

miltiorrhiza

Bunge (Zhang et al., 2009a)

Extrato padronizado da raiz

Tauracolato de sódio, intra-ductal, 3,5%,

Ratos Sprague-


4 mL/kg (1 mL = 1,5 g de extrato), i.v.



Solução salina

Amilase (U/L)


Não alterou

12 h (↓p<0,01)

Acanthopanax

senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms (Wang et al., 2015)

Extrato aquoso de raízes e rizomas

Tauracolato de sódio, intra-ductal, 3,5%

Ratos Sprague-


35 mg/kg, i.v. 6 h após a (i)PA


Solução salina

Ulnistatin 1000 u/100 g


24 h (↓p<0,05)

Artemisia asiatica

(Pamp.) Nakai ex Kitam (Hahm et al., 1998)

Extrato etanólico padronizado de todas as partes da planta

Ceruleína, i.v., 40 µg/kg, 2 x,

Ratos Sprague-


30, 100 e 300 mg/kg, i.g.

30 min antes e 30 e 90 min após a (i)PA

5 h após o início da (i)PA

Solução salina

SOD 10000 U/kg

Gabexato mesilato 40 mg/kg

Amilase (U/dL)


Não alterou

300 mg/kg (↓p<0,05)

(Continua)

59








Caesalpinia

pyramidalis Tul (Santana et al., 2012)

Extrato hidroetanólico da entrecasca

Obstrução do ducto bilio-pancreático

Ratos Wistar machos, n=6/grupo

100, 200 e 400 mg/kg, v.o.

1 h antes ou 1 h antes e 12 h após a (i)PA

6 e 24 h após a (i)PA

Solução salina + tween 80 0,1%

Dexametasona 10 mg/kg

MPO (UMPO/mg tecido)

Amilase (U/dL)

6 h, 400 mg/kg e 24 h, 400 mg/kg, 2x (↓p<0,01)

6 h, 200 e 400 mg/kg e 24 h, 400 mg/kg, 1 e 2x (↓p<0,01)

Cichorium

intybus L. (Minaiyan et al., 2012)

a) Pó das raízes secas

b) Extrato hidroalcoólico de partes aéreas


Camundongo Syrian

machos, n=6/grupo

50, 100 e 200 mg/kg,

a) 1 h antes (v.o.)

b) 30 min antes (i.p.) da (i)PA


Solução salina Amilase (U/dL)


v.o., 200 mg/kg (↓p<0,05) e i.p., 100, 200 mg/kg (↓p<0,01)

v.o. e i.p.200 mg/kg (↓p<0,01)

Mesmo desfecho para diferentes extratos

Echium

amoenun Fisch. & C.A. Mey (Abed et al., 2012)

Extrato hidroalcoólico das pétalas


Camundongos machos, n=6/grupo

100, 200 e 400 mg/kg, i.p.

30 min antes da (i)PA





400 mg/kg (↓p<0,05)

400 mg/kg (↓p<0,05)

400 mg/kg (↓p<0,05)

(Continua)

60








Gardenia

jasminoides J. Ellis (Jung et al., 2008)




0,1 ou 1 g/kg, v.o.

1 vez ao dia durante 1 semana antes da (i)PA





0,1 ou 1 g/kg (↓p<0,05)

1 g/kg (↓p<0,05)

0,1 ou 1 g/kg (↓p<0,05)

Ginkgo biloba

L. (Zeybek et al., 2003)

Extrato aquoso padronizado das folhas

Tauracolato de sódio, intra-ductal, 3%

Ratos Sprague-


100 mg/kg, via i.p.

24 h e 10 min antes da (i)PA

3,5 ou 12 h após a (i)PA



3,5 h (↓p<0,05)

3,5 h (↓p<0,05)

Hypericum

perforatum L. (Genovese et al., 2006)

Extrato metanólico padronizado das partes aéreas


Camundongos CD, machos, n=10/grupo

30 mg/kg, v.o. 1 h antes do início da (i)PA

6 h após a (i)PA


MPO (U/mg tecido)


(↓p<0,01)

(↓p<0,01)

(↓p<0,01)

Lithospermum

erytrorhizon

Siebold & Zucc. (Choi et al., 2015)

Extrato aquoso das raízes



100, 250 e 500 mg/kg, via i.p.

1 h antes do início da (i)PA



MPO (U/mg tecido)


(↓p<0,05) todos os tratamentos



(Continua)

61








Opuntia

humifusa

(Raf.) Raf. (Choi et al., 2014)

Extrato etanólico das hastes


Camundongos C57BL/6 fêmeas n=6/grupo

100, 250 e 500 mg/kg, via i.p.

1 h antes, ou 1, 3 e 6 h após a (i)PA



MPO (U/mg tecido)

500 mg/kg

(↓p<0,05) p-t, todas as doses (↓p<0,05) po-t (↓p<0,05) todas as doses p-t e po-t

Panax

ginseng C.A. Mey (Joo et al., 2009)

Extrato aquoso padronizado das cascas

Dietil-ditiocarbamato 600 mg/kg, i.p.

Ratos Sprague-


100 mg/kg, v.o.

Administração diária, por 3 semanas após a (i)PA



(↓p<0,05)

Patrinia

scabiosifolia

Link. (Seo et al., 2006)

Extrato aquoso de todas as partes da planta

Colecistocinina octapeptide, 75 µg/kg, s.c.

Ratos Wistar machos, n=6 a 8/grupo

100 mg/kg, v.o.

Administração diária por 5 dias antes da (i)PA



(↓p<0,05)

Punica

granatum L. (Minaiyan et al. 2004)

a) Pó do fruto seco; b) extrato hidroetanólicodas sementes; c) óleo fixo das sementes

Ceruleína i.p., 50 µg/kg, 5 x,

Camundongos Syrian machos, n=6/grupo

a, b) 125, 250 e 500 mg/kg; c) 50, 100 e 200 µL/kg, i.p.

a, b) 30 min antes; c) a cada 24 h por 5 dias, antes da (i)PA,


Solução salina Amilase (U/L) MPO (U/mg tecido) Análise Histológica

250 e 500 mg/kg (↓p<0,001) p-t 100 e 200 mg/kg po-t (↓p<0,001) **

(Continua)

62








Tripterygium

wilfordii

Hook. F. (Wang et al., 2013)

Fração do extrato etanólico das folhas

Tauracolato de sódio, intra-ductal, 3,5%

Ratos Sprague-


50 mg/kg via i.p.





(↓p<0,01)

(↓p<0,001)

Urtica dioica

L. (Yilmaz et al., 2014)

Extrato das folhas


Ratos Wistar machos, n=6/grupo

1 mL de solução a 5,2%, i.p.

6 h após após o término da (i)PA




(↓p<0,05)

(↓p<0,05)

(i)PA: indução da pancreatite aguda, p-t: pré-tratamento, po-t: pós tratamento. * Todos os desfechos foram comparados com o respectivo grupo com pancreatite aguda. ** Os resultados dos desfechos foram semelhantes em todos os modelos estudados.

63

4.3.3 Avaliação do risco de viés

Pode-se observar na figura 9 a avaliação da qualidade dos estudos incluídos, segundo a

ferramenta de risco de viés para estudos com animais (HOOIJMANS et al., 2014). Nela, pode-

se observar o agrupamento de trabalhos por autor, no qual é possível identificar quais trabalhos

possuem maior risco de viés. Note-se uma grande quantidade de artigos com dados ausentes ou

reportados de maneira incompleta, o que gerou numerosos julgamentos como risco de viés

incerto.

Aleatorização (viés de seleção): em 66,7% dos artigos avaliados para o risco de viés,

informou-se a realização de randomização dos animais antes dos experimentos, embora

nenhum trabalho tenha relatado a realização de uma aleatorização computadorizada ou feita por

fichas de randomização conforme sugere a ferramenta (Item 1 da ferramenta de risco de viés;

figura 10).

Características basais (viés de seleção): em 90% deles, as características basais como

sexo, idade e peso dos animais foram semelhantes e todos os grupos experimentais possuíam o

mesmo número de animais em sua estrutura (Item 2 da ferramenta de risco de viés; figura 10).

Alocação dos animais (viés de seleção): nenhum artigo investigado deixou claro os

critérios usados na alocação dos animais (Item 3 da ferramenta de risco de viés; figura 10).

Habitação aleatória (viés de desempenho): a maioria dos trabalhos (73,3%), no entanto,

informou ter submetido os animais a ambientes semelhantes, tanto durante, quanto após as

respectivas intervenções, com temperatura controlada, ciclo claro/escuro de 12 h e livre acesso

a água e ração, além de ter cumprido as regras de bem-estar animal preconizada pelas mais

diversas sociedades ao redor do mundo (Item 4 da ferramenta de risco de viés; figura 10).

Encobrimento (viés de desempenho): em relação ao encobrimento dos cuidadores ou

investigadores, não existiam informações suficientes, sendo que nenhum dos artigos

mencionava esta informação (Item 5 da ferramenta de risco de viés; figura 10).

Avaliação de desfecho aleatória (viés de detecção): Em relação à existência de

aleatorização dos animais para a realização da eutanásia e coleta dos tecidos, as informações

são inexistentes em todos os artigos avaliados para este fim (Item 6 da ferramenta de risco de

viés; figura 10).

Encobrimento (viés de detecção): em 43,3% dos estudos, encontra-se a informação

relacionada ao encobrimento do avaliador dos resultados (Item 7 da ferramenta de risco de viés;

figura 10).

64

Desfechos com dados incompletos (viés de atrito): em nenhum dos artigos analisados

para risco de viés foi informada a retirada de animais ou dados durante a realização dos

experimentos e sua posterior análise (Item 8 da ferramenta de risco de viés; figura 10).

Relatório seletivo de desfechos (viés de relato): o item possui o baixo risco de viés, com

76,7% de avaliações positivas relacionadas à concordância entre os métodos propostos e os

desfechos reportados (Item 9 da ferramenta de risco de viés; figura 10).

Outras fontes de viés (viés de relato): observou-se que em 63,3% dos artigos a

preparação vegetal utilizada foi descrita com clareza, enquanto que em 36,7% dos trabalhos

analisados a maneira de preparação dos extratos ou as suas características fitoquímicas não

foram descritos (Item 10 da ferramenta de risco de viés; figura 10). Todos os resultados

descritos podem ser observados nas figuras 9 e 10.

65

Abe

d et

al.,

201

2

Aru

na e

t al.,

201

4

Bab

u et

al.,

200

9

Bae

et a

l., 2

010

Bae

et a

l., 2

012a

Bae

et a

l., 2

012b

Che

n et

al.,

199

9

Cho

i et a

l., 2

014

Cho

i et a

l., 2

015

Das

et a

l., 2

006

Fen

g et

al.,

201

2

Gen

oves

e et

al.,

200

6

Hah

m e

t al.,

199

8

Joo

et a

l., 2

009

Jung

et a

l., 2

008

Min

aiya

n et

al.,

201

2

Min

aiya

n et

al.,

201

4

Ou

et a

l., 2

012

San

tana

et a

l., 2

012

Seo

et a

l., 2

006

Seo

et a

l., 2

011

Sid

hu e

t al.,

201

1

Wan

g et

al.,

201

3

Wan

g et

al.,

201

5

Yao

et a

l., 2

015

Yil

maz

et a

l., 2

014

Yu

et a

l., 2

011

Zey

bek

et a

l., 2

003

Zha

ng e

t al.,

200

9a

Zha

o et

al.,

200

4

1 + + - + + + - + + + + + - - + - - + - - - - + + + + + + + +

2 - + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - + + + + + + + +

3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

4 + + ? + + + ? + + + + ? + + + + + ? + + + + ? + ? + + + ? ?

5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

6 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

7 + ? + ? ? ? ? ? + + + ? + + ? ? + ? + ? ? ? + + ? + ? + ? ?

8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

9 + - + + + + - + + + - + - - + + + + + + + + + - + + + + + +

10 + + + + + + + + + + + - - + + + + - + - + + - + - - - - - -

Figura 9: Sumário dos autores da revisão sobre os itens de risco de viés de cada estudo incluído. Verde: baixo risco de viés; Amarelo: risco de viés incerto; Vermelho: alto risco de viés. Questões baseadas na ferramenta SYRCLE Risk of Bias para estudos com animais (HOOIJMANS et al., 2014). 1) Aleatorização, 2) Características basais, 3) Alocação dos animais, 4) Habitação aleatória, 5) Encobrimento, 6) Avaliação de desfecho aleatória, 7) Encobrimento, 8) Desfechos com dados incompletos, 9) Relatório seletivo de desfechos, 10) Outras fontes de viés (Clareza na preparação vegetal).

66

Figura 10. Porcentagem relativa de risco em todos os estudos incluídos. Julgamento dos autores da revisão sobre os itens do risco de viés de cada estudo incluído. Questões baseadas na ferramenta SYRCLE Risk of Bias para estudos com animais (HOOIJIMANS et al., 2014). 4.3.4 Plantas medicinais citadas

a) Nardostachys jatamansi (D.Don) DC. É uma planta de origem asiática, do gênero

Nardostachys e família Caprifoliaceae e que fornece um óleo aromático a partir de suas

raízes que é muito usado popularmente no tratamento das mais diversas condições

clínicas (BAE et al., 2012a, 2010). Possui em sua composição, sesquiterpenos como o

ácido jatamânsico e jatamansona, nardosinina, ligninas e neoligninas (BAE et al., 2010).

Na pancreatite aguda, o extrato das raízes e das folhas causaram efeito semelhante.

Foram observados a redução de parâmetros relacionados à melhora do quadro de PA

induzida por ceruleína ou por dieta deficiente em colina-metionina, como: redução da

mortalidade (BAE et al., 2013), redução da atividade de MPO pancreática (BAE et al.,

2012a, 2010, 2012b) e pulmonar (BAE et al., 2010, 2013), redução da amilase e lipase

séricas (BAE et al., 2012a, 2010, 2012b), melhora dos escores histopatológicos no

pâncreas (BAE et al., 2012a, 2010, 2012b) e pulmão (BAE et al., 2010, 2013), nos quais

foi possível observar redução de parâmetros como edema, vacuolização e infiltração

neutrofílica em grupos de animais com PA e tratados com o extrato de N. jatamansi.

Destaca-se a redução das concentrações séricas das citocinas fator de necrose tumoral

(TNF)-α, interleucina (IL)-6 e IL-1β, bem como do ácido ribonucleico mensageiro

(mRNA) para as mesmas (BAE et al., 2012a, 2010, 2012b) e da enzima heme oxigenase

(OH)-1 cuja indução ocorre via estresse tecidual (BAE et al., 2012a). Pode-se observar

o aumento da viabilidade celular de ácinos pancreáticos tratados com ceruleína (BAE

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

10) Clareza na preparação vegetal

9) Relatórios seletivos de desfechos

8) Desfechos com dados incompletos

7) Encobrimento

6) Avaliação de desfecho aleatória

5) Encobrimento

4) Habitação aleatória

3) Alocação dos animais

2) Características basais

1) Aleatorização

Risco de viés baixo Risco de viés incerto Risco de viés alto

67

et al., 2012a, 2010), principalmente nas concentrações mais baixas do extrato. Por fim,

inibiu a ativação das proteínas cinases ativadas por mitógeno (MAPK) no tecido

pancreático (BAE et al., 2010). A proteção do pâncreas mostrada pelo tratamento com

N. jatamansi pode estar relacionada à ação de compostos imunomoduladores e anti-

inflamatórios presentes nos seus extratos, levando a uma melhora global na pancreatite

aguda, tanto local quanto em órgãos distantes como o pulmão;

b) Camellia sinensis (L.) Kuntze é uma espécie do gênero Camellia e da família Theaceae,

popularmente conhecida como chá, possui componentes bioativos como taninos,

polifenóis e heteropolissacarídeos, que lhe confere propriedades antioxidantes, anti-

inflamatórias e antimicrobianas, entre outras (DU et al., 2016). O tratamento com o

extrato de Camellia sinensis cujas folhas não sofreram fermentação (chá verde) durante

a PA induzida por ceruleína ou por etanol com ceruleína, reduziu as concentrações

séricas de amilase e lipase, a atividade de MPO, as concentrações de MDA e o índice

de edema no pâncreas. Diminuiu também escores histopatológicos característicos de

inflamação pancreática como edema, necrose e infiltração de células inflamatórias. A

identificação de proteínas revelou inativação do NF-κB no pâncreas dos animais

tratados com o chá verde. Também foram significativamente reduzidas a expressão de

P selectina, molécula de adesão intercelular (ICAM)-1, TNF-α, fator de transformação

do crescimento (TGF)-β, fator endotelial de crescimento vascular (VEGF), nitrotirosina

e poly-difosfato de adenosina (ADP) ribose sintase no pâncreas, mostrando que o efeito

protetor da C. sinensis no pâncreas pode estar relacionado à sua atividade antioxidante;

c) Curcuma longa L. possui rizomas que são comumente usados na alimentação e na

medicina. Pertencente ao gênero Curcuma e à família Zingiberaceae, seus efeitos são

amplamente descritos como antioxidante, anti-inflamatório, imunomodulador, sedativo,

anticarcinogênico, entre outros (JOE; VIJAYKUMAR; LOKESH, 2004; MENON;

SUDHEER, 2007), estes efeitos são, principalmente, decorrentes da ação da curcumina,

um pigmento extraído das raízes da C. longa (GULCUBUK et al., 2006; JOE;

VIJAYKUMAR; LOKESH, 2004). O extrato aquoso das raízes e rizomas de C. longa

promoveram uma melhora geral no quadro de pancreatite aguda experimental nduzida

por ceruleína, devido à redução da atividade de OH-1 e seu mRNA no soro, das

concentrações séricas de amilase e lipase, das concentrações teciduais de IL-6, IL-1β e

TNF-α e seus respectivos mRNA no pâncreas e pulmão, da atividade de

68

mieloperoxidase (MPO) no pâncreas e pulmão, aumento da viabilidade celular no

pâncreas e melhora dos escores histopatológicos edema, inflamação, necrose e

vacuolização no pâncreas e pulmão (SEO et al., 2011). Além disso, o extrato da cúrcuma

diminuiu a expressão de fator nuclear (NF)-κB no pâncreas e aumentou a expressão de

receptores ativados por proliferador de peroxissomo (PPAR)-γ neste tecido (YU et al.,

2011). Ainda neste estudo, a administração de bloqueador de PPAR-γ juntamente com

o extrato da C. longa não apresentou atividade frente a expressão pancreática de NF-

κB, sugerindo a participação do PPAR-γ no mecanismo de ação da C. longa. Vale

destacar que a ativação do PPAR-γ suprime a resposta inflamatória pela inibição da

liberação de citocinas, da expressão de NF-κB e da ICAM-1 (SIDDIQUI et al., 2006);

d) Emblica officinallis Gaertn. é uma sinonímia para Phyllanthus emblica L., uma planta

da família Phyllanthaceae e do gênero Phyllanthus, descrita na medicina Ayurveda,

tradicional na Índia e conhecida como groselha indiana. É usada para tratar hemorragias,

diarreia, processos inflamatórios. Possui ácido ascórbico em sua composição, além de

taninos e filemblina (VARIYA; BAKRANIA; PATEL, 2016). Na PA induzida por

etanol e ceruleína ou por L-arginina, o tratamento com E. officinalis não reduziu a

atividade de amilase sérica em comparação ao grupo com pancreatite tratado com

veículo, mas reduziu a atividade de lipase sérica e de amilase pancreática. O tratamento

também reduziu as concentrações séricas de IL-10 e aumentou o conteúdo total de ácido

desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA), bem como a síntese de DNA

pancreática, indicadores de preservação tecidual. Foi observado também, na análise

histológica uma redução dos parâmetros inflamatórios teciduais nos animais tratados

com o extrato (SIDHU et al., 2011). Como os animais foram avaliados 3, 14 e 28 dias

após a indução da pancreatite, pode-se observar que o extrato de E. officinalis

potencializa a recuperação espontânea do pâncreas após a pancreatite aguda induzida

por L-arginina;

e) Rheum officinnale Baill. é conhecido popularmente como ruibarbo e essa planta do

gênero Rheum e da família Polygonaceae é tradicionalmente usada na medicina chinesa

como laxante e no tratamento das mais diversas condições inflamatórias, fazendo parte

da preparação tradicional chinesa Da-Huang, utilizado pela Medicina Chinesa para

tratar pancreatite aguda (FENG et al., 2012). No extrato aquoso de suas raízes e rizomas

estão presentes senosídeos e compostos fenólicos como as antraquinonas (CAI et al.,

69

2004; FENG et al., 2012). Na PA induzida por injeção intra-ductal de sais biliares, R.

officinale não reduziu os escores histopatológicos relacionados à inflamação pancreática

na pancreatite aguda, como infiltração celular, edema e necrose (CHEN; VALENTE;

ALEXANDER, 1999; FENG et al., 2012), no entanto, inibiu a ativação de MAPK no

pâncreas e a concentração plasmática de TNF-α e IL-6 (FENG et al., 2012).

f) Rheum palmatum L. também é conhecido como ruibarbo, pertence ao gênero Rheum e

à família Polygonaceae. Na PA induzida por tauracolato de sódio, além de reduzir as

concentrações de amilase sérica e os escores histopatológicos inflamatórios no pâncreas

(YAO et al., 2015; ZHAO et al., 2004), também o fez na mucosa intestinal de animais

com PA (YAO et al., 2015). A expressão de mRNA para o Receptor Tool-like (TLR)2

e TLR4 na mucosa intestinal foi inibida pelo tratamento com R. palmatum L, revelando

uma modulação na função imune da mucosa intestinal, que foi alterada no curso da PA

induzida por ceruleína (YAO et al., 2015). Assim, a administração de Rheum palmatum

L resulta em uma marcada redução da atividade da amilase sérica e na preservação da

arquitetura tissular pancreática, o que pode estar relacionado com a função imune e a

inibição de citocinas inflamatórias;

g) Salvia miltiorrhiza Bunge é conhecida na Medicina Chinesa como Danshen. Esta planta

pertence ao gênero Salvia e a família Lamiaceae. Estima-se que suas raízes sejam usadas

há mais de 2000 anos como remédio para tratar o coração e a circulação (SU et al., 2015)

e os primeiros registros oficiais do seu uso estão presentes no Shen Nong Materia

Medica E. Han Dynasty que data aproximadamente de 102-200 d.C. (LI et al., 2008).

Possui em sua composição, metabólitos secundários como o tanshinol, o ácido

salvânico, o ácido rosmarínico, a dihidrotanshinona além de protocatequinas (SHEN et

al., 2014). Foi observado neste trabalho que o tratamento com S. miltiorrhiza reduziu a

mortalidade de animais com pancreatite aguda induzida por tauracolato de sódio (OU

et al., 2012; ZHANG et al., 2009a, 2009c, 2009d, 2009e, 2009f). Foi observado também

a melhora nos escores histopatológicos dos animais tratados com S. miltiorrhiza no

pâncreas (OU et al., 2012; ZHANG et al., 2009a), pulmão (OU et al., 2012; ZHANG

et al., 2009d, 2009e), fígado (OU et al., 2012; ZHANG et al., 2009b, 2009c), coração

(ZHANG et al., 2009f), rins (OU et al., 2012), timo (ZHANG et al., 2010), baço

(ZHANG et al., 2010) e intestino delgado (ZHANG et al., 2010) durante a pancreatite

aguda. Além disso, o tratamento com S. miltiorrhiza levou à redução sérica das

70

concentrações de MDA e IL-18 (ZHANG et al., 2009e), IL-6 (ZHANG et al., 2009a,

2009e), endotoxina (ZHANG et al., 2009a, 2009c, 2009f), fosfolipase (PL)A2 (ZHANG

et al., 2009f), TNF-α (ZHANG et al., 2009c), amilase, ureia e creatinina (OU et al.,

2012), alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) (OU et al.,

2012; ZHANG et al., 2009d), fator de ativação plaquetária (PAF), IL-1β e sIL-2R

(ZHANG et al., 2010), além do aumento da atividade de superóxido dismutase (SOD)

no plasma (ZHANG et al., 2009e). Observou-se também a redução da expressão de

ICAM-1 no pulmão de animais com pancreatite aguda (ZHANG et al., 2009e) e a

diminuição da apoptose nesse órgão (ZHANG et al., 2009d). A apoptose também foi

reduzida nos rins e fígado (OU et al., 2012). A expressão tecidual de proteína Bax foi

elevado no pâncreas (ZHANG et al., 2009a) e reduzida nos rins, fígado e pulmões (OU

et al., 2012) dos animais tratados com este extrato, juntamente com a redução da

expressão de NF-κB no pâncreas e pulmão (OU et al., 2012). A intensidade e a

expressão das proteínas TRL4 (ZHANG et al., 2009c) e p65, bem como do NF-κB

(ZHANG et al., 2009b) no fígado também foram moduladas pelo tratamento com S.

miltiorrhiza durante a pancreatite aguda. Estes resultados demonstram que o extrato

padronizado da S. miltiorrhiza age de maneira local e sistêmica, tendo seu efeito protetor

estendido por diversos órgãos durante a pancreatite aguda experimental;

h) Acantopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms é um sinônimo de Eleutherococcus

senticosus (Rupr. & Maxim.) Maxim, um arbusto do gênero Eleutherococcus e da

família das Araliaceaes, conhecida popularmente como ginseng siberiano, embora seja

de um gênero diferente do Panax ginseng. O extrato aquoso de suas raízes e rizomas

diminuiu a mortalidade dos animais após a indução da PA por injeção intra-ductal de

tauracolato de sódio, reduziu as concentrações séricas de TNF-α e IL-6 e aumentou as

concentrações de IL-10. Reduziu a expressão pancreática da subunidade p65 do NF-κB

e a expressão de mRNA para TNF-α e IL-6 no tecido cerebral e aumentou a expressão

de mRNA para IL-10 neste tecido. Além de promover uma melhora nos parâmetros

histopatológicos do pâncreas e do cérebro dos animais com PA tratados com extrato;

i) Artemisia asiatica (Pamp.) Nakai ex Kitam é um sinônimo de Artemisia dúbia, var.

asiatica Pamp, do gênero Artemisia e família Compositae, conhecida como Artemisia é

um arbusto com reconhecida propriedade antioxidante, anti-inflamatória e citoprotetora

71

(OH et al., 1997; RYU et al., 1998). Foi observado que o extrato da A. asiatica induziu

apoptose nas células acinares pancreáticas de maneira dose-dependente, reduziu as

concentrações pancreáticas de malonaldeído (MDA) e melhorou o índice

histopatológico geral nos grupos tratados com 300 mg/kg de extrato, no entanto, o

tratamento não reduziu a amilase sérica na PA induzida por ceruleína (HAHM et al.,

1998);

j) Caesalpinia pyramidalis Tul. é conhecida como catingueira. Esta árvore do gênero

Caesalpinia e da família Leguminosae possui atividade antioxidante, anti-inflamatória

e antinociceptiva (SANTOS et al., 2011). Na PA induzida por obstrução do ducto

biliopancreático, foi observada a redução da hiperalgesia abdominal, de parâmetros

inflamatórios como MPO pancreática e pulmonar, da amilase, lipase e metabólitos de

óxido nítrico (NO) no soro, do índice de edema pancreático e da contagem total e

diferencial de leucócitos no sangue causado pelo tratamento com o extrato da entrecasca

desta planta. Também foi descrita redução do conteúdo tecidual de MDA com este

tratamento. Estes parâmetros foram reduzidos, principalmente quando os animais

tratados com o extrato da C. pyramidalis foram eutanasiados 6 h após a indução da PA.

Parte desse efeito pode ser atribuído à presença do flavonóide rutina na sua composição

(SANTANA et al., 2012b);

k) Cichorium intybus L. é conhecida popularmente como chicória, é uma erva do gênero

Cichorium e da família Compositae, nativa da Europa e da Ásia e posteriormente

cultivada em todo mundo, tem seu uso difundido tanto na alimentação quanto como

planta medicinal. No estudo de Minaiyan et al. (2012) foram utilizadas duas formas de

extrato, e ambos promoveram o decréscimo das concentrações séricas de amilase e

lipase. A via intraperitoneal se mostrou mais efetiva que a via oral pois, os animais

tratados pela via peritoneal tiveram os parâmetros histológicos pancreáticos reduzidos

durante a PA induzida por ceruleína, o que não ocorreu com os animais tratados pela

via oral (MINAIYAN et al., 2012);

l) Echium amoenum Fisch. & C. A.Mey. é uma erva nativa do Iran, conhecida como penas

vermelhas, pertencente ao gênero Echium e à família Boraguinaceae. É usado

popularmente como tônico, tranquilizante, antidepressivo, ansiolítico e antibacteriano.

Em sua composição, a antocianidina mais comum é a cianidina 3-glucosídeo. Na PA

72

induzida por ceruleína, o extrato das pétalas de E. amoenum diminuiu a resposta

inflamatória evocada durante a pancreatite aguda pela redução do índice de edema

pancreático, das concentrações séricas de amilase e lipase, a atividade de MPO

pancreática, as concentrações teciduais de MDA e de citocinas pró-inflamatórias como

TNF-α e IL-6 e os parâmetros histopatológicos inflamatórios característicos da PA.

Acredita-se que a presença de antocianidinas possa explicar, em parte, a atividade deste

extrato na PA (ABED et al., 2012);

m) Gardenia jasminoides J.Ellis, também conhecida como gardênia, é uma planta

arbustiva, semi-lenhosa que pertence ao gênero Gardenia e à família Rubiaceae, além

de ser uma planta ornamental, também é usada na medicina tradicional chinesa como

homeostática, anti-inflamatória, analgésica e antipirética. Seus principais componentes

são o gentiposídeo e a crocina (HU et al., 2005). O tratamento com o extrato desta planta

em animais com PA induzida por ceruleína, reduziu as concentrações séricas de amilase,

lipase, IL-1β e IL-6, o índice de edema pancreático, as concentrações pancreáticas de

mRNA para TNF-α, IL-1β e IL-6 e a atividade de MPO no pâncreas e pulmão. A

diminuição da gravidade da pancreatite pode ser observada também pela redução dos

valores dos escores histopatológicos edema e inflamação pancreática e pulmonar

(JUNG et al., 2008);

n) Ginkgo biloba L. é uma árvore do gênero Ginkgo e da família Ginkgoaceae é

mundialmente conhecida por seus efeitos neuroprotetores. Conhecida como ginkgo,

seus principais constituintes são os ginkgolídeos A, B, C e D (NASH; SHAH, 2015).

Quando usado para tratar a PA induzida por injeção intra-ductal de tauracolato de sódio,

o extrato de G. biloba apresentou diferença significativa do grupo não tratado nas

concentrações séricas de amilase e nos escores histopatológicos. Além disso, observa-

se uma acentuada redução das concentrações séricas de lipase e do MDA pancreático

tanto nos estágios iniciais quanto nos estágios avançados da pancreatite (ZEYBEK et

al., 2003);

o) Hypericum perforatum L. é conhecida como erva-de-são-joão, e pertence ao gênero

Hypericum e à família Hypericaceae. É usada na clínica como antidepressivo e seu

principal cinstituinte é a hipericina (JENDZELOVSKA et al., 2016). Quando usado no

tratamento da PA induzida por ceruleína, o H. perforatum reduziu a mortalidade, as

73

concentrações séricas de amilase e lipase, assim como a expressão de ICAM-1 e o

infiltrado de neutrófilos no pâncreas. O índice de edema, a atividade de MPO, as

concentrações de MDA e os escores histopatológicos edema, inflamação e necrose

foram significativamente reduzidos em pâncreas de animais tratados com o extrato. Foi

reduzida também a expressão de poly(ADP-ribose) (PAR) e de nitrotirosina no pâncreas

de animais tratados, mostrando assim, uma ação protetora do H. perforatum frente à PA;

p) Lithospermum erythorrhizon Siebold & Zucc. é um arbusto do gênero Lithospermum e

da Família Boraginaceae usado comumente na medicina tradicional Chinesa com o

nome de Zicao para tratar eczema, úlcera e constipação. Seu principal constituinte é a

naftoquinona shikonin, que possui diversas propriedades como anti-inflamatória,

antitrombótica, antioxidante e antimicrobiana (ANDUJAR et al., 2013). O tratamento

de animais com pancreatite aguda com L. erythrorhizon reduziu a lesão pancreática e a

lesão pulmonar associada a ela, atenuando a gravidade da PA induzida por ceruleína.

As principais evidências são infiltração neutrofílica, queda na atividade de amilase,

lipase e tripsina e redução da expressão de citocinas pró-inflamatórias (CHOI et al.,

2015);

q) Opuntia humifusa (Raf.) Raf. é um cacto pertencente ao gênero Opuntia e à família

Cactaceae, conhecido como figo espinhoso e possui propriedades terapêuticas contra

câncer, estresse oxidativo e úlcera. Possui compostos fenólicos, flavonoides e betalaínas

em sua composição (HAHM et al., 2016). Na PA induzida por ceruleína, tanto o pré

quanto pós tratamento com O. humifusa atenuaram a gravidade da pancreatite aguda,

observado pela melhora dos escores histopatológicos relacionados, tanto no pâncreas

quanto no pulmão, tecidos nos quais se pode observar a redução adicional da infiltração

de neutrófilos. A atividade de amilase e lipase séricas, a expressão de citocinas pró-

inflamatórias como TNF-α, IL-1β e IL-6 e a morte celular, incluindo necrose e apoptose

foram estatisticamente menores nos grupos de animais tratados com o extrato. Por fim,

foi relatada a inibição da ativação das cinases c-Jun N-terminal no pâncreas. Estes

resultados mostram uma efeito protetor tecidual promovido por este extrato, não

havendo diferença de resultados relacionadas ao momento do tratamento (CHOI et al.,

2014);

74

r) Panax ginseng C. A.Mey, conhecida como erva milagrosa, é uma planta do gênero

Panax e da família Araliaceae. É usada para tratar as mais diversas condições clínicas,

inflamatórias, dermatológicas, neurológicas cardiovascular e sexual, seus principais

constituintes são os ginsenosídeos (SABOURI-RAD et al., 2016). O tratamento da PA,

induzida por dietil ditiocarbamato, com P. ginseng preservou a arquitetura tecidual do

pâncreas, ao reduzir os escores histopatológicos relativos à inflamação tecidual. A

investigação imunohistoquímica revelou que a expressão de NF-κB, TNF-α e óxido

nítrico sintase induzida (iNOS) foi inibida no pâncreas de animais tratados com esta

planta. Os marcadores pancreáticos de estresse oxidativo como MDA e 4-

hidroxinonenal tiveram suas concentrações reduzidas após o tratamento, sugerindo que

o P. ginseng possui efeitos terapêuticos importantes no tratamento da pancreatite aguda

induzida por um inibidor de SOD (JOO et al., 2009);

s) Patrinia scabiosifolia Link é uma planta do gênero Patrinia e da família Caprifoliaceae

conhecida como valeriana de ouro, suas folhas e flores são ricas em saponinas

triterpenóides e utilizadas no tratamento da endometriose, apendicite e inflamação

(GAO et al., 2012). O extrato etanólico de P. scabiosifolia reduziu o índice de edema,

as concentrações séricas de amilase e lipase e a expressão de citocinas pró-inflamatórias

TNF-α, IL-1β e IL-6, além de elevar as concentrações pancreáticos de proteína do

choque séptico (HSP)60 e HSP72, em animais com PA, induzida por colecisticinina

octapeptide, e tratados com P. scabiosifolia, mostrando o efeito protetor deste extrato

contra as lesões causadas pela pancreatite aguda (SEO et al., 2006);

t) Punica granatum L. pertencente ao gênero Punica e à família Lythraceae, possui frutos

conhecidos como romã que são amplamente usados como antimicrobianos devido à

ação dos taninos (SINGH; CHIDAMBARA MURTHY; JAYAPRAKASHA, 2002). O

tratamento de animais com PA induzida por ceruleína levou a redução sérica da amilase

e lipase, atividade de MPO e escores histopatológicos (edema, infiltração de leucócitos

e vacuolização). Não houve diferença entre as 3 formas utilizadas da planta, que foram

o pó do fruto seco, o extrato hidroalcoólico das sementes e o óleo das sementes (MINAIYAN

et al., 2014);

u) Tripterygium wilfordii Hook. F. é conhecido como videira trovão de Deus e é uma erva

tradicionalmente usada na Medicina Chinesa para tratar artrite, pertence ao gênero

75

Tripterygium e à família Celastraceae e tem como principais constituintes o triptolídeo

e o celastrol (ZHANG et al., 2016). Quando utilizado no tratamento da PA induzida por

tauracolato de sódio, o T. wilfordii levou à redução das concentrações séricas de amilase,

lipase, D(-)-lactato e endotoxina, além de reduzir a quantidade de colônias e o tipo de

bactérias presentes no líquido ascítico. Foi observado também, a diminuição dos escores

histopatológicos no pâncreas e no íleo, com notada preservação das vilosidades

intestinais. Assim, este tratamento promoveu uma melhora não só do pâncreas como do

intestino, pela preservação da barreira intestinal, afetada pela pancreatite aguda (WANG

et al., 2013);

v) Urtica dioica L. é uma erva pertencente ao gênero Urtiga e à família Urticaceae, tendo

como constituintes carotenoides, terpenos, flavonoides e taninos, usada principalmente

como adstringente, antisséptica, bactericida, vasoconstrictora (BONETTI et al., 2016).

Quando administrada em animais com PA induzida por ceruleína, reduziu o escore

histopatológico total no pâncreas e promoveu um pequeno aumento no índice de

apoptose, no entanto, não alterou significativamente os parâmetros amilase, TNF-α,

M30, M65 e Caspase-3 (YILMAZ et al., 2014).

4.4 Discussão

Observando as espécies descritas nesta revisão é possível verificar que algumas plantas

já foram mais intensamente estudadas no tratamento pré-clínico da pancreatite aguda, como

Nardostachys jatamansi, Cammelia sinensis, Curcuma longa, Emblica officinallis, Rheum

palmaytum, Rheum officinale e Salvia miltiorrhiza. Também se destacam 5 famílias de plantas

cujos espécimes foram estudados em mais de um trabalho, a saber: Araliaceae (Acanthopanax

senticosus e Panax ginseng), Boraginaceae (Echium amoenum e Lithospermum erythrorhizon),

Caprifoliaceae (Nardostachys jatamansi e Patrinia scabiosifolia), Compositae (Artemisia

asiatica e Cichorium intybus) e Polygonaceae (Rheum palmatum e Rheum officinale).

O principal marcador bioquímico da PA utilizado na clínica (CÖL et al., 2010), de

execução simples e acessível (AISP, 2015), a amilase sérica fornece um diagnóstico acerca do

estado geral do pâncreas nas primeiras horas de desenvolvimento da PA (HOKARI et al., 2003).

O recrutamento de neutrófilos para o sítio da inflamação é quantificado pela atividade de MPO,

uma hemoproteína estocada nos grânulos azurófilos dos neutrófilos que catalisa a conversão de

cloreto e peróxido de hidrogênio em hipoclorito, o qual é secretado pelos neutrófilos durante o

76

processo inflamatório (KLEBANOFF et al., 2013). Esta resposta celular inicial, que consiste

em infiltração tecidual de neutrófilos, parece exacerbar a lesão pancreática, sendo responsável,

em parte, pela falência precoce de órgãos vista em alguns casos de PA (SHRIVASTAVA;

BHATIA, 2010), assim, alterações na atividade da MPO pancreática nos permitem inferir sobre

a gravidade da inflamação pancreática durante o quadro de pancreatite. Análises histológicas,

quando corretamente conduzidas, são ferramentas de grande importância na caracterização da

inflamação pancreática, já que a diferenciação entre pancreatite intersticial edematosa e

necrotizante têm uma relação direta com a evolução da doença e a sobrevida a ela associada, já

que, na prática clínica, em mais de 80% dos casos de pancreatite necrotizante o paciente vem a

óbito (YOKOE et al., 2015).

Várias outras plantas mostraram potencial para tratar a pancreatite aguda, a grande

maioria delas, nativas do continente asiático, o que pode ser explicado pela grande quantidade

de trabalhos desenvolvidos nesta região, cuja incidência de pancreatite aguda figura entre as

mais elevadas do mundo (YOKOE et al., 2015). No entanto, é preciso que se destaque o fato

de algumas plantas (Salvia miltiorrhiza e Nardostachys jatamansi) terem sido estudadas pelo

mesmo grupo de pesquisa, e pelos mesmos autores com enfoques diferentes sobre o seu uso na

pancreatite aguda, levando à publicação de vários trabalhos semelhantes com enfoques em

órgãos distintos, o que ainda que tenha aumentado as evidências sobre os seus usos na

pancreatite aguda, leva à manutenção dos mesmos vieses de publicação.

Durante a síntese dos trabalhos, pode se detectar uma inobservância à padronização no

que se refere à nomenclatura correta dos espécimes vegetais, um detalhe que pode reduzir a

validade científica dos trabalhos e aumentar o risco de viés. Outro detalhe que merece destaque

é a preparação ou origem dos extratos vegetais usados que nem sempre foram detalhados com

clareza, como por exemplo, a ausência do número de lote dos extratos padronizados utilizados

no trabalho, assim, nesta revisão foi incluído no item 10 da ferramenta de risco de viés o

questionamento sobre a clareza da preparação vegetal. Outra dificuldade encontrada, que levou

ao julgamento de muitos itens da ferramenta de risco de viés como “incerto”, foi o baixo

detalhamento acerca das condições experimentais, dos métodos e materiais. Provavelmente,

como consequência do baixo detalhamento de fatores essenciais na metodologia, a maioria dos

trabalhos está classificada como risco incerto de viés. Vale destacar, que os itens com risco de

viés incerto somados aos itens com alto risco de viés superam os itens com baixo risco de viés,

o que pode caracterizar os trabalhos como contendo alto risco de viés.

Os trabalhos analisados, mostraram que parte do enfoque dado ao uso das plantas

medicinais na pancreatite aguda passa pelas suas expressivas atividades antioxidantes, este fato,

77

direciona a metodologia dos trabalhos a, em grande parte, promoverem a determinação de

algum parâmetro ligado ao estresse oxidativo. No entanto, vale lembrar que a pancreatite aguda

apresenta a dor abdominal como um dos seus principais sinais clínicos, e, como um grande

número de plantas medicinais apresenta uma ação antinociceptiva, destaca-se a ausência de

trabalhos que abordem o estudo da hiperalgesia abdominal ou outro comportamento

nociceptivo na pancreatite aguda.

Os mais importantes achados deste trabalho são: i. o tratamento com plantas

medicinais é eficiente no tratamento da pancreatite aguda experimental, principalmente em

modelos de pancreatite aguda leve a moderada, como o modelo de indução da PA por ceruleína;

ii. Tanto a administração profilática quanto terapêutica destas plantas apresenta resultados

benéficos no tratamento da pancreatite aguda; iii. Destacam-se as plantas com atividade

antioxidante, o que pode ser explicado pelo forte componente relacionado ao estresse oxidativo

presente na pancreatite aguda. No entanto, alguns pontos limitantes merecem enfoque: i. A

maioria dos trabalhos não apresenta controles positivos, isso pode estar relacionado à ausência

de medicamentos específicos para o tratamento da pancreatite aguda; ii. Os dados relacionados

à metodologia dos trabalhos precisam ser melhor detalhados a fim de propiciar uma melhor

condução da análise de risco de viés; iii. Embora sejam necessários mais estudos acerca do uso

destas plantas, é preciso evitar a divisão dos resultados de uma pesquisa em vários artigos que

avaliam pequenos aspectos do uso de determinada planta na pancreatite aguda.

Já existem estudos clínicos que utilizaram plantas medicinais como adjuvantes ao

tratamento da pancreatite aguda em humanos, como a Salvia miltiohrrizae (ZHANG et al.,

2004), a mistura de Rheum officinalle e Rheum palmatum, o ruibarbo (WAN et al., 2014), a

tintura de Panax ginseng (TOLSTOI et al., 1985), as quais contribuíram para a redução do

tempo de hospitalização e das complicações relacionadas à PA. Assim, é necessário que

evidências científicas sejam obtidas em relação a eficácia das plantas medicinais em estudos

pré-clínicos, para que possam ser úteis no tratamento da pancreatite aguda em humanos. É

importante destacar também a necessidade de ensaios pré-clínicos criteriosamente conduzidos

a fim de reduzir os riscos de viés, melhorar a qualidade das informações sobre o material vegetal

e para que se possa obter evidências científicas que serão úteis para a prática clínica sobre

possíveis adjuvantes ao tratamento da pancreatite aguda.

78

5 CAPÍTULO 2

AVALIAÇÃO DO EXTRATO DE CRANBERRY (Vaccinium macrocarpon) NA PANCREATITE AGUDA EXPERIMENTAL

79

5.1 Considerações iniciais

A pancreatite aguda é uma doença inflamatória do pâncreas que envolve uma série de

eventos bioquímicos, imunológicos e fisiológicos, cuja complexidade dificulta a existência de

tratamento específico aos mecanismos subjacentes ao seu desenvolvimento (YADAV;

LOWENFELS, 2013). O consumo excessivo de álcool e a presença de cálculos biliares são as

principais causas de pancreatite, no entanto, independentemente das causas, a ativação precoce

das proteases pancreáticas e o aumento do cálcio intracelular desencadeiam a ativação de

tripsinogênio e induzem uma inflamação local, que leva à autodigestão, destruição do

parênquima tecidual e finalmente, necrose pancreática (BOOTH et al., 2011; ROBERTS et al.,

2014).

Buscando entender o desenvolvimento da pancreatite e desenvolver alternativas de

tratamento, diversos modelos laboratoriais têm sido utilizados, dentre eles, o modelo de indução

da pancreatite aguda por L-arginina, classicamente estudado em ratos, foi, há poucos anos,

validado para o uso em camundongos. Este modelo leva a um significativo aumento da amilase

plasmática, da atividade de MPO no tecido pancreático, associado a aumento dos escores

inflamatórios histopatológicos no pâncreas e pulmão (DAWRA et al., 2007), sendo de fácil

execução e reprodutibilidade.

As plantas medicinais são uma fonte promissora de compostos bioativos cujas

propriedades podem ser uteis no tratamento das mais variadas condições clínicas (HARVEY et

al., 2008). A busca por alternativas de tratamento da pancreatite aguda associada ao potencial

anti-inflamatório e antioxidante apresentado pelo Vaccinium macrocarpon motivaram o

desenvolvimento do presente estudo. Embora esta planta seja tradicionalmente utilizada no

tratamento das diversas condições inflamatórias do aparelho urinário, a presença de

proantocianidinas e flavonoides em sua composição (BLUMBERG et al., 2013) podem ser

preditores de possível redução da gravidade da pancreatite aguda após o tratamento com V.

macrocarpon. Neste trabalho foi utilizado um extrato padronizado da Vaccinium macrocarpon

(EpVm), cujas vantagens sobre o extrato bruto residem na melhor uniformização da preparação,

representando maior confiabilidade em relação a sua composição (FELTRIN, CHORILLI,

2010). Assim, este capítulo se destina a estudar o uso do EpVm na pancreatite aguda

experimental, relacionado a seus possíveis efeitos anti-inflamatório, antinociceptivo e

antioxidante.

80

5.2 Casuística e métodos

5.2.1 Reagentes e drogas

Os reagentes utilizados nos testes antioxidantes, brometo de hexadeciltrimetilamonio,

cloridrato de o-dianisidina, cloridrato de L-arginina, reagente de Bradford e albumina sérica

bovina foram adquiridos da Sigma Aldrich® (São Paulo – São Paulo, Brasil). As drogas

morfina, diazepam e dexametasona foram obtidas da União Química S/A (São Paulo - São

Paulo, Brasil), os anestésicos cetamina e xilazina para uso veterinário, foram obtidos da Ceva

Saúde Animal, Ltda (Paulínia – São Paulo, Brasil), obteve-se heparina sódica da Hipolabor

Pharmaceutic, Ltda (Belo Horizonte – Minas Gerais, Brasil). O Corante Giemsa para coloração

das lâminas hematológicas foi obtido de Newprov® (Pinhais – Paraná, Brasil). Anticorpos e

reagentes utilizados na determinação das concentrações de citocinas foram obtidos

comercialmente da R&D Systems, Inc. (Mineapolis - Minnesota, EUA). Demais reagentes

foram obtidos da Merck KGaA (Darmstadt – Hessen, Alemanha).

5.2.2 Material vegetal

O extrato hidroetanólico padronizado dos frutos de Vaccinium macrocarpon (EpVm) foi

adquirido comercialmente da Fagron BV (São Paulo – São Paulo, Brasil), lote 14083757D, com

certificado de análise de controle de qualidade (ANEXO E) e gentilmente cedido pela Dose

Certa Farmácia de Manipulação sob a responsabilidade do Me. Farm. Leandro de Oliveira

Porfírio. De acordo com o fabricante, este extrato obtido de frutos secos contém um mínimo de

25% (m/m) de antocianidinas.

5.2.3 Ensaio in vitro de capacidade antioxidante do EpVm

Eliminação de radicais 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH)

Para a avaliação da capacidade antioxidante contra o radical DPPH foi utilizada a

metodologia descrita por Silva et al (2005) com algumas modificações. Em microplaca foram

adicionados 50 µL do EpVm dissolvido em água destilada (suficiente para alcançar as

concentrações finais de 0,025; 0,25; 2,5; 6,25; 12,5 e 25 µg/mL no meio reacional) a 150 µL da

solução estoque de DPPH (24 µg/mL, concentração final de 18 µg/mL), e incubados a

temperatura ambiente por 30 min com posterior leitura de absorbância a 517 nm em leitor de

81

microplaca (Synergy 2, BioTek, Winooski – Vermount, EUA). A avaliação antioxidante foi

realizada em triplicata e os valores de absorbância foram expressos como porcentagem de

inibição do radical DPPH• pela seguinte equação:

% Inibição de DPPH = 100 – {(controle – teste) / controle} x 100

A metade da concentração que produziu efeito inibitório máximo (IC50) do EpVm foi

determinada pela inibição de 50% do radical DPPH. Para tanto, foi utilizado como controle

positivo o ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (trolox: 25 µg/mL). Os

valores de percentual de inibição foram comparados como o meio reacional sem adição de

extrato ou controle positivo (sistema). A partir do valor da IC50, foi calculado o índice de

atividade antioxidante (IAA) conforme previamente descrito (SHERER, GODOY, 2008), a

partir da equação abaixo:

IAA = concentração final de DPPH (µg/mL) / IC50 (µg/mL)

Eliminação de óxido nítrico (NO)

Nesta avaliação, o NO foi produzido a partir da decomposição espontânea do

nitroprussiato de sódio (SNP, 20 mmol/L) em de tampão fosfato de sódio (50 mmol/L, pH 7,4).

Uma vez gerado, o NO interage com o oxigênio para produzir íons nitrito, que foram

quantificados por meio da reação de Griess, de acordo com o método de Basu et al. (2006). Em

uma microplaca foi adicionado uma mistura reacional contendo 50 µL do EpVm dissolvido em

água destilada (suficiente para alcançar as concentrações finais de 0,025; 0,25; 2,5; 6,25; 12,5

e 25 µg/mL no meio reacional) e 50 µL de SNP (20 mmol/L) em tampão fosfato de sódio (pH

7,4) e posteriormente incubado a 37ºC por 1 hora. Após incubação, foram adicionados 100 µL

de reagente de Griess. A absorbância do cromóforo foi quantificada a 540 nm em leitor de

microplaca (Synergy 2, BioTek, Winooski – Vermount, EUA) e os resultados foram expressos

como quantidade de íons nitrito produzido. Trolox (100 µg/mL) foi utilizado como controle

positivo.

Inibição da peroxidação lipídica in vitro

A fonte de lipídios empregada para tal ensaio foi o homogenato de gema de ovo

(RUBERTO et al., 2000). A peroxidação lipídica foi determinada de acordo com Ohkawa,

82

Ohishi, Yagi (1979) com modificações. Resumidamente, o homogenato de gema de ovo (100

µL em tampão fosfato de sódio 50 mmol/L, pH 7,4) foi incubado com 50 µL de diferentes

concentrações do EpVm dissolvido em água destilada (suficiente para alcançar as concentrações

finais de 0,005; 0,05; 0,5; 1,25; 2,5 e 5 µg/mL no meio reacional) a 37ºC durante 30 minutos.

Posteriormente, foram adicionados 350 µL de ácido acético 20% (pH 3,5) e 600 µL de ácido

tiobarbitúrico (TBA, 0,36%) e incubado por 1 hora a 85ºC. Em seguida, os tubos foram

resfriados em gelo e centrifugados (Z326K, Hermle Labortechnik, Wehingen – Tuttlingen,

Alemanha) a 500 xg durante 15 minutos. A leitura da absorbância foi realizada a 532 nm em

leitor de microplaca (Synergy 2, BioTek, Winooski – Vermount, EUA).

A atividade antioxidante foi expressa em percentual de inibição da peroxidação lipídica

Trolox (5 µg/mL) foi utilizado como controle positivo. Os valores de percentual de inibição

foram comparados como o meio reacional sem adição de extrato ou controle positivo (sistema).

5.2.4 Animais

Neste estudo, foram utilizados 114 camundongos Swiss machos adultos (30-35 g)

obtidos do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal de Sergipe.

Os animais foram acondicionados em caixas apropriadas de polipropileno (dimensões

29x18x16 cm), com no máximo, 6 animais por caixa e mantidos em gabinete para biotério

(Modelo EB-273C, Insight® - São Paulo, Brasil) a 21 ± 2°C com acesso livre a ração (Labina,

Purina do Brasil® - Rio Grande do Sul, Brasil) e água filtrada, sob um ciclo claro/escuro de

12/12 h. Não houve privação de água ou ração durante o experimento.

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes

da Sociedade Brasileira de Experimentação Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética

em Uso Animal em Pesquisa da Universidade Federal de Sergipe (protocolo número 09/16,

ANEXO F), baseado nos princípios para o uso e cuidados dos animais de laboratório. Antes

dos experimentos, os animais foram aclimatados ao laboratório por sete dias e distribuídos

aleatoriamente entre os grupos experimentais com o auxílio de uma tabela de randomização

elaborada no software Excel 2016. Tanto os cuidadores quanto os pesquisadores e os

avaliadores dos resultados estavam encobertos para a intervenção que cada animal recebeu.

Ao final de cada experimento, os animais foram eutanasiados por excesso de anestésico

cetamina e xilazina seguido de exsanguinação e suas carcaças acondicionadas em sacos

plásticos próprios para materiais potencialmente infectantes e guardadas em freezer reservado

83

para este fim, até o descarte definitivo conforme rotina do Departamento de Fisiologia, pelo

serviço de coleta seletiva de resíduo biológico da Unuiversidade Federal de Sergipe.

5.2.5 Procedimento experimental de indução da pancreatite aguda

A indução da pancreatite aguda se deu por meio de duas injeções intraperitoneais (i.p.)

consecutivas de solução de cloridrato de L-arginina, na dose de 4 g/kg com um intervalo de 1

h entre elas (DAWRA et al., 2007). A solução injetada continha 8% de L-arginina com o pH

ajustado para 7,0. O grupo controle foi injetado com solução salina estéril (NaCl 0,9%). Setenta

e duas horas após a última injeção de L-arginina, os animais foram anestesiados (80 mg/kg de

cetamina mais 10 mg/kg de xilazina) para coleta de sangue periférico da ponta da cauda para

contagem de leucócitos e da veia abdominal para demais dosagens (1 mL), para posterior

separação do soro.

Sequencialmente, os animais foram eutanasiados por exsanguinação e submetidos à

perfusão transcardíaca com solução salina (NaCl 0,9%) e heparina (5 UI/L) e, posteriormente,

as amostras de tecido (pâncreas e pulmão) foram coletadas, pesadas e armazenadas em

biofreezer (Forma 900 Series, Thermo Scientific, Waltham - Massachusetts, EUA) à -80°C

para as análises. Após coletado, os elementos do sangue foram separados em centrífuga de

bancada (Z326K, Hermle Labortechnik, Wehingen – Tuttlingen, Alemanha) a 1000xg durante

15 min à temperatura ambiente para separação do soro que foi estocado a -80°C para as análises.

5.2.6 Delineamento experimental

Os animais foram divididos em cinco grupos, contendo seis animais (n = 6), a saber:

a) Grupo salina + veículo: os animais foram injetados com solução salina estéril

(0,9%, 5 mL/kg, i.p., duas administrações) e tratados com veículo (solução salina

estéril, i.p.) às 1, 24 e 48 horas após a última injeção de soro fisiológico;

b) Grupo L-arginina + veículo: os animais foram injetados com L-arginina (4 g/kg,

i.p., duas administrações) e tratados com veículo (i.p.) às 1, 24 e 48 horas após

a última injeção de L-arginina;

84

c) Três grupos L-arginina + EpVm: os animais foram injetados com L-arginina (4

g/kg, i.p., duas administrações) e tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg,

v.o.; ANHÊ et al., 2015) às 1, 24 e 48 horas após a última injeção de L-arginina.

Três grupos controles foram utilizados. Para avaliação dos parâmetros inflamatórios, foi

utilizado o controle com dexametasona (5 mg/kg, s.c.) às 1, 24 e 48 h (OU et al., 2012) após a

última injeção de L-arginina. Para avaliação da hiperalgesia abdominal, foi utilizado o controle

com morfina a (5 mg/kg, i.p.) 30 min antes de cada medição realizada às 24, 48 e 72 h

(SANTANA et al., 2012). Para o teste do campo aberto foi utilizado o controle com diazepam

(1 mg/kg) 30 min antes da primeira inserção dos animais no campo (SANTANA et al., 2012)

(Figura 11).

Figura 11: Linha do tempo referente ao delineamento experimental do tratamento da pancreatite aguda induzida por L-arginina. (A) Grupos experimentais para avaliação dos parâmetros inflamatórios. (B) Grupos experimentais para avaliação da hiperalgesia. 5.2.7 Determinação de parâmetros inflamatórios

Atividade de mieloperoxidase (MPO)

A medida de atividade de MPO baseia-se na velocidade de oxidação do substrato о-

dianisidina na presença de H2O2, evidenciada pela mudança de absorbância medida a 460 nm.

Amostras de pâncreas e pulmão dos animais foram coletadas, pesadas e cortadas em pedaços

pequenos e mantidas em tubos teste na presença de tampão fosfato (50 mmol/L, pH 6,0

contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio). Cada amostra foi homogeneizada em

homogeneizador de tecidos (T25 Ultra Turrax IKA, Staufen - Baden-Württemberg, Alemanha)

durante 15 s, e alíquotas do homogenato foram centrifugadas (2 min, 8000xg, 4oC; (Z326K,

85

Hermle Labortechnik, Wehingen – Tuttlingen, Alemanha). Os sobrenadantes obtidos foram

submetidos à análise da atividade da MPO, conforme descrito a seguir. Em uma placa de 96

poços, alíquotas de sobrenadante foram adicionadas a solução de dihidrocloreto de ο-

dianisidina (0,167 mg/mL, preparada em tampão fosfato de potássio 50 mmol/L contendo

0,005% de H2O2). As alterações dos valores da absorbância (460 nm) foram registradas em

leitor de microplaca (Synergy 2, BioTek, Winooski – Vermount, EUA), a intervalos de 15 s

durante 2-10 min. Os resultados foram expressos como unidades de MPO por mg de tecido

(UMPO/mg de tecido). Uma UMPO foi considerada como a quantidade de enzima que degrada

1 μmol de peróxido/min (BRADLEY et al., 1982).

Índice de edema pancreático

O índice de edema pancreático foi calculado como a razão entre o peso úmido e o peso

seco das amostras de tecido pancreático. Para este efeito, as amostras foram secas a 90°C

durante 12 h em termobloco (TDB-120, Biosan, Riga, Letônia), e a massa do tecido foi

mensurada antes e depois deste procedimento (SZABOLCS et al., 2007).

Contagem total e diferencial de leucócitos

As contagens de leucócitos totais e diferenciais foram realizadas a partir de alíquotas de

20 μL de sangue periférico retiradas da ponta da cauda de camundongos anestesiados

imediatamente antes da eutanásia. A partir do total de sangue coletado, 10 μL foram

adicionados a 190 μL de líquido de Turk e a contagem total dos leucócitos realizada em câmara

de Neubauer a partir da contagem de leucócitos presentes nos quatro quadrantes da câmara. A

contagem diferencial foi realizada a partir de esfregaços obtidos manualmente com 10 μL de

sangue periférico, corados com corante panótico InstantProv®, seguindo-se as instruções do

fabricante. Em cada lâmina, foram contadas 100 células, diferenciando-se as células

polimorfonucleares das mononucleares, baseando-se no critério morfológico normal. Ambas as

contagens foram realizadas sob microscópio ótico (CX41 Olympus Optical do Brasil®, São

Paulo – São Paulo, Brasil) por um analista encoberto. Os resultados foram expressos como

número de leucócitos/mL de sangue periférico (CARVALHO, 2008).

86

1.1.1.7 Quantificação do conteúdo tecidual de citocinas

Os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) para interleucina (IL)-6, IL-1β e fator de necrose

tumoral (TNF)-α foram realizados em homogenatos de amostra de pâncreas e tecido pulmonar

de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems). Homogenatos de amostra de

pâncreas e pulmão foram transferidos em duplicata para placas de 96 poços revestidas com

alíquotas de 100 μL de anticorpos monoclonais anti-IL-1β ou TNF-α ou IL-6 em solução salina

tamponada com tampão fosfato (PBS) a pH 7,4 durante 12 h de incubação. As placas foram

lavadas com PBS contendo 0,05% de Tween 20 e bloqueadas com PBS contendo FBS a 10%

durante 2 h. Após lavagens adicionais, foram adicionados padrões e amostras e incubados à

temperatura ambiente durante 24 h. Subsequentemente, os poços foram lavados e foram

adicionados anticorpos anti-IL-1β, IL-6 ou TNF-α biotinilados (específicos para camundongos)

e incubados à temperatura ambiente durante 1 h. Os poços foram lavados, adicionou-se avidina-

peroxidase e as placas foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente, antes de serem

novamente lavadas para a adição do substrato tetrametilbenzidina (TMB). O desenvolvimento

de cor foi medido a 450 nm utilizando um leitor de microplacas automatizado (Synergy 2,

BioTek, Winooski – Vermount, EUA). Amostras padrão foram pipetadas em cada placa de

ensaio utilizando diluições em série de IL-1β, IL-6 ou TNF-α recombinante. Os resultados

foram corrigidos pela quantidade tecidual de proteína e expressos como pg de cada citocina por

mg de proteína.

5.2.8 Avaliação da hiperalgesia abdominal

Para avaliar a hiperalgesia mecânica na região abdominal de camundongos, utilizou-se

o modelo eletrônico de von Frey, (EFF31, Insight®, São Paulo – São Paulo, Brasil), de acordo

com Santana et al. (2012) com pequenas adaptações. Os animais foram transferidos para gaiolas

individuais (dimensão 20 x 22 x 18 cm) e ambientados por 3 dias (1 vez ao dia, por 30 min).

No dia do teste (basal), foram aplicados estímulos mecânicos à região lateral anterior do

abdome dos animais, em triplicata, antes de qualquer manipulação e 24, 48 ou 72 h após a

indução da pancreatite aguda. Para cada animal, em cada tempo de avaliação, foi aplicado um

estímulo crescente (em g) à região abdominal dos camundongos, com um intervalo de pelo

menos 1 minuto, até que um comportamento de retirada fosse observado quando o valor da

força de limiar foi registado pelo equipamento (0,1 a 1000 g).

87

Este teste foi realizado de maneira encoberta, de modo que o examinador não conhecia

a identidade dos grupos. A medida da intensidade do estímulo foi realizada 1 hora antes da

indução da pancreatite (linha de base) e foi repetida 24, 48 e 72 h após, totalizando 4 ensaios.

Os dados foram expressos como variação (Δ), subtraindo o valor médio obtido das três

medições tomadas em cada ponto de tempo após a indução da pancreatite do valor basal médio

registado para cada animal (antes da pancreatite).

5.2.9 Estudo da atividade locomotora

A atividade locomotora dos animais foi investigada em aparato de campo aberto

(Insight®, Ribeirão Preto – São Paulo) de 60 cm de diâmetro. Os camundongos foram divididos

em três grupos experimentais contendo 6 animais cada e tratados com veículo ou EpVm (200

mg/kg; v.o.) 1 h antes e diazepam (1 mg/kg; i.p.) 30 min antes de serem colocados

individualmente ao campo aberto, e após 1 minuto de ambientação, foi registrada durante 5 min

a frequência de locomoção dos animais, que foi expressa como distância percorrida em metros,

tempo de mobilidade em segundos e número linhas cruzadas, segundo descrição de Capaz et

al. (1981). Após 24 h da primeira entrada no campo, os animais foram recolocados

individualmente no campo aberto e a frequência de locomoção foi novamente mensurada. Este

experimento foi registrado em vídeo e analisado de maneira encoberta por software ANYmaze

versão 5.1, específico para tal fim.

5.2.10 Determinação dos parâmetros bioquímicos no soro

As concentrações de amilase, lipase, uréia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST)

e alanina aminotransferase (ALT) no soro foram avaliados para cada grupo experimental

utilizando kits comerciais específicos para a amilase (Katal Biotechnology, Belo Horizonte -

Minas Gerais, Brasil) (Human do Brasil, São Paulo – São Paulo, Brasil), ureia e creatinina

(Vida Biotecnologia, Belo Horizonte, MG) e ALT ou AST (Laboratório Liquiform, Lagoa

Santa – Minas Gerais, Brasil) de acordo com as instruções dos fabricantes.

5.2.11 Determinação do status oxidativo

Para estes ensaios, amostras de pâncreas e pulmão foram pesadas e homogeneizadas em

tampão fosfato 50 mmol/L pH 7,0, centrifugadas (Z326K, Hermle Labortechnik, Wehingen –

88

Tuttlingen, Alemanha) a 10000xg e o sobrenadante foi utilizado para todos os ensaios

antioxidantes. Estes ensaios foram realizados em duplicatas.

Determinação do conteúdo tecidual de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

Para a determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em

amostras de homogenatos de pâncreas e pulmões, utilizou-se o método descrito anteriormente

(BOSE; SUTHERLAND; PINSKY, 1989) com pequenas modificações (SANTANA et al.,

2012). Alíquotas dos homogenatos foram incubadas a 90°C durante 45 min com solução

contendo TBA a 0,37%, em meio ácido [ácido tricloroacético (TCA) a 15% e ácido clorídrico

0,25 mol/L]. Ao final da incubação e após centrifugação durante 5 min a 8000 xg, alíquotas dos

sobrenadantes foram submetidas à extração do produto de reação com igual volume de n-

butanol e solução saturada de NaCl, seguida pela agitação em vórtex (QL901, Biomixer,

Nanquin – Jiangsu, China) por 30 s e centrifugação durante 2 min a 8000xg. Alíquotas dos

sobrenadantes (fase orgânica) foram pipetadas em placa de 96 poços para leitura dos valores de

absorbância em leitor de microplaca a 535 nm (corrigidos pelos valores de absorbância a 572

nm; Synergy 2, BioTek, Winooski – Vermount, EUA). Os resultados foram expressos como

nmol de MDA por mg de tecido, utilizando-se, para o cálculo, um coeficiente de extinção molar

de 1,55 x 105 L.mol-1.cm-1 e os resultados foram expressos como pmol de malondialdeído

(MDA) formado por mg de proteína.

Determinação do conteúdo proteico de grupamentos carbonílicos

A determinação do conteúdo de proteína oxidada (grupamento carbonil) foi realizada

pela reação de grupos carbonil com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH), como previamente

descrito (LEVINE et al., 1990).

Alíquotas de homogenatos de tecido do pâncreas e pulmão foram precipitadas com TCA

a 10% e, após centrifugação, o sedimento foi tratado com 1 mL de DNPH 0,2% em HCl (2

mol/L) ou 1 mL de HCl (2 mol/L) como um branco. As amostras foram incubadas durante uma

hora à temperatura ambiente com agitação de 5 minutos. Em seguida, adicionou-se 200 uL de

TCA e as proteínas precipitadas foram subsequentemente lavadas três vezes com TCA a 10%,

três vezes com etanol/acetato de etila 1:1 (vol/vol) e três vezes novamente com TCA a 10%. O

precipitado final foi dissolvido em cloridrato de guanidina a 6 mol/L com TCA: os detritos

insolúveis foram removidos por centrifugação. A concentração de grupos carbonil foi calculada

89

a partir da absorbância em 370 nm, utilizando 21,5 L.mmol-1cm-1 como o coeficiente de

extinção para hidrazonas alifáticas e os resultados foram expressos como nmol de carbonil por

mg de proteína.

Determinação do conteúdo tecidual de grupos sulfidril não protéicos

Os grupos sulfidril não proteicos de pâncreas e de pulmão (NP-SH) foram determinados

por reação de Ellman utilizando ácido 5'5'-ditio-bis-2-nitrobenzóico (DTNB), como

anteriormente descrito (SEDLAK; LINDSAY, 1968).

Para esta reação, as alíquotas de homogenatos foram pipetadas em microplaca de 96

poços em volume equivalente a 50 µg de proteína. A este volume, foi acrescentado PBS (50

mmol/L, pH 7,0) até o volume de 165 µL. Após, adicionou-se 35 µL de tampão de reação (ácido

bórico à 100 mmol/L acrescido de EDTA à 0,2 mmol/L, pH 8,5) e 10 µL do reagente de Ellman

(DTNB, 10 mmol/L). Após uma hora de incubação, a absorbância foi medida a 412 nm em

leitor de microplaca (Synergy 2, BioTek, Winooski – Vermount, EUA) e os resultados foram

expressos em µg de NP-SH por mg de proteína, considerando-se um coeficiente de extinção

molar de 14,15 L.mol-1cm-1.

Capacidade antioxidante total

A capacidade antioxidante dos tecidos foi avaliada utilizando o ensaio de poder

antioxidante de redução do ferro (FRAP, do inglês ferric ion reducing antioxidant power). Este

ensaio utiliza antioxidantes como agentes redutores num método colorimétrico. Neste ensaio, a

baixo pH, um complexo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (FeIII-TPTZ) é reduzido à forma

ferrosa, que é azulada e monitorada por medição da alteração na absorbância a 593 nm. A

alteração na absorbância é diretamente proporcional ao poder redutor dos antioxidantes

doadores de elétrons presentes nas amostras de tecido homogêneo de pâncreas e de tecido

pulmonar. A alteração de absorbância é traduzida em um valor de FRAP (em μmol/L) que

relaciona a alteração da absorbância da amostra teste com a de uma solução padrão de valor de

FRAP conhecido (500-1200 μmol/L). Em microtubo, adicionou-se 90 µl do homogenato de

pâncreas ou pulmão, 270 µl de água destilada e 2,7 ml de reagente FRAP (750 ml de tampão

acetato 0,3 M, 75 ml solução TPTZ 10 mM e 75 ml cloreto férrico 20 mM). Homogeneizou-se

e colocou-se em banho-maria a 37 ºC. Após 30 minutos efetuaram-se as leituras em leitor de

90

microplaca (Synergy 2, BioTek, Winooski – Vermount, EUA) a 593 nm. Os resultados foram

expressos como μmol de Fe por mg de proteína (BENZIE; STRAIN, 1996).

5.2.12 Determinação da atividade de enzimas antioxidantes

Atividade de catalase

A atividade da enzima catalase (CAT) foi avaliada pela diminuição da absorção de H2O2

a 240 nm, devido ao consumo de H2O2 pela CAT, conforme descrito anteriormente (FOSSATI;

PRENCIPE; BERTI, 1980). Esta determinação ocorreu em duas etapas, constituindo-se de duas

reações químicas. Na primeira, a catalase contida na amostra dismuta o H2O2 de concentração

conhecida em água e oxigênio molecular. Na segunda reação, o H2O2 remanescente é

determinado pela oxidação da o-dianisidina em uma reação catalisada pela enzima horseradish

peroxidase (HRP).

Alíquotas do sobrenadante dos homogenatos de pâncreas e pulmão (30 µL) foram

separadas em 2 grupos, metade delas foi incubada a 60°C por duas horas para a inativação da

catalase a fim de ser usada como branco da amostra e a outra metade, juntamente com os pontos

da curva padrão de H2O2 em tampão fosfato 50 mmol/L pH 7,0 em concentrações que variaram

entre 8820 – 11 µM, formam utilizados para a determinação da atividade de catalase. Todas as

amostras (incluindo as inativadas) foram incubadas com 500 µM de H2O2 (10 mmol/L) em

temperatura ambiente, em tempos variáveis (5 min para as amostras de pâncreas e 2 min para

as amostras de pulmão). A reação foi interrompida pela adição de 500 µL de azida sódica

(NaN3, 1 mmol/L). Paralelamente, 30 µL de tampão fosfato (50 mmol/L, pH 7,0) foram

incubados com os diferentes pontos da curva, nos respectivos tempos de incubação.

Após interrupção da reação, 20 µL do produto da reação anterior foram adicionados a

200 µL de meio de reação contendo 0,167 mg/mL de o-dianisidina e 0,095 µg/mL de HRP em

tampão fosfato (5 mmol/L, pH 6,0). A monitorização da velocidade de formação do produto de

oxidação da o-dianisidina foi realizada registrando-se o aumento da absorbância da mistura a

460 nm, por meio de leituras coletadas em intervalos de 10 s, durante 10 min em leitor de

microplaca (Synergy 2, BioTek, Winooski – Vermount, EUA). O valor da atividade da catalase

foi calculado a partir de velocidade máxima por minuto de cada reação e extrapolada na curva

de H2O2. A atividade específica foi expressa como unidades de CAT por mg de proteína. Uma

unidade de CAT foi definida como a quantidade de enzima que degradou um μmol de H2O2 por

min.

91

Atividade de superóxido dismutase

A atividade de superóxido dismutase (SOD Cu/Zn) foi quantificada por meio do método

da epinefrina, com base na capacidade da SOD de inibir a auto oxidação da adrenalina em

adrenocromo, que possui um máximo de absorção a 480 nm. Após a quantificação das proteínas

nas respectivas amostras, foi pipetado em placa de 96 poços, 5 µL de solução de catalase (10

µmol/L) e, em poços diferentes, quantidade de amostra que contém 5, 10 ou 20 µg de proteína.

Completou-se o volume da reação para 190 µL com tampão glicina (50 mmol/L; pH 10,2). A

absorbância da mistura foi registrada em 480 nm a 32°C em leitor de microplaca (Synergy 2,

BioTek, Winooski – Vermount, EUA). Após a leitura, foi acrescentado aos poços da placa 5

µL de adrenalina 60 mmol/L. A reação foi novamente quantificada a 480 nm, em modo cinético

por 10 min. Uma unidade de atividade de SOD foi definida como a quantidade de proteína que

causa 50% de inibição da auto oxidação de adrenalina a 26°C (MISRA; FRIDOVICH, 1972).

Atividade de glutationa peroxidase

A atividade da glutationa peroxidase (GPx) foi determinada como descrito

anteriormente (PAGLIA; VALENTINE, 1967). Neste ensaio, a molécula oxidada de glutationa

(GSSG), produzida na reação primária com a GPx é reduzida por intermédio da glutationa

redutase (GR), com o auxílio do cofator NADPH.

A reação consistiu de duas etapas. Na primeira, 30 µL de amostra foram incubados em

placa de 96 poços com 55 µL de meio de reação (tampão fosfato 50 mmol/L pH 7,0 contendo

ácido etilenodiamino tetra acético (EDTA) 0,1 mol/L, glutationa (GSH) 0,08 mol/L e GR 9,6

U/mL) por 5 min a 37°C. Na segunda etapa, acrescentou-se a essa reação 5 µL de hidroperóxido

de terc-butil e 10 µL de nicotinamida adenina difosfato (NADPH) 1,2 mmol/L. A absorbância

foi monitorada a 340 nm a 37°C em leitor de microplaca (Synergy 2, BioTek, Winooski –

Vermount, EUA) e foi considerado um coeficiente de extinção molar para o NADPH em 6220

L.mol-1cm-1. A atividade enzimática foi expressa em μmol de GSH/mg de proteína/min.

5.2.13 Determinação de proteínas

O teor de proteína das amostras de tecidos de pâncreas e de pulmão foi determinado

pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976) utilizando o reagente Bio-Rad® Protein Assay.

Os resultados foram calculados a partir de uma curva padrão com concentrações de albumina

sérica bovina variando de 10 a 500 μg/mL e expressos como mg de proteína por mL.

92

5.2.14 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) e a

normalidade dos dados foi analisada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, seguido do teste de

Dallal-Wilkinson-Lillie, considerando α = 0,05 para distribuição normal. Como foi detectada

distribuição normal, os dados foram analisados subsequentemente por análise de variância

unidirecional (ANOVA) seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Especificamente nos dados do

decurso temporal da hiperalgesia abdominal (Figura 20), a ANOVA de duas vias foi usada para

comparar os grupos e tratamentos em todos os tempos, sendo seguida pelo pós-teste de

Bonferroni para distinguir o efeito do tratamento específico. Toda diferença estatística com

p<0,05 foi considerada significativa. As análises estatísticas foram executadas usando o

software GraphPad Prism (versão 7.0).

5.3 Resultados

5.3.1 Capacidade antioxidante in vitro do EpVm pela eliminação de radicais DPPH

Os valores do percentual de inibição do radical DPPH estão mostrados na Figura 12

para as concentrações pré-estabelecidas. O EpVm levou à diminuição do radical DPPH, a partir

de 2,5 µg/mL (p<0,001), quando comparado ao sistema (meio reacional sem adição de extrato).

O trolox (25 µg/mL) também reduziu (p<0,001) o radical DPPH, levando a inibição de 65,1 ±

0,4%. O valor calculado para a IC50 do EpVm neste ensaio foi de 5,7 µg/mL, e o índice de

atividade antioxidante calculado foi de 3,2.

93

0

25

50

75

100

125

***

***

*** ******

12,50,25 2,5 6,250,025 Trolox(25 µg/mL)

EpVm (µg/mL)

Sistema 25

Ra

dic

al D

PP

H (

%)

Figura 12. Atividade antioxidante do extrato padronizado de V. macroparpon (EpVm) frente a radicais DPPH in vitro. Diferentes concentrações do extrato foram testadas no ensaio do radical DPPH. Os resultados representam a média ± E.P.M das porcentagens de inibição in

vitro, em triplicata. Trolox foi usado como antioxidante padrão. *p<0.05, ou ***p<0.001 vs. respectivo sistema (meio reacional sem o antioxidante); ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni. 5.3.2 Capacidade antioxidante in vitro do EpVm pela eliminação do óxido nítrico (NO)

A inibição do NO pelo EpVm está representada na Figura 13. Os valores do percentual

de inibição do nitrito nas concentrações pré-estabelecidas foram significativamente reduzidas a

partir da concentração de 6,25 µg/mL (p<0,05), o valor de IC50 foi de 22,23 µg/mL. O trolox

(25 µg/mL) também reduziu (p<0,001) a geração dos íons nitrito.

IC50 = 5,7 µg/mL

94

0

25

50

75

100

125

***

******

*

12,50,25 2,5 6,250,025 Trolox(25 µg/mL)

EpVm (µg/mL)

Sistema 25

Nitri

to (

%)

Figura 13. Atividade antioxidante do extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) in

vitro pela eliminação do NO. Diferentes concentrações EpVm foram testadas no ensaio do radical nitrito. Os resultados representam a média ± E.P.M das percentagens de inibição in vitro; em triplicata. Trolox foi usado como antioxidante padrão. *p<0.05, ou ***p<0.001 versus o respectivo sistema (meio reacional sem o antioxidante); ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni.

5.3.3 Inibição da peroxidação lipídica in vitro

A Figura 14 apresenta a inibição da lipoperoxidação nas diferentes concentrações do

EpVm. A inibição da peroxidação lipídica foi observada a partir de 1,25 µg/mL (p<0,001). O

valor de IC50 foi de 5,2 µg/mL. O trolox (5 µg/mL) também reduziu (p<0,001) a

lipoperoxidação.

IC50 = 22,23 µg/mL

95

0

25

50

75

100

125

******

*** ***

2,50,05 0,5 1,250,005 Trolox(5 µg/mL)

EpVm (µg/mL)

Sistema 5

Pe

roxid

açã

o lip

ídic

a (

%)

Figura 14. O extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) diminui a lipoperoxidação in vitro. Diferentes concentrações do EpVm foram testadas em relação à lipoperoxidação. Os resultados são representados por média ± E.P.M dos valores do percentual de inibição, em triplicata. O trolox foi utilizado como antioxidante padrão; ***p<0.001 vs. sistema (meio reacional sem o antioxidante), ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni. 5.3.4 Efeito do EpVm nos parâmetros inflamatórios

A inflamação pancreática induzida pela L-arginina foi caracterizada por aumento

significativo da atividade de MPO pancreática após 72 h, quando comparado ao grupo

veículo + salina. O tratamento com EpVm a 200 mg/kg inibiu este efeito (p<0,001), assim como

o tratamento com a dexametasona (p<0,05; Figura 15A). Além disso, a indução da pancreatite

também aumentou significativamente a atividade de MPO no tecido pulmonar, quando

comparada com o grupo veículo+salina. Este efeito foi também reduzido pelo tratamento com

EpVm (200 mg/kg; p<0,001), bem como pelo tratamento com dexametasona (p<0,05; Figura

15B). As doses de 50 ou 100 mg/kg de EpVm não alteraram a atividade de MPO pancreática ou

pulmonar.

A administração de L-arginina aumentou o índice de edema pancreático após 72 h

(p<0,001) quando comparado ao grupo veículo + salina. O tratamento com EpVm (200 mg/kg)

ou dexametasona produziu inibição deste efeito (p<0,001 para ambos). No entanto, o tratamento

com EpVm a 50 ou 100 mg/kg não alterou o edema (Figura 16).

IC50 = 5,2 µg/mL

96

UM

PO

/mg

de

pulm

ão

Figura 15. Efeito do tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na atividade da mieloperoxidase (MPO) pancreática (A) e pulmonar (B). Camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg), dexametasona (Dexa; 5 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. A atividade de MPO foi mensurada nos tecidos pancreático e pulmonar (n = 6). ###p<0,001 vs veículo + salina e *p<0,05 ou ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

97

Figura 16. Efeito do tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) no índice de edema pancreático. Camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg), dexametasona (Dexa; 5 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. O índice de edema foi quantificado no tecido pancreático. ###p<0,001 vs veículo + salina e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

As contagens total e diferencial de leucócitos no sangue periférico foram avaliadas

como um marcador adicional de inflamação sistêmica. A Tabela 3 indica que a contagem total

de leucócitos aumentou em animais do grupo veículo + L-arginina, no qual se observa que este

aumento foi causado principalmente pela contagem de células mononucleares (monócitos,

principalmente), quando comparados com o salina + veículo. As contagens de células

polimorfonucleares não foram alteradas pela indução da pancreatite. O tratamento com EpVm

(50, 100 ou 200 mg/kg) reduziu a contagem total de leucócitos (p<0,001) e de mononucleares

(p<0,05 para 50 mg/kg e p<0,001 para 100 e 200 mg/kg) em comparação ao grupo L-arginina

+ veículo. O tratamento de camundongos com dexametasona reduziu os leucócitos totais

(p<0,01), polimorfonucleares (p<0,05) e mononucleares (p<0,001) quando comparados com

animais do grupo L-arginina + veículo.

98

Tabela 3. O tratamento com o extrato padronizado da V. macrocarpon (EpVm) reduz a contagem total e diferencial de leucócitos no sangue periférico de camundongos submetidos a pancreatite aguda por L-arginina. Tratamento Leucócitos totais

(x 106/mL)

Polimorfonucleares

(x 106/mL)

Mononucleares

(x 106/mL)

Salina + Veículo 3,8 ± 0,5 2,4 ± 0,4 1,4 ± 0,2

L-arginina + Veículo 9,3 ± 1,0a 3,4 ± 0,8 5,8 ± 0,3a

L-arginina + EpVm (50 mg/kg) 6,4 ± 0,3b 2,1 ± 0,1 4,2 ± 0,3b

L-arginina + EpVm (100 mg/kg) 5,1 ± 0,4d 1,7 ± 0,3 3,4 ± 0,3d

L-arginina + EpVm (200 mg/kg) 5,0 ± 0,8d 2,5 ± 0,6 2,5 ± 0,4d

L-arginina + Dexa (5 mg/kg) 3,1 ± 0,1d 1,2 ± 0,1c 1,9 ± 0,1d

Camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg), dexametasona (Dexa; 5 mg/kg) ou veículo (salina). Coletas de sangue foram realizadas 72 h após a indução da pancreatite para contagem total e diferencial de leucócitos. ap<0,001 vs grupo salina + veículo ou bp<0,05, cp<0,01 e dp<0,001 vs grupo L-arginina + veículo.

Além do aumento dos parâmetros inflamatórios anteriormente mencionados, as

concentrações de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaram significativamente no pâncreas e no pulmão

após a indução da pancreatite aguda por L-arginina (Figura 16-18) quando comparados com os

respectivos grupos veículo + salina. As concentrações de TNF-α foram diminuídas pelo

tratamento com EpVm no pâncreas (p<0,01 e p<0,05 respectivamente para 100 e 200 mg/kg,

Figura 16A) e pulmão (p<0,001, Figura 16B) quando comparados com animais tratados com

veículo. A quantidade de IL-1β também diminuiu no pâncreas (p<0,01 para 50 e 200 mg/kg e

p<0,001 para 100 mg/kg, Figura 17A) e no pulmão (p <0,001, Figura 17B) em todas as doses

do tratamento com EpVm, quando comparado com animais tratados com veículo. Foi observado

efeito semelhante para as concentrações de IL-6, para as quais os grupos tratados com EpVm,

independentemente da dose utilizada, apresentaram concentrações menores desta citocina no

pâncreas (p<0,001, Figura 18A) e no pulmão (p<0,001, Figura 18B) quando comparados com

animais tratados com veículo. Como controle positivo, o tratamento com dexametasona

diminuiu estas citocinas nos tecidos pancreático e pulmonar (Figura 16-18).

99

Figura 17. O tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) inibe a produção de Fator de Necrose Tumoral (TNF)-α no pâncreas e no pulmão. Camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg), dexametasona (Dexa; 5 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. As concentrações de TNF-α foram quantificadas nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). ###p<0,001 vs veículo + salina e *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

100

Figura 18. O tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) inibe a produção de Interleucina (IL)-1β no pâncreas e no pulmão. Camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg), dexametasona (Dexa; 5 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. As concentrações de IL-1β foram quantificadas nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). #p<0,05 e ###p<0,001 vs veículo + salina e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

101

Figura 19. O tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) inibe a produção de interleucina (IL)-6 no pâncreas e pulmão. Camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg), dexametasona (Dexa; 5 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. As concentrações de IL-6 foram quantificadas nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). ##p<0,01 e ###p<0,001 vs veículo + salina e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina. 5.3.5 Efeito do EpVm na hiperalgesia mecânica abdominal

A pancreatite aguda induzida pela L-arginina foi acompanhada pela redução da

intensidade do estímulo necessário para causar um comportamento de retirada dos

camundongos após 48 ou 72 h (p<0,001), indicando que os mesmos desenvolveram a

hiperalgesia abdominal como consequência da inflamação pancreática. A ANOVA de duas vias

indicou uma interação significativa entre os fatores tempo e o tratamento neste experimento

102

(p<0,001, F(12,66)=4,087). A injeção de salina, ao invés de L-arginina, não alterou o

comportamento de retirada dos camundongos (Figura 20).

A Figura 20 também mostra que o tratamento com EpVm reduziu a hiperalgesia

abdominal dos camundongos submetidos a pancreatite aguda após 48 h (p<0,01 para 50 mg/kg

e p<0,05 para 100 mg/kg) ou 72 h (p<0,001 para 50 mg/kg, p<0,01 para 100 mg/kg e p<0,05

para 200 mg/kg).

Como controle positivo, o tratamento com morfina (5 mg/kg) inibiu a hiperalgesia

abdominal após 24 (9,7 ± 1 g, p<0,001), 48 (8,3 ± 2 g, p<0,001) e 72 h (5,8 ± 2 g, p<0,001) da

indução da pancreatite, quando comparado com animais tratados com veículo (-3,7 ± 1, -8,1 ±

1 e -10,1 ± 1 g, respectivamente para 24, 48 e 72 h pós-indução.

Figura 20. Efeito do tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na hiperalgesia abdominal durante a pancreatite aguda induzida por L-arginina. Camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg), ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. A variação (∆) da intensidade do estímulo que causou um comportamento de retirada foi calculada subtraindo-se os valores basais (0 h) dos valores em cada tempo (24, 48 ou 72 h) e foi expressa em g, n=6. ###p<0,001 vs o respectivo controle negativo; *p<0,05, **p<0,01 ou ***p<0,001 vs o respectivo grupo L-arginina + veículo.

103

5.3.6 Efeito do EpVm na atividade locomotora

A capacidade de locomoção dos animais expostos ao EpVm foi avaliada no teste do

campo aberto. O grupo tratado com diazepam apresentou diminuição da capacidade locomotora

(p<0,001) após 30 min após da administração deste, quando comparado ao grupo tratado com

salina. Este efeito não foi observado 24 h após o tratamento. Os animais tratados com EpVm

não apresentaram alteração dos parâmetros locomotores quando comparados com o grupo

tratado com salina (Tabela 4).

Tabela 4: Ausência de efeito do extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na atividade locomotora de camundongos no campo aberto. Parâmetro Salina EpVm Diazepam

1ª entrada 2ª entrada 1ª entrada 2ª entrada 1ª entrada 2ª entrada

Distância (m) 36,3 ± 4,1 37,5 ± 4,5 34,3 ± 3,1 35,9 ± 3,6 8,4 ± 3,6a 33,1 ± 3,4

Mobilidade (s) 275 ± 9 277 ± 10 258 ± 17 267 ± 10 17 ± 5 a 268 ± 11

Linhas cruzadas 245 ± 20 248 ± 22 238 ± 17 242 ± 12 13 ± 3 a 183 ± 25

Grupos de camundongos foram tratados com veículo (NaCl 0,9%, v.o., 1 h antes), EpVm (200 mg/kg, v.o., 1 h antes) ou diazepam (1,0 mg/kg, i.p., 30 min antes) para a 1ª observação no campo aberto. Após 24 h, os animais foram recolocados no aparato de campo aberto. Foram quantificados a distância percorrida (m), o tempo de mobilidade (s) e o número de linhas cruzadas pelo animal em 5 min, após 1 min de ambientação. Os resultados foram expressos como média ± EPM, n=6 camundongos por grupo, a p<0,001 versus o respectivo grupo veículo. ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferronni.

5.3.7 Efeito do EpVm nos parâmetros bioquímicos séricos

A indução da pancreatite aguda pela L-arginina aumentou significativamente as

concentrações séricas de amilase e lipase. Este efeito foi acompanhado pelo aumento das

concentrações séricas de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST),

ureia e creatinina após 72 h da indução de pancreatite aguda, quando comparado com o grupo

veículo + salina. O tratamento com EpVm reduziu as concentrações séricas de amilase (200

mg/kg, p<0,001), lipase (200 mg/kg, p<0,01), ALT (100 mg/kg, p<0,05; 200 mg, p<0,05) e

AST (100 mg/kg, p<0,05; 200 mg/kg, p<0,01). Foi também observado que as concentrações

séricas de ureia (50 mg/kg, p<0,001; 100 mg/kg, p<0,001; 200 mg/kg, p<0,001) e creatinina

(100 mg/kg, p<0,05; 200 mg/kg, p<0,05) foram diminuídas pelo EpVm. O tratamento com

dexametasona (5 mg/kg) diminuiu as concentrações de amilase (p<0,01), lipase (p<0,05) e ureia

(p<0,001) no soro (Tabela 4).

104

5.3.8 Efeito do EpVm no status oxidativo

Os produtos de peroxidação lipídica aumentaram significativamente tanto no pâncreas

(Figura 21A) como no pulmão (Figura 21B) após a indução da pancreatite. Este efeito foi

inibido pelo tratamento com EpVm nas doses de 50, 100 ou 200 mg/kg (p<0,001, Figura 21A)

quando comparado com o grupo tratado com veículo. No tecido pulmonar, as doses de 100 e

200 mg/kg também inibiram a produção de MDA (p<0,05 e p<0,01, respectivamente, Figura

21B) quando comparado com o tratamento com veículo.

Foram encontradas maiores quantidades de radicais carbonil no pâncreas e no pulmão

de animais após a indução da pancreatite aguda (Figura 22A-B). Este efeito foi inibido em

animais tratados com EpVm no pâncreas (p<0,05 para 50 mg/kg e p<0,01 para 100 e 200 mg/kg,

Figura 22A) e pulmão (p<0,001, Figura 22B) em comparação aos animais tratados com veículo.

Adicionalmente, os grupamentos sulfidril não proteicos (NP-SH) presentes no pâncreas

e de pulmão foram diminuídos significativamente pela indução de pancreatite aguda (Figura

23A-B). O tratamento com EpVm nas doses de 100 e 200 mg/kg restabeleceu o teor de NP-SH

no pâncreas (p<0,05, Figura 23A) e no pulmão (p<0,001, Figura 23B) quando comparado ao

grupo veículo + L-arginina.

Adicionalmente, o status antioxidante no pâncreas e no pulmão foi mensurado por meio

da determinação do FRAP. Na Figura 24 nota-se que a capacidade antioxidante dos tecidos foi

significativamente reduzida no pâncreas e no pulmão devido à indução de pancreatite aguda. O

tratamento com 200 mg/kg de EpVm diminuiu este parâmetro (p<0,05, Figura 24A) e pulmão

(p<0,001, Figura 24B) em comparação aos animais tratados com veículo. O tratamento com as

outras doses do extrato não afetou este parâmetro no pâncreas ou pulmão.

105

Tabela 4. O tratamento com extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) reduz parâmetros bioquímicos séricos em camundongos submetidos a pancreatite aguda induzida por L-arginina.

Parâmetro Veículo + Salina L-arginina +

Salina

L-arginina +

EpVm (50

mg/kg)

L-arginina +

EpVm (100

mg/kg)

L-arginina +

EpVm (200

mg/kg)

L-arginina +

Dexa (5 mg/kg)

Amilase (U/dL) 222 ± 21 968 ± 114a 873 ± 44 763 ± 73 346 ± 16e 458 ± 132d

Lipase (U/dL) 69 ± 13 475 ± 102a 313 ± 23 370 ± 52 196 ± 26d 209 ± 26c

ALT (UI/L) 4,2 ± 0,3 9,8 ± 0,3a 8,2 ± 1,2 6,3 ± 0,5c 5,6 ± 0,9c 7,2 ± 0,5

AST (UI/L) 6,4 ± 0,2 11,6 ± 1,5b 7,2 ± 0,7 6,1 ± 0,5e 7,1 ± 0,5d 8,5 ± 0,5

Urea (mg/dL) 44,5 ± 6,5 94,0 ± 11,2a 27,1 ± 5,7e 35,4 ± 14,1e 24,2 ± 1,1e 21,1 ± 2,3e

Creatinina (mg/dL) 5,7 ± 0,1 9,2 ± 0,3b 7,7 ± 0,3 6,0 ± 0,5c 6,0 ± 0,7c 8,0 ± 1,2

Grupos de camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg), dexametasona (Dexa; 5 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. ap<0,01 and bp<0,05 vs. o respectivo grupo veículo + salina ou cp<0,05, dp<0,01, ep<0,001 vs. o respectivo grupo L-arginina + salina.

106

Figura 21. Efeito do tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na produção de malondialdeído (MDA) no pâncreas e pulmão de animais com pancreatite aguda. Grupos de camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. A produção de MDA foi quantificada nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). #p<0,05 e ###p<0,001 vs veículo + salina e **p<0,01 e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

107

Figura 22. Efeito do tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na geração de grupamentos carbonil no pâncreas e pulmão de animais com pancreatite aguda. Grupos de camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. A presença de grupos carbonil foi quantificada nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). ###p<0,001 vs veículo + salina e *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

108

Figura 23. Efeito do tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na geração de radicais sulfidril não protéicos (NP-SH) no pâncreas e pulmão de animais com pancreatite aguda. Grupos de camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. A produção de NP-SH foi quantificada nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). #p<0,05 e ##p<0,01 vs veículo + salina e *p<0,05 e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

109

Figura 24. Capacidade antioxidante total (FRAP) no pâncreas (A) e pulmão (B) de animais com pancreatite aguda tratados com veículo ou o extrato padronizado de V.

macrocarpon (EpVm). Grupos de camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. O poder antioxidante de redução do ferro (FRAP) foi quantificado nos tecidos pancreático e pulmonar. #p<0,05 vs veículo + salina e *p<0,01 e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

110

5.3.9 Efeito do EpVm na atividade das enzimas antioxidantes

A indução de pancreatite aguda reduziu significativamente a atividade das enzimas

CAT, SOD e GSH-Px no pâncreas e a atividade de CAT e SOD no pulmão (Figura 25-24).

A Figura 25A mostra a reversão dos efeitos da indução da pancreatite sobre a atividade

de CAT no pâncreas de animais com pancreatite aguda que foram tratados com EpVm na dose

de 50 mg/kg (p<0,05), 100 mg/kg (p<0,01) e 200 mg/kg (p<0,01). Foi observado efeito

semelhante nos pulmões (Figura 25B) de animais com pancreatite tratados com EpVm nas doses

de 100 e 200 mg/kg (p<0,05).

Concomitantemente, a atividade de SOD aumentou significativamente no pâncreas após

tratamento com EpVm nas doses de 100 e 200 mg/kg (p<0,01, Figura 26A), o que também foi

observado no pulmão após tratamento com 100 mg/kg (p<0,01, Figura 26B). No entanto, a

atividade de GSH-Px não foi modificada pelo tratamento com EpVm tanto no pâncreas como

no pulmão (Figura 27).

111

Figura 25. O tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) reverte as alterações causadas pela indução da pancreatite aguda sobre a atividade da enzima catalase (CAT) no pâncreas e pulmão de animais. Grupos de camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. A atividade da enzima CAT foi quantificada nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). #p<0,05 e ###p<0,001 vs veículo + salina e *p<0,01, **p<0,01 e ***p<0,001 vs veículo + L-arginina.

112

Figura 26. Efeito do tratamento extrato padronizado de V. macrocarpon (EpVm) na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) no pâncreas e pulmão de animais com pancreatite aguda. Grupos de camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. A atividade da enzima SOD foi quantificada nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). #p<0,05 vs veículo + salina e **p<0,01 vs veículo + L-arginina.

113

Figura 27. Atividade da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px) no pâncreas e pulmão de animais com pancreatite aguda após tratamento com o extrato padronizado de V.

macrocarpon (EpVm) ou veículo. Grupos de camundongos foram submetidos a injeção de L-arginina ou salina, tratados com EpVm (50, 100 ou 200 mg/kg) ou veículo (salina) e eutanasiados após 72 h da indução da pancreatite. A atividade da enzima GSH-Px foi quantificada nos tecidos pancreático (A) e pulmonar (B). #p<0,05 vs veículo + salina.

114

5.4 Discussão

O uso de plantas medicinais com elevada atividade antioxidante para tratar a pancreatite

aguda (PA) associado à necessidade de novas alternativas de tratamento desta doença

direcionou ao estudo da Vaccinium macrocarpon, uma planta medicinal de conhecida atividade

antioxidante dos seus frutos e amplamente pesquisada em outras condições clínicas, mas sem

evidências no tratamento da PA. A presença de antocianinas nesta planta reforçou a

possibilidade de efeito benéfico na PA. De fato, no presente estudo são apresentados resultados

que mostram que o tratamento com EpVm pode modular a resposta inflamatória no pâncreas e

no pulmão com a participação do estresse oxidativo durante pancreatite aguda induzida por L-

arginina. Ainda, a hiperalgesia abdominal também foi alterada no decurso da pancreatite em

animais tratados com o EpVm. A descoberta de que o EpVm tem efeito benéfico na PA é

inovadora para este extrato, que é frequentemente utilizado pela população no tratamento de

condições inflamatórias do sistema urinário (BLUMBERG et al., 2013).

O estudo da capacidade antioxidante e de inibição da lipoperoxidação in vitro do EpVm

mostra o índice de atividade antioxidante calculado a partir do resultado da inibição do radical

DPPH (SHERER; GODOY, 2009) considerado muito forte (IAA>2,0). Além disso, os valores

de IC50 calculados neste trabalho para os testes da inibição do radical DPPH, do radical nitrito

e da lipoperoxidação foram confirmados por achados em trabalhos anteriores (LAPSHINA et

al., 2015; CHOI et al., 2014; SEKIZAWA et al., 2013), que destacam o potencial antioxidante

da V. macrocarpon. Esta elevada atividade antioxidante in vitro pode ser um preditor para

efeitos benéficos na pancreatite aguda, pois o estresse oxidativo é uma característica importante

tanto para resposta inflamatória no pâncreas, como nos efeitos secundários a pancreatite (RAU

et al., 2000).

Para avaliar esta possibilidade, no presente estudo foi utilizado o modelo de pancreatite

aguda induzida pela L-arginina. Este modelo foi previamente estabelecido em camundongos

por Dawra e col. (2007), estudo no qual uma dose elevada de L-arginina induziu lesão no tecido

pancreático com maiores alterações ocorrendo após 72 h. No presente estudo, a inflamação

pancreática observada neste estudo foi acompanhada por alterações sistêmicas como lesão

pulmonar (aumento da atividade da MPO, e concentração de citocinas no pulmão), aumento da

contagem de leucócitos no sangue periférico e alteração das funções hepática (aumento das

atividades séricas de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT)) e

renal (aumento das concentrações séricas de ureia e creatinina).

115

O tratamento com EpVm induziu efeitos protetores contra a inflamação pancreática. A

atividade de MPO, o índice de edema e a produção de citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-6) foram

reduzidas por este extrato. Em paralelo à redução da lesão pancreática nos animais tratados com

EpVm, as concentrações de amilase e lipase séricas diminuíram, o que confirma a redução da

lesão pancreática. A infiltração de neutrófilos é uma característica da pancreatite aguda

(SZATMARY; GUKOVSKY; ANGELES, 2016) e o presente estudo mostra que o EpVm pode

interferir na presença dessas células no pâncreas inflamado, o que está de acordo com os

achados anteriores de que o extrato dos frutos de V. macrocarpon reduziu a atividade de MPO

em patas de camundongos injetadas com carragenina (NARDI et al., 2016).

De modo semelhante, o tratamento com 1,5% de pó de extrato seco de frutos de V.

macrocarpon (incorporado na dieta) reduziu a atividade de MPO no cólon de camundongos

submetidos a colite induzida por dextrano sulfato de sódio (XIAO et al., 2015), bem como um

tratamento profilático com cranberry (100 mg/kg) diminuiu a atividade de MPO no coração de

ratos submetidos à cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina (ELBERRY et al., 2010). Em

conjunto, estes resultados destacam o efeito anti-quimiotático do EpVm.

Paralelamente a este efeito, o tratamento com EpVm produziu efeito anti-

edematogênico. O edema pancreático está relacionado à perturbação da microcirculação,

envolvendo principalmente a modulação da produção de óxido nítrico, espécies reativas de

oxigênio, bradicinina, prostaciclina e endotelina (AKINOSOGLOU; GOGOS, 2014). Foi

demonstrado que o extrato de frutos de V. macrocarpon reduziu a produção de prostaglandinas

in vitro, apresentou atividade antioxidante e inibiu o edema da pata de camundongos induzido

por carragenina (NARDI et al., 2016), dando suporte aos achados do presente estudo. A redução

da migração de neutrófilos para o pâncreas e a formação de edema induzida por EpVm

certamente são dependentes da atividade inibitória de citocinas pró-inflamatórias, uma vez que

os conteúdos pancreáticos de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram reduzidos pelo tratamento com EpVm.

Por conseguinte, outros autores demonstraram que o extrato de V. macrocarpon. inibiu

a produção de IL-6, IL-8 e prostaglandina E2 por fibroblastos gengivais estimulados com LPS

in vitro (BODET; CHANDAD; GRENIER, 2007) e que as frações de extratos de V.

macrocarpon com diferentes conteúdos de polifenóis (polifenóis de massa molecular baixa,

média ou alta) reduziram a expressão de TNF-α e IL-6 em células de adenocarcinoma de cólon

humano (Caco-2) (DENIS et al., 2015). Além disso, as concentrações séricas de IL-1β e

interferon-γ e a expressão de RNAm para TNF-α e IL-1β no cólon foram reduzidas pelo

tratamento com cranberry em camundongos submetidos a colite induzida por dextrano sulfato

116

de sódio (XIAO et al., 2015). Assim, o efeito anti-inflamatório observado neste trabalho, pode

ser atribuído, em parte, à ação dos compostos fenólicos presentes no extrato da V. macrocarpon.

Em adição à inflamação pancreática, a hiperalgesia abdominal foi observada após 48

horas de indução da pancreatite. Resultados semelhantes foram descritos por Abreu et al. (2016)

no modelo de pancreatite induzida por L-arginina e pode-se considerar que esta manifestação

mimetiza a dor abdominal observada em humanos durante uma crise de PA, uma característica

clínica recorrente nos pacientes com esta doença. A redução da hiperalgesia abdominal

encontrada no presente estudo pelo tratamento com EpVm pode ser uma consequência da

diminuição dos mediadores inflamatórios pancreáticos, como o TNF-α, IL-1β e IL-6. No

entanto, não é possível descartar a possibilidade de que as substâncias apresentadas no EpVm

tenham reduzido a estimulação das vias nociceptivas, como um efeito semelhante a drogas

opióides. Vale destacar que os animais tratados com EpVm não apresentaram alterações na no

comportamento de deambulação quando inseridos em aparato de campo aberto, dado que

fornece suporte aos achados no experimento da hiperalgesia abdominal, que utiliza o

comportamento dos animais como parâmetro de avaliação.

Poucos estudos investigaram o possível efeito analgésico do extrato dos frutos de V.

macrocarpon. Um estudo clínico randomizado mostrou que os homens que receberam

radioterapia para câncer de próstata e ingeriram cápsulas deste extrato apresentaram menor

incidência de dor e ardor (HAMILTON et al., 2015). A presença de antocianinas também pode

estar contribuindo para este efeito anti-hiperalgésico, pois um estudo anterior mostrou que o

extrato de uva rico em antocianinas reduziu a nocicepção causada pela dor neuropática induzida

pela ligadura do nervo ciático em ratos (KAUR et al., 2016). Além disso, antocianinas

reduziram a nocicepção induzida pela formalina em camundongos, um efeito que contou com

a ativação do receptor opióide (UCHIDA et al., 2008).

Após a indução de pancreatite aguda, foram observadas respostas extra pancreáticas nos

animais injetados com L-arginina, como o aumento da contagem de leucócitos no sangue

periférico, a atividade de MPO nos pulmões e os marcadores de lesão hepática e renal. Embora

os mecanismos subjacentes a estas alterações não sejam bem compreendidos neste modelo de

pancreatite, o efeito benéfico do EpVm é reforçado por estes resultados. A contagem total de

leucócitos no sangue periférico geralmente aumenta e antecipa a infiltração de leucócitos no

pâncreas e outros tecidos nos estágios iniciais da pancreatite (GRANGER; REMICK, 2005).

Curiosamente, no presente estudo, a contagem de células mononucleares aumentou no sangue,

o que é compatível com a participação de monócitos na pancreatite aguda e com o tempo de

avaliação de 72 horas (SHRIVASTAVA; BHATIA, 2010).

117

Outros marcadores de alterações sistêmicas utilizadas no presente estudo foram

concentrações séricas de ALT e AST. O aumento da ALT, mas não da AST, geralmente é um

preditor de pancreatite biliar (ZARNESCU et al., 2015). No entanto, no modelo de pancreatite

aguda induzida por L-arginina em ratos, outros estudos mostraram que AST e ALT estão

aumentados (YENICERIOGLU et al., 2013; ZHANG et al., 2012), mas nenhum estudo

mensurou a atividade destas enzimas em camundongos. A ureia e a creatinina também foram

alteradas no curso de pancreatite aguda no presente estudo e em outros (MUDDANA et al.,

2009; WU et al., 2011). Considerando que a ureia é formada após o metabolismo da L-arginina

(VISEK; SHOEMAKER, 1986), poderia ser esperada uma concentração aumentada deste

metabólito nos animais injetados com L-arginina.

Coletivamente, estes dados reforçam a ideia de que a pancreatite induzida pela L-

arginina causou alterações hepáticas e renais. De forma interessante, essas alterações foram

reduzidas pela administração de EpVm, uma vez que este reverteu, parcialmente, o aumento das

concentrações de ALT, AST, ureia e creatinina no soro dos animais tratados. É possível que

este efeito ocorra devido à redução da lesão pancreática, como confirmado pelo decréscimo da

atividade das enzimas amilase e lipase, conhecidos marcadores inflamatórios pancreáticos, o

que levou a menor lesão sistêmica.

A lesão pulmonar é o efeito secundário da pancreatite mais relacionado à mortalidade

em pacientes (PEZZILLI; BELLACOSA; FELICANI, 2009) e, no modelo de pancreatite

induzida por L-arginina, a atividade de MPO no pulmão aumentou após 72 h da indução,

corroborando achados anteriores (DAWRA et al., 2007). O fato do tratamento com EpVm ter

reduzido a atividade de MPO no pulmão é complementar aos efeitos protetores

extrapancreáticos anteriormente mencionados e também pode ser uma consequência da redução

da lesão pancreática. A lesão pulmonar relacionada à pancreatite é multifatorial e está associada

à presença de enzimas ativadas, destruição do surfactante pulmonar, baixa taxa de perfusão

pulmonar e aumento das citocinas no tecido pulmonar (ZHOU et al., 2010). Merece destaque

o achado de que a diminuição da atividade de MPO no pulmão foi acompanhada por diminuição

substancial das concentrações de TNF-α, IL-1β e IL-6 neste órgão em animais tratados com

EpVm. As antocianinas, presentes no EpVm podem ter contribuído para este efeito, pois é

conhecido que as mesmas podem inibir a ativação da via do NF-κB em monócitos e

consequentemente reduzir a produção de citocinas (KARLSEN et al., 2007).

Como o EpVm é rico em antocianinas e esses compostos possuem efeitos antioxidantes

tanto in vitro quanto in vivo (KRISTO; KLIMIS-ZACAS; SIKALIDIS, 2016) foi especulado

que as ações benéficas observadas nos parâmetros pancreáticos e extrapancreáticos poderiam

118

estar relacionadas com a formação de espécies reativas. De fato, o aumento da peroxidação

lipídica e dos grupos carbonil, em paralelo à diminuição de NP-SH e da capacidade antioxidante

total (FRAP), tanto no pâncreas como no pulmão indicaram que o estresse oxidativo

desempenha um papel significativo neste modelo, como anteriormente observado em outros

trabalhos (ABREU et al., 2016; KAUR et al., 2016; MELO et al., 2011). O tratamento com

EpVm reduziu estes parâmetros, o que poderia ser atribuído ao efeito antioxidante de

antocianinas e dos demais compostos fenólicos presentes no EpVm (KRISTO; KLIMIS-

ZACAS; SIKALIDIS, 2016; MATHISON et al., 2014; NARDI et al., 2016; SKROVANKOVA

et al., 2015; ZAFRA-STONE et al., 2007).

Outra possibilidade complementar para explicar o efeito antioxidante do EpVm poderia

ser a modulação da atividade de enzimas antioxidantes endógenas. De fato, a indução da

pancreatite foi caracterizada pela redução da atividade de CAT, SOD e GSH-Px no pâncreas e

no pulmão, concordando com achados prévios (ABREU et al., 2016; CZAKO et al., 1998; RAU

et al., 2000). As alterações na atividade de CAT e SOD foram revertidas pelo tratamento com

EpVm, reforçando a hipótese de que o este extrato modulou marcadamente a atividade das

enzimas antioxidantes. Curiosamente, as atividades de CAT e SOD parecem ser mais

suscetíveis à reversão no pâncreas do que no pulmão, o que reforça a sugestão de que a redução

da lesão pancreática foi importante para a modulação de efeitos sistêmicos. A modulação

benéfica das atividades de CAT e SOD em animais tratados com EpVm foi mais evidente do

que a atividade de GPx, que não foi alterada pelo tratamento com EpVm, embora a glutationa

pareça desempenhar um papel importante no tecido pancreático (MORENO et al., 2014). Sabe-

se que as enzimas antioxidantes apresentam cooperação sinérgica para manter a concentração

de ERO’s dentro dos limites fisiológicos, entretanto, a especificidade de cada enzima nos

diferentes órgãos e tecidos ainda não está completamente elucidada (KAUR et al., 2016).

Estes efeitos observados pelo tratamento com EpVm podem ser causados pelos

compostos apresentados neste extrato. As antocianinas (cerca de 25% da composição no caso

do extrato utilizado no presente estudo) e outros compostos fenólicos (tais como a quercetina,

o kaempferol, o ácido elágico e o ácido p-cumárico) estão presentes em cranberries

(SKROVANKOVA et al., 2015) e devem ter contribuído para a redução do estresse oxidativo,

o que por sua vez diminuiu a lesão pancreática resultando em menos alterações extra

pancreáticas em camundongos.

Em sua totalidade, os resultados do presente estudo indicam o papel protetor do EpVm

no modelo de pancreatite aguda induzida pela L-arginina pela redução da lesão pancreática, da

estimulação das vias nociceptivas e de alterações sistêmicas através da participação chave do

119

efeito antioxidante deste extrato. Assim, pode ser sugerido que o EpVm pode ser uma alternativa

futura como adjuvante no tratamento da pancreatite aguda em humanos.

120

6 CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que:

a) 22 espécies de plantas medicinais foram utilizadas em estudos pré-clínicos de pancreatite aguda;

b) o risco de viés dos estudos pré-clínicos de pancreatite aguda é elevado, devido o grande número de itens com risco de viés incerto;

c) o extrato padronizado da V. macrocarpon possui atividade antioxidante in vitro;

d) o tratamento da pancreatite aguda experimental com o extrato padronizado da V.

macrocarpon reduziu a intensidade dos parâmetros inflamatórios nos animais;

e) o tratamento da pancreatite aguda experimental com o extrato padronizado da V.

macrocarpon reduziu os marcadores bioquímicos séricos nos animais com pancreatite aguda, quando comparado com os animais controle;

f) a lesão pancreática e pulmonar da pancreatite aguda experimental foi reduzida nos

animais tratados com o extrato padronizado de V. macrocarpon;

g) a atividade locomotora dos animais não foi alterada após tratamento com o extrato padronizado de V. macrocarpon;

h) o extrato padronizado de V. macrocarpon apresentou atividade antinociceptiva na

pancreatite aguda experimental.

121

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136

8 ANEXOS

137

ANEXO A. REGISTRO DO PROTOCOLO DA REVISÃO SISTEMÁTICA

142

ANEXO B. FORMULÁRIO DE EXTRAÇÃO DOS DADOS 1. Pesquisador: ( ) ASO ( ) DGS

2. Informações Gerais 2.1 Título do estudo

____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

2.2 Autores/contato ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.3 Código do arquivo no banco de dados ____________________________________ 2.4 Palavras-chave _______________________________________________________

____________________________________________________________________

3. Informações específicas 3.1 Grupos experimentais _____________________________________

_____________________________________ _____________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________

3.2 Número de animais por grupo _______________________________ 3.3 Espécie animal ___________________________________________ 3.4 Idade ___________________________________________________ 3.5 Peso/gênero______________________________________________ 3.6 Técnica de indução da PA___________________________________________

________________________________________________________________ 3.7 Planta medicinal utilizada ___________________________________________ 3.8 Gênero/família____________________________________________________ 3.9 Tipo de preparação ________________________________________________ 3.10 Via/dose _______________________________________________________ 3.11 Frequência/duração _______________________________________________

143

ANEXO C. FERRAMENTA SYRCLE’S PARA DECISÃO DE RISCO DE VIÉS

Item Type of bias Domain Description of domain Review authors judgment

1 Selection bias Sequence generation Describe the methods used, if any, to generate the allocation

sequence in sufficient detail to allow an assessment whether it

should produce comparable groups.

Was the allocation sequence adequately generated and

applied?

2 Selection bias Baseline characteristics Describe all the possible prognostic factors or animal

characteristics, if any, that are compared in order to judge

whether or not intervention and control groups were similar at

the start of the experiment.

Were the groups similar at baseline or were they adjusted

for confounders in the analysis?

3 Selection bias Allocation concealment Describe the method used to conceal the allocation sequence in

sufficient detail to determine whether intervention allocations

could have been foreseen before or during enrolment.

Was the allocation adequately concealed?

4 Performance bias Random housing Describe all measures used, if any, to house the animals

randomly within the animal room.

Were the animals randomly housed during the

experiment?

5 Performance bias Blinding Describe all measures used, if any, to blind trial caregivers and

researchers from knowing which intervention each animal

received. Provide any information relating to whether the

intended blinding was effective.

Were the caregivers and /or investigators blinded from

knowledge which intervention each animal received

during the experiment?

6 Detection bias Random outcome

assessment

Describe whether or not animals were selected at random for

outcome assessment, and which methods to select the animals,

if any, were used.

Were animals selected at random for outcome

assessment?

Continuação

144

Item Type of bias Domain Description of domain Review authors judgment

7 Detection bias Blinding Describe all measures used, if any, to blind outcome

assessors from knowing which intervention each animal

received. Provide any information relating to whether the

intended blinding was effective.

Was the outcome assessor blinded?

8 Attrition bias Incomplete outcome data Describe the completeness of outcome data for each main

outcome, including attrition and exclusions from the

analysis. State whether attrition and exclusions were

reported, the numbers in each intervention group (compared

with total randomized animals), reasons for attrition or

exclusions, and any re-inclusions in analyses for the review.

Were incomplete outcome data adequately addressed?

9 Reporting bias Selective outcome reporting State how selective outcome reporting was examined and

what was found.

Are reports of the study free of selective outcome

reporting?

10 Other Other sources of bias State any important concerns about bias not covered by other

domains in the tool.

Was the study apparently free of other problems that

could result in high risk of bias?

145

ANEXO D. FERRAMENTA DE RISCO DE VIÉS Revisor: ( ) ASO ( ) DGS Data: __/__/__ Referência do Artigo:__________________________ Código: _________________

N Julgamento dos autores da

revisão

Resposta Risco de viés

1 A sequência de alocação dos animais foi randomizada?

( ) sim ( ) não ( )não informa

( ) baixo ( ) alto ( ) incerto

2 As características basais estavam unificadas?



3 A alocação dos animais foi adequadamente encoberta?



4 Foram cumpridos os regulamentos de bem estar animal?



5 Os investigadores foram encobertos sobre a intervenção que cada animal recebeu?



6 Os animais foram selecionados aleatoriamente para a eutanásia?



7 O avaliador dos resultados estava encoberto?



8 Todos os animais foram incluídos na análise?



9 Os protocolos foram pré-especificados para todos os desfechos?



10 A origem/preparação vegetal está claramente descrita?



146

ANEXO E. LAUDO DO EXTRATO PADRONIZADO DE Vaccinium macrocarpon

147

ANEXO F. APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL DA UFS

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